MX2015002915A

MX2015002915A - Metodos para estimacion de la inmunidad especifica de peptido.

Info

Publication number: MX2015002915A
Application number: MX2015002915A
Authority: MX
Inventors: Masato Mitsuhashi
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Priority date: 2012-09-06
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2015-07-06
Also published as: TW201415030A; EP2893044A4; CA2883810C; CA2883810A1; EP2893044A1; US20150218638A1; JP2015529081A; JP6059350B2; TWI628437B; JP2017051199A; JP6313409B2; WO2014039231A1

Abstract

Las modalidades de la invención se relacionan generalmente a métodos para estimar la respuesta inmune relacionada con un antígeno o antígenos específicos. En varias modalidades, los métodos descritos en la presente se utilizan para habilitar una recomendación para un tipo particular de terapia contra un antígeno particular, tal como un agente infeccioso extraño o célula de cáncer. En varias modalidades, los métodos escritos en la presente permiten la inspección en curso de la función inmune de un sujeto.

Description

MÉTODOS PARA ESTIMACIÓN DE LA INMUNIDAD ESPECÍFICA DE PÉPTIDO CAMPO DE LA INVENCIÓN Varias modalidades de la presente descripción se relacionan a métodos para estimación de la función inmune de célula T de un sujeto. Más específicamente, varias modalidades de la presente descripción se relacionan a la estimación ex vivo de la inmunidad de célula T específica de péptido de un sujeto y/o la inspección de la terapia de vacuna de péptido que es administrada al sujeto.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA El sistema inmune comprende un conjunto de proteínas diversas, células, tejidos y procesos relacionados que sirven para proteger a un hospedero de las enfermedades y/o infecciones al identificar y eliminar o de otra manera inhibir los patógenos. Para realizar esto, una función clave del sistema inmune es distinguir las células extrañas o patógenos de las células endógenas, por ejemplo, distinguir entre "si mismo" y "no por si mismo". Además, ciertas células del sistema inmune funcionan para identificar a un patógeno al cual el hospedero se expuso previamente, para de esta manera mejorar el tiempo de respuesta del sistema inmune y el efecto para el hospedero.

BREVE DESCRIPCIÓN Mientras que la inmunidad humoral se puede estimar al medir los títulos de IgG en muestras de suero de un paciente, hasta los métodos descritos en la presente, la inmunidad celular no ha tenido contraparte de diagnóstico directa. Entre los muchos beneficios descritos en la presente, un diagnóstico ex vivo para la inmunidad celular dirigido contra un antigeno particular permite la estimación de la inmunidad especifica del antigeno de un sujeto, para de esta manera permitir una decisión adaptada e informada específicamente para ser hecha para la salud total del sujeto (por ejemplo, si se trata o no se trata, o qué tratamiento es probable de seguir).

Por lo tanto se proporcionan métodos en la presente para la identificación de un sujeto que tiene inmunidad celular contra un antígeno específico, que comprende obtener una primera muestra de sangre y una segunda muestra de sangre de un sujeto, exponer la primera muestra de sangre a un péptido derivado del antígeno especifico y exponer la segunda muestra de sangre al solvente solo, cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre entera y al identificar el sujeto como que tiene inmunidad celular contra el antígeno específico cuando la expresión del uno o más marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra; o al identificar al sujeto como que no tiene inmunidad celular contra el antígeno específico cuando la expresión del uno o más marcadores asociados con la función de célula T es sustancialmente similar en la misma muestra cómo es comparado con la segunda muestra.

En varias modalidades, las muestras de sangre son muestras de sangre entera. En varias modalidades el péptido derivado del antigeno específico de interés se disuelve en un solvente, caso en el cual la segunda muestra de sangre se expone (bajo condiciones idénticas) al solvente sin el péptido.

En varias modalidades, la cuantificación se realiza mediante un método que comprende adicionar un cebador y una transcriptasa inversa al RNA aislado de cada de la primera muestra de sangre y la segunda muestra de sangre para generar DNA complementario (cDNA), y poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T de una DNA polimerasa para generar DNA amplificado. En varias modalidades, los marcadores asociados con la función de célula T comprenden uno o más de CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDL1 y granzima B. Adicionalmente, los marcadores pueden incluir uno o más de GMCSF, interferona gamma, TNFSF2, CXCL10, CCL4, IL2, IL4, IL10, CTLA4, CCL2 y CXCL3.

En varias modalidades, el método además comprende tratar al sujeto de acuerdo con la inmunidad celular que tiene el sujeto a un antígeno particular (o no).

También se proporciona en la presente un método para caracterizar la función de célula T especifica de péptido de un sujeto, que comprende obtener una primera muestra de sangre entera y una segunda muestra de sangre entera de un sujeto, exponer la primera muestra de sangre entera a un solvente que comprende un péptido derivado de un antigeno, exponer la segunda muestra de sangre entera al solvente único, y cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la asociado de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre, en donde un nivel más grande de expresión en uno o más de los marcadores asociados con la función de célula T en la primera muestra de sangre entera se compara con la segunda muestra de sangre entera que indica que el sujeto tiene inmunidad celular al antigeno, y en donde un nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera muestra de sangre entera que no es significativamente diferente del nivel de expresión como es comparado con la segunda muestra de sangre entera indica que el sujeto carece de inmunidad celular al antigeno.

En varias modalidades, la cuantificación se realiza mediante un método que comprende adicionar un cebador y una transcriptasa inversa al RNA aislado de cada una de la primera muestra de sangre entera y la segunda muestra de sangre entera para generar DNA complementario (cDNA) y poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionado del grupo que consiste de CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDL1, y granzima B y una DNA polimerasa para generar DNA amplificado. Adicionalmente, el método opcionalmente además comprende poner en contacto el cDNA con una DNA polimerasa y los cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de la célula T seleccionados del grupo que consiste de GMCSF, interferona gamma, TNFSF2, CXCL10, CCL4, IL2, IL4, IL10, CCL2 y CXCL3.

En varias modalidades, el método además comprende tratar al sujeto en base a la caracterización de la función de la célula T especifica del péptido del sujeto.

También se proporcionan métodos para determinar la probabilidad de la eficacia de una terapia especifica de péptido que comprende obtener una primera y una segunda muestra de sangre de un sujeto, exponer la primera muestra de sangre a un solvente que comprende un antigeno de péptido contra el cual va a ser dirigida a la terapia especifica de péptido, exponer la segunda muestra de sangre al solvente único, cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T asociados con ya sea (i) células T citotóxicas o función de célula T citotóxica o (ii) T-reg y/o MDSC o T-reg y/o marcadores de función MDSC en la primera y la segunda muestras de sangre mediante un método que comprende (i) adicionar un cebador y una transcriptasa inversa al RNA aislado de cada una de la primera muestra de sangre entera y la segunda muestra de sangre entera para generar DNA complementario (cDNA) y poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antisentido gue son específicos para uno o más marcadores asociado con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste de CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDLl y granzima B y una DNA polimerasa para generar DNA amplificado; e identificar una probabilidad de incrementar eficacia de la terapia específica de péptido cuando los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se incrementan en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra; o identificar una probabilidad disminuida de eficacia de la terapia específica de péptido cuando (a) los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con T-reg y/o MDSC o T-reg y/o una función de MDSC y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra o (b) los marcadores asociados con la función de la célula T se asocian con células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T es sustancialmente similar en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra.

Adicionalmente se proporciona un método para inspeccionar la eficacia en curso de una vacuna, que comprende obtener una primera y una segunda muestra de sangre de un sujeto antes de que el sujeto sea expuesto a un antigeno de interés, exponer la primera muestra de sangre a un solvente que comprende un péptido derivado de antigeno de interés, exponer la segunda muestra de sangre al solvente único, cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre mediante un método que comprende: (i) adicionar un cebador y una transcriptasa inversa de RNA aislado de cada una de la primera muestra de sangre entera y la segunda muestra de sangre entera para generar DNA complementario (cDNA) y (ii) poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste de CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDL1, y granzima B y una DNA polimerasa para generar DNA amplificado, obtener una tercera y una cuarta muestra de sangre en el sujeto después de una vacuna dirigida contra el antígeno de interés que se ha administrado al sujeto, exponer la tercera muestra de sangre al solvente que comprende el péptido derivado de antígeno de interés, exponer la cuarta muestra de sangre al solvente único, cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la tercera y cuarta muestras de sangre mediante un método que comprende: (i) adicionar un cebador y una transcriptasa inversa al RNA aislado de cada una de la primera muestra de sangre entera y la segunda muestra de sangre entera para generar DNA complementario (cDNA) y (ii) poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste de CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDL1, y granzima B y una poli erasa para generar DNA amplificado, opcionalmente normalizar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T y la tercera y la cuarta muestras de sangre en base al nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre; e identificar una eficacia mantenida o incrementar la vacuna cuando la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la tercera muestra cómo se compara con la primera muestra; o identificar una eficacia disminuida de la vacuna cuando la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se reduce en la tercera muestra cómo se compara con la primera muestra.

También se proporcionan métodos para identificar un biomarcador de inmunidad celular, que comprende exponer una primera porción de una muestra de sangre a un solvente que comprende un péptido derivado de antígenos conocidos, exponer una segunda porción de la muestra de sangre al solvente único, cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda porciones por un método que comprende (i) adicionar un cebador y una transcriptasa inversa al RNA aislado de cada una de la primera muestra de sangre entera y la segunda muestra de sangre entera para generar DNA complementario (cDNA) y (ii) poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste de CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDL1 y granzima B y una DNA polimerasa para generar DNA amplificado; e identificar de un biomarcador de inmunidad celular cuando la expresión de un marcador asociado con la función de célula T se incrementa en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra, o cuando la expresión de un marcador asociado con la función de la célula T se disminuye en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra.

