JP5706913B2 - 攻撃的及び防御的免疫マーカーのexvivo誘導により宿主免疫機能を特徴付けるための方法 - Google Patents
攻撃的及び防御的免疫マーカーのexvivo誘導により宿主免疫機能を特徴付けるための方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2009年12月16日に出願された米国仮出願第61/287,114号の利益を主張するものであり、その開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
パーフォリン等の特定のタンパク質は、標的細胞の膜に細孔形成を誘導し、グランザイム等のプロテアーゼを細胞に進入させることで、プログラム細胞死プロセス(アポトーシス)を誘導することが可能となる。
する場合があり、それは、腫瘍細胞が探知を逃れ、癌性増殖を発生させる可能性を増加させる場合がある。
は複数の攻撃的免疫機能関連mRNAは、免疫リクルーター機能を有し、CCL2、CCL4、CCL8、CCL20、CXCL3、CXCL10、及びインターロイキン8からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、1つ又は複数の攻撃的免疫機能関連mRNAは、免疫キラー機能を有し、グランザイムB、パーフォリン、TNFSF1、TNFSF2、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF14、及びTNFSF15からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、1つ又は複数の攻撃的免疫機能関連mRNAは、免疫ヘルパー機能を有し、インターロイキン2、インターロイキン4、インターフェロンガンマ及びインターロイキン17Aからなる群から選択される。
は防御的免疫応答に関連する一群のマーカーの1つ又は複数を誘導する刺激剤(複数可)を使用することが伴う。幾つかの実施形態では、任意に、単離された白血球を使用してもよい。幾つかの実施形態では、攻撃的又は防御的マーカーの各々の1つ又は複数をコードするmRNAの測定を使用して、宿主の全体的免疫応答を特徴付ける。更に他の実施形態では、そのような攻撃的又は防御的マーカーの発現の特徴付けを使用して、免疫抑制薬又は抗癌薬(例えば、免疫調節薬)のいずれかとしての潜在的効力について、薬物をスクリーニングする。
く抗癌療法の潜在的効力を更に支持する。これは、リクルーター活性の増加が、攻撃的免疫系の細胞のリクルートを、例えばより迅速に、より多くの数で、及び/又はより長期間にわたって可能にすることにより、攻撃的機能の増加を更に増強する可能性が高いからである。幾つかの実施形態では、機能別分類における発現変化を評価及び使用して、最適な療法を決定し、他の実施形態では、分類内からの個々のマーカーを使用して、潜在的に最適な療法を決定する。
現を誘導し、誘導は、上記マーカーをコードするmRNAの量により測定される。攻撃的マーカーには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:CD16(NK細胞の表面マーカー);グランザイムB(速効性アポトーシスの誘導因子);パーフォリン(細胞を溶解するように機能する細胞溶解性タンパク質);TNFSF1(リンホトキシン、標的細胞に対する貪食細胞結合を増強するように機能する);TNFSF2(TNF−アルファ;遅効性アポトーシスの誘導因子);TNFSF5(CD40リガンド、抗原提示細胞及びマクロファージを活性化するように作用する);TNFSF6(Fasリガンド、アポトーシスの誘導因子);TNFSF14(LIGHT;T細胞増殖及び腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する);TNFSF15(アポトーシスの誘導因子)。防御的免疫マーカーには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:IL10(Th1のダウンレギュレーション因子であるサイトカイン);TGF−ベータ(リンパ球活性化を阻止する);CD25(T−regの表面マーカー);FoxP3(T−regマーカー);CTLA4(細胞傷害性リンパ球抗原);GARP(反復優位型糖タンパク質A(glycoprotein A repetitions predominant));IL17(T細胞活性化の推定上の負の制御因子);ARG(アルギナーゼ、MDSCのマーカー);及びPD−1(プログラム死1(programmed death 1)、T細胞応答の負の制御因子)。
mRNAは、オリゴ(dT)が固定されたmRNA捕捉帯にハイブリダイズする。幾つかの実施形態で使用することができる溶解緩衝液の組成物に関する更なる詳細は、米国特許出願第11/376,018号に見出すことができ、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態では、オリゴ(dT)に固定されたmRNAからcDNAが合成される。好ましい実施形態では、その後、cDNAは、感染関連マーカーを増幅するために特異的に設計されたプライマーを用いたリアルタイムPCRを使用して増幅される。そのような実施形態で使用されるプライマーは、表1に示されている。幾つかの実施形態で使用されるPCR反応に関する更なる詳細は、米国特許出願第11/376,018号にも見出すことができる。
全血試料を健康なヒト成人から収集した。血液試料を、収集して誘導経時的試験用に幾つかの個々のチューブに入れる際に、ヘパリン処理した。その後、各チューブに由来する18個の等体積分割量を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、100ng/mLのrIL−2、又はフィトヘマグルチニン(PHA)のいずれかで刺激した。分割量を、37℃で0、1、2、4、8、又は20時間インキュベートした。インキュベーション後、試料は、分析するまで−80℃で保存した。各試料を、三重重複で刺激及び分析した。ベータアクチン、IL−2、a型IL−2受容体(CD25)、及びb型IL−2受容体(CD122)をコードするmRNAを、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Mitsuhashi Mら、Clin Chem 52巻:634〜642頁(2006年)に記載の方法により測定した。
ル(Bio−Rad社製)、0.5g/L プロテイナーゼK(Pierce社製)、0.1g/L サケ精子DNA(5 Prime Eppendorf/Brinkman社製)、0.1g/L大腸菌tRNA(Sigma社製)、各5nmol/Lの特異的逆方向プライマー、及び1010分子/Lの合成RNA34(外部対照として)で補完された、60μLの溶解緩衝液原液[5g/L N−ラウロイルザルコシン、4×標準クエン酸生理食塩水、10mmol/L Tris−HCl(pH7.4)、1mmol/L EDTA、1mL/L IGEPAL CA−630(NP−40の代替品)、1.79mol/L チオシアン酸グアニジン(全てSigma社製)]をろ過プレートの各ウェルに添加した。その後、プレートを37℃で10分間インキュベートし、オリゴ(dT)固定化収集マイクロプレート(GenePlate;RNAture社製)の上に設置し、2000gで5分間4℃で遠心分離した。4℃で一晩保存した後、マイクロプレートを、100μLの単純溶解緩衝液で3回洗浄し、その後150μLの洗浄緩衝液[0.5mol/L NaCl、10mmol/L Tris(pH7.4)、1mmol/L EDTA]で4℃にて3回洗浄した。
シヌクレオシド三リン酸、4ユニットのrRNasin、及び80UのMMLV逆転写酵素(Promega社製;プライマーなし)を含有する30μLの緩衝液を添加し、37℃で2時間インキュベーションすることにより、cDNAを各ウェルにて直接合成した。各30μL反応物から、4μLのcDNAを、384ウェルPCRプレートに直接移し、5μLのTaqManユニバーサルマスター混合物(Applied Biosystems社製)、及び1μLの各5μΜ感染関連マーカー又はベータアクチン用順方向及び逆方向プライマー(表1を参照)を添加した。使用したプライマー配列は、上記の表1に示されている。また、ACTB(β−アクチン)用のプライマー配列は、以前に発表されており(Mitsuhashi Mら、Pharm Res.25巻:1116〜1124頁、2008年)、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。PCRは、PRISM7900HT(Applied Biosystems社製)を用いて、95℃で10分間を1サイクル、その後95℃で30秒間、55℃で30秒間、及び60℃で1分間を45サイクルさせて実施した。各遺伝子を別々のウェルで増幅した。サイクル閾値(Ct)、すなわち、ある量のPCR産物(蛍光に基づく)が生成されたサイクルを、分析ソフトウェア(SDS;Applied Biosystems社)を用いて決定した。各mRNAのCtを、ACTBのCtで減算してΔCtを計算し、%ACTBを、2-ΔCt×100により計算した。
本発明の幾つかの実施形態は、攻撃的又は防御的免疫マーカーの発現を誘導する化合物の能力に基づき、薬物化合物候補をスクリーニングするのに使用される。幾つかの実施形態では、そのような薬物スクリーニングアッセイは、抗癌臨床状況において、IL−2と共に同時投与することができる化合物を特定する効率を増加させるだろう。そのような化合物は、理想的には防御的免疫マーカーの発現増加を阻止する。従って、IL−2刺激は、推定上の癌細胞に対する攻撃的免疫応答を誘導し、候補化合物は、IL−2誘導性の負のフィードバック防御免疫応答を阻止し、それにより、攻撃的応答の自己誘導性ダウンレギュレーションを制限するだろう。このように、攻撃的免疫応答は、防御的免疫応答の欠如(又は低減)により効果的に強化される。
の誘導を測定することでは、著しい発現変化(白抜き円)はもたらされなかった。しかしながら、刺激因子としてのrIL−2の存在下では、ヤヌスキナーゼ(Jak)の阻害剤で処理した試料を除いて、ほとんどの血液試料が、TNFSF1 mRNA(攻撃的免疫マーカー)の誘導を示す。この試料は、rIL−2に応答したTNFSF1の誘導を示さなかった。従って、この化合物は、攻撃的免疫応答を阻止又は低減する可能性を有し、免疫抑制促進化合物として機能する可能性がある。しかしながら、防御的免疫応答の2つのマーカー、CD25又はFoxP3(それぞれ、図3I及び3J)に対する同じ化合物の効果を評価すると、データは、rIL−2がこれら防御的マーカーの誘導を阻止することを示す。従って、この一組の実験からは、この特定のJak阻害剤が、攻撃的又は防御的免疫応答の促進によく適するかどうかは不明確である。この化合物の効力を解明するには、更なる用量反応試験及び/又は追加的な免疫マーカーを用いた試験が必要である。
4E〜4F)、CD25(図4G〜4H)、又はFoxP3(図4I〜4J)の誘導を測定した追加的な実験を示す。これらのデータは、攻撃的マーカーIFNγ及びTNFSF−1の誘導の欠如、及びFoxP3、防御関連マーカーの発現誘導により示されるように、Jak1が、攻撃的免疫マーカー(つまり、防御促進性)の特異的阻害剤であることを示す。化合物E084も、攻撃的マーカーIFNγ及びTNFSF−1の特異的阻害を実証した。しかしながら、E084は、CD25及びFoxP3を両方とも誘導し、E084が、防御的免疫応答のより強力な促進因子であり得ることを示唆した。また、本明細書に記載の方法の実施形態は、単一アッセイで、一群の推定上の誘導体化合物と比較したデータを同時に生成することができるという点で、種々の誘導体又は修飾化合物の特徴付けによく適する。更に、上述のデータの明確に異なる特徴に基づき、本明細書に記載の方法の実施形態は、臨床状況で使用される防御特異的(つまり、攻撃促進性)阻害剤化合物の検出に有用である。従って、このアッセイプラットフォームは、攻撃的及び防御的免疫機能の共通の選択的阻害剤の分析/スクリーニングに有用である。
末梢血中で循環する成熟白血球は、一般的に定常状態にあり、それらは、炎症、新生物、異物(微生物、移植組織及び装置、薬物、並びにワクチン)の局所病変に移動すると、特異的な様式で完全に活性化される。活性化の特異性は、他の要因の中でも、リクルートされた白血球のタイプ及び局所的刺激因子のタイプに依存する。in vivo白血球応答をin vitro系でシミュレートするために、この実施例では、未処理の全血を、種々の特異的で一般的な刺激因子に暴露し、白血球応答の多様性を定量化した。種々の白血球応答を、特定のタイプの免疫応答(例えば、体液性免疫、細胞性免疫等)とのそれらの関連性に基づき分類した。
材料
抗T細胞受容体α/β鎖(TCR)モノクローナル抗体(IgG1κ)及び対照マウスIgG1κは、BioLegend社(サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)から得た。逆転写酵素、dNTP、及びRNasinは、Invitrogen社(カールズバッド、カリフォルニア州、米国)から購入した。他の化学薬品は全て、Sigma−Aldrich社(セントルイス、ミズーリ州、米国)から購入した。免疫複合体(熱凝集IgG、HAG)は、以前に記述されているように、ヒトIgGを63℃で15分間加熱することにより調製した(Ostreikoら、1987年)。8ウェルストリップマイクロチューブにて、各1.2μLのフィトヘマグルチニン−L(2mg/ml)、HAG(10mg/ml)、リポ多糖(LPS)(0.5mg/ml)、ザイモサンA(75mg/ml)、組換えインターロイキン2(rIL2)(5μg/ml)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、抗TCR抗体(50μg/ml)、及び対照IgG(50μg/ml)を、8個のウェルにそれぞれ添加し、使用まで−80℃で保存した。
ヘパリン処理した全血試料は、施設内審査委員会の承認後、Apex Research Institute(タスティン、カリフォルニア州、米国)から得た。血液収集後の条件を等しくするために、血液試料を、4℃で一晩保存した。翌朝、血液を貯溜容器にデカントし、8ウェルマルチチャネルピペットを使用して、各60μLの血液を、上述の対照作用剤又は刺激因子を含有する3つのストリップに分注した(図5A)。この試験に必要な血液量は、1.44ml(60μL/ウェル×8つのウェル×3つのストリップ(三重重複))だった。蓋を閉じた後、ストリップを、37℃で4時間インキュベートし、その後−80℃で冷凍保存した。幾つかの実施形態では、より大きな体積の又はより小さな体積の血液を使用してもよいことが理解されるだろう(例えば、多数の刺激因子又は白血球活性化関連遺伝子を試験するために増加させてもよい)。2つの分類の患者、この例では、正常な健康(対照)対象体(表5のデータ)及び癌を有する患者(表6のデータ)で試験した。
標的mRNAのmRNA配列は、GenBankから検索した。PCRプライマーは、Primer Express(Applied Biosystems(ABI)社製、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国)により、コード領域内に設計した(表1を参照)。オリゴヌクレオチドは、IDT社(コーラルビル、アイオワ州、米国)が合成した。標的mRNA(合計32個)は、β−アクチン(ACTB)、β2−ミクログロブリン(B2M)、グランザイムB(GZB)、パーフォリン1(PRF1)、腫瘍壊死因
子スーパーファミリー(TNFSF)−1、2、5、14、及び15、CCLケモカイン−2、4、8、及び20、CXCLケモカイン−3及び10、インターロイキン(IL)−2、4、6、8、10、及び17A、インターフェロン−γ(IFNG)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)、CD11a、16、及び25、トランスフォーミング成長因子ベータ1(TGFB1)、フォークヘッドボックスP3(FOXP3)、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(IGH@)、アルギナーゼ(ARG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、並びにプロオピオメラノコルチン(POMC)だった。
50マイクロリットルの刺激及び冷凍された全血を解凍し、96ウェル特注ろ過プレートに適用した(図5B)。フィルター膜で遠心分離することにより、白血球を単離した。幾つかの実施形態では、フィルター膜で白血球を単離するために、他の技術を使用してもよい(例えば、真空、陽圧、及び重力等)。白血球の単離に関する更なる情報は、米国特許出願第10/796,298号、第11/525,515号、第11/376,018号、第11/803,593号、第11/803,594号、及び第11/803,663号に見出すことができ、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特異的逆方向プライマーの混合液を含有する60μLの溶解緩衝液をろ過プレートに適用し、その結果生じた細胞溶解産物を、ポリ(A)+mRNA精製用のオリゴ(dT)固定化マイクロプレートに移した(図5C)。cDNAを、各ウェルの50μL溶液中で直接合成した:液相では特異的プライマーによるcDNAのプライミング、及び固相ではオリゴ(dT)によるcDNAのプライミング。液相又は固相のcDNAは、iTaqSYBR(Biorad社製、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国)を使用して、サーマルサイクラー(それぞれ、PRISM7900、ABI社製、及びiCycler、Biorad社製)で、リアルタイムPCRに使用した。PCR条件は、95℃で10分間、その後65℃で1分間及び95℃で30秒間の50サイクルだった。IL2及びIL4の場合、4μLの未希釈cDNA溶液を、384ウェルPCRプレートにて10μLの最終体積で使用した。(図5D)。FOXP3、ARG、IFNG、GMCSF、及びPOMCの場合、2μLの未希釈cDNA溶液を、5μLの最終体積でPCRに使用した。その後、cDNAを、32μLのDNase/RNaseフリー水を添加することにより1:2に希釈し、各2μLのcDNAを、5μLの最終体積で、残り24個の遺伝子(IL17A以外)のPCRに使用した。残ったcDNAを新しいストリップマイクロチューブに移した後、固相cDNAを直接使用して、30μLのPCR溶液を添加することによりIL17Aを増幅した。融解曲線を常に分析して、PCRシグナルが単一PCR産物に由来したことを確認した。サイクル閾値(Ct)を、分析ソフトウェア(SDS、ABI社製)で決定し、統計的p値は、刺激因子及び対照の各々の3つのCt値を使用したt検定により計算した。薬物処理した三重重複試料のCtから、対照試料の平均Ct値を個々に減算してΔCtを計算し、増加倍率を2^(−ΔCt)として計算した。
この例では、6つの異なる刺激因子を(2つの対照と共に)使用した(表5及び6、x軸)。PHAは、一般的なT細胞集団を刺激するために一般的に使用されるレクチンである。HAGは、IgG Fc受容体(FcγR)陽性白血球を刺激する免疫複合体のモデルである。主な細胞性標的が、CD16+ナチュラルキラー(NK)細胞である抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)とは異なり、HAGによる刺激は、CD16+、CD32+、及びCD64+細胞を標的とする。LPS及びザイモサンは、先天性免疫を分析するためのトール様受容体(TLR)を刺激するために一般的に使用される作用剤である。抗TCR抗体は、CD4+及びCD8+T細胞の両方のT細胞受容体(α/β鎖)の抗原認識分子に結合するため、普遍的なTCR抗原として使用される(Mitsuhashiら、2008年c)。組換えIL−2は、制御性T細胞(Treg)を含むIL2受容体陽性T細胞に結合し、多種多様な免疫反応を誘導する。
制又は低減する能力を有する。対照的に、それらの発現の低減は、自己免疫疾患の発生を促進する場合がある。従って、負の制御因子の発現及びリクルーター/キラー分子のバランスは、幾つかの実施形態では、所与のタイプの療法の潜在的効力を更に評価するため使用される。表5に示されているように、IL10 mRNAは、抗TCR抗体及びザイモサンにより誘導され、TGFB1 mRNAは、ザイモサンにより誘導された。FOXP3及びCD25 mRNAを、Treg活性のマーカーとして測定した。刺激因子は、FoxP3を誘導しなかったが、CD25は、HAGを除く全ての刺激因子により誘導された(表5を参照)。アルギナーゼmRNAは、MSDC機能のマーカーとして測定したが、誘導は表5では検出されなかった。
Claims (9)
- 免疫に基づく治療または免疫に基づかない治療が対象体に対する有効な治療の候補となるかを決定する方法であって、
対象体から取得された全血の少なくとも第1と第2の分割量を提供すること、
前記第1の分割量を、免疫刺激剤を含有する溶媒に暴露すること、
前記第2の分割量を、前記免疫刺激剤を含有しない前記溶媒に暴露すること、
前記暴露後に、前記第1の分割量における免疫機能関連mRNAの量と前記第2の分割量における該mRNAの量との比率を定量化することを含み、
前記免疫刺激剤が、ザイモサンおよび組換えインターロイキン2からなる群より選択され、
前記免疫機能関連mRNAが、IGH@、CD16、FOXP3、およびアルギナーゼからなる群より選択され、且つ
以下の(a)〜(c)からなる群より選択される特徴を有する、方法:
(a)組換えインターロイキン2への暴露によりFOXP3が誘導されず、ザイモサンへの暴露によりIGH@が誘導されることは、免疫に基づく治療が有効であることを示し、組換えインターロイキン2への暴露によりFOXP3が誘導され、ザイモサンへの暴露によりIGH@が誘導されないことは、免疫に基づかない治療が有効であることを示す;
(b)組換えインターロイキン2への暴露によりFOXP3が誘導されず、ザイモサンへの暴露によりCD16が誘導されることは、免疫に基づく治療が有効であることを示し、組換えインターロイキン2への暴露によりFOXP3が誘導され、ザイモサンへの暴露によりCD16が誘導されないことは、免疫に基づかない治療が有効であることを示す;
(c)組換えインターロイキン2への暴露によりFOXP3が誘導され、ザイモサンへの暴露によりアルギナーゼが誘導されることは、免疫に基づかない治療が有効であることを示し、組換えインターロイキン2への暴露によりFOXP3が誘導されず、ザイモサンへの暴露によりアルギナーゼが誘導されないことは、免疫に基づく治療が有効であることを示す。
- 前記全血が、室温で又は冷却して1日未満保存される、請求項1に記載の方法。
- 前記暴露が、24時間未満である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記暴露が、2〜6時間である、請求項3に記載の方法。
- 前記暴露が、約4時間である、請求項4に記載の方法。
- 前記全血が、ヘパリン処理された全血である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象体が、癌を有する対象体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫に基づく治療が、抗癌免疫療法治療計画を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫に基づかない治療が、放射線、外科手術、および化学療法からなる群より選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
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