TW201415030A - 用於評估胜肽專一免疫的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明的實施例大體上係關於用於評估與一或更多個專一抗原相關的免疫反應的方法。在數個實施例中，本文所描述的方法用於賦能針對特定抗原(諸如，外源傳染原或癌細胞)的特定類型治療的推薦。在數個實施例中，本文揭示的方法賦能對受試者的免疫功能的持續監視。

Description

用於評估胜肽專一免疫的方法 【相關案】
本申請案主張於2012年9月6日提出申請的美國臨時申請案第61/697,591號的權益，該美國臨時申請案的全部揭示內容以引用的方式併入本文。
本揭示案的數個實施例係關於用於評估受試者的T細胞免疫功能的方法。更特定言之，本揭示案的數個實施例係關於受試者的胜肽專一T細胞免疫的體外評估及/或監視施予受試者的胜肽疫苗治療。
免疫系統包含一組各種蛋白質、細胞、組織及相關過程，該組蛋白質、細胞、組織及相關過程用於藉由識別及除去或以其他方式抑制病原體來保護宿主免於疾病及/或傳染。為實現此舉，免疫系統的關鍵功能為區別外源細胞或病原體與內源細胞，例如，區別「自身」及「非自身」。此外，免疫系統的某些細胞用於識別宿主之前所暴露至的病原體，從而改良免疫系統的反應時間及針對宿主的結果。
儘管可藉由量測來自患者的免疫血清樣本中的IgG滴定量評估體液免疫，然而細胞免疫一直沒有直接的診斷對策，直到發明本文揭示的方法。在本文揭示的許多益處中，針對特定抗原的細胞免疫的體外診斷允許評估受試者的抗原專一免疫，從而允許對受試者的整體健康做出特別訂制的及基於充分認知的決定(例如，是否治療或何種治療可能成功)。
因此本文提供用於識別具有針對專一抗原的細胞免疫的受試者的方法，該方法包含以下步驟：從受試者獲得第一血樣(blood sample)及第二血樣，暴露第一血樣至來源於專一抗原的胜肽及單獨暴露第二血樣至溶劑，量化第一及第二全血樣本中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準且當一或更多個T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本增加時，識別受試者為具有針對專一抗原的細胞免疫；或當一或更多個T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本為實質上類似的時，識別受試者為不具有針對專一抗原的細胞免疫。
在數個實施例中，血樣為全血樣本。在數個實施例中，來源於感興趣的專一抗原的胜肽溶解於溶劑中，在此情況下，第二血樣被暴露(在相同條件下)至沒有胜肽的溶劑。
在數個實施例中，藉由包含以下步驟的方法執行量化：添加引物及逆轉錄酶至從第一血樣及第二血樣中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(complementary DNA；cDNA)，及將cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關 標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及DNA聚合酶接觸，以產生擴增的DNA。在數個實施例中，T細胞功能相關標記物包含CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B中的一或更多者。此外，標記物可包括GMCSF、干擾素γ、TNFSF2、CXCL10、CCL4、IL2、IL4、IL10、CTLA4、CCL2及CXCL3中的一或更多者。
在數個實施例中，該方法進一步包含以下步驟：根據受試者具有(或不具有)對特定抗原的細胞免疫，治療受試者。
本文亦提供表徵受試者的胜肽專一T細胞功能的方法，該方法包含以下步驟：從受試者獲得第一全血樣本及第二全血樣本，暴露第一全血樣本至包含來源於抗原的胜肽的溶劑，單獨暴露第二全血樣本至溶劑，及量化第一及第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準，其中一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準在第一全血樣本中相較於第二全血樣本更高指示受試者具有對抗原之細胞免疫，且其中一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準在第一全血樣本中相較於第二全血樣本沒有顯著不同指示受試者缺乏對抗原的細胞免疫。
在數個實施例中，藉由包含以下步驟的方法執行量化：添加引物及逆轉錄酶至從第一全血樣本及第二全血樣本中的每一者分離的RNA以產生互補DNA(cDNA)，及將cDNA與專門針對與一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一 或更多個T細胞功能相關標記物選自由以下物質組成的群組：CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B。此外，該方法視情況進一步包含以下步驟：將cDNA與DNA聚合酶及專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物接觸，該一或更多個T細胞功能相關標記物選自由以下物質組成的群組：GMCSF、干擾素γ、TNFSF2、CXCL10、CCL4、IL2、IL4、IL10、CCL2及CXCL3。
在數個實施例中，該方法進一步包含以下步驟：基於受試者的胜肽專一T細胞功能的特性化治療受試者。
亦提供用於決定胜肽專一治療的效力的似然度的方法，該方法包含以下步驟：從受試者獲得第一及第二血樣，暴露第一血樣至包含胜肽專一治療所針對的胜肽抗原的溶劑，單獨暴露第二血樣至溶劑，藉由方法量化第一及第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準，該一或更多個T細胞功能相關標記物相關於(i)細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能或(ii)T-reg細胞及/或MDSC或T-reg細胞及/或MDSC功能標記物，該量化方法包含以下步驟：(i)添加引物及逆轉錄酶至從第一全血樣本及第二全血樣本中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(cDNA)，及將cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一或更多個T細胞功能相關標記物選自由以下物質組成的群組：CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1 及顆粒酶B；以及當T細胞功能相關標記物相關於細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能及T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本增加時，識別胜肽專一治療效力的增加的可能性；或當(a)T細胞功能相關標記物相關於T-reg細胞及/或MDSC或T-reg細胞及/或MDSC功能及T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本增加時，或(b)T細胞功能相關標記物相關於細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能且T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本為實質上類似的時，識別胜肽專一治療效力的減少的似然度。