Adicionalmente, se proporciona en la presente un método para determinar la probabilidad de la eficacia de una terapia específica de péptido que comprende, obtener una primera y una segunda muestra de sangre de un sujeto, exponer la primera muestra de sangre a un solvente que comprende un antígeno de péptido contra el cual se va a dirigir la terapia específica de péptido, exponer la segunda muestra de sangre al solvente único, cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre, en donde el uno o más marcadores asociados con la función de célula T se asocian con ya sea (i) células T citotóxicas o función de célula T citotóxica o (ii) T-reg y/o MDSC o T-reg y/o función de MDSC; identificar una probabilidad incrementada de eficacia de la terapia especifica de péptido cuando los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la primera muestra, como se compara con la segunda muestra; o identificar una probabilidad disminuida de eficacia de la terapia especifica de péptido cuando (a) los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con T-reg y/o MDSC o T-reg y/o función de MDSC y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra, o (b) los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T es sustancialmente similar en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra. En algunas modalidades, se observa una probabilidad de incrementada de eficacia cuando ciertos marcadores asociados con la función de célula T se disminuyen en expresión. Por ejemplo, en varias modalidades una probabilidad incrementada de eficacia de una terapia especifica de péptido se identifica cuando los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con células T citotóxicas o función de célula T citotóxica y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se disminuye en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra. De manera similar, una probabilidad disminuida de eficacia se puede identificar, en ciertas modalidades, cuando los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con T-reg y/o MDSC o T-reg y/o función de MDSC y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se disminuye en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra, o los marcadores asociados con la función de la célula T se asocian con células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T es sustancialmente similar en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra.

Como se utiliza en la presente, el término "incrementado" será dado en su significado ordinario y también se referirá a incrementos en la expresión de mayor que aproximadamente 5%, mayor que aproximadamente 10%, mayor que aproximadamente 15%, mayor que aproximadamente 20%, mayor que aproximadamente 25%, mayor que aproximadamente 50%, o más. Del mismo modo, como se utiliza en la presente, el término "disminuido" será dado en su significado ordinario y también se referirá a disminuciones en la expresión de mayor que aproximadamente 5%, mayor que aproximadamente 10%, mayor que aproximadamente 15%, mayor que aproximadamente 20%, mayor que aproximadamente 25%, mayor que aproximadamente 50%, o más. En algunas modalidades, un incremento se refiere a un incremento estadísticamente significativo en la expresión (por ejemplo, p<0.05 en base a un análisis estadístico establecidos en la téenica). En algunas modalidades, una disminución se refiere a una disminución estadísticamente significativa en la expresión (por ejemplo, p<0.05 en base al análisis estadístico establecidos en la técnica).

También se proporciona, en varias modalidades, un método para identificar una terapia específica de péptido efectiva para tratar un trastorno autoinmune que comprende obtener una muestra de sangre del sujeto en riesgo por, o que sufre de un trastorno autoinmune, exponer una primera porción de la muestra de sangre a un solvente que comprende un péptido específico asociado con la terapia específica de péptido, exponer una segunda porción de la muestra de sangre al solvente único, cuantificar el nivel de expresión de uno o más mRNA asociados con la función inmune auto-limitante en la primera y la segunda porción de la muestra de sangre, y determinar que la terapia específica de péptido es probable que sea eficaz cuando hay un nivel más grande de expresión en la primera porción de la muestra de sangre como se compara con la segunda porción de la muestra de sangre.

Se proporciona en varias modalidades, un método para inspeccionar la eficacia en curso de una vacuna, que comprende, obtener una primera y una segunda muestra de sangre de un sujeto antes de que el sujeto se exponga a un antigeno de interés, exponer la primera muestra de sangre a un solvente que comprende un péptido derivado del antigeno de interés, exponer la segunda muestra al solvente único, cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre, administrar al sujeto una vacuna dirigida contra el antigeno de interés, obtener una tercera y una cuarta muestra de sangre del sujeto después de la administración, exponer la tercera muestra de sangre al solvente que comprende el péptido derivado del antigeno de interés, exponer la cuarta muestra de sangre al solvente único, cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la tercera y la cuarta muestras de sangre, tal como al utilizar un método seleccionado del grupo que consiste de reacción en cadena de polimerasa en transcripción inversa (RT-PCR), RT-PCR en tiempo real, manchado de northern, análisis génico de microarreglo, PCR digital, secuenciación de RNA, hibridación de nanoplex, clasificación de célula activada con fluorescencia, ELISA, espectrometría de masas, y manchado de western, normalizar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la tercera y la cuarta muestras de sangre en base al nivel de expresión de uno o más marcadores asociado con la función de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre, e identificar una eficacia mantenida o incrementada de la vacuna cuando la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la tercera muestra cómo se compara con la primera muestra, o identificar una eficacia disminuida de la vacuna cuando la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se reduce en la tercera muestra cómo se compara con el primera muestra.

En modalidades adicionales, se proporciona un método para identificar a un sujeto que tiene inmunidad celular contra un antigeno especifico, que comprende, obtener una primera y una segunda muestra de sangre de un sujeto, exponer la primera muestra de sangre a un solvente que comprende un péptido derivado del antigeno especifico, exponer la segunda muestra de sangre al solvente único, cuantificar el nivel de expresión de uno más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre, e identificar al sujeto como que tiene inmunidad celular contra el antigeno especifico cuando la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la primera muestra cómo es comparado con la segunda muestra, o identificar al sujeto como que no tiene inmunidad celular contra el antigeno especifico cuando la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T es sustancialmente similar en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra.

Por otra parte, se proporciona un método para caracterizar la función de células T especificas de péptido de un sujeto, que comprende, obtener una primera y una segunda muestra de sangre de un sujeto, exponer la primera muestra de sangre a un solvente que comprende un péptido derivado de un antigeno, exponer la segunda muestra de sangre al solvente único, cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre, en donde un nivel más grande de expresión del uno o más marcadores asociados con la función de célula T en primera muestra cómo se compara con la segunda muestra indica que el sujeto tiene inmunidad celular al antigeno, y en donde un nivel de expresión del uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera muestra que no es significativamente diferente del nivel de expresión como es comparado con la segunda muestra indica que el sujeto carece de inmunidad celular al antigeno.

En varias modalidades, los métodos proporcionados en la presente permiten la identificación de un biomarcador de inmunidad celular, los métodos que comprenden, exponer una primera porción de una muestra de sangre a un solvente que comprende un péptido derivado de antigenos conocidos, exponer una segunda porción de la muestra de sangre al solvente único, cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda porciones, e identificar un biomarcador de inmunidad celular cuando la expresión de un marcador asociado con la función de célula T se incrementa en la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra.

En varias modalidades, la cuantificación se logra utilizando métodos tales como la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), RT-PCR en tiempo real, manchado de northern, análisis génico de microarreglo, PCR digital, secuenciación de RNA, hibridación de nanoplex, clasificación de célula activada con fluorescencia, ELISA, espectrometría de masas y manchado de western. Otros métodos, tales como téenicas de formación de imagen cuantitativa, métodos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitación y los similares también se pueden utilizar para cuantificar los marcadores de función de célula T, dependiendo de la modalidad.

En varias modalidades, la función de célula T específica de péptido se relaciona con la actividad de célula T dirigida contra una o más de una condición cancerosa, una condición autoinmune, una infección viral, una infección bacteriana, una infección fúngica, una infección de levadura, infección debido a priones, e infecciones debido a parásitos. En algunas modalidades, el uno o más marcadores asociados con la función de célula T se selecciona del grupo que consiste de GMCSF, interferona gamma, TNFSF2, CXCL10, CCL4, IL2, IL4, IL10, CTLA4, CCL2, CXCL3, CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17 y arginasa. Otros marcadores que están asociados con las funciones inmunes accesorias también se cuantifican, ya sea en además de o en lugar de los marcadores de la función de célula T, dependiendo de la modalidad. Además, la evaluación de varias rutas asociadas con la función inmune también se puede evaluar opcionalmente de acuerdo con los métodos descritos en la presente (por ejemplo, una ruta especifica se puede evaluar, por completo o en parte) antes que un solo marcador o panel de marcadores.

En varias modalidades, las muestras de sangre entera están sin tratar antes de la exposición al solvente, aunque en varias modalidades, las muestras de sangre entera se tratan con un anticoagulante. En varias modalidades, el anticoagulante comprende heparina. Otros anticoagulantes (por ejemplo, citrato) también se pueden utilizar, dependiendo de la modalidad.

En varias modalidades, las muestras se exponen a los péptidos a una temperatura que se aproxima a una temperatura fisiológica. Por ejemplo, en varias modalidades, la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 42°C. En varias modalidades, la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 37°C. La duración de exposición puede variar, dependiendo de la modalidad (por ejemplo, en base a la antigenicidad relativa de péptido). En varias modalidades, la exposición se realiza por una cantidad de tiempo de menor que aproximadamente 8 horas. En varias modalidades,' la cantidad de tiempo es de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas. Duraciones más largas o más cortas se pueden utilizar en otras modalidades.

