JP5837691B2 - 白血球機能関連mRNAの生体外での誘導によって癌免疫療法に対するホストの応答性を予測する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、2011年7月18日出願の米国特許仮出願第61/509,030号の利益を主張するものである。
メータを予め設定すること、前記臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出すること、ならびに前記予め設定した値を前記予測変数値に対する比較参照値として用いて前記対象を前記臨床応答グループ分類して、前記医療専門家が前記対象のための癌免疫療法を推奨することを可能とすること、を含む。
機能関連mRNAとの各組み合わせに対する多変量分析によりパラメータを予め設定し、臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出し、個人を臨床応答グループに分類する目的で、予測変数値を予め設定された値と比較し、および個人が臨床応答グループのいずれかに分類される場合に、個人を癌免疫療法に対する潜在的応答者として特定することによって免疫療法に対する個人の潜在的応答性を特定すること、を含む。いくつかの実施形態では、ここで、第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連する。
活性化剤への暴露を、白血球活性化剤が3つ以上の白血球機能関連mRNAの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行うことであって、ここで、第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連し、ii)第三の全血サンプルを第一または第二の白血球活性化剤を含まない溶媒にその継続時間にわたって暴露すること、iii)第一、第二、および第三の全血サンプル中にて3つ以上の白血球機能関連mRNAをコードするmRNAの量を測定することによって3つ以上の白血球機能関連mRNAの発現を定量すること、iv)癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの1つ以上における複数の患者を用いて第一および第二の白血球活性化剤と3つ以上の白血球機能関連mRNAとの各組み合わせに対して多変量分析を行うことによって値を予め設定すること、およびv)臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出すること、を含むアッセイの実施、c)予測変数値および予め設定した値の入手、d)癌免疫療法に対する臨床応答性が既知であるグループのいずれかに個人を分類する目的での、予測変数値と予め設定した値との比較、ならびに、e)この比較から患者が臨床応答グループのいずれかに分類されるという結果が得られる場合における、患者への癌免疫療法の実施、を含む。いくつかの実施形態では、臨床応答グループ外に分類されるという結果が得られる場合には、患者に対して、非免疫学的癌治療が実施される。
される。ある実施形態では、その他の中間的なグループが含まれる(例:低悪性度(low-grade)の進行、高悪性度(high-grade)の進行、など)。
球活性化剤と3つ以上の白血球機能関連mRNAとの各組み合わせに対する多変量判別分析によりパラメータを予め設定すること、臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出すること、および個人を臨床応答グループに分類する目的で予測変数値と予め設定された値とを比較することを含み、ここで、臨床応答グループのいずれかへの分類が、個人を癌免疫療法に対する応答者として特定する結果となる。
される。
(NCI)と共に癌免疫療法学会(Society for Immunotherapy of Cancer)(SITC
)が主催した会議からまとめられた推奨事項を最近公開した。
本明細書で述べるいくつかの実施形態では、癌免疫療法の実施に対する対象(例:癌患者)の応答性を生体外で特定するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、応答する可能性のある個人から末梢全血を採取し、この全血を1つ以上の白血球活性化剤で刺激することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも2つの異なる白血球活性化剤が用いられる。いくつかの実施形態では、1つ以上の白血球機能関連mRNA(例:白血球機能のマーカー)をコードするmRNAにおける変化の検出が、その剤の投与に対する個人の潜在的応答性に関連付けられる。ある実施形態では、1つのマーカー(または1つのマーカークラス)の応答の変動では、正確に応答性を予測するのに不十分である。そのような実施形態では、応答性を特定するために、2、3、または4つ以上のマーカーが定量され、分析される。