此外提供用於監視疫苗的持續效力的方法，該方法包含以下步驟：在受試者暴露至感興趣的抗原之前從受試者獲得第一及第二血樣，將第一血樣暴露至包含來源於感興趣的抗原的胜肽的溶劑，單獨將第二血樣暴露至溶劑，藉由包含以下步驟的方法量化第一及第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準：(i)添加引物及逆轉錄酶至從第一全血樣本及第二全血樣本中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(cDNA)，及(ii)將cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一或更多個T細胞功能相關標記物係選自由以下物質組成的群組：CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B，在針對感興趣的抗原的疫苗已經施予受試者之後從受試者獲得第三及第四血樣，將第三血樣暴露至包含來源於感興趣的 抗原的胜肽的溶劑，單獨將第四血樣暴露至溶劑，藉由包含以下步驟的方法量化第三及第四血樣中一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準：(i)添加引物及逆轉錄酶至從第一全血樣本及第二全血樣本中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(cDNA)，及(ii)將cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一或更多個T細胞功能相關標記物係選自由以下物質組成的群組：CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B，基於第一及第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準視情況標稱化第三及第四血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準；以及當T細胞功能相關標記物的表達在第三樣本中相較於第一樣本增加時，識別疫苗的維持或增加的效力；或當T細胞功能相關標記物的表達在第三樣本中相較於第一樣本減少時，識別疫苗的減少的效力。
亦提供用於識別細胞免疫的生物標記物的方法，該方法包含以下步驟：暴露血樣的第一部分至包含來源於已知抗原的胜肽的溶劑，單獨暴露血樣的第二部分至溶劑，藉由包含以下步驟的方法量化第一及第二部分中一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準：(i)添加引物及逆轉錄酶至從第一全血樣本及第二全血樣本中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(cDNA)，及(ii)將cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一或更多個T細胞功能相關標 記物係選自由以下物質組成的群組：CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B；以及當T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本增加時或當T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本減少時，識別細胞免疫的生物標記物。
此外，本文提供用於決定胜肽專一治療的效力的似然度的方法，該方法包含以下步驟：從受試者獲得第一及第二血樣，將第一血樣暴露至包含胜肽專一治療所針對的胜肽抗原的溶劑，單獨將第二血樣暴露至溶劑，量化第一及第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準，其中一或更多個T細胞功能相關標記物相關於(i)細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能或(ii)T-reg細胞及/或MDSC或T-reg細胞及/或MDSC功能；當T細胞功能相關標記物相關於細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能及T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本增加時，識別胜肽專一治療效力的增加的似然度；或當(a)T細胞功能相關標記物相關於T-reg細胞及/或MDSC或T-reg細胞及/或MDSC功能及T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本增加時，或(b)T細胞功能相關標記物相關於細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能及T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本為實質上類似的時，識別胜肽專一治療效力的減少的似然度。在一些實施例中，當某些T細胞功能相關標記物的表達減少時，觀察效力增加的似然度。舉例而言，在數個實施例中，當T細胞功能相關標記物相關於 細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能且該等T細胞功能相關標記物的表達在該第一樣本中相較於該第二樣本減少時，識別胜肽專一治療效力的增加的似然度。類似地，在某些實施例中，當T細胞功能相關標記物相關於T-reg細胞及/或MDSC或T-reg細胞及/或MDSC功能且該等T細胞功能相關標記物的表達在該第一樣本中相較於該第二樣本減少時，或當T細胞功能相關標記物相關於細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能且該等T細胞功能相關標記物的表達在該第一樣本中相較於該第二樣本為實質上類似的時，可識別效力的減少的似然度。
如本文所使用的，術語「增加的」應被賦予該術語的一般意義且應亦代表大於大約5%、大於大約10%、大於大約15%、大於大約20%、大於大約25%、大於大約50%或以上的表達的增加。同樣地，如本文所使用的，術語「減少的」應被賦予該術語的一般意義且應亦代表大於大約5%、大於大約10%、大於大約15%、大於大約20%、大於大約25%、大於大約50%或以上的表達的減少。在一些實施例中，增加代表表達的統計上顯著的增加(例如，基於已經建立的技術的統計分析為p<0.05)。在一些實施例中，減少代表表達的統計上顯著的減少(例如，基於已經建立的技術的統計分析為p<0.05)。
在數個實施例中，亦提供用於識別可有效治療自身免疫疾病的胜肽專一治療的方法，該方法包含以下步驟：從有患自身免疫疾病風險或遭受自身免疫疾病的受試者獲得血 樣，將血樣的第一部分暴露至包含相關於胜肽專一治療的專一胜肽的溶劑，單獨將血樣的第二部分暴露至溶劑，量化相關於血樣的第一及第二部分中的自限性免疫功能的一或更多個mRNA的表達水準，及當血樣的第一部分中的表達水準相較於血樣的第二部分更大時，決定胜肽專一治療很可能為有效的。
在數個實施例中提供用於監視疫苗的持續效力的方法，該方法包含以下步驟：在受試者暴露至感興趣的抗原之前從受試者獲得第一及第二血樣，將第一血樣暴露至包含來源於感興趣的抗原的胜肽的溶劑，單獨將第二血樣暴露至溶劑，量化第一及第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準，將針對感興趣的抗原的疫苗施予受試者，在施予之後從受試者獲得第三及第四血樣，將第三血樣暴露至包含來源於感興趣的抗原的胜肽的溶劑，單獨將第四血樣暴露至溶劑，量化第三及第四血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準，諸如藉由使用選自由以下方法組成的群組的方法：逆轉錄聚合酶連鎖反應(reverse-transcription polymerase chain reaction；RT-PCR)、即時RT-PCR、北方墨點法、微陣列基因分析、數位PCR、RNA定序、奈米雜交(nanoplex hybridization)、流式細胞分選、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、質譜分析法及西方墨點法，基於第一及第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準標稱化第三及第四血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準，及當T細胞功能相關標記物的表達在第 三樣本中相較於第一樣本增加時，識別疫苗的維持或增加的效力，或當T細胞功能相關標記物的表達在第三樣本中相較於第一樣本減少時，識別疫苗減少的效力。
在額外實施例中，提供用於識別具有針對專一抗原的細胞免疫的受試者之方法，該方法包含以下步驟：從受試者獲得第一及第二血樣，將第一血樣暴露至包含來源於專一抗原的胜肽的溶劑，單獨將第二血樣暴露至溶劑，量化第一及第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準，及當T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本增加時，識別受試者為具有針對專一抗原的細胞免疫，或當T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本為實質上類似的時，識別受試者為不具有針對專一抗原的細胞免疫。