Además de permitir la determinación de la eficacia potencial de una terapia de péptido, la identificación de una terapia especifica de péptido para tratar trastornos autoinmunes, verificar la eficacia en curso de una vacuna, identificar un sujeto que tiene inmunidad celular contra un antigeno especifico, caracterizar la función de célula T especifica de péptido de un sujeto y/o identificar un biomarcador de inmunidad celular, los métodos descritos en la presente también, dependiendo de la modalidad, permiten uno o más de lo siguiente: habilitar a un profesional médico para recomendar una terapia basada en péptido o no basada en péptido, habilitar recomendaciones que sean hechas a los profesionales médicos en si una terapia de péptido seria apropiada para un paciente especifico, habilitar el consejo de una terapia basada en péptido especifica que sea realizada por un sujeto en necesidad de una terapia, y métodos para tratar un sujeto en base a la función inmune de célula T del sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A - 1L representan la inducción de varios mRNAs inmuno relacionados en respuesta a la estimulación por un agente de control o por una acumulación de péptidos virales.

Las Figuras 2A - 21 representan la cinética de inducción de mRNA mediante una acumulación de péptidos virales en comparación a fitohemaglutinina (PHA).

DESCRIPCIÓN DETALLADA Las alteraciones en la función inmune, ya sea si se reduce o se incrementa la función, son una fuente de una variedad de problemas de salud potenciales. Por ejemplo, la función inmune supra-activa, en algunos casos, puede conducir a enfermedades autoinmunes. En otros casos, la función inmune disminuida puede dar por resultado una propensión para desarrollar infecciones, que están incrementadamente en riesgo para ciertas enfermedades, y/o el desarrollo de cáncer de varios tipos. Como tal, sabiendo el estado inmune actual de un sujeto podría ser una pieza muy importante de información con el fin de mantener la salud de un sujeto o tratar a un sujeto para un malestar particular.

Función Inmune - General y Específica de Péptido Una variedad de tipos de células, proteínas y rutas que son funcionalmente interrelacionadas constituyen el sistema inmune. La función del sistema inmune es proteger a un hospedero de la enfermedad al identificar y luego eliminar patógenos y/o células indeseadas (por ejemplo, células dañadas o células de tumor). Como muchos de los patógenos y células indeseadas gue causan infecciones o enfermedades son extrañas a un hospedero (o células endógenas que han perdido algún aspecto "autónomo" y ganado algún aspecto "no autónomo") una primera etapa en la cascada inmune es frecuentemente identificar células particulares como "no autónomas". Las células endógenas se reconocen por la expresión del Complejo de Histocompatibilidad Mayor de Clase I (MHC). Esas células sin MHC Clase I o con niveles reducidos de expresión se pueden dirigir por el sistema inmune como células "autónomas" o "no autónomas", dañadas. Los patógenos extraños se procesan por el sistema inmune y los antigenos derivados de las células extrañas se forman en complejo con MHC, para de esta manera permitir que otras células en el sistema inmune posteriormente reconozcan y las células objetivo que llevan tales antigenos extraños.

Mientras que el sistema inmune está comprendido de muchos tipos de células diferentes, los glóbulos blancos (WBCs; leucocitos) son una de las células inmunes de clases funcionales claves. Los linfocitos son un subtipo de WBC que además se dividen en células exterminadores naturales (NK), células T y células B. Las células exterminadoras naturales (NK) son linfocitos citotóxicos especializados que se dirigen y destruyen, entre otros, las células de tumor, células viralmente infectadas o células "auto" dañadas. Las células T están involucradas en la inmunidad mediada por células (discutidas más enseguida) mientras que las células B son principalmente responsables para la inmunidad humoral (relacionada con anticuerpos). Las células T son distinguibles de otros tipos de linfocito por la presencia del receptor de célula T en la superficie celular. Las células T son capaces de inducir la muerte de células somáticas infectadas o de tumor. Las citoquinas (por ejemplo, aquellas liberadas debido a la inflamación o infección) o presentación de células NK activas de antigenos extraños y células T citotóxicas, que luego liberan gránulos pequeños que contienen varias proteínas y proteasas. Una de tal proteína liberada, perforina, induce la formación de poro en la membrana de una célula dirigida, permitiendo que las proteasas, tales como granzimas, entren a la célula dirigida e induzca la muerte celular programada (apoptosis). De esta manera, las células T, entre otros tipos de células inmunes, desempeñan una función importante en la función inmune en curso y la salud total de un sujeto.

Como se mencionó en lo anterior, las células T expresan receptores de célula T en su superficie, que funcionan para reconocer moléculas MHC automáticas específicas expresadas en la superficie de las células vecinas. Las Células que Presentan Antígeno (APC) trabajan en conjunción con MHC y células T para combatir infecciones o cuerpos extraños. Las APCs procesan los antigenos extraños (por ejemplo, por fagocitosis y digestión subsecuente) y presentan fragmentos de péptidos de los antigenos extraños en un complejo con las moléculas MHC en la superficie de las células propias del sujeto. Los complejos de péptido-MHC sobre APCs luego interactúan con el receptor de célula T en ciertas células T (por ejemplo, células T positivas de CD4), que es la primera etapa en el establecimiento en la inmunidad especifica de péptido. La fracción de células T que interaccionan con el APC luego producir clones específicos que comprenden acumulaciones de células T efectoras y células T de memoria.

Las células T efectoras (tales como células T CD8+) se autoajustan para y reconocer específicamente el antígeno extraño particular que se procesa mediante la APC. Ellas funcionan en el plazo corto a mediano para atacar células que expresan el antígeno extraño, tales como cánceres, células infectadas y los similares. Esto se conoce como la respuesta inmune mediada por la célula primaria.

Las células T de memoria desempeñan una función más prominente en la respuesta inmune mediada por célula secundaria. Las células de memoria representan un "acumulación" de células que se ceban para reconocer el antígeno extraño particular que se presentó inicialmente a las células T en la forma del complejo de péptido-MHC. En una exposición subsecuente al antigeno extraño, las células T de memoria pueden generar rápidamente células T efectoras adicionales para combatir las células que expresan el antigeno extraño.

Como un resultado de las cascadas de eventos resumidos en lo anterior, un sujeto genera una primera respuesta más lenta a un antigeno (respuesta inmune mediada por célula primaria) y simultáneamente ceba su sistema inmune para ser preparado para montar un ataque más rápido en una exposición subsecuente (respuesta inmune mediada de célula secundaria).

Categorías de la Función Inmune Generalmente hablando, las cascadas inmunes descritas en lo anterior se pueden caracterizar por los diversos tipos de función inmune involucrados. Las categorías principales de actividad inmune tienen conjuntamente de manera funcional para asegurar que el sistema inmune pueda dirigir de manera efectiva las células inmunes a un área del cuerpo cuando son necesarias, y una vez ahí, actúan para inhibir y/o exterminar las células extrañas o de otra manera ayudar en el montaje de una respuesta inmune. Estas categorías incluyen, pero no están limitadas, a la función de reclutamiento, función exterminadora, función supresora (del exterminador) y función ayudante. Una variedad de otras funciones, por ejemplo, presentación de antígeno, regulación de angiogénesis, modulación del dolor, etc. también son incluidas.

Una etapa de umbral en la iniciación de la función de inmune efectiva es el suministro de células inmunes de regiones de almacenamiento al sitio de una célula foránea o antigeno. Esta función de reclutamiento es esencial para la función apropiada del sistema inmune. Las regiones de las cuales se movilizan las células inmunes incluyen, pero no están limitadas a, sangre entera, médula ósea, el sistema linfático y otras áreas. El reclutamiento de células inmunes permite reconocimiento de antigenos extraños en la ubicación del antigeno extraño (por ejemplo, un tumor o infección). El reclutamiento frecuentemente inicia mediante la liberación de quimioquinas de las células extrañas o aún de células endógenas que están en la región de la célula extraña. La función de reclutamiento que es comprometido de mal funcionamiento significa que las células inmunes no se pueden instruir apropiadamente para ir adicionalmente en función. Se proporciona la función reclutadora, en algunas modalidades, mediante las quimioquinas u otras moléculas quimiotácticas. En algunas modalidades, las quimioquinas de una función de motivo particular reclutan otras moléculas inmunes. Por ejemplo, en varias modalidades, las moléculas CCL tales como CCL-2, CCL-4, CCL-8 o CCL-20 están involucradas en el reclutamiento de otras células inmunes. En otras modalidades, las moléculas CXCL, tales como CXCL-3 o CXCL-10 están involucradas. En algunas modalidades, otros efectores de quimioquina, ya sea el motivo C-C o C-X-C u otra variedad, están involucrados.

Después de haber sido reclutadas a la ubicación apropiada, los otros tipos de células inmunes pueden realizar su función designada, que en algunas modalidades, es para exterminar la célula(s) objetivo. En algunas modalidades, la muerte de las células objetivo ocurre por la via de apoptosis. Por ejemplo, cuando el objetivo es un tumor, una o más células que tienen función exterminadora se reclutan al sitio objetivo. En algunas modalidades, tales células exterminadoras expresan una o más moléculas tales como granzima B, perforina, TNFSF1 (linfotoxina), TNFSF2 (TNF-alfa), TNFSF 5 (ligando CD40), TNFSF6 (ligando Fas), TNFSF14 (LUZ), TNFSF 15 (TLlA) y/o CD16. Como tal, el reclutamiento de estas células al sitio objetivo inicia una cascada que da por resultado la destrucción de las células objetivo, y de esta manera realiza un propósito del sistema inmune, por ejemplo, destrucción y/o remoción de un cuerpo extraño o célula.