により、全血製剤の使用が、誘導および測定反応の阻害または改変を起こし得る可能性がある。さらに、いくつかの実施形態で用いられる特定の刺激剤(例:白血球活性化剤)は、血漿タンパク質または血漿因子と相互作用を起こす場合があり、それによって活性の低下または減少が示され得る。しかし、本明細書で述べるいくつかの実施形態で示されるように用いられる場合、全血は、意外なことに、癌免疫療法に対する個人の今後の、または現在進行中の応答性の特定を可能とする、再現性、正確性、および生理学的妥当性を有する結果をもたらす。しかし、好ましい実施形態が全血を用いる一方で、他の実施形態では、血漿から分離された血液細胞、ならびに単離された白血球製剤を用いてもよい。ある実施形態では、全血は、ヘパリン処理されている。全血の使用により、手順が、簡便で(例:最小限の侵襲性)、再現性があり(一貫した実験条件および設備が用いられる)、生理学的であり、および標準化された方法への変換が容易であるものとなる。いくつかの実施形態では、採取された全血は、刺激プロトコルまで4℃にて保存される。
いくつかの実施形態では、採取された血液サンプルは、1、2、3、または4つ以上の白血球活性化剤と組み合わされる。いくつかの実施形態では、2つの反復実験サンプルが、コントロール剤(例:血液サンプル中にてほとんど、またはまったく応答を誘導しないもの)とも組み合わされる。特定の実施形態では、コントロール剤は、(1もしくは複数の)白血球活性化剤を含ませるのに用いられたものと同じ溶媒である。特定の実施形態では、コントロール剤は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)である。他の実施形態では、DMSOなど、その他の不活性コントロール剤が用いられてよい。
用いられる時間が掛かる複雑な培養工程が省略される。
いくつかの実施形態では、特定のマーカーが評価される。本明細書で用いられる場合、「マーカー」の用語は、分子生物学で用いられる通りのその通常の意味が与えられるものとし、また、機能の特定のタイプまたはクラスと、特に白血球機能と関連する(1もしくは複数の)mRNAも意味するものとする。例えば、特定のRNAは、化学遊走の機能と関連する可能性があり、一方、別のRNAは、抗原提示と関連する可能性がある。いくつかの実施形態では、マーカーは、その一般的に認められる機能に基づいて評価されるが、ある実施形態では、単一のマーカーが、2つ以上のクラスまたは機能を代表するものであり得る。特定の免疫機能と関連するマーカーの限定されない例を、表2に示す。他の実施形態では、免疫機能の同じ(または追加の)分類からの追加のマーカーが用いられる。
ータのみが既知である場合に、本明細書で開示される方法によるグループへの帰属(例:応答性)の予測が可能である。判別分析についての標準的な本技術分野で受け入れられている方法を用いて、各グループ(例:PD、SD、PR)、ならびに対象とするmRNAと刺激剤との各組み合わせに対するパラメータを発生させた。しかし、上記で考察したように、ある実施形態では、その他のタイプの多変量分析が用いられる(例:非判別分析(non-discriminant analysis))。これの限定されない例は、表3に示される(パラメー
タは表3Aに示される)。その後、対象とする各遺伝子および各刺激剤に対するこれらのパラメータならびに変化倍数データを用いて、グループへの帰属の予測を行うことができる。この計算の限定されない例を以下に示す:
予測変数値=グループ1に対するパラメータ定数+[パラメータ値(遺伝子Xおよび刺激剤A)]+[パラメータ値(遺伝子Xおよび刺激剤B)]+[パラメータ値(遺伝子Yおよび刺激剤A)]+[パラメータ値(遺伝子Yおよび刺激剤B)]+[...]
プの免疫療法にまで拡張される。その理由は、この評価が、各患者における複数の免疫機能の複数のマーカーの分析を用いているからであり、従って、これは、すべてのタイプの癌に対して適切である。
本明細書にて開示される方法および手順は、様々な用途に有用である。例えば、この方法は、癌免疫療法に対する個人の潜在的応答性を特定するための生体外での方法として用いることができる。提供される方法はまた、算出された癌免疫療法に対する応答の可能性に基づいて、医療専門家が対象に対して癌免疫療法を推奨することを可能とすることもできる。加えて、この方法は、対象に対して癌免疫療法レジメンを受けるようアドバイスするために用いることもできる。さらに、この方法は、癌患者を治療するために用いることもできる。代替の方法(機能性白血球アッセイ、サイトカインプロファイリング、タンパク質分析など)を、潜在的応答者の特定、データに裏付けされた臨床的推奨、および/または癌患者の治療を実施するための試みに用いることも可能であるが、本明細書で開示される方法は、潜在的免疫療法応答者の識別に、予想外の高い精度を提供するものである。従って、本明細書で開示される方法は、潜在的免疫療法応答者を識別することだけでなく、医療専門家が特定の治療法を推奨することを可能とすること、免疫療法の成功の可能性が高いということに関して癌患者にアドバイスすること、および/または癌患者の治療を進めることについても特に有利である。本明細書で開示される方法は、従って、個人に対して特定の治療法を提供する新たな機会を開くものであり、このことは、治療法の効力の改善、患者の治療成績の改善、および医療コストの低減を補助するものとなる。上記で挙げたものは限定されない例であることから、本明細書で開示される方法は、その他の用途にも用いることができる。