此外，提供表徵受試者的胜肽專一T細胞功能的方法，該方法包含以下步驟：從受試者獲得第一及第二血樣，將第一血樣暴露至包含來源於抗原的胜肽的溶劑，單獨將第二血樣暴露至溶劑，量化第一及第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準，其中第一樣本中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準相較於第二樣本更大指示受試者具有針對抗原的細胞免疫，且其中一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準在第一樣本中相較於第二樣本沒有顯著不同指示受試者缺乏針對抗原的細胞免疫。
在數個實施例中，本文提供的方法允許識別細胞免疫的生物標記物，該方法包含以下步驟：將血樣的第一部分 暴露至包含來源於已知抗原的胜肽的溶劑，單獨將血樣的第二部分暴露至溶劑，量化第一及第二部分中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準，及當T細胞功能相關標記物的表達在第一樣本中相較於第二樣本增加時，識別細胞免疫的生物標記物。
在數個實施例中，使用諸如逆轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)、即時RT-PCR、北方墨點法、微陣列基因分析、數位PCR、RNA定序、奈米雜交、流式細胞分選、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、質譜分析法及西方墨點法的方法實現量化。取決於實施例，其他方法，諸如定量成像技術、免疫組織化學法、免疫沉澱法等等，亦可用於量化T細胞功能的標記物。
在數個實施例中，胜肽專一T細胞功能係關於針對癌症情況、自身免疫情況、病毒傳染、細菌傳染、真菌傳染、酵母菌傳染、由於病原性蛋白顆粒的傳染及由於寄生蟲的傳染中的一或更多者的T細胞活性。在一些實施例中，一或更多個T細胞功能相關標記物係選自由以下物質組成的群組：GMCSF、干擾素γ、TNFSF2、CXCL10、CCL4、IL2、IL4、IL10、CTLA4、CCL2、CXCL3、CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17及精胺酸酶。取決於實施例，除T細胞功能標記物之外或代替T細胞功能標記物，亦量化相關於附加免疫功能的其他標記物。此外，相關於免疫功能的各種途徑的評估亦可視情況根據本文揭示的方法(例如，可整體或部分地評估專一途徑)而不是單個標記物或一組標記物評估。
在數個實施例中，在暴露至溶劑之前不處置全血樣 本，而在數個實施例中，使用阻凝劑處置全血樣本。在數個實施例中，阻凝劑包含肝素。取決於實施例，亦可使用其他阻凝劑(例如，檸檬酸鹽)。
在數個實施例中，樣本在近似於生理溫度的溫度下暴露至胜肽。舉例而言，在數個實施例中，在從大約30℃至大約42℃的溫度下執行暴露。在數個實施例中，在大約37℃的溫度下執行暴露。取決於實施例(例如，基於胜肽的相對抗原性)，可改變暴露持續時間。在數個實施例中，以小於大約8小時的時間量執行暴露。在數個實施例中，時間量為從大約1小時至大約4小時。較長或較短的持續時間可用於其他實施例中。
除了賦能決定胜肽治療的潛在效力、識別用於治療自身免疫疾病的胜肽專一治療、監視疫苗的持續效力、識別具有針對專一抗原的細胞免疫的受試者、表徵受試者的胜肽專一T細胞功能及/或識別細胞免疫的生物標記物之外，取決於實施例，本文所描述的方法允許以下內容中的一或更多者：使得醫療專業人員能夠推薦基於胜肽或非基於胜肽的治療、使得能夠向醫療專業人員推薦胜肽治療是否適合特定患者、使得能夠建議需要治療的受試者接受基於專一胜肽的治療，及基於受試者的T細胞免疫功能治療受試者的方法。
第1A圖至第1L圖圖示回應於藉由控製劑或藉由病毒胜肽庫的刺激各種免疫相關mRNA的誘導。
第2A圖至第2I圖圖示相較於植物血凝素 (phytohemagglutinin；PHA)藉由病毒胜肽庫的mRNA誘導的動力。
免疫功能的改變，無論功能減少或增加，皆是各種潛在健康問題的來源。舉例而言，在一些情況下，過度活化的免疫功能可導致自身免疫疾病。在其他情況下，減少的免疫功能可導致引發傳染、某些疾病風險日益增加及/或引發各種類型癌症的傾向。因此，為了維持受試者的健康或治療患特定疾病的受試者，瞭解受試者的當前免疫狀態可為一條非常重要的資訊。
免疫功能-一般情況及胜肽專一
功能上相關的各種細胞類型、蛋白質及途徑構成免疫系統。免疫系統的功能為藉由識別及隨後除去病原體及/或非所欲的細胞(例如，受損的細胞或腫瘤細胞)保護宿主免於疾病。由於引起傳染或疾病的許多病原體及非所欲的細胞為宿主外部的(或已經失去某一「自身」態樣及獲得某一「非自身」態樣的內源細胞)，故免疫級聯的第一步通常為識別特定細胞為「非自身」的。藉由免疫蛋白I型主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex；MHC)辨識內源細胞。不具有免疫蛋白I型MHC或具有減少的表達水準的彼等細胞可藉由免疫系統標記為受損的「自身」或「非自身」細胞。外源病原體藉由免疫系統處理及來源於外源細胞的抗原與MHC複合，從而使得免疫系統中的其他細胞能夠稍後辨識及標記承載此類外源抗原的細胞。 儘管免疫系統由許多不同細胞類型組成，但是白血細胞(white blood cell；WBC)(白細胞)為關鍵功能類別免疫細胞之一。淋巴細胞為WBC的子類型，淋巴細胞進一步劃分為自然殺傷(natural killer；NK)細胞、T細胞及B細胞。自然殺傷(NK)細胞為專門的細胞毒性淋巴細胞靶細胞且尤其消滅腫瘤細胞、病毒傳染細胞或受損的「自身」細胞。T細胞包含於細胞性免疫反應中(以下更多地論述)而B細胞主要負責體液免疫(關於抗體)。T細胞可藉由細胞表面上T細胞受體的存在與其他淋巴細胞類型區別。T細胞能夠誘導傳染的體細胞或腫瘤細胞死亡。細胞活素(例如，由於發炎或傳染釋放的彼等細胞活素)或外源抗原的呈現活化NK細胞及細胞毒性T細胞，該等NK細胞及細胞毒性T細胞隨後釋放包含各種蛋白質及蛋白酶的小顆粒。一個如此釋放的蛋白質，穿孔蛋白，誘導靶細胞薄膜中孔的形成，允許諸如顆粒酶的蛋白酶進入靶細胞及誘導程式性的細胞死亡(細胞凋亡)。因此，連同其他免疫細胞類型，T細胞在持續的免疫功能及受試者的整體健康中扮演重要角色。
如上所述，T細胞表達T細胞表面的T細胞受體，T細胞受體用於辨識相鄰細胞的表面上表達的專一自身MHC分子。抗原呈現細胞(antigen presenting cell；APC)連同MHC及T細胞協作以抗擊傳染或異物。APC處理外源抗原(例如，藉由吞噬及隨後的分解)及呈現與受試者自身細胞表面上的MHC分子複合的外源抗原的胜肽片段。APC上的胜肽-MHC複合物隨後與某些T細胞(例如，CD4陽性T細胞)上的T細 胞受體相互作用，此為建立胜肽專一免疫的第一步。與APC相互作用的T細胞部分隨後產生包含效應性T細胞及記憶T細胞庫的專一克隆。
效應性T細胞(諸如CD8+T細胞)用於特定地辨識藉由APC處理的特定外源抗原。效應性T細胞在短期至中期作用於攻擊表達外源抗原的細胞，諸如癌細胞、受傳染細胞等等。此被稱為初次細胞性免疫反應。
記憶T細胞在再次細胞性免疫反應中扮演更為突出的角色。記憶細胞代表主要負責辨識最初以胜肽-MHC複合物的形式呈現於T細胞的特定外源抗原的細胞「庫」。在隨後暴露至外源抗原之後，記憶T細胞可快速產生額外的效應性T細胞以抗擊表達外源抗原的細胞。
作為以上概述的事件級聯的結果，受試者產生對抗原的第一較慢反應(初次細胞性免疫反應)，且同時負責準備受試者的免疫系統以在隨後的暴露之後提供更快速的攻擊(再次細胞性免疫反應)。
免疫功能的種類
一般而言，上述免疫級聯可藉由涉及的各種類型的免疫功能表征。免疫活性的主要種類在功能上一起確保免疫系統可有效地將免疫細胞引導至需要免疫細胞的身體區域，且一旦在彼處，免疫細胞作用以抑制及/或殺傷外源細胞或以其他方式幫助提供免疫反應。該等種類包括但不限於：募集功能、殺傷功能、抑制(殺傷)功能或輔助功能。各種其他功能，例如，抗原呈現、血管增生調控、痛覺調節等等亦包 括在內。
有效免疫功能的開始的取閾值步驟為從儲存區域輸送免疫細胞至外源細胞或抗原的位置。此募集功能對於免疫系統的正常功能是重要的。區域(從該等區域調動免疫細胞)包括但不限於：全血、骨髓、淋巴系統及其他區域。免疫細胞的募集允許辨識外源抗原位置處(例如，腫瘤或傳染處)的外源抗原。募集通常藉由從外源細胞或甚至從外源細胞區域中的內源細胞釋放趨化因數啟動。受損或不能正常工作的募集功能意謂免疫細胞不能正確地得到指示在哪裡發揮作用。在一些實施例中，藉由趨化因數或其他趨化性分子提供募集功能。在一些實施例中，特定類型的趨化因數用於募集其他免疫分子。舉例而言，在數個實施例中，CCL分子，諸如CCL-2、CCL-4、CCL-8或CCL-20涉及募集其他免疫細胞。在其他實施例中，涉及CXCL分子，諸如CXCL-3或CXCL-10。在一些實施例中，涉及其他趨化因數效應物，無論是C-C類還是C-X-C類或其他種類皆涉及。