Otra función del sistema inmune, es proporcionar una influencia negativa (por ejemplo, un limite) en la función de exterminación del sistema inmune. Esto es, por lo menos en parte, para prevenir la función inmune supra activa, que podría conducir a trastornos inmunes. Las células que participan en esta función limitante se pueden reconocer por marcadores que incluyen, pero no limitado a, IL10, TGF-beta, (forkhead box p3) FoxP3, CD25, arginasa, CTLA-4, y/o PD-1. Estas células ayudan a asegurar la función inmune en total apropiada al mantener la actividad del sistema inmune balanceado.

Los tipos de células adicionales se pueden involucrar, a grados variantes, en la función de exterminación del sistema inmune y/o la función auto-limitante del sistema inmune. Las células T ayudante (células Th) son un subgrupo de linfocitos que ayudan a maximizar las capacidades del sistema inmune. Distinto a las células descritas en lo anterior, las células Th carecen de actividad citotóxica o fagocitica. Las células Th, sin embargo, se involucran en activar y dirigir otras células inmunes tales como células T citotóxicas (por ejemplo, las células exterminadoras descritas en lo anterior). Las células Th se dividen en dos subcategorias principales (Thl o Th2) que dependen, entre otros factores, que tipo de célula principalmente activa, que citoquinas producen, y qué tipo de estimulación inmune se promueven. Por ejemplo, las células Thl principalmente se asocian con macrófagos, mientras que las células Th2 principalmente se asocian con células B. Las células Thl producen interferona-gamma, TNF-beta y IL-2, mientras que las células Th2 producen IL1, IL5, IL6, IL10 y IL13. Los marcadores de los subconjuntos de células Th son conocidos y se pueden utilizar para identificar la inducción de ciertos subtipos de célula Th en respuesta a la estimulación. Por ejemplo, la inducción de IL2 o IFNG representa respuestas a la estimulación por las células Thl, mientras que la inducción de IL4 o IL10 representa respuestas a la estimulación por células Th2. Otros subtipos, tal como Thl7 son representados por otros marcadores, tal como IL17 (ver, por ejemplo, las Tablas 5 y 6).

Una variedad de otros marcadores de funciones inmunes accesorias también existen. Por ejemplo, la función de presentación de antigenos se puede evaluar mediante la medición de GMCSF, la proliferación de célula B se puede evaluar mediante la medición de IGH2, la angiogénesis se puede evaluar mediante la medición de VEGF (que puede ser de importancia particular con respecto a la posible formación de tumor, ya que muchos tumores tienen demandas de flujo de sangre incrementado), el dolor se puede evaluar mediante la medición de POMC.

La función de exterminación del sistema inmune tal como la función de células NK y células T citotóxicas es importante, en varias modalidades, para la destrucción de células cancerosas y el combate de infecciones y/o inflamación (entre otras aplicaciones). Debido a su habilidad para exterminar potencialmente tantas células objetivo no deseadas, asi como células endógenas normales, las células NK poseen dos tipos de receptores de superficie, receptores de activación y receptores inhibidores. Conjuntamente, estos receptores sirven para balancear la actividad de, y por lo tanto regular, la actividad citotóxica de las células NK. Las señales de activación se requieren para la activación de células NK, y pueden involucrar citoquinas (tales como interferonas), activación de receptores FcR a células objetivo contra los cuales se han montado respuestas inmunes humorales, y/o el enlace de ligando extraño a varios receptores de superficie de célula NK de activación. Las células dirigidas luego se destruyen mediante el mecanismo apoptótico descrito en lo anterior.

De manera similar, las células T citotóxicas también requieren activación, aunque va a ser a través de un proceso de dos señales que da por resultado la presentación de un antigeno extraño (por ejemplo, no automático) a las células T citotóxicas. Una vez activadas, las células T citotóxicas se someten a expansión clonal, grandemente en respuesta de la interleucina-2 (IL-2), un factor de crecimiento y diferenciación para células T. Las células T citotóxicas funcionan un poco de manera similar a las células NK en la inducción de formación de poro y apoptosis en células objetivo. En varias modalidades, la identificación de la función de célula T especifica de un sujeto es importante para determinar la habilidad del sujeto para montar una respuesta a un antigeno extraño particular. Además, en varias modalidades, la función de las células T determina, por lo menos en parte, la velocidad de respuesta de la función inmune del sujeto.

La naturaleza auto-limitante de la función inmune se cree que es moderada por T-reg y MDSCs. El desarrollo en el timo, muchos T-reg expresan la familia de horquilla del factor de transcripción FoxP3 (forkhead box p3). En muchos estados de la enfermedad, particularmente cánceres, alteraciones en números T-reg, particularmente aquellos T-reg que expresan Foxp3, son encontrados. Por ejemplo, los pacientes con tumores tienen un exceso relativamente local de células T positivas de Foxp3 que inhibe la habilidad del cuerpo para suprimir la formación de células cancerosas. Las MDSCs no destruyen las células T ofensivas, sin embargo, no alteran como las células T citotóxicas se comportan. Las MDSCs secretan arginasa (ARG) una proteasa que descompone el aminoácido arginina. Los linfocitos, incluyendo células T citotóxicas y células NK son dependientes indirectamente en la arginina para la activación. La secreción de ARG por MDSCs limita la activación de las células NK y las células T citotóxicas. De esta manera, en varias modalidades, la inmunidad especifica de péptido se puede impactar por la limitación de activación de las células T. En algunos casos, la regulación auto-limitante mediante T-reg y MDSCs puede conducir a una limitación total de la funcionalidad del sistema inmune en un ambiente de tejido local. Esto tiene el potencial para conducir a la función de exterminación reducida y que puede ser insuficiente para completamente radicar las células extrañas.

Como se discutió en más detalle enseguida, la evaluación de la inmunidad especifica de péptido permite la estimación de la eficacia de una vacuna, la probabilidad de que un sujeto montará (o no montará) una respuesta inmune contra un cierto antigeno, y el rastreo de la función inmune relacionada con un antigeno especifico o clase de antigeno a través del tiempo (entre otras aplicaciones). Por otra parte, por los métodos descritos en la presente los antigenos específicos (o clases de antígenos) se pueden evaluar con respecto a cómo estimulan la función inmune en un individuo.

Medidas de Diagnóstico Un sujeto puede recibir inmunoterapia, o una vacunación, dirigida a tratar (por ejemplo, eliminar) una población particular de células en un sujeto, por ejemplo, un tumor canceroso. En respuesta a la inmunoterapia o producción de vacunación de una IgG específico se puede inducir en el sujeto. Mientras que el título de IgG específico se puede medir mediante una variedad de inmunoensayos, estos ensayos generalmente no son informativos con respecto a la función de la célula T que es específica para la vacuna. De esta manera, no existe actualmente prueba de diagnóstico de rutina para determinar las función de las células T dirigidas contra objetivos específicos (por ejemplo, un antígeno extraño o fragmento de péptido de ese antígeno como es discutido en lo anterior). Las dificultades téenicas tales como aislamiento de células, condiciones de cultivo variantes, y métodos para detectar o cuantificar la función han evitado tales ensayos de diagnóstico de rutina. Por ejemplo, con el fin de estimular el receptor de célula T en las células T de un sujeto, se requieren células vivientes de ese sujeto (las células T no reconocen MHC no automático); en otras palabras, son necesarias células de donador igualadas en MHC. Esto presenta un problema con respecto al uso práctico de los ensayos de diagnóstico ya que las células propias de un sujeto deben ser recolectadas y cultivadas en cultivo antes de estimar la inmunidad de célula T especifica de péptido.

Para dirigirse a estas limitaciones y proporcionar una estimación de diagnóstico más de rutina de la inmunidad de célula T especifica de péptido, varias modalidades descritas en la presente permitir el uso de un panel de uno o más péptidos exógenos (por ejemplo, aquellos para los cuales se desea una estimación de la inmunidad de un sujeto). En varias modalidades, los péptidos exógenos se utilizan para suplementar aquellos péptidos que ya se han procesado mediante las APC, para de esta manera permitir una determinación más completa de la función de célula T de ese sujeto particular.

En varias modalidades, los métodos descritos en la presente se utilizan para inspeccionar la función inmune de un sujeto a través del tiempo, con respecto a un objetivo de péptido particular. Por ejemplo, en algunas modalidades, una pluralidad de muestras se puede recolectar del sujeto y se estima la función de célula T especifica de péptido. Los resultados de esta inspección a través del tiempo, en algunas modalidades, permiten una determinación de si ese sujeto ha tenido o continúa teniendo un nivel incrementado de actividad inmune especifica a ese péptido. En algunas modalidades, esta inspección a través del tiempo se puede utilizar para estimar si un sujeto ha desarrollado inmunodeficiencia (por ejemplo, inmunodeficiencia congénita o adquirida) . En varias modalidades, esta estimación se hace al recolectar una muestra del paciente y al exponerla a un panel de péptidos específicos. En varias modalidades, esta exposición dará por resultado la inducción de ciertos mRNAs inmune relacionados. Las muestras subsecuentes recolectadas a través del tiempo y probadas de la misma manera, si un mRNA que se indujo previamente mostró una carencia de o una inducción disminuida, demostraría una respuesta inmune deficiente a uno o más de los péptidos específicos en el panel. Ventajosamente, tal determinación permite la detección del estado inmunocomprometido en un sujeto en etapas tempranas, para de esta manera permitir la intervención médica apropiada, si es necesario. En algunas modalidades, antes que un panel de péptidos específicos, se utilizan péptidos singulares.