表1に示すように、様々なタイプの癌を有する26人の患者を募集した。これらの対象は、癌免疫療法のタイプとして、樹状細胞療法を受けた。しかし、上述のように、開示される方法は、その他のタイプの免疫療法にも適用可能である。
ワクチン治療(そのプロトコルは以下で述べる)の前に、末梢血液を採取し、3つの反復サンプルとして、フィトヘマグルチニン−L(PHA、一般的T細胞活性化剤)、熱凝集IgG(HAG、Fcγ受容体を活性化するための免疫複合体の古典的モデル)、ザイモサン(自然免疫活性化剤としてのToll様受容体(TLR)−2アゴニスト)、組換えヒトインターロイキン2(rIL2)、組換えヒトインターフェロンα2β(rIFN)、ヒトT細胞受容体のα/β鎖(抗原認識ユニット)に対するマウスモノクローナル抗体(aTCR、TCRアゴニスト)、ピシバニール(OK432、日本で臨床的に承認された免疫活性化剤)、およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)により37℃にて4時間刺激した。
(中外製薬株式会社、東京、日本)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州)を入れた8ウェルのストリップ3つ(合計24ウェル、全部で1.44mL)に直ちに適用した。37℃にて4時間インキュベートした後、分析までストリップを−80℃で凍結しておいた。
、ハーキュリーズ、カリフォルニア州)を用いたリアルタイムPCRに用いた。その他のmRNAについては、cDNAは、ヌクレアーゼフリー水で1:1に希釈し、2μLをPCRに用いた。プライマー配列は表2に示す。各遺伝子は、個別に増幅した。出発物質として3つの反復サンプルの全血アリコートを用いたため、各cDNAについて単一のPCR反応を行った。誤った増幅を最小限に抑える目的で、PCR条件を高いストリンジェンシーに最適化した:PRISM7900(アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州)により、95℃10分間を1サイクル、続いて1分間の95℃での変性、および1分間の65℃でのアニーリング/伸長を50サイクル。ある実施形態では、対象とするマーカーに応じて、その他の条件を用いてよい。プライマー配列は、同一のストリンジェンシーで設計し、従って、PCRプロトコルは、すべてのmRNAに適用可能なものであった。融解曲線分析を毎回行って、増幅が単一のピークから得られていることを確認した。サイクル閾値(Ct)は、分析ソフトウェア(SDS、アプライドバイオシステムズ)によって決定した。
mRNA分析とは独立してDCワクチン治療法を実施した。簡潔に述べると、末梢血単核白血球を白血球アフェレーシス(COM.TEC、フレセニウスヘモケア社、バートホンブルク、ドイツ)によって回収し(5000mLの血液体積から平均2.8×109細胞を回収)、AIM−V(ギブコ−BRL、グランドアイランド、ニューヨーク州)に懸濁し、5%CO2:95%空気のインキュベーター中、滅菌培養皿にて2時間インキュベートした。非接着細胞を吸引で除去し、接着細胞を、rGMCSF(最終50ng/mL)(ゲンタウア、神戸、日本)およびrIL4(50ng/mL)(R&Dシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州)を添加したAIM−Vに再懸濁した。確立された方法に従って、培養を6日間継続した。未熟DCを、各患者のHLA分類に応じてWT1ペプチド(HLA−A2402(CMTWNQMNL)もしくはHLA−A0201(CYTWNQMNL)(ネオンプス社、サンディエゴ、カリフォルニア州)、および/またはMUC−1ペプチド(TRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAP)(サーモフィッシャーサイエンティフィック、ブレーメン、ドイツ)を添加したrTNFα(50ng/mL)(セルジェニックステクノロジートランスファー社、フライブルグ、ドイツ)と共にさらに4日間インキュベートした。
個々のmRNAデータをPD、SD、およびPR(CRのケース1つを含む)の間で比較すると、ザイモサン誘導IFNG(図1C)およびIL10(図1D)は、SD(p=0.04)またはPDとSDを合わせたもの(p=0.02)よりも、PRにて有意に高かった。対照的に、PHA−(図1G)およびrIL2−誘導TNFSF2(=TNFα)(図1K)は、PRまたはSDとPRを合わせたものよりも、PDにて有意に高かった(PHAについてはp=0.006、rIL2についてはp=0.04)。SDにおけるPHA誘導IL10(図1H)は、それぞれPD(p=0.04)またはPR(p=0.