在已經募集至適當位置之後，其他類型的免疫細胞可執行免疫細胞的指定功能，在一些實施例中，該功能為殺傷一或更多個靶細胞。在一些實施例中，靶細胞的死亡經由細胞凋亡發生。舉例而言，當靶細胞為腫瘤細胞時，具有殺傷功能的一或更多個細胞被募集至靶位置。在一些實施例中，此類殺傷細胞表達諸如顆粒酶B、穿孔蛋白、TNFSF1(淋巴細胞毒素)、TNFSF2(TNF-α)、TNFSF5(CD40配位體)、TNFSF6(Fas配位體)、TNFSF14(LIGHT)、TNFSF 15(TL1A) 及/或CD16的分子中的一或更多者。因此，該等細胞募集至靶位置啟動引起靶細胞崩潰的級聯，且因此實現免疫系統的一個目標，例如，使異物或細胞崩潰及/或移除異物或細胞。
免疫系統的另一功能是提供免疫系統的殺傷功能的消極影響(例如，限制)。亦即，至少部分地阻止過度活化的免疫功能，該過度活化的免疫功能可導致自身免疫疾病。參與此限制功能的細胞可藉由標記物辨識，該等標記物包括但不限於：IL10、TGF-β、(forkhead box p3)FoxP3、CD25、精胺酸酶、CTLA-4及/或PD-1。該等細胞幫助藉由保持免疫系統的活性平衡來確保正常的整體免疫功能。
在免疫系統的殺傷功能及/或免疫系統的自限性功能中，可能不同程度地涉及額外的細胞類型。輔助性T細胞(Th細胞)為淋巴細胞的子群組，該等輔助性T細胞幫助最大化免疫系統的能力。不同於上述細胞，Th細胞缺乏細胞毒素或吞噬活性。然而，Th細胞涉及活化且導引其他免疫細胞，諸如細胞毒性T細胞(例如，上述殺傷細胞)。取決於Th細胞初次活化何種細胞類型、Th細胞產生何種細胞活素及促進何種類型的免疫刺激，連同其他因素，Th細胞被劃分為二個主要子種類(Th1或Th2)。舉例而言，Th1細胞初次是與巨噬細胞合作，而Th2細胞初次是與B細胞合作。Th1細胞產生干擾素-γ，TNF-β及IL-2，而Th2細胞產生IL1、IL5、IL6、IL10及IL13。Th細胞子集的標記物為已知的且可用於回應於刺激識別某些Th細胞子類型的誘導。舉例而言，IL2或IFNG的誘導代表Th1細胞對刺激的反應，而IL4或IL10的誘導代 表Th2細胞對刺激的反應。其他子類型，諸如Th17，藉由諸如IL17的其他標記物代表(參見，例如，表5及表6)。
附加免疫功能的各種其他標記物亦存在。舉例而言，可藉由量測GMCSF評估抗原呈現功能，可藉由量測IGH2評估B細胞增殖，可藉由量測VEGF評估血管增生(由於許多腫瘤具有增加的血液流動需求，故血管增生對於可能的腫瘤形成可為特別重要的)，可藉由量測POMC評估痛覺。
在數個實施例中，對於使癌細胞崩潰及抗擊傳染及/或發炎(連同其他應用)，免疫系統的殺傷功能(諸如NK細胞及細胞毒性T細胞的功能)為重要的。由於NK細胞潛在地殺傷不需要的靶細胞以及正常內源細胞二者的能力，NK細胞具有二種類型的表面受體：活化受體及抑制受體。共同地，該等受體用於平衡NK細胞的活性且因此調節NK細胞的細胞毒素活性。需要活化訊號用於NK細胞的活化，且活化訊號可包括細胞活素(諸如干擾素)及/或外源配位體，該細胞活素對靶細胞的FcR受體進行活化(針對靶細胞已經提供體液免疫反應)，該外源配位體接合各種活化NK細胞表面受體。隨後藉由上述凋亡機制破壞靶細胞。
類似地，細胞毒性T細胞亦需要活化，經考慮為經由二訊號過程引起呈現外源(例如，非自身的)抗原至細胞毒性T細胞。一旦被活化，主要回應於介白素-2(IL-2)(介白素-2為一種T細胞的生長分化因數)，細胞毒性T細胞經歷克隆擴增。細胞毒性T細胞在誘導孔隙形成且靶細胞凋亡方面的作用有點類似於NK細胞的作用。在數個實施例中，識別 受試者的專一T細胞功能對於決定受試者提供對特定外源抗原的反應的能力為重要的。此外，在數個實施例中，T細胞的功能至少部分地決定受試者的免疫功能的反應速率。
免疫功能的自限性被認為藉由T-reg細胞及MDSC緩和。在胸腺中發展的許多T-reg細胞表達叉頭族轉錄因數FoxP3(forkhead box p3)。在許多疾病狀態中，尤其是癌症，發現T-reg細胞數量改變，尤其是表達Foxp3的彼等T-reg細胞。舉例而言，患有腫瘤的患者具有局部相對過量的Foxp3陽性T細胞，該等Foxp3陽性T細胞抑制身體壓制癌細胞形成的能力。MDSC不破壞攻擊性T細胞，然而，MDSC確實改變細胞毒性T細胞的行為方式。MDSC分泌精胺酸酶(arginase；ARG)，即一種分解胺基酸精胺酸的蛋白酶。包括細胞毒性T細胞及NK細胞的淋巴細胞間接地取決於精胺酸而活化。藉由MDSC分泌ARG限制NK細胞及細胞毒性T細胞的活化。因此，在數個實施例中，胜肽專一免疫可受到T細胞的活化限制的影響。在一些情況下，T-reg細胞及MDSC的自限性調整可導致在局部組織環境中免疫系統的功能的整體限制。此具有導致減少的殺傷功能的潛能及減少的殺傷功能可能不足以完全地去除外源細胞。
如以下更詳細論述的，評估胜肽專一免疫允許評估疫苗的效力、受試者將(或將不)提供針對特定抗原的免疫反應的機率及隨時間跟蹤相關於一種專一抗原或一類抗原的免疫功能(以及其他應用)。此外，藉由本文揭示的方法，專一抗原(或一類抗原)可關於其如何個別地刺激免疫功能 來評估。
診斷措施
受試者可接收針對治療(例如，除去)受試者體內的特定細胞族群(例如，癌性腫瘤)的免疫治療或疫苗接種。回應於免疫治療或疫苗接種，專一IgG可在受試者體內被誘導產生。儘管彼專一IgG的滴定量可藉由各種免疫測定來量測，但是該等測定一般無法提供關於對疫苗專一的T細胞功能的資訊。因此，目前不存在常規診斷測試以決定針對特定目標(例如，如上所述的外源抗原或彼抗原的胜肽片段)的T細胞功能。諸如細胞分離、改變培養條件及偵測或量化功能的方法的技術困難已阻礙了此類常規診斷測定。舉例而言，為了刺激受試者的T細胞上的T細胞受體，需要來自 彼受試者 的活細胞(T細胞不辨識非自身MHC)；換言之，匹配MHC的供體細胞為必需的。此呈現關於診斷測定的實際用途的問題為必須收集受試者自身的細胞且在評估胜肽專一T細胞免疫之前受試者自身的細胞必須在培養物中生長。
為了解決該等限制且提供胜肽專一T細胞免疫的更常規的診斷評估，本文揭示的數個實施例使得能夠使用一組一或更多個外源胜肽(例如，針對彼等外源胜肽受試者的免疫評估為所欲的)。在數個實施例中，外源胜肽用於補充已經藉由APC處理的彼等胜肽，從而允許彼特定受試者的T細胞功能的更完全的決定。
在數個實施例中，本文揭示的方法用於隨時間監視受試者對於特定胜肽目標的免疫功能。舉例而言，在一些實 施例中，可從受試者收集複數個樣本及評估胜肽專一T細胞功能。在一些實施例中，此隨時間監視的結果使得能夠決定彼受試者是否已經具有或持續具有增加水準的彼胜肽專一的免疫活性。在一些實施例中，此隨時間的監視可用於評估受試者是否已經發展有免疫缺陷(例如，先天的或獲得性免疫缺陷)。在數個實施例中，此評估藉由從患者收集樣本及將樣本暴露至一組專一胜肽來進行。在數個實施例中，此暴露將引起誘導某些免疫相關的mRNA。若之前誘導的mRNA顯示缺乏誘導或顯示減少的誘導，則隨時間收集及以相同方式測試後續樣本將證明回應於該組中專一胜肽中的一或更多者的免疫反應低下。有利地，此決定使得能夠偵測受試者在早期的免疫功能受損的狀態，從而在需要時允許適當的醫療介入。在一些實施例中，使用單肽而非一組專一胜肽。
在數個實施例中，監視胜肽專一T細胞功能可用於評估疫苗治療的效力。暴露至抗原之前，受試者將不會具有回應於受試者的血樣暴露至來源於抗原的胜肽而誘導產生的mRNA。若彼受試者隨後接收包含彼特定抗原的疫苗，則受試者的免疫系統將如本文所描述的處理抗原。之後，暴露來自受試者的血樣至來源於抗原的胜肽將誘導產生mRNA(因為受試者已經產生辨識彼胜肽/抗原的免疫細胞)。以此方式，可監視受試者體內疫苗治療的效力。舉例而言，在最初的疫苗接種之後，暴露至胜肽之後的mRNA的誘導產生可用作針對持續監視的基線。收集將來樣本及如本文所揭示的測試該等樣本之後，隨時間誘導的水準減少指示疫苗效力的損失。 在數個實施例中，此表明疫苗的新的「加強劑」或替代疫苗可為必需的。在一些實施例中，在最初樣本中mRNA的誘導產生的決定用作閾值。換言之，若特定mRNA的誘導產生不足以達到某一水準，則在一些實施例中，施予另一劑疫苗。隨後重複對患者反應的測試，且若滿足閾值誘導，則不需要進行額外的疫苗施予(直到如需要「加強劑」的時候，如上所述)。
在一些實施例中，本文揭示的方法用於決定受試者之前是否已經暴露至特定胜肽。舉例而言，在數個實施例中，若受試者之前沒有暴露至特定抗原，則將可能偵測不到免疫相關的mRNA的誘導產生。此至少部分地歸因於相對缺乏記憶T細胞，如上所述。相反，若事實上受試者之前已經暴露至專一胜肽，則將引起免疫相關的mRNA的誘導產生，因為第一次暴露已經導致產生記憶T細胞庫。因此，在數個實施例中，可基於隨後暴露至彼胜肽來決定對受試者是否有處於過度免疫反應的風險。