En varias modalidades, la inspección de la función de células T específicas de péptido se puede utilizar para estimar la eficacia de una terapia de vacuna. Antes de ser expuesto a un antígeno, un sujeto no tendrá mRNA inducido en respuesta a la exposición de sus muestras de sangre a un péptido derivado del antigeno. Si ese sujeto subsecuentemente recibe una vacuna que comprende el antigeno particular, el sistema inmune del sujeto procesará el antígeno como es descrito en la presente. Después, la exposición de una muestra de sangre del sujeto a un péptido derivado de antigeno induciría el mRNA (debido a que el sujeto ha generado células inmunes que reconocen ese péptido/antígeno). De esta manera, la eficacia de una terapia de vacuna se puede inspeccionar en un sujeto. Por ejemplo, después de una vacunación inicial, la inducción de mRNA después de la exposición al péptido se puede utilizar como una línea de base para la inspección en curso. Después de la recolección de muestras futuras y al probarlas como es descrito en la presente, una caída en el nivel de inducción a través del tiempo indica una pérdida de eficacia de la vacuna. Esto sugiere, en varias modalidades, que puede ser necesaria un nuevo "refuerzo" de vacuna o una vacuna alternativa. En algunas modalidades, la determinación de inducción de mRNA en una muestra inicial se utiliza como un umbral. En otras palabras, si la inducción de mRNA particular, no es suficiente para alcanzar un cierto nivel, entonces, en algunas modalidades, otra dosis de la vacuna es administrada. La prueba de la responsividad del paciente luego se repite, y si se cumple la inducción umbral, no son necesarias administraciones de vacunas adicionales (hasta el tiempo en que se requiere un "refuerzo", como es descrito en lo anterior).

En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente se utilizan para determinar si un sujeto se ha expuesto previamente a un péptido particular. Por ejemplo, en varias modalidades, un sujeto no se ha expuesto previamente a un antigeno particular, la inducción del mRNA inmuno relacionado probablemente no seria detectada. Esto es debido a, por lo menos en parte, de que una falta relativa de célula de memoria T, como es discutido en lo anterior. En contraste, si un sujeto ha sido de hecho previamente expuesto al péptido especifico, la inducción del mRNA inmuno relacionado resultarla, ya que la primera exposición habría conducido a la producción de una acumulación de célula T de memoria. De esta manera, en varias modalidades, se puede hacer una determinación de si el sujeto está en riesgo para una respuesta inmune hiperactiva en base a una exposición subsecuente a ese péptido.

En varias modalidades, la estimación de la inmunidad específica de péptido de un sujeto permite una determinación de si un sujeto puede montar una respuesta efectiva contra un tipo particular de célula extraña, por ejemplo, un tipo particular de cáncer. Por ejemplo, si una célula de cáncer específica produce un marcador (por ejemplo, un péptido) que es único a la célula de cáncer (como es comparado con las células normales) y la exposición de una muestra de un sujeto a ese péptido específicos da por resultado la inducción del mRNA inmuno relacionado asociado con la función de exterminación (por ejemplo, células T citotóxicas), es probable que el sujeto sea capaz de montar una respuesta inmune contra esa célula de cáncer. En contraste, la exposición a la muestra del sujeto al péptido especifico de la célula cáncer y una carencia de inducción de mRNA relacionado con la función inmune asociados con la exterminación indicaría que el sujeto es menos probable de ser capaz de montar una respuesta inmune para eliminar la célula de cáncer. En tales casos, puede ser aconsejable la terapia adjunta (por ejemplo, cirugía, terapia química o de radiación).

En varias modalidades, los métodos descritos en la presente se utilizan para identificar a un sujeto que tiene inmunidad celular contra un antígeno específico y tratar a ese sujeto por consiguiente. En varias modalidades, tal método comprende obtener por lo menos dos muestras biológicas (por ejemplo, muestras de sangre) de un sujeto, exponer una de tales muestras a un péptido derivado de un antígeno específico de interés y tratar una segunda muestra a condiciones idénticas (sin el péptido) y cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en las muestras. A medida que la expresión de los marcadores de función de célula T se analiza, un sujeto se puede identificar por tener inmunidad celular contra el antígeno específico cuando la expresión del uno o más marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la muestra con respecto al péptido como es comparado con la muestra no expuesta al péptido. Del mismo modo, el sujeto se identifica como que no tiene inmunidad celular contra el antigeno especifico cuando la expresión del uno o más marcadores asociados con la función de célula T es sustancialmente similar en las dos muestras (expuestas a péptidos contra no expuesta). En base a esa identificación, el sujeto se puede tratar por consiguiente. De esta manera, en aquellas modalidades en donde el sujeto exhibe inmunidad celular, una terapia inmuno basada se puede administrar al sujeto. Si no se detecta inmunidad celular, las terapias no inmuno basadas se pueden probar más efectivas para ese sujeto. En varias modalidades, el sujeto puede ser "vacunado" con el péptido del antigeno de interés, con el fin de reforzar la respuesta inmune celular que el sujeto monta.

En varias modalidades, también se proporciona un método para tratar a un sujeto en base a su función de célula T especifica de péptido de un sujeto. Similar a la anterior, una pluralidad de muestras de sangre se recolectan del sujeto, por lo menos una de las cuales expone un péptido derivado de un antigeno de interés y una de las cuales no se expone de esta manera. El nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en las muestras expuestas y no expuestas se cuantifica y cuando un nivel más grande de expresión de los marcadores asociados con la función de célula T está presente en la muestra expuesta como es comparado de la muestra no expuesta, el sujeto tiene inmunidad celular a ese antigeno especifico. A la inversa, cuando el nivel de expresión no es significativamente diferente en las muestras expuestas contra no expuestas, el sujeto carece de inmunidad celular al antigeno. Después, se realiza la administración de una terapia particular; una terapia inmuno basada si el sujeto tiene inmunidad celular y una terapia no inmuno basada si el sujeto carece de inmunidad celular.

En varias modalidades, la cuantificación se realiza de acuerdo con los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, en una modalidad, la cuantificación comprende adicionar un cebador y una transcriptasa inversa con el RNA aislada de cada una de las muestras (expuesta y no expuesta) para generar DNA complementario (cDNA) y poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T y una DNA polimerasa para generar DNA amplificado.

Adicionalmente, varias modalidades se dirigen a determinar la probabilidad de la eficacia de una terapia específica de péptido y luego administrar la terapia, si es apropiado. En varias modalidades, los métodos comprenden obtener una primera y una segunda muestra de sangre de un sujeto, exponer la primera muestra de sangre a un solvente que comprende un antígeno de péptido contra el cual se va a dirigir la terapia específica de péptido y exponer la segunda muestra de sangre al solvente único. Después de que se cuantifica el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T. Estos marcadores pueden ser, dependiendo de la modalidad, marcadores de células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica o T-reg y/o marcadores de función MDSC. Una terapia especifica de péptido luego se identifica como que tiene una probabilidad incrementada de eficacia cuando los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la primera muestra cómo es comparado con la segunda muestra. Alternativamente, la cuantificación puede dar por resultado una identificación de una probabilidad de la eficacia de la terapia especifica de péptido cuando (a) los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con T-reg y/o MDSC o T-reg y/o función de MDSC y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se incrementa la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra, o (b) los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T es sustancialmente similar en la primera muestra cuando se compara con la segunda muestra. En base a la identificación de la terapia especifica de péptido que es efectiva, la terapia puede ser ya sea administrada al sujeto (cuando se determina probablemente que sea efectiva) o la administración se puede llevar a cabo (cuando se determina improbable que sea efectiva). En varias modalidades, la terapia especifica de péptido es una terapia anti-cáncer.

También, en una modalidad, se proporciona un método para identificar una terapia especifica de péptido efectiva para tratar un trastorno autoinmune en un sujeto y después tratar al sujeto. El método comprende, en varias modalidades, obtener una muestra de sangre del sujeto en riesgo por, o que sufren de un trastorno autoinmune, exponer una primera porción de la muestra de sangre a un solvente que comprende un péptido especifico asociado con la terapia especifica de péptido, exponer una segunda porción de la muestra de sangre al solvente único, y cuantificar el nivel de expresión de uno o más mRNA asociados con la función inmune auto-limitante en la primera y la segunda porción de la muestra de sangre, determinar que la terapia específica de péptido es probable que sea eficaz cuando hay un nivel más grande de expresión en la primera porción de la muestra de sangre como se compara con la segunda porción de la muestra de sangre, y cuando la terapia específica de péptido se determina que es probable que sea efectiva, administrar la terapia especifica de péptido al sujeto.

En varias modalidades, los métodos descritos en la presente se pueden utilizar para determinar la eficacia potencial de un tipo particular de vacuna de péptido. Por ejemplo, en ciertas situaciones autoinmunes, aún existen células o proteínas que atacan otras células endógenas dentro del cuerpo del sujeto (como ocurre con la diabetes tipo I). Varias modalidades de los métodos descritos en la presente son útiles para determinar la eficacia potencial de una vacuna de péptido putativo. En otras palabras, si la exposición de una muestra de un sujeto a la vacuna de péptido putativa da por resultado una inducción de mRNA relacionada con la función inmune auto-limitante descrita en lo anterior, entonces es probable que la vacuna de péptido putativa fue eficaz para tratar la situación autoinmune. Esto es debido a que la prueba de diagnóstico ha indicado que el péptido inducirá un conjunto de células asociadas con auto-limitación de la función inmune del sujeto. Por otra parte, estas células serán específicamente dirigidas contra aquellas células que también llevan el péptido específico y están atacando células endógenas (por ejemplo, las células "culprit").