02)よりも有意に低かった。2つのコントロール遺伝子(ACTBおよびB2M)の増加倍数は、3つのグループ間で異なっていなかった(図1A、B、E、F、I、J)。その他のmRNAの誘導の評価は、3つのグループ間にて有意な相違を示さなかった(表4参照)。図1にてある程度の統計的有意差が見られはするが、PD、SD、およびPRの間にて数値が大きく重複していることから、この結果を診断に適用することは困難である。
CTLA4、FOXP3、PD−1、およびIL10は、免疫抑制のマーカーであり、これらを刺激後に分析した。図2に示すように、PHA誘導IL10は、26人の患者の中で、PHA誘導CTLA4(図2A)、PD−1(図2B)、およびFOXP3(図2C)の結果と相関していた。しかし、結果には個人間での比較的大きい変動が存在し、それによって、応答者の最終的な予測が困難となっている。さらに、血液サンプルの刺激は、白血球機能関連遺伝子のすべての組み合わせの間に相関を示すというものではない。例えば、PHA誘導IL10を、IFNG(図2D)、IL2(図2E)、およびTNFSF2(図2F)などのその他の免疫機能マーカーと比較すると、相関は識別されなかった。2つのmRNAのその他のすべての組み合わせについては、表5にまとめて示しており、これは、続いての多変量分析に用いた。この複雑性は、異なるマーカーの機能が様々であることに起因するものと考えられる(例:特定のマーカーは、特定の種類の刺激剤に対してより強く応答する可能性が高い)。
健康状態に、または疾患状態に対処する場合であっても、様々な免疫機能(上記で考察したものなど)が互いに相互作用を起こす。例えば、CTL活性が強く維持されたとしても、免疫抑制因子機能がこれらの殺傷機能を中和する(例:上回る)場合、癌を根絶することはできない。同様に、化学遊走活性が弱いためにCTLが癌病変部位に蓄積することができない場合も、癌が根絶される可能性は高くない。癌免疫療法に対する応答性をより高度に予測可能とするために、多変量分析を行うことによってこれらの複数の免疫機能を考慮に入れた。
剤の各Ct)として算出した。平均値を図1および表4に報告した。
。特筆すべきは、mRNAのこれらの組み合わせは、各々、異なる機能性マーカー群から得られたものであるということである。従って、いくつかの実施形態では、評価されるmRNAが多様となる程、より良好な予測精度が得られる。
上記で考察したように、癌免疫療法は高価であり、すべての癌患者に有効というわけではない場合がある。さらに、特定の免疫療法は、労力のかかる調製が必要であり、時間および追加のコストが加わることになる。従って、対象が治療法に応答する可能性が高いかどうかを特定することは、特に有利である。本明細書で開示される方法を用いて、追加の対象について試験を行い、その対象は、様々なタイプの癌による進行癌患者であった(21人の新たな対象、合計47人の患者)。臨床結果(PD、SD、およびPR)を、RECIST基準によって判定した。mRNA調製/cDNA合成の数は、1128(刺激8×3(3つの反復サンプル)×47(患者))であり、PCRの数は、18048(cDNA1128×mRNA16)であった。増加倍数(FI)は、PBSの値を用いて算出した。コントロール遺伝子ACTBおよびB2Mの増加倍数は、3つの臨床グループ間で相違しなかった。すべての対象は、少なくとも1つのmRNAの誘導を示し、このことは、アッセイ条件が妥当であり、血液サンプルが誘導する能力を有していたことを示す。PHA−誘導CTLA4、PDCD1、IL8、HAG−誘導IL8、CXCL3、ピシバニール−誘導IFNG、抗TCR−誘導IL8、およびrIFNγ2b−誘導IL10に関して、PD(n=21)およびPR(n=11)のグループ間にて有意差が検出された(p<0.05)。SDおよびPRグループを組み合わせた場合、PHA−およびHAG−誘導IL8のみが有意であった(それぞれ、p=0.03、0.04)。加えて、多変量判別分析を用いて、種々の予測式を導き出した。13のPHA−、5のZA−、3のHAG−、1のrIL2−、および2のTCR−誘導mRNAの増加倍数から得られた24のパラメータを用いた場合、PDおよびSD+PRの予測率は、26人の第一の患者群では、100%および96%であり、本実施例で報告する第二の患者群(n=21)では、100%および95%であった。この予想外に高度の予測は、本明細書で開示される方法に起因するものであり、これは、有利には、癌免疫療法に応答する可能性に関して癌患者をスクリーニングすることを可能とするものである。開示される方法では、臨床結果が各個人における種々の免疫機能間のバランスに依存するという事実を正確に反映する、多様なタイプの免疫機能の組み合わせの分析が可能である。従って、開示される方法および手順は、可能性のある癌免疫療法応答者の識別を可能とし、医療専門家がこの知識を身につけて癌免疫療法を推奨すること(該当する場合)を可能とし、および/または成功が予測
される免疫療法レジメンで癌患者を治療することを可能とするものである。
Claims (13)
- 医療専門家が対象に対して癌免疫療法を推奨することを可能とするための方法であって:
溶媒中にて前記対象から採取された第一の全血サンプルを第一の白血球活性化剤に暴露し、および前記溶媒中にて前記対象から採取された第二の全血サンプルを第二の白血球活性化剤に暴露することであって、前記暴露は、前記白血球活性化剤が3つ以上の白血球機能関連mRNAの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行われるものであり、ここで、前記第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連し;
前記対象から採取された第三の全血サンプルを前記第一または第二の白血球活性化剤を含まない前記溶媒に前記継続時間にわたって暴露すること;
前記第一、第二、および第三の全血サンプル中にて前記3つ以上の白血球機能関連mRNAをコードするmRNAの量を測定することによって、前記3つ以上の白血球機能関連mRNAの発現を定量すること;
癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの1つ以上における複数の患者を用いて前記第一または第二の白血球活性化剤に暴露した場合における前記3つ以上の白血球機能関連mRNAの量の変化倍数の各々を変数として多変量分析を行うことによってパラメータを予め設定すること;
前記臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出すること;ならびに、
前記予め設定した値を、前記予測変数値に対する比較参照値として用いて前記対象を前記臨床応答グループに分類し、前記医療専門家が前記対象のための癌免疫療法を推奨することを可能とすること、
を含む方法であって、
前記3つ以上の白血球機能関連mRNAが、以下のいずれかの組み合わせを含む、方法。
(1)インターフェロン−ガンマ、CXCLケモカイン−3、およびCTL−関連タンパク質4
(2)インターフェロン−ガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子スーパーファミリー−2
(3)インターフェロン−ガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびプログラム細胞死1
(4)腫瘍壊死因子スーパーファミリー−1、腫瘍壊死因子スーパーファミリー−2、およびCTL−関連タンパク質4 - 前記定量が、(i)RT−PCRを用いて前記3つ以上の白血球機能関連mRNAを増幅すること、又は、(ii)ノーザンブロットを用いて前記白血球機能関連mRNAの誘導を測定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記定量が、前記3つ以上の白血球機能関連mRNAの増幅用に特に設計されたプライマーによるリアルタイムRT−PCRを用いて、前記3つ以上の白血球機能関連mRNAを増幅することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記3つ以上の白血球機能関連mRNAが、異なる機能性免疫分類に関連する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌免疫療法が、樹状細胞ワクチンを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記全血サンプルが、抗凝固剤で処理される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗凝固剤が、ヘパリンを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記暴露が、(i)30℃から42℃の温度、又は、(ii)37℃の温度で実施される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記継続時間が、6時間未満である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記継続時間が、1から4時間である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である前記グループが、病勢安定、部分寛解、全生存、および無退縮(regression-free)生存から成る群より選択される、請求項1〜1
0のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第一及び第二の白血球活性化剤が、
(i)フィトヘマグルチニン、熱凝集IgG、ザイモサン、インターロイキン2、インターフェロンアルファ−2−ベータ、ヒトT細胞受容体のアルファ/ベータ鎖に対するモノクローナル抗体、およびピシバニールから成る群より選択される、
(ii)インターフェロンアルファ−2−ベータ、熱凝集IgG、ザイモサン、およびヒトT細胞受容体のアルファ/ベータ鎖に対するモノクローナル抗体の1つ以上と組み合わされたフィトヘマグルチニンである、又は、
(iii)インターフェロンアルファ−2−ベータ、熱凝集IgG、ザイモサン、フィトヘマグルチニン、およびヒトT細胞受容体のアルファ/ベータ鎖に対するモノクローナル抗体の1つ以上と組み合わされたインターロイキン−2である請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。 - 前記多変量分析が、多変量判別分析を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
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