在數個實施例中，評估受試者的胜肽專一免疫使得能夠決定受試者是否可提供針對特定類型外源細胞(例如，特定類型的癌細胞)的有效反應。舉例而言，若專一癌細胞產生癌細胞(相較於正常細胞)獨有的標記物(例如，胜肽)且暴露來自受試者的樣本至彼專一胜肽引起相關於殺傷功能(例如，細胞毒性T細胞)的免疫相關的mRNA的誘導，則很可能受試者能提供針對彼癌細胞的免疫反應。相反，來自受試者的樣本暴露至癌細胞的專一胜肽及缺乏相關於殺傷的 免疫功能相關的mRNA的誘導將指示受試者不太可能能夠提供免疫反應以去除癌細胞。在此類情況中，輔助治療(例如，外科手術、化學或放射治療)為可建議的。
在數個實施例中，本文揭示的方法用於識別具有針對專一抗原的細胞免疫的受試者及相應地治療彼受試者。在數個實施例中，此方法包含以下步驟：從受試者獲得至少二個生物樣本(例如，血樣)，暴露此類樣本中的一者至來源於感興趣的專一抗原的胜肽及以相同條件(無胜肽)處置第二樣本，及量化樣本中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準。當分析T細胞功能標記物的表達時，若相較於未暴露至胜肽的樣本，暴露至胜肽的該樣本中的該一或更多個T細胞功能相關標記物的表達增加，則受試者可經識別為具有針對專一抗原的細胞免疫。同樣地，當該一或更多個T細胞功能相關標記物的表達在兩個樣本(暴露至胜肽對比未暴露至胜肽)中為實質上類似的時，受試者經識別為不具有針對專一抗原的細胞免疫。基於彼識別，可相應地治療受試者。因此，在受試者展示細胞免疫的彼等實施例中，基於免疫的治療可施予受試者。若沒有偵測到細胞免疫，則基於非免疫的治療可認定為對彼受試者更有效。在數個實施例中，使用來自感興趣的抗原的胜肽對受試者「接種疫苗」，從而增強受試者提供的細胞免疫反應。
在數個實施例中，亦提供基於受試者的胜肽專一T細胞功能治療受試者的方法。類似於以上內容，從受試者收集複數個血樣，將該等複數個血樣中的至少一者暴露至來源 於感興趣的抗原的胜肽且該等複數個血樣中的一者未如此暴露。在暴露的及未暴露的樣本中一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準被量化且當T細胞功能相關標記物的表達水準在暴露的樣本中相較於未暴露的樣本更大時，受試者具有針對彼專一抗原的細胞免疫。相反地，當表達水準在暴露樣本中相較於未暴露樣本沒有顯著不同時，受試者缺乏對該抗原的細胞免疫。之後，執行特定治療的施予；若受試者的確具有細胞免疫則執行基於免疫的治療且若受試者缺乏細胞免疫則執行基於非免疫的治療。
在數個實施例中，根據本文所描述的方法執行量化。舉例而言，在一個實施例中，量化包含以下步驟：添加引物及逆轉錄酶至從樣本(暴露的及未暴露的)中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(cDNA)，及將該cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA。
此外，數個實施例係針對決定胜肽專一治療的效力的似然度及隨後若適當時施予治療。在數個實施例中，該等方法包含以下步驟：從受試者獲得第一及第二血樣，將該第一血樣暴露至包含該胜肽專一治療所針對的胜肽抗原的溶劑及單獨將該第二血樣暴露至溶劑。之後，量化一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準。取決於實施例，該等標記物可為細胞毒性T細胞標記物或細胞毒性T細胞功能或T-reg細胞及/或MDSC功能標記物。當該等T細胞功能相關標記物相關於細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能且該等T細胞 功能相關標記物的表達在該第一樣本中相較於該第二樣本增加時，隨後識別胜肽專一治療為具有效力增加的似然度。或者，當(a)該等T細胞功能相關標記物相關於T-reg細胞及/或MDSC或T-reg細胞及/或MDSC功能且該等T細胞功能相關標記物的表達在該第一樣本中相較於該第二樣本增加時，或(b)該等T細胞功能相關標記物相關於細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能且該等T細胞功能相關標記物的表達在該第一樣本中相較於該第二樣本實質上為類似的時，量化可引起識別胜肽專一治療效力減少的似然度。基於識別胜肽專一治療為有效的，治療能因此施予受試者(當決定可能有效時)或者施予可放棄(當決定不可能有效時)。在數個實施例中，胜肽專一治療為抗癌治療。
又，在一個實施例中，存在用於識別對治療受試者的自身免疫疾病有效的胜肽專一治療及之後治療受試者的方法。在數個實施例中，該方法包含以下步驟：從處於自身免疫疾病的風險或遭受自身免疫疾病的受試者獲得血樣，將該血樣的第一部分暴露至包含相關於該胜肽專一治療的專一胜肽的溶劑，單獨將該血樣的第二部分暴露至該溶劑，及量化該血樣的該第一及該第二部分中的相關於自限性免疫功能的一或更多個mRNA的表達水準，當表達水準在血樣的第一部分中相較於血樣的第二部分更大時，決定胜肽專一治療很可能為有效的，及當決定胜肽專一治療很可能為有效的時，施予胜肽專一治療至受試者。
在數個實施例中，本文揭示的方法可用於決定特定 類型胜肽疫苗的潛在效力。舉例而言，在某些自身免疫情況中，存在攻擊受試者體內的其他內源細胞的細胞或蛋白質(如伴隨I型糖尿病出現)。本文揭示的方法的數個實施例用於決定推定胜肽疫苗的潛在效力。換言之，若將來自受試者的樣本暴露至推定胜肽疫苗引起相關於以上論述的自限性免疫功能的mRNA的誘導產生，則有可能彼推定的胜肽疫苗將有效治療自身免疫症狀。此是因為診斷測試已經指示胜肽將誘導相關於受試者免疫功能的自限性的一組細胞。此外，該等細胞將特別地針對亦承載專一胜肽及正攻擊內源細胞的彼等細胞(例如，「罪犯」細胞)。
目標情況
在數個實施例中，本文揭示的方法及組成物用於評估受試者提供針對各種不同專一抗原的免疫反應的能力。舉例而言，在數個實施例中，外源抗原可來源於癌細胞(或其他變異細胞)。可取決於實施例測試對各種癌症專一的標記物。舉例而言，在數個實施例中，可測試受試者針對各種癌症的專一免疫，該等癌症包括但不限於：急性淋巴母細胞性白血病(lymphoblastic leukemia；ALL)、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia；AML)、腎上腺皮質癌、卡波西肉瘤、淋巴瘤、胃腸癌、闌尾類癌、中樞神經系統癌、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦腫瘤(包括但不限於：星狀細胞瘤、脊髓腫瘤、腦幹神經膠質瘤、顱咽管瘤、成室管膜細胞瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、髓上皮瘤)、乳癌、支氣管腫瘤、伯奇氏淋巴瘤、宮頸癌、結腸癌、慢性淋巴細胞性 白血病(chronic lymphocytic leukemia；CLL)、慢性粒性白血病(chronic myelogenous leukemia；CML)、慢性脊髓增生異常、導管癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤毛細胞白血病、腎細胞癌、白血病、口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、眼部癌症、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腦垂體癌、子宮癌及陰道癌。
替代地，在數個實施例中，可測試受試者針對來源於細菌、病毒、真菌及/或寄生蟲的傳染細胞的專一免疫。在一些實施例中，回應於細菌來源傳染(例如，選自由以下種類組成的群組的傳染性細菌：博多氏桿菌屬、螺旋體屬、布魯氏桿菌屬、曲狀桿菌屬、衣原體及嗜衣體屬、梭狀芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、腸球菌屬、大腸桿菌屬、法蘭西斯氏菌屬、嗜血桿菌屬、幽門螺桿菌屬、退伍軍人桿菌屬、勾端螺旋體屬、李斯特菌屬、分枝桿菌屬、支原體屬、奈瑟菌屬、假單孢菌屬、立克次體屬、沙門氏桿菌屬、志賀氏桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、螺旋體屬、弧菌屬及耶氏桿菌屬，及突變株或所述者的組合)的T細胞可藉由本文揭示的方法的數個實施例識別。
在一些實施例中，可評估受試者提供針對病毒來源的傳染物的專一反應的能力。病毒可包括但不限於：腺病毒、柯薩奇病毒、非洲淋巴細胞瘤病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、單純泡疹病毒、1型單純泡疹病毒、2型巨細胞病毒、埃博拉病毒、人類8型泡疹病毒、愛滋病病毒(HIV)、流行感冒病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人類乳頭 狀瘤病毒、副流行感冒病毒、脊髓灰白質病毒、狂犬病病毒、呼吸道融合病毒、風疹病毒及水痘-帶狀泡疹病毒，及所述者的組合。外泌體亦可用於處置各種廣泛的細胞類型，包括但不限於：血管細胞、上皮細胞、間質細胞、肌肉組織(骨骼肌、平滑肌及/或心肌)、骨骼細胞(例如，骨頭、軟骨及結締組織)、神經細胞(例如，神經元、膠質細胞、星狀細胞、許旺細胞)、肝細胞、腎細胞、內臟細胞、肺細胞、皮膚細胞或身體內的任何其他細胞。
在數個實施例中，本文揭示的方法用於決定受試者是否可提供(或具有)對具有改變的代謝功能的細胞的免疫反應。在一些實施例中，具有新陳代謝差異的細胞(相較於正常細胞)表達專一識別標記物。受試者可提供針對此類細胞的免疫反應，努力避免基於障礙細胞的不良影響的機率。舉例而言，細胞的新陳代謝紊亂可引起細胞從正常細胞轉換為原癌細胞。因此，免疫反應可在細胞變成癌細胞之前除去細胞。在數個實施例中，可偵測到自身免疫的傾向。在數個實施例中，本文揭示的方法可用於決定是否事實上受試者之前已產生具有某一新陳代謝障礙的細胞。舉例而言，在一些實施例中，本文揭示的方法允許偵測對特定類型的新陳代謝機能障礙專一的胜肽。
方法
在數個實施例中，在所主張的方法中使用的樣本為全血樣本。在數個實施例中，可肝素化血樣。一旦收集，將血樣暴露至至少一個專一抗原。如上所述，抗原可來源於各 種來源(癌細胞、病毒、細菌等等)中的任一者。在一些實施例中，在近似於生理溫度的溫度下發生暴露。在數個實施例中，在從大約30℃至大約40℃的溫度下執行暴露。在數個實施例中，在大約37℃下執行暴露。取決於實施例，暴露的持續時間可從大約一個小時變化至大約八個小時。在一些實施例中，暴露持續大約1小時至大約2小時、大約二個小時至大約三個小時、大約三個小時至大約四個小時、大約四個小時至大約五個小時、大約五個小時至大約六個小時或大約六個小時至大約八個小時。取決於實施例，亦使用更長或更短的暴露持續時間。在一些實施例中使用單肽，而在其他實施例中使用複數個胜肽或一組胜肽。在數個實施例中，構成組的胜肽全部來源於共用一般來源，例如，所有胜肽來自單個類型的癌細胞。在一些實施例中，構成組的胜肽來源於不同來源，例如，一些胜肽來自癌細胞且一些胜肽來自諸如細菌的傳染物。設計胜肽組的撓性允許取決於測試的特定受試者的需要而訂制決定胜肽專一T細胞功能。
在一些實施例中，使用不反應的溶劑(例如，磷酸鹽緩衝鹽水)稀釋胜肽，從而使偵測到的誘導量合適，使得實現所欲的訊號增益度(例如，訊號訊雜比足以允許精確的量化)。因此，在數個實施例中，該等方法包含以下步驟：將血樣(例如，全血樣本)暴露至來源於感興趣的抗原的胜肽，彼胜肽已經在溶劑中被分散(例如，被稀釋)。在數個實施例中，血樣為全血樣本。在數個實施例中，不添加額外的抗原呈現細胞至樣本。儘管在數個實施例中使用溶劑稀釋 胜肽，但是在其他實施例中不使用溶劑(例如，若胜肽已經乾燥，諸如具有冷凍乾燥的胜肽)。
在決定mRNA水準的彼等實施例中，除了白細胞以外的紅細胞及血液成份視情況從全血樣本移除。在其他實施例中，使用全血，不去除或分離出任何特定的細胞類型。在較佳實施例中，使用用於分離及擴增mRNA的裝置分離出白細胞。此裝置的實施例更詳細地描述於美國專利案第7,745,180號、第7,968,288號、第7,939,300號、第7,981,608號及第8,076,105號中，該等專利申請案的每一者以引用方式整體併入本文。
簡言之，裝置的某些實施例包含：含有複數個樣本輸送井的多井板、井下方的白細胞擷取過濾器及過濾器下方的含有固定化的寡酶(dT)的mRNA擷取區域。在某些實施例中，裝置亦含有適用於接收過濾板的真空箱以在板與箱之間建立密封，使得當施加真空壓力時，從樣本輸送井跨過白細胞擷取過濾器汲取血，從而擷取白細胞及允許非白細胞血液成份藉由清洗過濾器來移除。在其他實施例中，使用經由從樣本井中及經由跨過白細胞擷取過濾器汲取血樣(諸如離心作用或正壓力)的其他手段。在裝置的較佳實施例中，在層疊在一起的複數個過濾薄膜上擷取白細胞。在數個實施例中，隨後使用裂解液溶解擷取的白細胞，從而從擷取的白細胞中釋放mRNA。隨後將mRNA與mRNA擷取區域中固定化的寡核苷酸(dT)混合。關於可用於數個實施例中的裂解液的組成的進一步細節可見美國專利案第8,101,344號，該美國專利 案以引用的方式整體併入本文。在數個實施例中，從固定化的寡聚(dT)mRNA合成cDNA。在較佳實施例中，隨後使用具有特別設計用於擴增傳染相關的標記物的引物的即時PCR擴增cDNA。在數個實施例中，使用量化mRNA的其他方法，包括但不限於：北方墨點法、二維RT-qPCR、RNase保護等等。在數個實施例中，使用其他量測端點，諸如，蛋白水準及/或功能測試。
在完成PCR反應之後，量化一或更多個白細胞功能相關標記物的各種mRNA(如藉由偵測到的PCR擴增cDNA的數量代表)。在某些實施例中，藉由比較編碼一或更多個標記物的mRNA的數量與參考值計算量化。在其他實施例中，參考值為未藉由刺激劑誘導的基因(例如，管家基因)的表達水準。在某些此類實施例中，β-肌動蛋白被用作參考值。在所屬技術領域中眾所周知的許多其他管家基因亦可被用作參考值。在其他實施例中，管家基因被用作校正因數，使得最後的比較為一或更多個白細胞功能相關標記物的誘導的表達水準，相較於來自非誘導(控制)樣本的相同標記物。在又其他實施例中，參考值為零，使得一或更多個白細胞功能相關標記物的量化藉由絕對數代表。在數個實施例中，量化二個、三個或三個以上白細胞功能相關標記物。在數個實施例中，使用即時PCR執行量化及以成倍增加(對比適當控制)來表達資料。在某些實施例中，使用選自由以下內容組成的群組中的方法量化一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準：逆轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)、即時RT-PCR、 北方墨點法、微陣列基因分析、數位PCR、RNA定序、奈米雜交、流式細胞分選、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、質譜分析法及西方墨點法。在一些實施例中，當某些T細胞功能相關標記物的表達減少時，觀察效力的增加的似然度。舉例而言，在數個實施例中，當T細胞功能相關標記物相關於細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能且該等T細胞功能相關標記物的表達在該第一樣本中相較於該第二樣本減少時，識別胜肽專一治療的效力的增加的似然度。類似地，在某些實施例中，當T細胞功能相關標記物相關於T-reg細胞及/或MDSC或T-reg細胞及/或MDSC功能且該等T細胞功能相關標記物的表達在該第一樣本中相較於該第二樣本減少時，或當T細胞功能相關標記物相關於細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能且該等T細胞功能相關標記物的表達在該第一樣本中相較於該第二樣本為實質上類似的時，可識別效力的減少的似然度。
如本文所使用的，術語「增加的」應被賦予該術語的一般意義且應亦代表大於大約5%、大於大約10%、大於大約15%、大於大約20%、大於大約25%、大於大約50%或以上的表達的增加。同樣地，如本文所使用的，術語「減少的」應被賦予該術語的一般意義且應亦代表大於大約5%、大於大約10%、大於大約15%、大於大約20%、大於大約25%、大於大約50%或以上的表達的減少。在一些實施例中，增加代表表達的統計上的顯著增加(例如，基於建立的技術的統計分析為p<0.05)。在一些實施例中，減少代表表達的統計上 的顯著減少(例如，基於建立的技術的統計分析為p<0.05)。
實例
將參閱以下實例描述特定實施例，該實例應視為說明性的而不是限制意義的。
實例1-回應於胜肽暴露的免疫功能相關的mRNA的誘導
儘管知道MHC上的胜肽來源於APC中分解的蛋白質，然而，當前實例評估以外源胜肽替換(或補充)內源胜肽。使用市售的胜肽庫(CEF胜肽庫；Mabtech,www.mabtech.com)，儘管如上所述，使用單肽或訂制的胜肽組。此庫包含23個不同的I類限制胜肽，所有胜肽界定為來源於巨細胞病毒、非洲淋巴細胞瘤病毒及流行感冒病毒的共用CD8+T細胞抗原決定基。此組在幾乎90%的白種人中藉由病毒專一CD8+T細胞誘導IFN-γ產生且亦在許多單獨情況中引出穿孔蛋白、顆粒酶B及MIP-1β反應。
庫存胜肽(200μg/mL)在PBS中以1：3、1：10、1：10及1：100稀釋且在37℃下施加至肝素化全血長達4小時。沒有添加額外的細胞。分別使用正及負控制白細胞凝集素(PHA-L)及PBS。
如第1圖所圖示，正控制PHA-L誘導GMCSF、IFNG、TNFSF2、CXCL10、CCL4、IL4、IL10、CTLA4及CXCL3，然而控制管家基因β肌動蛋白(beta actin；ACTB)沒有被誘導。此證實CEF胜肽庫以劑量依賴方式誘導GMCSF、IFNG、TNFSF2、CXCL10及CCL4的適當執行。
第2圖圖示回應於暴露至CEF組的mRNA誘導的動 力。在長達1、2、4、8及24小時的持續時間如上所述執行暴露且藉由即時PCR評估mRNA表示(封閉的圓圈代表藉由CEF的誘導及開放的三角形為PBS控制)。各種mRNA的誘導的類似性顯示外源胜肽替換(或補充)MHC上存在的胜肽，而不是藉由細胞佔據及經處理以與MHC複合(此將移動CEF暴露的運動曲線至右邊)。
該等資料指示白細胞暴露至外源胜肽允許誘導免疫功能相關的mRNA。同樣地，此實驗說明可藉由本文揭示的體外方法評估胜肽專一T細胞免疫。

Claims (53)

  1. 一種用於識別具有針對一專一抗原的細胞免疫的一受試者的方法，該方法包含以下步驟：從一受試者獲得一第一全血樣本及一第二全血樣本；將該第一全血樣本暴露至包含來源於該專一抗原的一胜肽的一溶劑；單獨將該第二全血樣本暴露至該溶劑；藉由包含以下步驟的一方法量化該第一及該第二全血樣本中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準：(i)添加一引物及一逆轉錄酶至從該第一全血樣本及該第二全血樣本中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(cDNA)，以及(ii)將該cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及一DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一或更多個T細胞功能相關標記物選自由以下物質組成的群組：CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B；以及當該一或更多個T細胞功能相關標記物的該表達在該第一樣本中相較於該第二樣本增加時，識別該受試者為具有針對該專一抗原的細胞免疫；或當該一或更多個T細胞功能相關標記物的該表達在該第一樣本中相較於該第二樣本為實質上類似的時，識別該受試者為不具有針對該專一抗原的細胞免疫。
  2. 如請求項1所述之方法，該方法進一步包含以下步驟：將該cDNA與一DNA聚合酶及專門針對該一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物接觸，該一或更多個T細胞功能相關標記物係選自由以下物質組成的群組：GMCSF、干擾素γ、TNFSF2、CXCL10、CCL4、IL2、IL4、IL10、CTLA4、CCL2及CXCL3。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該專一抗原相關於一癌症情況、一病毒傳染、一細菌傳染、一真菌傳染、一酵母菌傳染、由於病原性蛋白顆粒的傳染及由於寄生蟲的傳染中的一或更多者。
  4. 如請求項1所述之方法，其中使用一阻凝劑處置該等全血樣本。
  5. 如請求項4所述之方法，其中該阻凝劑包含肝素。
  6. 如請求項1所述之方法，其中該暴露步驟在從大約30℃至大約42℃的一溫度下執行。
  7. 如請求項6所述之方法，其中該暴露步驟在大約37℃的一溫度下執行。
  8. 如請求項1所述之方法，其中執行該暴露步驟達小於大約8小時的一時間量。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該時間量為從大約1至大約4小時。
  10. 一種表徵一受試者的該胜肽專一T細胞功能的方法，該方法包含以下步驟：從一受試者獲得一第一全血樣本及一第二全血樣本；將該第一全血樣本暴露至包含來源於一抗原的一胜肽的一溶劑；單獨將該第二全血樣本暴露至該溶劑；藉由包含以下步驟的一方法量化該第一及該第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準：(i)添加一引物及一逆轉錄酶至從該第一全血樣本及該第二全血樣本中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(cDNA)，以及(ii)將該cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及一DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一或更多個T細胞功能相關標記物係選自由以下物質組成的群組：CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B；以及 其中該一或更多個T細胞功能相關標記物的一表達水準在該第一全血樣本中相較於該第二全血樣本更大指示該受試者具有對該抗原的細胞免疫，以及其中該一或更多個T細胞功能相關標記物的一表達水準在該第一全血樣本中相較於該第二全血樣本沒有顯著不同指示該受試者缺乏對該抗原的細胞免疫。
  11. 如請求項10所述之方法，該方法進一步包含以下步驟：將該cDNA與一DNA聚合酶及專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物接觸，該一或更多個T細胞功能相關標記物係選自由以下物質組成的群組：GMCSF、干擾素γ、TNFSF2、CXCL10、CCL4、IL2、IL4、IL10、CCL2及CXCL3。
  12. 如請求項10所述之方法，其中該胜肽專一T細胞功能針對一癌症情況、一自身免疫情況、一病毒傳染、一細菌傳染、一真菌傳染、一酵母菌傳染、由於病原性蛋白顆粒的傳染及由於寄生蟲的傳染中的一或更多者。
  13. 如請求項10所述之方法，其中使用一阻凝劑處置該等全血樣本。
  14. 如請求項13所述之方法，其中該阻凝劑包含肝素。
  15. 如請求項10所述之方法，其中該暴露步驟在從大約30℃至大約42℃的一溫度下執行。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該暴露步驟在大約37℃的一溫度下執行。
  17. 如請求項10所述之方法，其中執行該暴露步驟達小於大約8小時的一時間量。
  18. 如請求項17所述之方法，其中該時間量為從大約1小時至大約4小時。
  19. 一種用於決定一胜肽專一治療的效力的似然度的方法，該方法包含以下步驟：從一受試者獲得一第一及一第二血樣；將該第一血樣暴露至包含該胜肽專一治療所針對的一胜肽抗原的一溶劑；單獨將該第二血樣暴露至該溶劑；藉由包含以下步驟的方法量化該第一及該第二血樣中的相關於(i)細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能或(ii)T-reg細胞及/或MDSC或T-reg細胞及/或MDSC功能標記物的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準： (i)添加一引物及一逆轉錄酶至從該第一全血樣本及該第二全血樣本中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(cDNA)，以及(ii)將該cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及一DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一或更多個T細胞功能相關標記物係選自由以下物質組成的群組：CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B；以及當該等T細胞功能相關標記物相關於細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能及該等T細胞功能相關標記物的表達在該第一樣本中相較於該第二樣本減少時，識別該胜肽專一治療的效力的一增加的似然度；或當以下情況時，識別該胜肽專一治療的效力的一減少的似然度：(a)該等T細胞功能相關標記物相關於T-reg細胞及/或MDSC或T-reg細胞及/或MDSC功能且該等T細胞功能相關標記物的表達在該第一樣本中相較於該第二樣本增加，或(b)該等T細胞功能相關標記物相關於細胞毒性T細胞或細胞毒性T細胞功能且該等T細胞功能相關標記物的該表達在該第一樣本中相較於該第二樣本為實質上類似的。
  20. 如請求項19所述之方法，其中該胜肽專一治療為一抗癌治療。
  21. 如請求項19所述之方法，該方法進一步包含以下步驟：將該cDNA與一DNA聚合酶及專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物接觸，該一或更多個T細胞功能相關標記物係選自由以下物質組成的群組：GMCSF、干擾素γ、TNFSF2、CXCL10、CCL4、IL2、IL4、IL10、CTLA4、CCL2及CXCL3。
  22. 如請求項19所述之方法，其中該胜肽抗原來源於從以下物質組成的群組中選擇的一來源：一病毒、一細菌及一癌細胞。
  23. 如請求項19所述之方法，其中使用一阻凝劑處置該等全血樣本。
  24. 如請求項23所述之方法，其中該阻凝劑包含肝素。
  25. 如請求項19所述之方法，其中該暴露步驟在從大約30℃及大約42℃的一溫度下執行。
  26. 如請求項25所述之方法，其中該暴露步驟在大約37℃的一溫度下執行。
  27. 如請求項19所述之方法，其中執行該暴露步驟達小於大約8小時的一時間量。
  28. 如請求項27所述之方法，其中該時間量為從大約1小時至大約4小時。
  29. 一種用於識別有效治療一自身免疫疾病的一胜肽專一治療的方法，該方法包含以下步驟：從處於一自身免疫疾病風險或遭受一自身免疫疾病的該受試者獲得一血樣；將該血樣的一第一部分暴露至包含相關於該胜肽專一治療的一專一胜肽的一溶劑；單獨將該血樣的一第二部分暴露至該溶劑；量化該血樣的該第一及該第二部分中相關於自限性免疫功能的一或更多個mRNA的表達水準，諸如藉由使用從以下內容組成的群組中選擇的一方法：逆轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)、即時RT-PCR、北方墨點法、流式細胞分選、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、質譜分析法及西方墨點法，其中使相關於自限性免疫功能的該一或更多個mRNA及一DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一或更多個mRNA選自由以下物質組成的群組：CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B；以及當該血樣的該第一部分中的一表達水準相較於該血樣的該第二部分更大時，決定該胜肽專一治療很可能為有效的。
  30. 如請求項29所述之方法，其中使用一阻凝劑處置該等全血樣本。
  31. 如請求項30所述之方法，其中該阻凝劑包含肝素。
  32. 如請求項29所述之方法，其中該暴露步驟在從大約30℃至大約42℃的一溫度下執行。
  33. 如請求項32所述之方法，其中該暴露步驟在大約37℃的一溫度下執行。
  34. 如請求項29所述之方法，其中執行該暴露步驟達小於大約8小時的一時間量。
  35. 如請求項34所述之方法，其中該時間量為從大約1小時至大約4小時。
  36. 一種用於監視一疫苗的該持續效力的方法，該方法包含以下步驟：在將一受試者暴露至一感興趣的抗原之前從該受試者獲得一第一及一第二血樣；將該第一血樣暴露至包含來源於該感興趣的抗原的一胜肽的一溶劑；單獨將該第二血樣暴露至該溶劑； 藉由包含以下步驟的一方法量化該第一及該第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準：(i)添加一引物及一逆轉錄酶至從該第一全血樣本及該第二全血樣本中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(cDNA)，以及(ii)將該cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及一DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一或更多個T細胞功能相關標記物係選自從以下物質組成的群組：CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B；以及在針對該感興趣的抗原的一疫苗已經施予該受試者之後從該受試者獲得一第三及一第四血樣；將該第三血樣暴露至包含來源於該感興趣的抗原的該胜肽的該溶劑；單獨將該第四血樣暴露至該溶劑；藉由包含以下步驟的一方法量化該第三及該第四血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的該表達水準：(i)添加一引物及一逆轉錄酶至從該第一全血樣本及該第二全血樣本中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(cDNA)，以及(ii)將該cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈引物及反義鏈引物及一DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一或更多個T細胞功能相關標記物係選自由以下物質組成的該群組：CD25、FoxP3、 CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B；以及基於該第一及該第二血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的該表達水準標稱化該第三及該第四血樣中的一或更多個T細胞功能相關標記物的該表達水準；以及當該等T細胞功能相關標記物的該表達在該第三樣本中相較於該第一樣本增加時，識別該疫苗的一維持的效力或一增加的效力；或當該等T細胞功能相關標記物的該表達在該第三樣本中相較於該第一樣本減少時，識別疫苗的一減少的效力。
  37. 如請求項36所述之方法，其中該一或更多個T細胞功能相關標記物額外包含GMCSF、干擾素γ、TNFSF2、CXCL10、CCL4、IL2、IL4、IL10、CTLA4、CCL2及CXCL3中的一或更多者。
  38. 如請求項36所述之方法，其中該感興趣的抗原相關於一癌症情況、一病毒傳染、一細菌傳染、一真菌傳染、一酵母菌傳染、由於病原性蛋白顆粒的傳染及由於寄生蟲的傳染中的一或更多者。
  39. 如請求項36所述之方法，該方法進一步包含以下步驟：當偵測到疫苗的一減少的效力時視情況施予一疫苗加強劑。
  40. 如請求項36所述之方法，其中使用一阻凝劑處置該等全血樣本。
  41. 如請求項40所述之方法，其中該阻凝劑包含肝素。
  42. 如請求項36所述之方法，其中該暴露步驟在從大約30℃至大約42℃的一溫度下執行。
  43. 如請求項42所述之方法，其中該暴露步驟在大約37℃的一溫度下執行。
  44. 如請求項36所述之方法，其中執行該暴露步驟達小於大約8小時的一時間量。
  45. 如請求項44所述之方法，其中該時間量為從大約1小時至大約4小時。
  46. 一種用於識別細胞免疫的一生物標記物的方法，該方法包含以下步驟：將一血樣的一第一部分暴露至包含來源於已知抗原的一胜肽的一溶劑；單獨將該血樣的一第二部分暴露至該溶劑；藉由包含以下步驟的一方法量化該第一及該第二部分中的一或更多個T細胞功能相關標記物的表達水準： (i)添加一引物及一逆轉錄酶至從該第一全血樣本及該第二全血樣本中的每一者分離出的RNA以產生互補DNA(cDNA)，以及(ii)將該cDNA與專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義鏈及反義鏈引物及一DNA聚合酶接觸以產生擴增的DNA，該一或更多個T細胞功能相關標記物係選自由以下物質組成的群組：CD25、FoxP3、CTLA4、GARP、IL17、精胺酸酶、PD-1、PDL1及顆粒酶B；以及當一T細胞功能相關標記物的該表達在該第一樣本中相較於該第二樣本增加時或當一T細胞功能相關標記物的該表達在該第一樣本中相較於該第二樣本減少時，識別細胞免疫的一生物標記物。
  47. 如請求項46所述之方法，該方法進一步包含以下步驟：將該cDNA與一DNA聚合酶及專門針對一或更多個T細胞功能相關標記物的正義及反義引物接觸，該一或更多個T細胞功能相關標記物係選自由以下物質組成的群組：GMCSF、干擾素γ、TNFSF2、CXCL10、CCL4、IL2、IL4、IL10、CCL2、CXCL3。
  48. 如請求項46所述之方法，其中使用一阻凝劑處置該等全血樣本。
  49. 如請求項48所述之方法，其中該阻凝劑包含肝素。
  50. 如請求項46所述之方法，其中該暴露步驟在從大約30℃至大約42℃的一溫度下執行。
  51. 如請求項50所述之方法，其中該暴露步驟在大約37℃的一溫度下執行。
  52. 如請求項46所述之方法，其中執行該暴露步驟達小於大約8小時的一時間量。
  53. 如請求項52所述之方法，其中該時間量為從大約1小時至大約4小時。
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