Condiciones Objetivo En varias modalidades, los métodos y composiciones descritos aquí se utilizan para estimar una habilidad del sujeto para montar una respuesta inmune contra una variedad de diferentes antígenos específicos. Por ejemplo, en varias modalidades, el antígeno extraño se puede derivar de células cancerosas (u otras células mutadas). Los marcadores específicos para una variedad de cánceres se pueden probar, dependiendo de la modalidad. Por ejemplo, en varias modalidades, un sujeto se puede probar para la inmunidad especifica a una variedad de cánceres que incluyen, pero no limitados a leucemia linfoblástica (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), carcinoma adrenocortical, sarcoma de kaposi, linfoma, cáncer gastrointestinal, cáncer de apéndice, cáncer del sistema nervioso central, carcinoma de célula basal, cáncer de conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, tumores del cerebro (incluyendo, pero no limitado a astrocitomas, tumores de la médula espinal, glioma del tallo cerebral, craneofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma), cáncer de mama, tumores bronquiales, linfoma de burkitt, cáncer cervical, cáncer de colon, leucemia linfocitica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (CML), trastornos mieloproliferativos crónicos, carcinoma ductal, cáncer de endometrio, cáncer esofágico, cáncer gástrico, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hogkin, leucemia de célula pilosa, cáncer de célula renal, leucemia, cáncer oral, cáncer del hígado, cáncer del pulmón, linfoma, melanoma, cáncer ocular, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de pituitaria, cáncer uterino y cáncer vaginal.

Alternativamente, en varias modalidades, un sujeto se puede probar para la inmunidad específica a células de infecciones derivadas de bacterias, virus, hongos y/o parásitos. En algunas modalidades, las células T responsivas e infecciones de origen bacteriano (por ejemplo, bacteria infecciosa se selecciona del grupo de géneros que consisten de Bordetella, Borrelia, Brucella, Campylobacter, Chlamydia y Chlamydophíla, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus , Escherichia, Francisella, Haemophilus , Helicobacter, Legionella , Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Mycoplasma , Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Vibrio y Yersinia, y mutantes o combinaciones de los mismos) se pueden identificar por varias modalidades de los métodos descritos en la presente.

En algunas modalidades, la habilidad de un sujeto para montar una respuesta especifica contra agentes infecciosos de origen viral se puede estimar. Los virus pueden incluir, pero no están limitados a adenovirus, Coxsackievirus, virus de Epstein-Barr, un virus de hepatitis A, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus de herpes simple tipo 1, virus de herpes simple, tipo 2, citomegalovirus, virus de ebola, virus de herpes humano, tipo 8, HIV, virus de influenza, virus de sarampión, virus de paperas, papilomavirus humano, virus parainfluenza, poliovirus, virus de rabia, virus sincitial respiratorio, virus de rubéola y virus de varicela-zoster y combinaciones de los mismos. Los exosomas se pueden utilizar para tratar una amplia variedad de tipos de células también, incluyendo pero no limitadas a células vasculares, células epiteliales, células intersticiales, musculatura (esquelética, lisa y/o cardiaca), células esqueléticas (por ejemplo, hueso, cartílago y tejido conectivo), células nerviosas (por ejemplo, neuronas, células gliales, astrocitos, células de Schwann), células de hígado, células de riñón, células de intestino, células de pulmón, células de la piel o cualquier otra célula en el cuerpo.

En varias modalidades, los métodos descritos en la presente son útiles para la determinación de si un sujeto puede (o tiene) que montar una respuesta inmune a las células que tienen función metabólica alterada. En algunas modalidades, las células con una discrepancia metabólica (como es comparado con las células normales) expresan marcadores de identificación específicos. Un sujeto puede montar una respuesta inmune contra tales células, en un esfuerzo para evitar la posibilidad de efectos adversos en base al mal funcionamiento de la célula. Por ejemplo, la interrupción metabólica de una célula puede causar que una célula sea convertida de una célula normal a una célula pre-cancerosa. De esta manera, la respuesta inmune puede eliminar la célula antes de que la célula llegue a ser cancerosas. En varias modalidades, se puede detectar una propensión para autoinmunidad. En varias modalidades, los métodos descritos en la presente se utilizan para determinar si un sujeto ha generado de hecho previamente una célula con cierto mal funcionamiento metabólico. Por ejemplo, los métodos descritos en la presente, en algunas modalidades, permiten la detección de péptidos específicos a una clase particular de disfunción metabólica.

Métodos En varias modalidades, las muestras utilizadas en los métodos reivindicados son muestras de sangre entera. En varias modalidades, las muestras de sangre se pueden heparinizar. Una vez recolectadas, las muestras de sangre se exponen a por lo menos un antígeno específico. Como es discutido en lo anterior, el antígeno se puede derivar de cualquiera de una variedad de fuentes (células de cáncer, virus, bacterias, etc.). En algunas modalidades, la exposición ocurre a una temperatura que se aproxima a una temperatura fisiológica. En varias modalidades, la exposición se realiza a una temperatura que varía de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C. En varias modalidades, la exposición se realiza a aproximadamente 37°C. Dependiendo de la modalidad, la duración de la exposición puede variar de una hora aproximadamente a ocho horas. En algunas modalidades, la exposición dura por aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas, aproximadamente dos horas a aproximadamente tres horas, aproximadamente tres horas a aproximadamente cuatro horas, aproximadamente cuatro horas a aproximadamente cinco horas, aproximadamente cinco horas a aproximadamente seis horas, o aproximadamente seis horas a aproximadamente ocho horas. También se utilizan duraciones más largas o cortas de exposición, dependiendo de la modalidad. En algunas modalidades se utilizan péptidos únicos, mientras que en otras modalidades, se utiliza una pluralidad o panel de péptidos. En varias modalidades, los péptidos que constituyen el panel todos se derivan de una fuente general común, por ejemplo, todos los péptidos son de un solo tipo de célula de cáncer. En algunas modalidades, los péptidos que constituyen el panel se derivan de diferentes fuentes, por ejemplo, algunos péptidos de células de cáncer y algunos péptidos de agentes infecciosos tales como bacterias. La flexibilidad en el diseño del panel de péptidos permite la adaptación de la determinación de la función de célula T especifica de péptidos dependiendo de las necesidades de un sujeto particular que es probando.

En algunas modalidades, los péptidos se diluyen con solvente no reactivo (por ejemplo, solución salina amortiguada de fosfato) con el fin de adaptar la cantidad de inducción que es detectada, tal que se logra un grado deseado de ganancia de señal (por ejemplo, una relación de señal a ruido es suficiente para permitir la cuantificación precisa). De esta manera, en varias modalidades los métodos exponer una muestra de sangre (por ejemplo, una muestra de sangre entera) a un péptido derivado de un antígeno de interés, ese péptido se ha dispersado (por ejemplo, diluido) en un solvente. En varias modalidades, la muestra de sangre es una muestra de sangre entera. En varias modalidades, no se adicionan células que presentan antigeno adicionales a la muestra. A pesar del uso de un solvente para diluir el péptido en varias modalidades, en otras modalidades, no se utiliza un solvente (por ejemplo, si un péptido se ha secado, tal como con un péptido secado por congelación).

En aquellas modalidades en las cuales se determinan los niveles de mRNA, los eritrocitos y componentes de sangre diferentes de leucocito opcionalmente se remueven de la muestra de sangre entera. En otras modalidades, la sangre entera se utiliza sin remoción o aislamiento de cualquier tipo de célula particular. En modalidades preferidas, los leucocitos se aíslan utilizando un dispositivo para aislar y amplificar mRNA. Las modalidades de este dispositivo se describen en más detalle en las Patente de los Estados Unidos Nos. 7,745,180, 7,968,288, 7,939,300, 7,981,608 y 8,076,105, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad por referencia en la presente.

En breve, ciertas modalidades del dispositivo comprenden una placa de multi-cavidades que contiene una pluralidad de cavidad de suministro de muestra, un filtro que captura leucocitos debajo de las cavidades, y una zona de captura de mRNA debajo del filtro que contiene oligo(dT) inmovilizado. En ciertas modalidades, el dispositivo también contiene una caja al vacío adaptada para recibir la placa de filtro para crear un sello entre la placa y la caja, tal que cuando se aplica presión de vacio, la sangre se retira de las cavidades de suministro de muestra a través del filtro de captura de leucocitos, para de esta manera capturar los leucocitos y permitir que los componentes de sangre no de leucocitos sean removidos al lavar los filtros. En otras modalidades, otros medios para retirar las muestras de sangre a través de las cavidades de muestra y a través del filtro de captura leucocito, tal como centrifugación o presión positiva, son utilizados. En modalidades preferidas del dispositivo, los leucocitos se capturan en una pluralidad de membranas de filtro que están en capas conjuntamente. En varias modalidades, los leucocitos capturados luego se lisan con una solución amortiguadora de lisis, para de esta manera liberar mRNA de los leucocitos capturados. El mRNA luego se híbrida al oligo(dT)-inmovilizado en la zona de captura de mRNA. Detalle adicional que conserva la composición de amortiguadores de lisis que se pueden utilizar en varias modalidades se pueden encontrar en la Patente de los Estados Unidos 8,101,344, que se incorpora en su totalidad por referencia en la presente. En varias modalidades, el cDNA se sintetiza del mRNA oligo (dT)-inmovilizado. En modalidades preferidas, el cDNA luego se amplifica utilizando PCR en tiempo real con cebadores específicamente diseñados para la amplificación de marcadores asociados con la infección. En varias modalidades, se utilizan otros métodos de cuantificación de mRNA, que incluyen, pero no limitados a, manchado de northern, RT-qPCR 2-dimensional, protección de RNasa y los similares. En varias modalidades, se utilizan otros puntos de extremo de medición, tales como, por ejemplo, niveles de proteina y/o ensayos funcionales.

Después de la completación de la reacción de PCR, los diversos mRNA (como es representado por la cantidad de cDNA amplificado por PCR detectado) para uno o más marcadores asociados con la función de leucocito se cuantifican. En ciertas modalidades, la cuantificación se calcula al comparar la cantidad de mRNA que codifica uno o más marcadores a un valor de referencia. En otras modalidades, el valor de referencia es el nivel de expresión de un gen que no es inducido por el agente estimulante, por ejemplo, un gen de mantenimiento. En ciertas de tales modalidades, la beta-actina se utiliza como el valor de referencia. Otros numerosos genes de auto-mantenimiento que son bien conocidos en la téenica también se pueden utilizar como un valor de referencia. En otras modalidades, un gen de auto-mantenimiento se utiliza como un factor de corrección, tal que la comparación final es el nivel de expresión inducido de uno o más marcadores asociados con la función en leucocito como es comparado con el mismo marcador de una muestra no inducida (control). En todavía otras modalidades, el valor de referencia es cero, tal que la cuantificación de uno o más marcadores asociados con la función de leucocito se representa por un número absoluto. En varias modalidades, dos, tres o más marcadores asociados con la función se leucocito se cuantifican. En varias modalidades, la cuantificación se realiza utilizando PCR en tiempo real y los datos se expresan en términos de incremento de veces (conjunto contra un control apropiado). En ciertas modalidades, el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T se cuantifica utilizando un método seleccionado del grupo que consiste de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), RT-PCR de tiempo real, manchado de northern, análisis génico de microarreglo, PCR digital, secuenciación de RNA, hibridación de nanoplex, clasificación de célula activada por fluorescencia, ELISA, espectrometría de masas y manchado de western. En algunas modalidades, una probabilidad incrementada de eficacia se observa cuando ciertos marcadores asociados con la función de célula T se disminuyen en la expresión. Por ejemplo, en varias modalidades una probabilidad incrementada de eficacia de una terapia específica de péptido se identifica cuando los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con células T citotóxicas o la función de células T citotóxicas y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se disminuye en primera muestra cómo es comparado con la segunda muestra. De manera similar, una probabilidad disminuida de eficacia se puede identificar, en ciertas modalidades, cuando los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con T-reg y/o MDSC o T-reg y/o función de MDSC y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se disminuye en la primera muestra cómo es comparado por la segunda muestra, o los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica y la expresión de los marcadores asociado con la función de célula T es sustancialmente similar a la primera muestra cómo se compara con la segunda muestra.

Como se utiliza en la presente, el término "incrementado" será dado en su significado ordinario y también se referirá a incrementos en la expresión de mayor que aproximadamente 5%, mayor que aproximadamente 10%, mayor que aproximadamente 15%, mayor que aproximadamente 20%, mayor que aproximadamente 25%, mayor que aproximadamente 50% o más. Del mismo modo, como se utiliza en la presente, el término "disminuido" será dado en su significado ordinario y también se referirá a disminuciones en la expresión de mayor que aproximadamente 5%, mayor que aproximadamente 10%, mayor que aproximadamente 15%, mayor que aproximadamente 20%, mayor que aproximadamente 25%, mayor que aproximadamente 50%, o más. En algunas modalidades, un incremento se refiere a un incremento estadísticamente significativo en la expresión (por ejemplo, p<0.05 en base a un análisis estadístico establecido en la téenica). En algunas modalidades, una disminución se refiere a una disminución estadísticamente significativa en la expresión (por ejemplo, p<0.05 en base a un análisis estadístico establecidos en la técnica).

EJEMPLOS Una modalidad específica será descrita con referencia al siguiente ejemplo, que debe ser considerado en un sentido ilustrativo antes que restrictivo.

Ejemplo 1 - Inducción del RNA Relacionado con la Función Inmune en Respuesta a la Exposición de Peptido Mientras que los péptidos en MHC se conocen que son derivados de proteínas digeridas en APC, sin embargo, el presente ejemplo evalúa el reemplazo (o suplementación) de péptidos endógenos con péptidos exógenos. Se empleó una acumulación de péptido comercialmente disponible (CEF peptide pool; Mabtech, www.mabtech.com), aunque como es discutido en lo anterior, se utilizan péptidos únicos o paneles adaptados de péptidos. Esta acumulación contiene 23 péptidos restringidos en clase I diferentes, todos definidos como epítopos de célula T de CD8+ comunes derivados de citomegalovirus, virus de Epstein-Barr y virus de influenza. Este panel induce la producción de IFN-g mediante la célula T CD8+ específicas de virus en casi 90% de Caucásicos y también induce las respuestas de Perforina, Granzima B y MIR-Ib en muchos individuos.

El péptido de extracto (200 mg/mL) se diluyó con 1:3, 1:10, 1:10 y 1:100 en PBS, y se aplicó a sangre entera heparinizada a 37°C durante 4 horas. No se adicionaron células adicionales. Se utilizaron controles positivos y negativos de leucoaglutinina (PHA-L) y PBS respectivamente.

Como se muestra en la Figura 1, PHA-L de control positivo indujo GMCSF, IFNG, TNFSF2, CXCL10, CCL4, IL4, IL10, CTLA4, y CXCL3, mientras que el gen beta actina de mantenimiento de control (ACTB) no se indujo. Esto confirma el desempeño apropiado de esto. La acumulación de péptido CEF indujo GMCSF, IFNG, TNFSF2, CXCL10 y CCL4 en una manera dependiente de dosis.

La Figura 2 representa la cinética de la inducción de mRNA en respuesta a la exposición del panel CEF. La exposición se realizó como es descrito en lo anterior para duraciones de 1, 2, 4, 8 y 24 horas y la expresión de mRNA se evaluó por PCR en tiempo real (circuios cerrados representan la inducción por CEF y triángulos abiertos son el control de PBS). La similitud de la inducción en los diversos mRNA sugiere que los péptidos exógenos reemplazan (o suplementan) los péptidos existentes en MHC, antes que ser captador por la células y procesados para ser formados en complejo con el MHC (que desplazarla la curva cinética para la exposición de CEF a la derecha).

Estos datos indican que la exposición de los leucocitos a péptidos exógenos permiten que sean inducidos los mRNAs relacionados con la función inmune. Como tal, este experimento demuestra que la inmunidad de célula T especifica de péptido se puede estimar mediante los métodos ex vivo descritos en la presente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar a un sujeto que tiene inmunidad celular contra un antigeno específico, caracterizado porque comprende: exponer la primera muestra de sangre entera obtenida del sujeto a un solvente que comprende un péptido derivado del antígeno específico; exponer la segunda muestra de sangre entera obtenida del sujeto al solvente único; cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre entera por un método que comprende: (i) adicionar un cebador y una transcriptasa inversa al RNA aislado de cada una de la primera muestra de sangre entera y la segunda muestra de sangre entera para generar un DNA complementario (CDNA) y (ii) poner en contacto el CDNA con cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste en CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDL1 y granzima B y una DNA polimerasa para generar DNA amplificado; e identificar al sujeto como que tiene inmunidad celular contra el antigeno especifico cuando la expresión del uno o más marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la primera muestra de sangre entera cuando se compara con la segunda muestra de sangre entera; o identificar al sujeto como que no tiene inmunidad celular contra el antigeno especifico cuando la expresión del uno o más marcadores asociados con la función de célula T es sustancialmente similar en la primera muestra de sangre entera cómo se compara con la segunda muestra de sangre entera.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende poner en contacto el cDNA con una DNA polimerasa y cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste de GMCSF, interferona gamma, TNFSF2, CXCL10, CCL4, IL2, IL4, IL10, CTLA4, CCL2 y CXCL3 en la etapa (ii).

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el antígeno específico está asociado con una o más de una condición cancerosa, una infección viral, una infección bacteriana, una infección fúngica, una infección de levaduras, infección debido a priones e infecciones debido a parásitos.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las muestras de sangre entera se tratan con un anticoagulante.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticoagulante comprende heparina.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 42°C.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 37°C.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la exposición se realiza durante una cantidad de tiempo de menor que aproximadamente 8 horas.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la cantidad de tiempo es de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas.

10. Un método para caracterizar la función de célula T especifica de péptido de un sujeto, caracterizado porque comprende: exponer la primera muestra de sangre entera obtenida del sujeto a un solvente que comprende un péptido derivado de un antigeno; exponer la segunda muestra de sangre entera obtenida del sujeto al solvente único; cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre entera mediante un método que comprende: (i) adicionar un cebador y una transcriptasa inversa de RNA aislado de cada una de la primera muestra de sangre entera y la segunda muestra de sangre entera para generar DNA complementario (cDNA), y (ii) poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociado con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste de CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDL1, y granzima B y una DNA polimerasa para generar DNA amplificado; y en donde un nivel más grande de expresión del uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera muestra de sangre entera como es comparado con la segunda muestra de sangre entera indica que el sujeto tiene inmunidad celular al antígeno, y en donde un nivel de expresión del uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera muestra de sangre entera que no es significativamente diferente del nivel de expresión como es comparado con la segunda muestra de sangre entera indica que el sujeto carece de inmunidad celular al antigeno.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque además comprende poner en contacto el cDNA con una DNA polimerasa y cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste en GMCSF, interferona gamma, TNFSF2, CXCL10, CCL4, IL2, IL4, IL10, CCL2 y CXCL3 en la etapa (ii).

12. El método de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque la función de célula T especifica de péptido se dirige contra una o más de una condición cancerosa, una condición autoinmune, una infección viral, una infección bacteriana, una infección fúngica, una infección de levaduras, infección debido a priones e infecciones debido a parásitos.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque las muestras de sangre entera se tratan con anticoagulante.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticoagulante comprende heparina.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 42°C.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 37°C.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, caracterizado porque la exposición se realiza durante una cantidad de tiempo de menos de aproximadamente 8 horas.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la cantidad de tiempo es de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas.

19. Un método para determinar la probabilidad de la eficacia de una terapia especifica de péptido, caracterizado porque comprende: exponer la primera muestra de sangre obtenida del sujeto a un solvente que comprende un antigeno de péptido contra el cual se va a dirigir la terapia especifica de péptido; exponer la segunda muestra de sangre obtenida del sujeto al solvente único; cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T asociados ya sea con (I) células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica o (II) T-reg y/o MDSC o T-reg y/o marcadores de función de MDSC en la primera y la segunda muestras de sangre por un método que comprende: (i) adicionar un cebador y una transcriptasa inversa al RNA aislado de cada una de la primera muestra de sangre entera y la segunda muestra de sangre entera para generar DNA complementario (cDNA), y (ii) poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste en CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDLl y granzima B y una DNA polimerasa para generar DNA amplificado; e identificar una probabilidad incrementada de eficacia de la terapia específica de péptido cuando los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica y la expresión de los marcadores asociados con la función de las células T se incrementa en la primera muestra de sangre cómo se compara con la segunda muestra de sangre; o identificar una probabilidad disminuida de eficacia de la terapia específica de péptido cuando (a) los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con T-reg y/o MDSC o T-reg y/o función de MDSC y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se incrementan en la primera muestra de sangre cómo se compara con la segunda muestra de sangre, o (b) los marcadores asociados con la función de célula T se asocian con células T citotóxicas o la función de célula T citotóxica y la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T es sustancialmente similar en la primera muestra de sangre cómo se compara con la segunda muestra de sangre.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la terapia especifica de péptido es una terapia anti-cáncer.

21. El método de conformidad con la reivindicación 19 o 20, caracterizado porque además comprende poner en contacto el cDNA con una DNA polimerasa y cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste de en GMCSF, interferona gama, TNFSF2, CXCL10, CCL4, IL2, IL4, IL10, CTLA4, CCL2 y CXCL3 en la etapa (ii).

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque el antígeno de péptido se deriva de una fuente seleccionada del grupo que consiste en un virus, una bacteria y una célula de cáncer.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque las muestras de sangre entera se tratan con un anticoagulante.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el anticoagulante comprende heparina.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 42°C.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 37°C.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, caracterizado porque la exposición se realiza durante una cantidad de tiempo de menor que aproximadamente 8 horas.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la cantidad de tiempo es de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas.

29. Un método para identificar una terapia especifica de péptido efectiva para tratar un trastorno autoinmune, caracterizado porque comprende: exponer una primera porción de la muestra de sangre obtenida de un sujeto en riesgo por o que sufre de un trastorno autoinmune a un solvente que comprende un péptido especifico asociado con la terapia especifica de péptido; exponer una segunda porción de la muestra de sangre al solvente único; cuantificar el nivel de expresión de uno o más mRNA asociados a la función inmune auto limitante en la primera y segunda porción de la muestra de sangre, tal como al utilizar un método seleccionado del grupo que consiste de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), RT-PCR de tiempo real, manchado de northern, clasificación de célula activada por fluorescencia, ELISA, espectrometría de masas y manchado de western, en donde el uno o más mRNA asociados con la función inmune auto-limitante se selecciona del grupo que consiste de CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDL1 y granzima B; y determinar que la terapia específica de péptido es probable para ser eficaz cuando hay un nivel más grande de expresión en la primera porción de la muestra de sangre cuando se compara con la segunda porción de la muestra de sangre.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque las muestras de sangre entera se tratan con un anticoagulante.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el anticoagulante comprende heparina.

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 42°C.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 37°C.

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33, caracterizado porque la exposición se realiza durante una cantidad de tiempo de menor que aproximadamente 8 horas.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la cantidad de tiempo es de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas.

36. Un método para inspeccionar la eficacia en curso de una vacuna, caracterizado porque comprende: exponer la primera muestra de sangre obtenida de un sujeto antes de que el sujeto se exponga a un antigeno de interés a un solvente que comprende un péptido derivado del antigeno de interés; exponer la segunda muestra de sangre obtenida de un sujeto antes de que el sujeto se exponga a un antigeno de interés al solvente único; cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y segunda muestras de sangre mediante un método que comprende: (i) adicionar un cebador y una transcriptasa inversa de RNA aislado de cada una de la primera muestra de sangre entera y la segunda muestra de sangre entera para generar DNA complementario (cDNA), y (ii) poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste de CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDLl y granzima B y una DNA polimerasa para generar DNA amplificado; y exponer la tercera muestra de sangre obtenida del sujeto después de que una vacuna dirigida contra el antígeno de interés se ha administrado al sujeto, al solvente que comprende el péptido derivado del antígeno de interés; exponer la cuarta muestra de sangre obtenida del sujeto después de que una vacuna dirigida contra el antígeno de interés se ha administrado al sujeto, al solvente único; cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la tercera y la cuarta muestras de sangre mediante un método que comprende: (i) adicionar un cebador y una transcriptasa inversa de RNA aislado de cada una de la primera muestra de sangre y la segunda muestra de sangre para generar DNA complementario (cDNA), y (ii) poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antísentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste de CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDL1 y granzima B y una DNA polimerasa para generar DNA amplificado; y normalizar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la tercera y cuarta muestras de sangre base al nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda muestras de sangre; y identificar una eficacia mantenida o incrementada de la vacuna cuando la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la tercera muestra de sangre cómo se compara con la primera muestra de sangre; o identificar una eficacia disminuida de la vacuna cuando la expresión de los marcadores asociados con la función de célula T se reduce en la tercera muestra de sangre cómo es comparado con la primera muestra de sangre.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque además comprende poner en contacto el cDNA con una DNA polimerasa y cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste de G CSF, interferona gamma, TNFSF2, CXCL10, CCL4, IL2, IL4, IL10, CTLA4, CCL2, y CXCL3 en la etapa (ii).

38. El método de conformidad con la reivindicación 36 o 37, caracterizado porque el antígeno de interés está asociado con uno o más de una condición cancerosa, una infección viral, una infección bacteriana, una infección fúngica, una infección de levaduras, infección debido a priones e infecciones debido a parásitos.

39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, caracterizado porque además comprende administrar opcionalmente un refuerzo de vacuna cuando se detecta una eficacia disminuida de la vacuna.

40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, caracterizado porque las muestras de sangre entera se tratan con un anticoagulante.

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el anticoagulante comprende heparina.

42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 42°C.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 37°C.

44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 43, caracterizado porque la exposición se realiza durante una cantidad de tiempo de menor que aproximadamente 8 horas.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la cantidad de tiempo es de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas.

46. Un método para identificar un biomarcador de inmunidad celular, caracterizado porque comprende: exponer una primera porción de una muestra de sangre a un solvente que comprende un péptido derivado de antigenos conocidos; exponer una segunda porción de la muestra de sangre al solvente único; cuantificar el nivel de expresión de uno o más marcadores asociados con la función de célula T en la primera y la segunda porciones por un método que comprende (i) adicionar un cebador y una transcriptasa inversa a RNA aislado de cada una de la primera porción y la segunda porción de la muestra de sangre para generar DNA complementario (cDNA), y (ii) poner en contacto el cDNA con cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T seleccionados del grupo que consiste de CD25, FoxP3, CTLA4, GARP, IL17, arginasa, PD-1, PDL1 y granzima B y una DNA polimerasa para generar DNA amplificado; e identificar un biomarcador de inmunidad celular cuando la expresión de un marcadores asociados con la función de célula T se incrementa en la primera porción cómo es comparado con la segunda porción o cuando la expresión de un marcador asociado con la función de célula T se disminuye en la primera porción cómo es en comparado con la segunda porción.

47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque además comprende poner en contacto el cDNA con una DNA polimerasa y cebadores de sentido y antisentido que son específicos para uno o más marcadores asociados con la función de célula T que se seleccionan del grupo que consiste de GMCSF, interferona gamma, TNFSF2, CXCL10, CCL4, IL2, IL4, IL10, CCL2, CXCL3, en la etapa (ii).

48. El método de conformidad con la reivindicación 46 o 47, caracterizado porque las muestras de sangre entera se tratan con un anticoagulante.

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el anticoagulante comprende heparina.

50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 a 49, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 42°C.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la exposición se realiza a una temperatura de aproximadamente 37°C.

52. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 a 51, caracterizado porque la exposición se realiza durante una cantidad de tiempo de menor que aproximadamente 8 horas.

53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la cantidad de tiempo es de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas.