JP2024507806A - チェックポイント阻害薬を用いる処置に対する感受性を決定する方法及び組成物 - Google Patents

チェックポイント阻害薬を用いる処置に対する感受性を決定する方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

状態(例えば癌)を有する患者又は対象の免疫細胞において、1つ又は複数のバイオマーカー(例えば、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子、免疫細胞機能調節因子、ナイーブ免疫細胞マーカー、制御性T細胞因子、並びに免疫抑制受容体)の発現レベルを、腫瘍細胞の交流電場への曝露の前後に検出することによって、チェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する方法及びキットが提供される。1つ又は複数のバイオマーカーを検出するための核酸プローブを含むキットもまた提供される。

Description

特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない本明細書に引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照によって組み込まれる。
関連出願1459-0091WO)の相互参照
本出願は、2021年2月17日に出願された米国仮出願第63/150,359号、及び2021年4月9日に出願された同第63/172,862号の利益を主張し、これらは共に、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
腫瘍治療電場(TTFields)とは、低強度且つ中間周波数(例えば、50kHz～1MHz又は100～500kHz)の交流電場を標的領域に印加することを伴う効果的な抗新生物処置である。
in vivoの文脈では、TTFields療法は、装着可能且つ持ち運び可能なデバイス(Optune(登録商標))を使用して送達することができる。送達システムは、電場生成装置、4つの粘着性パッチ(非侵襲性絶縁トランスデューサーアレイ)、充電式バッテリー及び持ち運び用ケースを備える。トランスデューサーアレイは、皮膚に適用され、デバイス及びバッテリーに接続される。この療法は、昼夜問わず、可能な限り多くの時間装着されるように設計されている。前臨床現場では、TTFieldsは、例えば、Inovitro(商標)TTFieldsラボベンチシステムを使用してin vitroで印加され得る。Inovitro(商標)は、TTFields生成装置、及びプレート1つ当たり8つのセラミック皿を含有するベースプレートを備える。細胞は、各皿の内部に置かれたカバースリップ上に播種される。TTFieldsは、各皿において、高誘電率セラミックによって絶縁された垂直な2対のトランスデューサーアレイを使用して印加される。in vivoとin vitroの両方の文脈において、TTFieldsの向きは1秒ごとに90°切り替えられ、したがって細胞分裂の種々の配向軸を包含する。
成人における最も一般的且つ致死的な脳癌であるGBMは(1、2)、免疫原性が最も低い腫瘍の1つでもある。近年の研究は、全体として、GBMを有する患者における顕著な免疫調節異常及び機能障害を実証している。GBMにおける腫瘍免疫微小環境(TiME)は、大きく免疫抑制されており、とりわけ、免疫チェックポイントタンパク質のより高い発現及び免疫抑制細胞の浸潤、より少ない数の腫瘍浸潤リンパ球、全身性T細胞リンパ球減少症及びアネルギー、サイトカイン調節異常を特徴とする(3、4)。加えて、血液脳関門は、腫瘍関連抗原の免疫細胞への曝露、及びその逆の曝露を更に低減し、免疫療法の取り組みを更に妨げる(4)。
遺伝子シグネチャーとは、生物学的プロセス、疾患若しくは状態、又は処置若しくは他の外部事象に対する応答の結果としての特徴的な発現パターンを有する遺伝子又は遺伝子群である。例えば、遺伝子シグネチャーにおける1つ又は複数の遺伝子は、患者又は対象が何らかの処置又は環境条件に曝露された後、上昇又は低下した発現レベルを有し得る。変更された発現レベルの集合パターンは、全体として、疾患又は状態に対する処置の前又は後における生物学的状態の存在又は非存在を決定するための、或いは前記処置若しくはその後の処置に応答する可能性がより高いか若しくはより低い、又は疾患若しくは状態が悪化する可能性がより高いか若しくはより低い患者又は対象を選択及び/又は予測するためのマーカーとして役立ち得る。
Azouryら、Curr Cancer Drug Targets、2015;15(6):452～62頁 www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp http://geneontology.org/ //www.gsea-msigdb.org https://milaboratory.com/software/mixcr/ https://github.com/mikessh/vdjtools https://cloud.r-project.org/web/packages/immunarch/index.html
本明細書に記載されるように、TTFieldsは、対象の腫瘍細胞に印加されて、免疫系を活性化させることができる。TTFieldsによる免疫系の活性化は、遺伝子シグネチャーを含む1つ又は複数の遺伝子の発現レベル(例えば、mRNA、他の核酸、又はタンパク質の発現レベル)を測定することによって評価することができる。遺伝子シグネチャーの遺伝子の発現のパターンは、次いで、対象が例えばチェックポイント阻害薬を用いる腫瘍の処置に対して感受性であるかどうかを決定するために使用することができる。
一態様は、(a)対象の免疫T細胞において、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程、(b)対象の免疫T細胞において、T細胞機能調節因子を発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程、(c)対象の免疫T細胞において、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程、(d)対象の免疫T細胞において、制御性T細胞因子を発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程、(e)対象の免疫T細胞において、免疫抑制受容体を発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程、並びに(f)対象の免疫T細胞において、1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程によって、チェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する方法を提供する。
交流電場は、第1の発現レベルを決定する工程(例えば、上の工程a～f)の後且つ第2の発現レベルを決定する工程(例えば、以下の工程h～m)の前に、50kHz～1MHzの間、好ましくは100～500kHzの間の周波数において対象の腫瘍細胞に印加され得る。
方法は、(h)対象の免疫T細胞において、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程、(i)対象の免疫T細胞において、T細胞機能調節因子を発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程、(j)対象の免疫T細胞において、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程、(k)対象の免疫T細胞において、制御性T細胞因子を発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程、(l)対象の免疫T細胞において、免疫抑制受容体を発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程、並びに(m)対象の免疫T細胞において、1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程を更に含む。
対象は、(i)サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸の少なくとも50%の第1の発現レベルが、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸の第2の発現レベルよりも低い場合、(ii)T細胞機能調節因子を発現する核酸の少なくとも50%の第1の発現レベルが、T細胞機能調節因子を発現する核酸の第2の発現レベルよりも低い場合、(iii)ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸の少なくとも50%の第1の発現レベルが、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸の第2の発現レベルよりも高い場合、(iv)制御性T細胞因子を発現する核酸の少なくとも50%の第1の発現レベルが、制御性T細胞因子を発現する核酸の第2の発現レベルよりも高い場合、(v)免疫抑制受容体を発現する核酸の少なくとも50%の第1の発現レベルが、免疫抑制受容体を発現する核酸の第2の発現レベルよりも高いか又はそれと比較して変化していない場合、並びに(vi)1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸の第1の発現レベルが、1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸の第2の発現レベルよりも高いか若しくは低いか、又はそれと比較して変化していない場合にチェックポイント阻害薬を用いて処置される。
本明細書に記載される別の態様は、(a)対象の免疫細胞において、以下のバイオマーカー:サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子、免疫細胞機能調節因子、ナイーブ免疫細胞マーカー、制御性T細胞因子、若しくは免疫抑制受容体、又はそれらの組合せの第1の発現レベルを決定する工程、(b)工程(a)の後且つ工程(c)の前に、50kHz～1MHzの間、好ましくは100～500kHzの間の周波数の交流電場を対象の腫瘍細胞に印加する工程、並びに(c)対象の免疫細胞において、工程(a)のバイオマーカーの第2の発現レベルを決定する工程を含む方法を提供する。
任意選択で、工程(a)は、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第1の発現レベルを決定する工程を含むか、又は工程(a)は、免疫細胞機能調節因子の第1の発現レベルを決定する工程を含むか、又は工程(a)は、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第1の発現レベルを決定する工程と免疫細胞機能調節因子の第1の発現レベルを決定する工程の両方を含む。
ある態様では、免疫細胞機能調節因子は、T細胞機能調節因子又はナチュラルキラー細胞である。
一態様では、工程(a)は、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子、免疫細胞機能調節因子、ナイーブ免疫細胞マーカー、制御性T細胞因子、並びに免疫抑制受容体の第1の発現レベルを決定する工程を含む。
バイオマーカー発現レベルは、核酸発現又は対応するタンパク質の発現によって決定され得る。
別の態様では、方法は、その後、(i)少なくとも50%のサイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第1の発現レベルが、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第2の発現レベルよりも低いか、(ii)少なくとも50%の免疫細胞機能調節因子の第1の発現レベルが、免疫細胞機能調節因子の第2の発現レベルよりも低いか、(iii)少なくとも50%のナイーブ免疫細胞マーカーの第1の発現レベルが、ナイーブ免疫細胞マーカーの第2の発現レベルよりも高いか、(iv)少なくとも50%の制御性T細胞因子の第1の発現レベルが、制御性T細胞因子の第2の発現レベルよりも高いか、又は(v)少なくとも50%の免疫抑制受容体の第1の発現レベルが、免疫抑制受容体の第2の発現レベルよりも高いか若しくはそれと比較して変化していない場合にチェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する工程を含み得る。この態様は、少なくとも50%のサイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第1の発現レベルが、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第2の発現レベルよりも低い場合にチェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する工程、又は少なくとも50%の免疫細胞機能調節因子の第1の発現レベルが、免疫細胞機能調節因子の第2の発現レベルよりも低い場合にチェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する工程、又は(i)少なくとも50%のサイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第1の発現レベルが、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第2の発現レベルよりも低く、且つ(ii)少なくとも50%の免疫細胞機能調節因子の第1の発現レベルが、免疫細胞機能調節因子の第2の発現レベルよりも低い場合にチェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する工程を更に含み得る。
別の態様では、チェックポイント阻害薬は、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミリマブ(cemilimab)、アテゾリムマブ(atezolimumab)、アベルマブ、デュルバルマブ、IDO1阻害薬、TIGIT阻害薬、LAG-3阻害薬、TIM-3阻害薬、VISTA阻害薬、又はB7-H3阻害薬であり、チェックポイント阻害薬は、対象の処置における使用のためのものであり、ここで、対象は、上に記載したような第1及び第2の発現レベルを決定する工程を受けている。
別の態様は、抗癌薬の投与前に対象の免疫系の活性化を示す方法であって、対象の免疫細胞において、本明細書に記載される1つ又は複数のバイオマーカーの第1及び第2の発現レベルを決定する工程、並びに1つ又は複数のバイオマーカーの第1及び第2の発現レベルを比較する工程を含み、(これもまた本明細書に記載されるように)交流電場が、2つの決定の間に対象の腫瘍細胞に印加されており、第1及び第2の発現レベルの差が対象の免疫系の活性化を示す、方法を提供する。
ある態様では、免疫細胞機能調節因子はT細胞機能調節因子であるか、又はナイーブ免疫細胞マーカーはナイーブT細胞マーカーである。
ある態様では、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸は、GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、若しくはCCL4、又はそれらの組合せであるか、或いは免疫細胞機能調節因子を発現する核酸は、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、若しくはHMGB3、又はそれらの組合せであるか、或いはナイーブ免疫細胞マーカーを発現する核酸は、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、若しくはIL7R、又はそれらの組合せであるか、或いはナイーブ免疫細胞マーカーを発現する核酸は、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、若しくはIL7R、又はそれらの組合せであるか、或いは制御性免疫細胞因子を発現する核酸は、IL2RA、FOXP3、若しくはIKZF2、又はそれらの組合せであるか、或いは免疫抑制受容体を発現する核酸は、LAG3、TIGIT、PDCD1、若しくはCTLA4、又はそれらの組合せである。
更に別の態様では、核酸は、GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、CCL4、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、HMGB3、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、IL7R、IL2RA、FOXP3、IKZF2、LAG3、TIGIT、PDCD1、CTLA4、又はそれらの組合せである。
更に別の態様では、チェックポイント阻害薬は、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミリマブ、アテゾリムマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、IDO1阻害薬、TIGIT阻害薬、LAG-3阻害薬、TIM-3阻害薬、VISTA阻害薬、又はB7-H3阻害薬である。
腫瘍細胞は、脳細胞、血液細胞、乳房細胞、膵細胞、卵巣細胞、肺細胞、又は間葉系細胞であり得る。特に、腫瘍細胞は脳細胞であり得る。好ましくは、腫瘍細胞は癌細胞である。
本明細書に記載される別の態様は、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸、T細胞機能調節因子を発現する核酸、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸、制御性T細胞因子を発現する核酸、免疫抑制受容体を発現する核酸、並びに/又は1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸を検出するための核酸プローブを含有するキットを提供する。
別の態様では、キットは、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子、T細胞機能調節因子を発現する核酸、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸、制御性T細胞因子を発現する核酸、並びに免疫抑制受容体を発現する核酸の発現を検出するための核酸(プローブ又はプライマーを含む)を2つ以上、好ましくは3つ以上、より好ましくは4つ以上含む。
ある態様では、キットは、GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、又はCCL4を検出するための核酸を含み得るか、或いはキットは、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、又はHMGB3を検出するための核酸を含み得るか、或いはキットは、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、又はIL7Rを検出するための核酸を含み得るか、或いはキットは、IL2RA、FOXP3、又はIKZF2を検出するための核酸を含み得るか、或いはキットは、LAG3、TIGIT、PDCD1、又はCTLA4を検出するための核酸を含み得るか、或いはキットは、GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、CCL4、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、HMGB3、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、IL7R、IL2RA、FOXP3、IKZF2、LAG3、TIGIT、PDCD1、若しくはCTLA4、又はそれらの任意の組合せを検出するための核酸を含み得る。
図1a～図1bは、処理されなかった(NT)か又はTTFieldsを用いて処理された(TTF)LN428 GBM細胞における、細胞質の輪郭のためにb-アクチン及び核対比染色のためにDAPIを用いた、cGAS及びAIM2について染色した例示的な共焦点画像を示す図である。図1bは、細胞を、TTFieldsを用いて24時間処理した場合の図1aの実験を示し、側面図(右端のパネル)は、TTFields誘導細胞質小核クラスター(cytosolic micronuclei cluster)が狭い橋路を介して真核から直接突出していることを示す。図1c、図1d、図1e、及び図1fは、ビヒクル(図1c、図1e)又はG1停止を誘導するリボシクリブ(4.5μM)(図1d、図1f)のいずれかを用いて前処理され、次いで処理されなかった(図1c、図1d)か又はTTFieldsを用いて24時間処理された(図1e、図1f)LN428 GBM細胞における、DAPI対比染色を用いたcGAS、AIM2、及びLAMINA/Cについての免疫蛍光染色を示す、zスタックを伴う例示的な共焦点画像を示す図であり、S期移行がTTFields誘導細胞質小核クラスターのために必要であることを実証する。図1gは、大きな細胞質小核クラスターを有する細胞の百分率を示す例示的な棒グラフを提供し、cGAS及びAIM2動員は、図1c、図1d、図1e、及び図1fに関して記載されたように処理された3つの示されたGBM細胞株において、TTFieldsに依存している。図1hは、効果的なG1-S停止を実証するリボシクリブ(4.5μM)を用いて0及び24時間処理されたLN428細胞のヨウ化プロピジウム(PI)染色によるDNA含量解析を示す例示的なヒストグラムを提供する。 図2a及び図2bは、全溶解物中のp-IRF3及びp-p65に関するイムノブロッティングによって決定されるように(図2a)、並びに非処理条件の値を1に設定してb-アクチン充填対照に対して正規化した、総IRF3及びp65レベルに対するホスホ-IRF3(p-IRF3)及びp-p65画分の濃度測定によって定量されるように(図2b)、処理されなかったか又はTTFieldsを用いて24時間処理された3つの示されたGBM細胞株において、cGAS-STINGインフラマソームの成分IRF3及びp65がTTFields処理後に活性化したことを示す図である。図2cは、TTFieldsを用いた24時間処理の後のLN428細胞において免疫蛍光染色及び共焦点顕微鏡検査によって検出された、大きな細胞質小核クラスターにおけるp-IRF3及びp65の増加した濃度及び動員を示す図である。図2d及び図2eは、TTFieldsを用いた24時間処理に応答した、3つの示されたGBM細胞株におけるいくつかのPIC遺伝子(図2d)並びにT1IFN及びT1IRG(図2e)の相対的なmRNA上方制御を実証する棒グラフを提供する。図2f及び図2gは、スクランブル(Sc)又はSTING(ST KD)shRNAを発現し、処理されなかったか又はTTFieldsを用いて24時間処理された3つの示されたGBM細胞株における、mRNA発現(図2f)、及びELISAによる全溶解物中のINFbタンパク質レベル(図2g)において測定されるように、PIC及びT1IRGのTTFields誘導上方制御がSTINGに依存したことを示す例示的な棒グラフを提供する。 図3aは、スクランブル(Sc)又はAIM2(AIM2 KD)shRNAを発現し、処理されなかったか又はTTFieldsを用いて24時間処理された3つの示されたGBM細胞株における、活性化カスパーゼ-1 FAM-YVAD-FMKの蛍光標識特異的不可逆的阻害薬を使用して決定されるカスパーゼ-1活性化レベルの例示的なヒストグラムを提供する。図3bは、スクランブル(Sc)又はAIM2(AIM2 KD)shRNAを発現し、処理されなかったか又はTTFieldsを用いて24時間処理されたU87MG及びLN827細胞からの全溶解物中のカスパーゼ-1切断産物(N-GSDMD)を明らかにするGSDMDに関するイムノブロッティングを示す例示的なX線写真を提供する図である。図3cは、スクランブル(Sc)又はAIM2(AIM2 KD)shRNAを発現し、処理されなかったか又はTTFieldsを用いて24時間処理された3つの示されたGBM細胞株における、上清へのLDH放出によって決定される、AIM2依存的なTTFieldsによって誘導された形質膜破壊の増加を示す例示的な棒グラフを提供する。 図4aは、腫瘍関連抗原(新抗原)と、cGAS-STING及びAIM2-カスパーゼ-1インフラマソームを介したアジュバント「危険」信号との両方を提供する、TTFields処理KR158-lucマウスGBM細胞の完全ワクチン接種プラットフォームとしての使用を試験する、免疫化、抗原再投与(rechallenge)、及びモニタリングスキーマを詳述する例示的な図を提供する。図4b、図4c、及び図4dは、頭蓋内免疫化の最大40日後(図4b)、及び2×親KR158-luc細胞を用いた抗原再投与の最大21日後(図4c)の連続in vivo BLI、並びに(図4d)に要約される各プロトコルにおける100日目時点での無腫瘍動物の数によって決定される、処理されなかったか又はTTFieldsを用いて72時間前処理された、STING及びAIM2 DKDを伴うか又は伴わないKR158-luc細胞を使用した免疫化後の例示的な同所性KR158-luc GBM成長を示す図である。図4eは、図4b、図4c、及び図4dにおいて使用された様々な条件のKR158-luc細胞を用いて免疫化された、及び抗原を再投与された動物の生存率を示す例示的なカプラン・マイヤー推定量を提供するグラフである。図4f及び図4gは、図4b、図4c、図4d、及び図4eにおいて使用された様々な条件のKR158-lucを用いて免疫化された動物の、一次免疫化の2週間後における、流入領域深頸部リンパ節(dcLN)における総DC(MHCII+、CD11c+)及び活性化DC(CD80+、CD86+)の画分(図4f)と、脾臓における総DC、活性化DC、並びに早期活性化CD69+、CD4+及びCD8+T細胞(図4g)との免疫表現型解析を示す例示的な箱ひげ図とドットプロットとの組合せを提供するグラフである。補足図S12a、補足図S12b、補足図S12c、補足図S12d、補足図S12e、補足図S12f、及び補足図S12gは、図4との関連において記載されたこれらの同じ動物の、dcLN、PMBC及び脾臓のより詳細な免疫表現型解析を提供する。図4hは、補足図S12f及び補足図S12gに記載されている実験のために使用した同じ動物から採取した同所性脳腫瘍のCD8及びCD3についての免疫蛍光染色並びにDAPIの対比染色を示す代表的な写真を提供する。図4i、図4j、図4k、及び図4lは、KR158-lucを用いた抗原再投与の1(図4i)及び2(図4j)週間後の生存Sc-TTF免疫化動物のPBMCにおける総DC並びに完全活性化(CD44+、CD62L-)CD4+及びCD8+T細胞の免疫表現型解析を、同じKR158-luc細胞を移植した新たなナイーブコホートと比較して示す例示的な箱ひげ図とドットプロットとの組合せを提供するグラフである。 図5aは、GBMと新たに診断された患者におけるアジュバントTTFields処置を詳述する例示的な図を提供する。図5bは、示された主要なT細胞クラスターのアノテーションの根拠を提供する、T細胞の様々な運命及び機能に関与する示された遺伝子セットの発現レベルの例示的なヒートマップを提供する。図5cは、グラフに基づく細胞クラスタリング技法UMAPを使用して12名のGBM患者におけるPBMCのscRNA-seqデータセットにおける38の主要な免疫細胞型及び亜型を分ける、解像度1における例示的なカラー細胞クラスターマップを提供する。図5dは、示された重要なクラスターの、割合と発現の両方のTTF後の変化(紫色の破線)、及び割合の変化を伴わない発現のみのTTF後の変化(青色の破線)を示す、TTFields前(TTF前-緑色)及びTTF後(オレンジ色)のUMAPプロットの例示的な重ね合わせを提供する図である。図5eは、TTF前及びTTF後のPBMCにおける単一細胞レベルでのT1IRG経路GO:0034340の平均発現レベルの例示的なヒートマップを提供する。図5f、図5g、図5h、図5i、図5j、図5k、及び図5lは、TTF前及びTTF後のPBMCにおける示されたクラスターの割合を総PBMCの百分率として示す、例示的な箱ひげ図と対のドットプロットとの組合せを提供するグラフである。図5m及び図5oは、それぞれの細胞型においてTTF前後のカウント数が検出可能な患者のpDC(図5m)及びcDC(図5o)における、全ての遺伝子のTTF前発現と比較した全ての遺伝子のTTF後発現のlogFCを示す遺伝子発現の例示的なヒートマップを提供する。図5n及び図5pは、図5m及び図5oにおける試料患者の、TTFields処置の前後で比較したpDC(図5n)及びcDC(図5p)における示されたGO経路の例示的な遺伝子セットエンリッチメント解析(GSEA)を提供するグラフである(NES:正規化エンリッチメントスコア)。 図6aは、12名中9名の患者におけるTTFields処置後のTCRbクローナル増殖(負のDI logFC)を示す、TCRbのシンプソン多様度指数(DI)のlogFCの例示的なドットプロットを提供する。図6bは、12名中11名の患者におけるクローナル増殖を示す、TTFields後のT細胞に最も大量に存在する200のTCRbクローンの、TTFields前のT細胞におけるそれらの割合と比較した例示的な2D面グラフを提供する。図6cは、中程度の負の相関を示す、12名の患者におけるDIのlogFC対クラスター31(pDC)の割合のlogFCの例示的な散布図を提供する(スピアマンの相関係数r=-0.608、p=0.04)。図6d(上段のパネル)は、検出可能なTTFields前pDCカウント数を有した9名の患者におけるTTF処置前とTTF処置後との間の遺伝子発現logFCの例示的なヒートマップを提供し、中段のパネルは、9名の患者における遺伝子発現logFC分布のバイオリンプロットを提供し、下段のパネルは、DI logFCの降順に並べた9名の患者におけるTCRb DI logFCのヒートマップと比較した、絶対遺伝子発現logFCの平均として定義される散乱スコアのヒートマップを提供する。図6eは、強力な負の相関を示す、TCRb DI logFC対散乱スコアの例示的な散布図を提供する(スピアマンの相関係数r=-0.8、p=0.014)。図6fは、GBM患者におけるTTFieldsによる獲得免疫誘導の遺伝子シグネチャーを示す、TCRb DI logFCの昇順に並べた12名の患者における、T細胞クラスターアノテーションのために使用した同じ遺伝子セットの遺伝子発現の例示的なヒートマップを提供する。図6gは、図6fに対応する図であり、図6fの本来のカラーバージョンに存在する特徴をより明確に伝えるための詳細を伴う。図6hは、図6fに対応する図であり、図6fの本来のカラーバージョンに存在する特徴をより明確に伝えるための詳細を伴う。 図S1(図1a～図1bをサポートする)は、処理されなかった(NT)か又はTTFieldsを用いて24時間処理された(TTF)LN428 GBM細胞における、細胞質の輪郭のためにβ-アクチン及び核対比染色のためにDAPIを用いた、cGAS及びAIM2の免疫蛍光染色を示す、より広い視野を有する例示的な共焦点画像を提供する図である。 図S2(図1a～図1bをサポートする)は、処理されなかった(NT)か又はTTFieldsを用いて24時間処理された(TTF)3つの示されたGBM細胞株における、細胞質の輪郭のためにβ-アクチン及び核対比染色のためにDAPIを用いた、cGAS及びAIM2の免疫蛍光染色を示す例示的な共焦点画像を提供する図である。 図S3(図1a～図1bをサポートする)は、処理されなかった(NT)か又はTTFieldsを用いて24時間処理された(TTF)U87MG及びLN827 GBM細胞における、細胞質の輪郭のためにβ-アクチン及び核対比染色のためにDAPIを用いた、LAMIN A/Cの免疫蛍光染色を示す例示的な共焦点画像を提供する図である。 図S4(図1c～図1hをサポートする)は、ビヒクル(図S4a、図S4c、図S4e、図S4g)又はG1停止を誘導するリボシクリブ(図S4b、図S4d、図S4f、図S4h)のいずれかを用いて前処理され、次いで処理されなかった(図S4a～図S4b、図S4e～図S4f)か又はTTFieldsを用いて24時間処理された(図S4c～図S4d、図S4g～図S4h)LN827(図S4a～図S4d)、U87MG(図S4e～図S4h)GBM細胞における、DAPI対比染色を用いたcGAS、AIM2、及びLAMIN A/Cの免疫蛍光染色を示す、zスタックを伴う例示的な共焦点画像を提供する図であり、S期移行がTTFields誘導細胞質小核クラスターのために必要であることを実証する。 図S5a及び図S5b(図1をサポートする)は、ビヒクル又はG1停止を誘導するリボシクリブのいずれかを用いて前処理され、次いで処理されなかったか又はTTFieldsを用いて24時間処理されたU87MG(図S5a)、LN428(図S5b)GBM細胞における、DAPI対比染色を用いたcGAS、AIM2、及びLAMIN A/Cについての免疫蛍光染色を示す例示的な共焦点画像を提供する図である。図S5c及び図S5dは、様々な条件(図S5a及び図S5b)を用いて処理された3つの示されたGBM細胞株における、単離された自立している小さな細胞質小核(図S5c)及び断片化された核(図S5d)を有する細胞の百分率を示す例示的な棒グラフを提供する。 図S6a、図S6b、図S6c、及び図S6e(図1をサポートする)は、150kHzのTTFieldsを用いた24時間の処理が、DAPI対比染色を用いたcGAS、AIM2、及びLAMIN A/Cについての免疫蛍光染色によって決定されるように、肺腺癌腫細胞株A549(図S6a)及び膵腺癌腫細胞株PANC-1(図S6c)において、cGASとAIM2の両方を動員した大きな細胞質小核クラスターをもたらし、PICであるIL6とT1IRGであるISG15の両方がこれらの細胞株において、TTFieldsに応答して制御された(図S6b及び図S6d)ことを示す、zスタックを伴う例示的な共焦点画像を提供する図である。 図S7aは、LN428 GBM細胞におけるSTINGに関するイムノブロッティングを示し、STINGがTTFields曝露から6時間以内に急速に分解されたことを示す例示的なX線写真を提供する図である。図S7b及び図S7c(図2cをサポートする)は、大きな細胞質小核クラスターにおけるp-IRF3及びp65の増加した濃度及び動員が、TTFieldsを用いた24時間処理の後のLN827(図S7b)及びU87MG(図S7c)GBM細胞において免疫蛍光染色及び共焦点顕微鏡検査によって検出されたことを示す図である。 図S8a(図2d～図2gをサポートする)は、72時間までにmRNA発現のピークを示す、3つの示されたGBM細胞株におけるTTFieldsに応答したPICであるIL6及びT1IRGであるISG15のmRNA上方制御の例示的な動態を提供するグラフである。図S8b(図2d～図2gをサポートする)は、TTFieldsを用いた24時間処理に応答した、3つの示されたGBM細胞株におけるいくつかの追加のT1IRGの相対的なmRNA上方制御を示す例示的な棒グラフを提供する。図S8c(図2d～図2gをサポートする)は、スクランブル(Sc)又はSTING(ST KD)shRNAを発現し、処理されなかったか又はTTFieldsを用いて24時間処理された3つの示されたGBM細胞株におけるmRNA発現レベルにおいて測定されるように、追加のT1IRGのTTFields誘導上方制御もまたSTINGに依存したことを示す例示的な棒グラフを提供する。図S8d(図2d～図2gをサポートする)は、U87MG、LN824、及びLN428 GBM細胞において2つの独立したSTING shRNA #1及び#2を使用したSTING枯渇に関するイムノブロッティングを示す例示的なX線写真を提供する図である。図S8e(図2d～図2gをサポートする)は、独立したSTING shRNA#2が、TTFieldsを用いた24時間処理の後のLN428 GBM細胞において、いくつかの代表的なPIC及びT1IRGのTTFields誘導上方制御を同様に抑制したことを示すグラフである。 図S9a(図3aをサポートする)は、200kHzでの24時間のTTFields及びTMZ(150μg/ml)を用いた処理の後のLDH放出アッセイの例示的な棒グラフを提供し、TTFieldsによって誘導されたプログラム壊死細胞死がTMZによって引き起こされた死とは異なることを示す。図S9bは、shRNAを使用したAIM2の効率的なKDを示す、AIM2に関するイムノブロッティングの例示的なX線写真を提供する図である。 図S10a(図4をサポートする)は、TTFieldsがマウスGBMモデルKR150-lucにおけるcGAS-STINGインフラマソームをSTING及びAIM2依存的に刺激することを示すグラフである。図S10b(図4をサポートする)は、TTFieldsがマウスGBMモデルKR150-lucにおけるAIM2-カスパーゼ-1インフラマソームをSTING及びAIM2依存的に刺激することを示すグラフである。図S10c及び図S10dは、STING(図S10c)及びAIM2(図S10d)それぞれについて少なくとも2つのshRNAを使用して、同様の結果であったことを示す図である。図S10eは、TTFields曝露から6時間以内に急速に分解されたKR158-luc GBM細胞におけるSTINGに関するイムノブロッティングを示す例示的なX線写真を提供する図である。図S10fは、KR158細胞を、TTFieldsを用いて144時間処理し、72時間から次の3日間にわたって毎日、条件上清(conditioned supernatant)を回収して、同系マウスから単離されたばかりの脾細胞を3日間培養し、続いて免疫表現型解析を行う共培養スキーマを詳述する例示的な図を提供する。図S10g、図S10h、図S10i、図S10j、及び図S10kは、処理されなかったか又はTTFieldsを用いて24時間処理された、スクランブル対照(Sc)、シングルSTING KD(ST)、シングルAIM2 KD(A)又はダブルSTING/AIM2 KD(DKD)shRNAを有するか又は有しないKR158細胞から取得された条件上清と共培養した同系脾細胞における全てのCD45+細胞の、総DC(MHCII+、CD11c+)(図S10g)、活性化DCの画分(CD80+、CD86+)(図S10h)、総CD4+(図S10i)、CD8+(図S10j)T細胞及びそれらの早期カウンターパート(CD69+)、完全(CD44+、CD62L-)活性化画分、総マクロファージ(MHCII+、CD11b+)及びそれらの活性化画分(F4/80+)(図S10k)の免疫表現型解析を示す例示的な棒グラフを提供する。 図S11(図4をサポートする)は、PICであるIL6及びT1IRGであるISG15が、TTFields停止後少なくとも3日間にわたって、TTFieldsに応答してSTING/AIM2依存的に上方制御されたままであったことを示す例示的な棒グラフを提供する。 図S12a、図S12b、図S12c、図S12d、図S12e、図S12f、図S12g、図S12h、図S12i、及び図S12j(図4をサポートする)は、図4と同様の様々な条件における免疫化の2週間後の動物の、及びKR158-luc GBM細胞を用いて抗原を再投与された動物の、免疫化の2週間後の流入領域dcLNにおけるCD4及びCD8 T細胞、それらの完全(CD44+、CD62L-)及び早期(CD69+)活性化カウンターパート、MDSC(CD11b+/Ly6g/Ly6c+)、並びにマクロファージ(MHCII+、CD11b+)(図S12a～図S12c)と;一次免疫化の2週間後のPBMCにおけるDC、MDSC、マクロファージ、CD4及びCD8 T細胞並びにそれらの完全及び早期活性化カウンターパート(図S12d～図S12f)と;免疫化の2週間後の脾細胞におけるMDSC、マクロファージ、CD4及びCD8 T細胞並びにそれらの完全活性化カウンターパート(図S12g～図S12h)と;抗原再投与の1(図S12i)及び2週間(図S12j)後のPBMCにおける早期活性化CD4及びCD8 T細胞との免疫表現型解析を示す例示的な箱ひげ図とドットプロットとの組合せを提供するグラフである。 図S13(図5bをサポートする)は、12名のGBM患者における単一細胞レベルでのscRNA-seqによる、単一PBMCにおける示された一般的な免疫細胞マーカー遺伝子の発現の例示的なヒートマップであって、全てのクラスターにわたるそれらの発現分布を解像度1においてUMAPグラフに示す、ヒートマップを提供する。 図S14a、図S14b、図S14c、及び図S14d(図5bをサポートする)は、12名のGBM患者における、総T細胞(図S14a)、CD4 T細胞(図S14b)、CD8 T細胞(図S14c)、及びB細胞(図S14d)に関する単一細胞レベルでのscRNA-seqによって評価された、リンパ球に関する示されたマーカー遺伝子の発現の例示的なヒートマップであって、全てのクラスターにわたるそれらの発現分布を解像度1においてUMAPグラフに示す、ヒートマップを提供する。 図S15a、図S15b、図S15c、図S15d、及び図S15e(図5bをサポートする)は、12名のGBM患者における、DC(図S15a)、NK細胞(図S15b)、単球(図S15c)、巨核球/血小板(図S15d)、及び造血幹細胞(図S15e)に関する単一細胞レベルでのscRNA-seqによって評価された、非リンパ球に関する示されたマーカー遺伝子の発現の例示的なヒートマップであって、全てのクラスターにわたるそれらの発現分布を解像度1においてUMAPグラフに示す、ヒートマップを提供する。 図S16a、図S16b、図S16c、及び図S16d(図5bをサポートする)は、12名のGBM患者における、クラスター31(形質細胞様DC)(図S16a)、クラスター25(cDC)(図S16b)、クラスター17(T1IRG古典的単球)(図S16c)、及びクラスター22(Xcl1/2+、Klrc1+NK細胞)(図S16d)に関する単一細胞レベルでのscRNA-seqによって評価された、示されたマーカー遺伝子の発現の例示的なヒートマップであって、全てのクラスターにわたるそれらの発現分布を解像度1においてUMAPグラフに示す、ヒートマップを提供する。 図S17a、図S17b、図S17c、及び図S17d(図5b～図5cをサポートする)は、12名のGBM患者における、クラスター0(細胞傷害性エフェクターT細胞)(図S17a)、クラスター9(疲弊エフェクターCD8 T細胞)(図S17b)、クラスター6(移行メモリーCD8 T細胞)(図S17c)、及びクラスター26(メモリーCD8 T細胞)(図S17d)に関する単一細胞レベルでのscRNA-seqによって評価された、示されたマーカー遺伝子の発現の例示的なヒートマップであって、全てのクラスターにわたるそれらの発現分布を解像度1においてUMAPグラフに示す、ヒートマップを提供する。 図S18a及び図S18b(図5dをサポートする)は、12名のGBM患者におけるPBMCの、各患者のTTFields前後の例示的なUMAPグラフとUMAPの重ね合わせとを、個々の患者の別々のTTF前及びTTF後UMAPグラフ(図S18a)、並びに結合したTTF前、結合したTTF後、及び結合したTTF前後のUMAPグラフの重複(図S18b)として提供するグラフである。 図S19(図5f～図5pをサポートする)は、それぞれの細胞クラスターにおいてTTFields前後のカウント数が検出可能なGBM患者における、示されたPBMC細胞クラスター中の全ての遺伝子のTTF前発現と比較した全ての遺伝子のTTF後発現のlogFCを示す遺伝子発現の例示的なヒートマップを提供する。 図S20(図5f～図5pをサポートする)は、それぞれの細胞クラスターにおいてTTFields前後のカウント数が検出可能な患者における、示された細胞クラスター中の全ての経路のTTF前発現と比較した、GBM患者のPBMCにおける様々な免疫細胞クラスターの全ての経路のTTF後発現のlogFCを示す遺伝子発現の例示的なヒートマップを提供する。 図S21a及び図S21b(図5m～図5pをサポートする)は、T1IFN及びT1IRG経路並びにDCに重要な経路のTTFields後の活性化を示す、pDC(C31)(図S21a)及びcDC(C25)(図S21b)における10の機能的に重要な経路のTTFields前発現と比較したTTFields後発現のlogFCを示す遺伝子発現の例示的なヒートマップを提供する。 図S22a、図S22b、及び図22c(図5i～図5lをサポートする)は、GBM患者のPBMC中の細胞傷害性エフェクター(C0)(図S22a)、移行メモリー(C6)(図S22b)、及びメモリーCD8 T細胞(C26)(図S22c)における機能的に重要な経路のTTFields後の濃縮又は活性化を示す、機能的に重要な経路のGSEAの例示的なグラフを提供する。 図S23(図6aをサポートする)は、12名中9名の患者における具体的なクローナル増殖を示す、TTFields前後の試料におけるTCRβクローナル構造及び配列を詳述する例示的な円グラフを提供する。 図S24(図6aをサポートする)は、全ての患者におけるTTFields前後の検出可能なTCRβクローンの累計度数の例示的な折れ線グラフであって、P12を除く全てにおいて、TTFields後のT細胞に最も大量に存在するクローンの様々な程度のクローナル度数の増大を示す、折れ線グラフを提供する。 図S25a(図6a～図6bをサポートする)は、12名中9名の患者におけるTTFields処置後のTCRαクローナル増殖(負のDI logFC)を示す、TCRαのシンプソン多様度指数(DI)のlogFCの例示的なドットプロットを提供する。図25b(図6a～図6bをサポートする)は、12名の患者全員におけるクローナル増殖を示す、TTFields後のT細胞に最も大量に存在する200のTCRαクローンの、TTFields前のT細胞におけるそれらの割合と比較した例示的な2D面グラフを提供する。 ベースライン患者特徴を示す、図5～図6に関連する表S1である。 凍結保存されたPBMCの生存率(生細胞%)を示す、図5～図6に関連する表S2である。 GBM患者におけるPBMCの単一細胞RNA-seqのパラメータ及び品質管理を示す、図5a～図5bに関連する表S3である。 GBM患者における濃縮末梢Tリンパ球のバルクRNA-seqのパラメータ及び品質管理を示す、図5～図6に関連する表S4である。 pDC(C31)においてTTFields後に上方制御した上位T1IRG及びT2IRG経路を示す、図5iをサポートする表S5である。 末梢T細胞におけるTCRα/β V(D)Jのシンプソン多様度指数を示す、図6aをサポートする表S6である。
上記及び他の態様、特徴、並びに本開示の他の利点は、添付の図面と共に示される以下の詳細な説明からより明確に理解されるだろう。
新たに診断されたGBM(5)及び悪性胸膜中皮腫(6)に対する、並びにいくつかの他の固形腫瘍においては現在後期臨床試験中の、新たな標準処置となって以来、GBMを有するTTFields応答者において、腫瘍造影効果及び浮腫の一時的な増加が、多くの場合、処置開始直後に生じ、その後遅れてX線検査上の奏効が生じるという臨床観察が繰り返し生じている(7～10)。肺、結腸、腎臓及び卵巣癌のマウスモデルでは、TTFieldsは、免疫原性細胞死を誘導し、免疫細胞の動員を促進することが実証され(11、12)、したがって、TTFieldsが必要とされる刺激を提供して、GBM患者における局所及び全身性免疫抑制を逆転させ得るという期待が高まっている。しかしながら、その分子機構は依然として不明確であり、臨床証拠は不足している。
チェックポイントタンパク質は、免疫応答の減衰を引き起こし得る免疫系(例えば、T細胞増殖及びIL-2産生)の阻害薬として機能する。例えば、Azouryら、Curr Cancer Drug Targets、2015;15(6):452～62頁を参照されたい。チェックポイントタンパク質は、免疫応答を停止させることによって癌に関する有害な効果を及ぼし得る。チェックポイントタンパク質の機能の阻止は、休止T細胞を活性化して癌細胞を攻撃させるために使用することができる。チェックポイント阻害薬は、免疫系を動員して癌細胞を攻撃させるためにチェックポイントタンパク質を阻害する癌薬である。
したがって、チェックポイント阻害薬を癌処置として使用してチェックポイントタンパク質の活性を阻止し、サイトカインの産生及び腫瘍特異的T細胞の動員による癌性細胞の攻撃を可能にすることにおける関心が存在し、チェックポイント阻害薬は、免疫療法薬の開発における活発な分野である。本明細書に記載されるように、TTFieldsは、部分的には、DNAセンサーによって検出されるTTFields誘導有糸分裂破壊に起因する「危険」信号を惹起することによって免疫系を活性化する。免疫系の活性化は、腫瘍細胞がチェックポイント阻害薬等の抗癌薬又は化学療法を用いる処置に対してより感受性となる環境を作ることができる。しかしながら、細胞又は組織のTTFieldsへの曝露後、免疫系がいつ活性化されたかを決定することは、そのような抗癌薬の効果を最大化するために重要であり得る。
例えば、TTFieldsへの更なる曝露が、抗癌薬を用いる処置の前の所与の患者において、免疫系活性化の最大化に有利となり得るかどうかを決定することは有益であり得る。抗癌薬を投与する前に患者の免疫系が完全に活性化される場合、患者の自然免疫系防御と抗癌薬の活性との組合せは、最大化され、より有効な処置及び/又は副作用を最小限にする抗癌薬の用量の減少をもたらし得る。
一部の場合では、患者は、TTFieldsに一定期間曝露されて、TTFields曝露が患者の免疫系を活性化したかどうかを決定するために評価され得る。TTFields曝露が免疫系を活性化した場合、抗癌療法が投与され得る。活性化しなかった場合、TTFieldsへの更なる曝露が抗癌薬を用いる処置の前に適用され得る。
遺伝子シグネチャー等のバイオマーカーは、個々の患者の免疫系がTTFieldsへの曝露後に活性化されたか否かを決定するために使用することができる。「遺伝子シグネチャー,」という用語は、本明細書で使用する場合、生物学的状態又は他の状態を示す発現変動を表す1つ又は複数の遺伝子又は遺伝子クラスターの発現パターンを指す。遺伝子シグネチャーは、例えば、遺伝子シグネチャーの一部である1つ又は複数の遺伝子の発現レベルを、薬物若しくはデバイスを用いる処置又はある環境条件の前後に決定することによって測定することができる。1つ又は複数の遺伝子の発現レベルの変化は、最適な処置を決定するために使用することができる生物学的変化を示し得る。
本明細書に記載されるように、TTFieldsへの曝露後の免疫系の活性化と関連する、遺伝子シグネチャーによって呈される発現パターンは、患者又は対象の免疫系が活性化されたかどうかを決定するために使用することができる。対象又は患者の免疫系が活性化された場合、抗癌療法(例えば、チェックポイント阻害薬、化学療法を用いる処置、又は他の処置)が対象又は患者に投与され得る。患者の免疫系が活性化されなかった場合、TTFields処置が継続され得るか、又は対象若しくは患者を処置する別の方針(例えば、TTFieldsを別の抗癌療法と組み合わせる)が取られ得る。
本明細書に記載される態様は、
(a)対象の免疫T細胞において、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程、
(b)対象の免疫T細胞において、T細胞機能調節因子を発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程、
(c)対象の免疫T細胞において、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程、
(d)対象の免疫T細胞において、制御性T細胞因子を発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程、
(e)対象の免疫T細胞において、免疫抑制受容体を発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程、
(f)対象の免疫T細胞において、1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸の第1の発現レベルを決定する工程、
(g)工程a～fの後且つ工程h～mの前に、100～500kHzの間の周波数の交流電場を腫瘍細胞に印加する工程、
(h)対象の免疫T細胞において、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程、
(i)対象の免疫T細胞において、T細胞機能調節因子を発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程、
(j)対象の免疫T細胞において、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程、
(k)対象の免疫T細胞において、制御性T細胞因子を発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程、
(l)対象の免疫T細胞において、免疫抑制受容体を発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程、
(m)対象の免疫T細胞において、1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸の第2の発現レベルを決定する工程、並びに
(n)(i)サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸の少なくとも50%の第1の発現レベルが、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸の第2の発現レベルよりも低い場合、(ii)T細胞機能調節因子を発現する核酸の少なくとも50%の第1の発現レベルが、T細胞機能調節因子を発現する核酸の第2の発現レベルよりも低い場合、(iii)ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸の少なくとも50%の第1の発現レベルが、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸の第2の発現レベルよりも高い場合、(iv)制御性T細胞因子を発現する核酸の少なくとも50%の第1の発現レベルが、制御性T細胞因子を発現する核酸の第2の発現レベルよりも高い場合、(v)免疫抑制受容体を発現する核酸の少なくとも50%の第1の発現レベルが、免疫抑制受容体を発現する核酸の第2の発現レベルよりも高いか又はそれと比較して変化していない場合、並びに(vi)1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸の第1の発現レベルが、1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸の第2の発現レベルよりも高いか又はそれと比較して変化していない場合にチェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する工程
によって、チェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する方法を提供する。
一部の場合では、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸は、GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、及びCCL4からなる群から選択される。
一部の場合では、T細胞機能調節因子を発現する核酸は、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、及びHMGB3からなる群から選択される。
一部の場合では、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸は、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、及びIL7Rからなる群から選択される。
一部の場合では、制御性T細胞因子を発現する核酸は、IL2RA、FOXP3、及びIKZF2からなる群から選択される。
一部の場合では、免疫抑制受容体を発現する核酸は、LAG3、TIGIT、PDCD1、及びCTLA4からなる群から選択される。
一部の場合では、1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸は、ISG15、ISG20、IL32、IFI44L、及びIFITM1からなる群から選択される。
一部の場合では、核酸は、GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、CCL4、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、HMGB3、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、IL7R、IL2RA、FOXP3、IKZF2、LAG3、TIGIT、PDCD1、CTLA4、ISG15、ISG20、IL32、IFI44L、及びIFITM1(「遺伝子シグネチャー」)のうちの1つ又は複数を含む。この遺伝子シグネチャー(そのバリアントを含む)の核酸のNCBI(米国立生物工学情報センター)参照番号及び核酸配列、並びにその核酸によってコードされるタンパク質の配列は、Table 7(表1)及びwww.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/に見出すことができる。図5及び図6並びに付随する本明細書の本文に記載されているような、遺伝子シグネチャーにおける1つ又は複数の遺伝子の発現レベルの変更は、対象又は患者が交流電場への曝露後に活性化された免疫系を有するかどうかを決定するために使用することができる。
一部の場合では、チェックポイント阻害薬は、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミリマブ、アテゾリムマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、IDO1阻害薬(例えば、BMS-986205、エパカドスタット、インドキシモド、KHK2455、SHR9146)、TIGIT阻害薬(例えば、MK-7684、エチギリマブ(etigilimab)、チラゴルマブ、BMS-986207、AB-154、ASP-8374)、LAG-3阻害薬(例えば、エフチラギモドアルファ(eftilagimod alpha)、レラトリマブ、LAG525、MK-4280、REGN3767、TSR-033、BI754111、Sym022、FS118、MGD013)、TIM-3阻害薬(例えば、TSR-022、MBG453、Sym023、INCAGN2390、LY3321367、BMS-986258、SHR-1702、RO7121661)、VISTA阻害薬(例えば、JNJ-61610588、CA-170)、及びB7-H3阻害薬(例えば、エノブリツズマブ、MGD009、オムブルタマブ)からなる群から選択される。
一部の場合では、細胞は、脳細胞、血液細胞、乳房細胞、膵細胞、卵巣細胞、肺細胞、及び間葉系細胞からなる群から選択される。一部の場合では、細胞は脳細胞である。一部の場合では、細胞は癌細胞である。
更なる態様は、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸、T細胞機能調節因子を発現する核酸、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸、制御性T細胞因子を発現する核酸、免疫抑制受容体を発現する核酸、並びに1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸を検出するための核酸を含むキットを提供する。
一実施形態では、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸は、GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、CCL4からなる群から選択される。
別の実施形態では、T細胞機能調節因子を発現する核酸は、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、及びHMGB3からなる群から選択される。
更なる実施形態では、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸は、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、及びIL7Rからなる群から選択される。
一実施形態では、制御型T細胞因子を発現する核酸は、IL2RA、FOXP3、及びIKZF2からなる群から選択される。
別の実施形態では、免疫抑制受容体を発現する核酸は、LAG3、TIGIT、PDCD1、及びCTLA4からなる群から選択される。
更なる実施形態では、1型インターフェロン応答遺伝子を発現する核酸は、ISG15、ISG20、IL32、IFI44L、及びIFITM1からなる群から選択される。
更に別の実施形態では、核酸は、GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、CCL4、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、HMGB3、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、IL7R、IL2RA、FOXP3、IKZF2、LAG3、TIGIT、PDCD1、CTLA4、ISG15、ISG20、IL32、IFI44L、及びIFITM1のうちの1つ又は複数を含む。この遺伝子シグネチャー(そのバリアントを含む)の核酸のNCBI(米国立生物工学情報センター)参照番号及び核酸配列、並びにその核酸によってコードされるタンパク質の配列は、Table 7(表1)及びwww.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/に見出すことができる。図5及び図6並びに付随する本明細書の本文に記載されているような、遺伝子シグネチャーにおける1つ又は複数の遺伝子の発現レベルの変更は、対象又は患者が交流電場への曝露後に活性化された免疫系を有するかどうかを決定するために使用することができる。
例示的なキットは、本明細書に記載されるように、遺伝子発現レベルを測定するための試薬及び装置と共に、交流電場への曝露の前後の遺伝子発現レベルを測定するアッセイにおける使用のための、遺伝子シグネチャーのうちの1つ又は複数の遺伝子を対象とする核酸プローブを含み得る。核酸プローブは、標識済み若しくは未標識、又は合成若しくは天然に存在する、一本鎖又は二本鎖DNA又はRNAであり得る。
以下の非限定的な例は、本明細書に記載される態様を実現及び使用する方法を示し、修正及び変更を含む本明細書に記載される実施形態及び態様に関する、図に準拠する更なるサポートデータを提供する。いかなる理論にも仮定にも拘束されるものではないが、これらの例には、記載されたデータに関して考えられる説明が含まれ得る。したがって、本発明は、以下に提供される例に限定されるのではなく、以下に列挙される特許請求の範囲の文言及びその均等物によって定義される全範囲を有することが意図される。
(実施例1)
TTFieldsはcGAS及びAIM2を動員する細胞質小核クラスターの形成を誘導する
TTFieldsと免疫活性化との間の潜在的な関連性は、TTFields誘導有糸分裂破壊によって生じる細胞質小核である13、14。これまでに報告されているように、3つのヒトGBM細胞株、すなわちU87MG15、LN42816、及びLN82717において、自立している小さな細胞質小核が、TTFields(別段の指摘がない限り200kHz)を用いた処理の24時間後のDAPI対比染色によって検出された。しかしながら、狭い橋路を介して核から直接延びる小核の大きなクラスターもまた、多くのTTFields処理細胞においてほとんど排他的に見出された(図1a～図1b、図1gに定量;図S1に広い視野)。
非病原性状態では、細胞質遊離DNAは、異常な宿主DNA代謝を示し、cGAS18～20及びAIM221～23を含むDNAセンサーによって認識され、いくつかの種類の癌では、自然免疫応答において強力な「危険」信号を惹起する24、25、26～28。したがって、cGAS及びAIM2がこれらの大きな細胞質小核クラスターに動員されるか否かを評価する実験を行った。いずれのDNAセンサーも、同定された全ての小核クラスターにおいて高密度に濃縮されており(図1、図S1)、これらのクラスターが、検出されないように核エンベロープによって遮蔽されていないことを示した。重要なことに、TTFields処理細胞における分散細胞質パターンから核周辺領域へのcGAS及びAIM2の再分布(図1a～図1f)は、小核クラスターを有しないものにおいても観察され(図S2)、これらの細胞において核エンベロープが損なわれている可能性を高めた。
TTFields下における核エンベロープの完全性を評価するために、核エンベロープの内側を裏打ちする2つの主要な構造タンパク質であるLAMIN A及びC(LAMINA/C)の分布を決定した29、30。予測されたように、3つ全てのGBM細胞株において、TTFieldsへの曝露は、小核クラスター突出の部位におけるLAMINA/Cの解体をもたらした(図1e、図S3、図S4c、図S4g)。対照的に、これらの細胞に存在する、単離された細胞質小核及び場合により断片化された核は、TTFields処理と無関係であり、LAMINA/Cに基づく膜によって保護されており、結果としてcGAS及びAIM2を動員しなかった(図S5)。更に、影響を受けた細胞の大半は、TTFieldsが紡錘体破壊を引き起こした際、分裂中期ではなく13、14、細胞周期移行が核エンベロープに対するTTFieldsの効果に必要か否かという疑問を生じた。
この疑問に対処するために、細胞を、TTFieldsへの24時間曝露の前に24時間、及び24時間曝露中に、サイクリン依存性キナーゼ4及び6の強力な阻害薬であるリボシクリブを用いて前処理して、G1停止を誘導した31(図1h)。3つ全ての株において、TTFields後にcGAS及びAIM2動員小核クラスターを有する細胞の百分率は、細胞周期にある細胞(cycling cell)と比較して、G1停止細胞で一貫して減少した(図1e～図1f、図S4c～図S4d、図S4g～図S4h)。リボシクリブ処理単独は、クラスター形成を増加しなかった(図1c～図1d、図S4a～図S4b、図S4e～図S4f)。これらの結果は、S期移行がTTFields誘導核エンベロープ破壊及び小核形成のために必要であり得ることを示す。
TTFieldsは、様々な固形腫瘍における臨床試験の進行した段階にあるため、ヒト肺及び膵腺癌腫細胞株A54932及びPANC-133それぞれに対するTTFields処理の効果を調査した。cGAS及びAIM2の集中的な動員を伴う細胞質小核クラスターが、以前に定義されたこれらの癌に最適な周波数34、35である150kHzのTTFieldsへの24時間曝露の後に、これらの細胞において同様に観察された(図S6a、図S6c)。
全体的に、TTFieldsは、GBM及び他の癌細胞型において、核エンベロープの破壊によって裸の細胞質小核クラスターを生成し、それによって2つの主要な細胞質DNAセンサーであるcGAS及びAIM2を動員して、それらの同族のインフラマソームの活性化に適した条件を作る。
(実施例2)
TTFieldsはcGAS-STING及びAIM2-カスパーゼ-1インフラマソームを活性化させる。
cGASの下流のシグナル伝達足場であるSTINGは、TANK結合セリン/スレオニンキナーゼ1(TBK1)を動員及び活性化させて、インターフェロン制御因子3をS396においてリン酸化し(pS396-IRF3)、古典的NFkB複合体成分p65をS536においてリン酸化し(pS536-p65)18～20、次いで核に遊走して、PIC、T1IFN及びT1IFN応答遺伝子(T1IRG)を上方制御する18～20。TTFieldsに応答して、pS396-IRF3レベルは、3つ全てのGBM細胞株において非処理細胞と比較して上昇し、pS536-p65レベルは、LN827及びU87MG細胞において上昇した(図2a～図2b)。LN428細胞では、より高い基底STING発現を有するにもかかわらず、pS536-p65レベルはTTFields後にわずかに低下し、これは、急速なSTING下方制御に対応し、これまでに報告されているように36、37、それ自身の加速した分解をもたらす、より低いのではなくより高いSTING活性化を反映している可能性が高かった(図2a～図2b、図S7a)。
実際、LN428細胞は、U87MG及びLN827細胞と比較して、小核クラスターへのより強力なTTFields誘導cGAS動員を呈した(図1g)。3つ全ての株において、TTFieldsに応答して小核クラスターの内部及び周辺により高い濃度のpS396-IRF3及びp65(図2c、図S7b～図S7c)が検出され、続いて、およそ72時間でピークに達し(図S8a)、STINGの存在に厳密に依存する(図2f～図2g、図S8c～図S8e)、PIC(図2d、図S8d)、T1IFN及びT1IRG(図2e、図2g、図S8b)の上方制御が検出された。TTFieldsに対する類似した応答は、A549及びPANC-1細胞株においても観察された(図S6b、図S6d)。したがって、TTFieldsは、GBM及び他の癌細胞型においてcGAS-STINGインフラマソームを活性化させ、PIC及びT1IFNの産生の増加をもたらす。
次に、TTFieldsがAIM2-カスパーゼ-1インフラマソームをAIM2依存的に活性化させるかどうかを決定するために、重要なAIM2標的である活性化カスパーゼ1をTTFields後に発現した、AIM2枯渇を伴うか又は伴わない細胞の割合を、活性化カスパーゼ1の蛍光標識特異的不可逆的阻害薬であるFAM-YVAD-FMKを利用して測定した。右にシフトした新たな蛍光ピークは、TTFieldsを用いて処理したスクランブルshRNA対照においてのみ一貫して検出され、AIM2枯渇細胞では検出されなかった(図3a、図S9a)。
活性化カスパーゼ1は、PICと、免疫原性の高いプログラム壊死細胞死の実行因子である、膜孔を形成するGASDERMIN D(GSDMD)38とのタンパク質切断及び放出を制御する。無傷AIM2を有するTTFields処理U87MG及びLN827細胞において、GSDMDのN末端タンパク質切断産物の画分は2.5～3.5倍増加した(図3b)。AIM2は、同じ条件下のLN428細胞では、イムノブロッティングによる検出ができなかった。しかしながら、3つ全ての株において、24時間のTTFields処理の後に、細胞質乳酸脱水素酵素(LDH)の上清への放出はAIM2依存的に2.5～3倍増加し21～23、TTFields誘導壊死細胞死を確認した(図3c)。LDH放出の増加は、後期アポトーシスにおいて生じる二次壊死39、40に起因するものではなかった。その理由は、単独か又はTTFieldsと組み合わされた、GBMの標準的な細胞毒性薬であるテモゾロミド(TMZ)によって引き起こされたアポトーシスは、それぞれ、非処理及びTTFields処理細胞において観察されたものを超えてLDH放出を増加しなかったためである(図S9b)。
要約すると、TTFieldsによって生じる細胞質小核クラスターは、cGAS及びAIM2を動員し、それらの同族のインフラマソームを活性化させて、PIC及びT1IFNの上方制御をもたらす。
(実施例3)
TTFields処理GBM細胞はGBMに対する免疫化プラットフォームを提供する。
次に、急速な頭蓋内成長、低い免疫原性、及び免疫療法に対する耐性を含む、ヒトGBMと臨床病理学的に類似したC57BL/6J同系GBMモデルを使用した41～43。cGAS-STING及びAIM2-カスパーゼ-1インフラマソームを、ルシフェラーゼタグ付きKR158細胞(KR158-luc)において、TTFieldsによってSTING(図S10a、図S10c)及びAIM2(図S10b、図S10d～図S10e)依存的に活性化させ、TTFieldsによって誘導された細胞質DNAセンサー及びそれらの同族のインフラマソームの活性化が癌細胞型及び種間で保存されていることを確認した。
免疫細胞に対するTTFields誘導PIC及びT1IFNの効果を調査するために、処理されなかったか又はTTFields処理された、STING(ST)若しくはAIM2(A)ノックダウン又はダブルノックダウン(DKD)を伴うか又は伴わないKR158-luc細胞由来の条件培地を回収して、健康な6～8週齢C57BL/6Jマウスから単離した脾細胞を3日間培養した。T細胞、DC、及びマクロファージの画分を決定した(図S10f)。総DC及び活性化(CD80/CD86+)DC、並びにCD4及びCD8 T細胞の早期活性化(CD69+)44、45及びエフェクター(CD44high/CD62Llow)46、47画分は、STING又はAIM2のいずれかが存在した場合、TTFields処理KR158-luc由来の条件培地において、非処理細胞由来の培地と比較して増加した(図S10g～図S10j)。類似した傾向は、総マクロファージ及び活性化マクロファージにおいても観察されたが、より少ない程度であった(図S10k)。したがって、TTFieldsによって誘導されたPIC及びT1IFNは、STINGとAIM2の両方を必要とし、TTFieldsと獲得免疫系との間の潜在的な関連性を提供する。
一態様では、TTFields処理GBM細胞を利用して、GBM腫瘍に対する獲得免疫を誘導することができる。KR158-luc細胞を、最初にTTFieldsに72時間曝露した後、細胞をC57BL/6Jマウスの右後部前頭大脳に定位移植して、TTFieldsの腫瘍間質細胞及び免疫細胞に対する交絡作用を回避しながら免疫原とアジュバントシグナルの両方を提供した(図4a)。重要なことに、KR158-luc細胞におけるPIC、T1IFN及びT1IRGのSTING及びAIM2依存的な上方制御は、TTFields停止後少なくとも3日間持続し、それらの免疫化ビヒクルとしての使用についての理論的根拠を提供することが確認された(図S11)。
ワクチン接種した動物を免疫表現型解析し、それらの脳を移植の2週間後に組織学的に調査したか、又は生物発光イメージング(BLI)によって腫瘍成長及び全生存期間(OS)についてモニタリングした。抗腫瘍メモリー応答を試験するために、100日目に生存動物に抗原を再投与し、2倍多い数の非処理KR158-luc細胞を用いて抗原を再投与された同数のワクチンナイーブ、性別一致、6～8週齢C57BL/6J対照と、免疫応答及びOSに関して比較した。
移植後7日目(D7)に、全ての群は同等のBLIシグナルを生じ、一次腫瘍樹立が全ての条件において等しかったことを確認した。しかしながら、その後、3つの対照群、すなわち、スクランブルshRNA/非処理(Sc)、STING-AIM2 DKD/TTFields処理(DKD-TTF)、及びSTING-AIM2 DKD/非処理(DKD)における1匹を除く全ての動物(39匹中38匹、又は97%)が進行性脳腫瘍を発症し、100日目までに死亡し、OS中央値(mOS)は45日であった。
対照的に、スクランブルshRNA/TTFields処理細胞(Sc-TTF)を投与された15匹中10匹(66%)の動物は、100日目に検出可能な腫瘍を有せず、mOSは未到達であった(図4b、図4d～図4e)。これらの10匹の生存Sc-TTF動物に2倍の親KR158-luc細胞を用いて抗原を再投与した場合、12匹のナイーブ対照では、週齢においてはるかに若かったにもかかわらず、45日後には1匹も生存しておらず、mOSがわずか38日であったのと比較して、6匹(60%)が、いかなる検出可能な腫瘍も有することなく、少なくとも更に144日間生存した(図4c～図4e)。
100日までに死亡した4匹のSc-TTFマウスは、ナイーブ対照と比較して、依然として有意な腫瘍成長の遅延及び生存期間の改善を呈した。要約すると、Sc-TTF細胞を用いて免疫化された40%(15匹中6匹)の動物は強力な抗腫瘍免疫を生じ、別の25%(15匹中4匹)はTTFields、STING及びAIM2依存的に部分免疫を得た。これは、ヒトGBMに非常に類似している低免疫原性モデルであるKR158の注目すべき功績である。
これらの肯定的な臨床観察の免疫学的根拠を定義するために、脳及び同側頭頸部から直接流入すると考えられる同側深頸部リンパ節(dcLN)48～50を、免疫表現型解析のために採取した。Sc細胞を投与された動物と比較して、dcLNにおけるDCの画分は、Sc-TTF細胞を用いて免疫化されたマウスにおいて増加し、これは、DKD-TTF細胞を注射した場合は逆転した。DKD細胞はSc細胞と比較してdcLNにおけるDCの差をもたらさず(図4f)、STING及びAIM2のみがTTFieldsで支配的になることを示した。重要なことに、dcLNにおけるDCのうち、活性化DC(CD80/CD86+)の画分は、Sc、DKD-TTF又はDKD細胞の代わりにSc-TTF細胞を移植した場合、2倍になり(図4f)、これは、早期活性化CD69+CD4及びCD8 T細胞の画分の増加と一致したが、総及び活性化CD4及びCD8の画分はこの時点ではまだ増加していなかった(図S12a～図S12b)。
次に、一次免疫化後2週目、次いで抗原再投与後1及び2週目に脾細胞及び末梢血単核細胞(PBMC)を一時的に免疫表現型解析することによって、KR158腫瘍に対するメモリー獲得応答の出現について末梢免疫コンパートメントを調査し、より早期の時点ではわずかな変化を予期した。免疫化後2週目では、予測されたように、DCの増加傾向のみが存在し、PBMCにおけるリンパ球の変化は、CD69+CD8 T細胞がSc-TTF動物においてより高かったことを除いては存在しなかった(図S12d～図S12f)。
しかしながら、驚くべきことに、総及び活性化DC並びにCD69+CD8 T細胞の増加が、対照と比較して、Sc-TTF動物由来の脾細胞において検出され(図4g、図S12h)、TTFields誘導免疫刺激の強度を証明した。実際、T(CD3)及びCD8 T(CD3+CD8+)細胞のSc-TTF腫瘍への浸潤は他の対照腫瘍と比較して増加した(図4h)。抗原再投与後、抗原を再投与したSc-TTFコホートでは、ワクチンナイーブ対照と比較して、DC並びに活性化CD4及びCD8 T細胞の画分は1週目に急速に増加し、2週目に更に増大したが(図4i～図4j)、CD69+CD4及びCD8 T細胞の画分は、1週目にのみ増加し、2週目は増加しなかった(図S12i～図S12j)。注目すべきことに、骨髄由来抑制細胞(CD11b+/Ly6g/Ly6c+)及びマクロファージにおける差は、異なるコホートにおいていかなる時点においても検出されなかった(図S12c～図S12d、図S12g)。
抗原を再投与した6匹の長期生存Sc-TTFマウスにおけるセントラルメモリー(CM)T細胞の存在を確認するために、抗原再投与の20週間後時点のそれらのdcLN及び脾臓におけるCM(CD44+CD62L+)CD4及びCD8 T細胞51～54の画分を測定した。対照マウスについては、6匹のナイーブマウスからなる週齢及び性別を一致させたコホートに同数のKR158-luc細胞を移植し、それらのdcLN及び脾臓を2週間後に解析した。CM及びエフェクター(CD44+CD62L-)51～54T細胞の画分は、Sc-TTFマウスがナイーブ対照よりも一貫して高かった(図4k～図4l)。
要約すると、TTFieldsは、細胞質小核クラスター形成を介してcGAS-STING及びAIM2-カスパーゼ-1インフラマソームを強力に活性化させ、それによって完全な「危険」信号を提供して、GBMのような免疫原性が低い腫瘍に対する抗腫瘍免疫を生成する。
(実施例4)
T1IRGに基づく軌道(trajectory)を介したGBM患者におけるTTFieldsによる獲得免疫活性化を反映する遺伝子シグネチャー。
KR158モデルの観察は、TTFieldsが、特にT1IRGに基づく軌道を介して、GBMを有する患者において同様に獲得免疫を活性化させ、TTFieldsを獲得免疫に関連付ける遺伝子シグネチャーが同定可能であるという仮説を導いた。この目的のために、化学放射線療法の完了後、GBMと新たに診断された12名の成人患者から以下の2つの時点、すなわち、TTFields及びTMZの開始が2週間後以内である時点と開始から約4週間後の時点(図5a)とにPBMCを採取して、1)TTFields効果に関与する細胞型及び亜型を同定するための単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)、並びに2)T細胞亜型にわたるTTFields誘導T1IFNの幅広い効果を捕捉する遺伝子シグネチャーを同定するための単離T細胞のディープバルクRNA-seqを実施した。高い配列決定深度もまた、最も大量に存在するT細胞受容体(TCR)クローンの集中的なクローナル解析によりTTFieldsによる獲得免疫活性化の直接的な証拠を提供することを可能にした。ベースライン患者特徴を表S1に示す。細胞生存率並びにscRNA-seq及びバルクRNA-seqの配列決定データをそれぞれ表S1～表S3に示す。
24のペアになった試料において、合計で193,760個のPBMCを分けた(表S3)。グラフに基づく細胞クラスタリング技法UMAP55を使用して、漸増する解像度パラメータ値(0.1、0.3、1、3、5及び10)を使用してグラフを分割した。解像度1は、それが適度なサイズのクラスターを生じたために選択され、PBMCを8つの主要な細胞型の38の生物学的に認識された亜型に分割した(図5b、図S13～図S17)。T細胞クラスターをより正確にアノテーションするために、細胞型マーカー及び機能調節因子を含有する遺伝子セットを、UMAPクラスタリング及び文献の再検討56～59から構築し、収集した(図5c)。
例えば、C15はナイーブCD8 T細胞を含有し、グランザイムK(GZMK)を発現するC37は移行又は部分活性化CD8 T細胞を構成した57、60。細胞傷害性エフェクターは、C0に集合し、C0が細胞傷害性制御因子ZNF68361、62を発現し、且つC9に見出された抑制マーカーTIGIT及び制御性T細胞(Treg)因子IKZF263を欠いていた点で、C9の疲弊エフェクターと異なっていた(図5c、図S17a～図S17b)。C6及びC26は移行及び長寿命メモリーCD8 T細胞をそれぞれ含み、GZMK(C6)、GZMB64、CCL365及びCCR766、67(C26)によって互いに区別された(図5c、図S17c～図S17d)。
TTFields前後のUMAPグラフの重ね合わせは、いくつかのクラスターの比例的な増加を明らかにした(図5d、図S21)。TTFieldsがT1IFNに基づく軌道を介して免疫系を誘導したことと一致して、直接的な標的で、DC亜型のうちT1IFNを最も多く産生する亜型であり、自然免疫系と獲得免疫系とを関連付けるのに重要な68～70特殊化DC亜型である形質細胞様DC(pDC)(C31)(図5f)と、IFI44L、MX1及びISG15を含むT1IRGを発現する単球亜型(C17)(図5g)とのより高い割合が見出された。別の主要なT1IFN応答性自然免疫細胞型であるNK細胞のXCL1/2+KLRC1+亜型(C22)71、72の増加傾向も存在した(図5h)。
これらの3つのクラスターがTTFieldsによって誘導されたT1IRGに基づく経路軌道の前面を構成していたことを確認するために、99の遺伝子が遺伝子オントロジーによってアノテーションされている73主要なT1IRG経路であるGO-0034340の発現平均についての全体的調査を、TTFields前後に単一細胞レベルで行った。実際、このT1IRG経路は、TTFieldsに応答して、まさにこれらの3つのクラスターにわたり、非古典的単球(C8)、古典的NK細胞(C1)及び古典的DC又はcDC(C25)を含む他の自然細胞型に延びる、上方制御した弧を形成した(図5e)。
遺伝子セットエンリッチメント解析(GSEA74)を使用して、遺伝子包括度を全ての遺伝子及び経路又は細胞特異的経路まで拡大した場合、TTFieldsの前後に検出可能なpDCを有する9名の患者全員のpDCの、特にT1IRG及びDC制御経路の広範な発現上方制御が存在した(表5及び図5m～図5n、図S20a、図S21a)。更に、TTFields後、pDCは、DC成熟を促進することが公知である75、IFNg(T2IFN)経路を上方制御した(表5)。数の増加は観察されなかったが、増加が主にdcLNにおいて認められたKR158モデルの場合と同様に、11個のPBMCにおけるcDCは、pDCに類似した遺伝子及び経路のTTFields後の広範囲に及ぶ上方制御を呈した(図5o～図5p、図S20b、図S2b)。同様に、TTFields処理は、C17及びC22(図S19a、図S19d、図S20c、図S20f)の、並びに患者間の差異がより大きいにもかかわらず、他の自然クラスター(図S19b～図S19c、図S19e、図S20d～図S20e、図S20g)の全体的な上方制御をもたらした。まとめると、これらの結果は、GBM患者において、特にT1IRGに基づく軌道に従った、TTFields後のDC及び自然細胞における強力な遺伝子上方制御を確認した。
次に、エフェクターT細胞が、KR158モデルにおいて観察されたように、TTFieldsによって誘導されたDC活性化後に活性化されたか否かを検討した。細胞傷害性(C0)及び疲弊(C9)エフェクターは比例的に増加しなかったが、それらの発現プロファイル及び活性化CD4(C4)の発現プロファイルは、患者及びクラスター間において様々な程度で、TTFields後に全体的な遺伝子上方制御を示した(図5i～図5j、図S19g～図S19h、図S20i～図S20j)。C0のGSEAは、とりわけ、MHC結合、NFkB76、IL-177、及びToll様受容体-378、79経路の濃縮を明らかにし(図S22a)、これは特に抗原特異的CD8エフェクター活性化及び増殖に関与した。注目すべきことに、C0細胞は、細胞傷害性エフェクターにおいて活性化誘導細胞死を促進することが公知である80、Fas/FasL経路も上方制御し(図S22a)、これはおそらく、それらがTTFields開始の4週間後にメモリーT細胞に移行する場合のC0の増加の欠如に寄与した。
この見解と一致して、長寿命メモリーCD8 T細胞(C26)の増加傾向が存在し、これは移行メモリーCD8 T細胞(C6)の縮小と一致し(図5k～図5l)、いずれも患者間において様々な程度で全体的な上方制御を呈した(図S19i～図S19j、図S20k～図S20l)。C26及びC6のGSEAは、mTOR81、82及び補体活性化83～85経路を含む、メモリーT細胞の発生及び維持にかつて関与していた共有制御経路の濃縮を示した(図S22b～図S22c)。
獲得免疫活性化の特徴である末梢TCRクローナル増殖86、87は、いくつかの癌において、とりわけ最も大量に存在するクローンに関して88、89、腫瘍浸潤TCRクローンと高い調和を有することが近年示された。したがって、TCRab V(D)J配列を、同じ12個のPBMCから単離したT細胞のディープRNA-seqから抽出して(表6)、TTFields処理がTCRクローナル増殖をもたらしたかどうかを決定した。TCR多様性を、加重算術平均に基づくTCRクローンの平均比例存在量であるシンプソンの多様度指数(DI)を使用して定量した。高い値及び低い値はそれぞれ、TCRクローンの均一な分布及び増殖を示す90、91。
12名の患者のうち9名が、TTFields曝露後にTCRb DIの負の対数倍率変化(logFC)を呈し、クローナル増殖を示した(図6a、図S24)。注目すべきことに、1名を除く全ての患者において、検出可能なクローンの40～100%(中央値67%)を占める、TTFields後に最も頻度が高い上位200のTCRbクローンは、TTFields前T細胞と比較して実質的な増殖を示し、DIと逆相関した(図6b、図S25)。12名中9名の患者における類似した増殖、及びTTFields後の上位200のクローンにおける一様な増殖(12名中12名)は、DIスケールの2つの極値に同じ患者を有し、移行帯又はその付近における患者の並びがわずかに変化しているTCRa VJクローナル解析においても観察された(図S26)。したがって、TTFields曝露は、末梢T細胞のクローナル濃縮に反映されるように、獲得免疫活性化と関連する。
観察されたTCRクローナル増殖は、TTFieldsによって誘導されたSTING及びAIM2インフラマソームによって生じた全身性炎症に対する非特異的反応であるよりも、TTFieldsによって誘導された腫瘍特異的応答である可能性が高いということを裏付けるために、TCRbクローナル増殖とpDCとの相関の強度を測定した。C31の割合は、完全なpDCデータセットを有する9名の患者において、TCRb DI logFCと中程度に負に相関した(スピアマンの係数r=-0.608、p=0.04)(図6c)。この相関が、遺伝子発現logFC分布によって測定される分子レベルのpDC活性化強度においてより強力になるかどうかを試験するために、これらの9名の患者におけるpDCの遺伝子発現プロファイルを測定した。正のDI logFCを有する3名の患者(P12、P22及びP9)は、遺伝子発現logFC値がより広く分布している、すなわち、全体的に散乱している他の6名の患者と比較して、遺伝子発現logFCが0付近により集中している、すなわち、散乱がより少ない別個の群に分類された(図6d)。患者間の絶対遺伝子発現logFCの平均として定義される散乱スコアとDI logFCとの強力な負の相関(スピアマンの係数r=-0.8、p=0.014)が観察され(図6e)、TCRクローナル増殖は、pDCを介して獲得免疫を誘導するTTFieldsの直接的な結果である可能性が高いということを示した。
TTFieldsによる獲得免疫誘導の遺伝子シグネチャーを、T細胞クラスターをアノテーションするために使用される遺伝子セット(図5c)を利用することによって決定して、12名の患者全員におけるTCRb DI logFCと比較検討した(Table 7(表1))。DI logFCは、サイトカイン、細胞傷害性及び制御遺伝子のレベルと負に相関し、ナイーブ及びTregマーカーと正に相関し、正のDI logFCを有する3名の患者におけるTCRbクローナル増殖の欠如が、部分的にはTreg活性の増加に起因し得ることを示唆した。予期されたように、DI logFCと調査した4つの抑制受容体及びT1IRGとの相関は観察されず、TTFields後のTCRa/bクローナル増殖が全身性炎症に対する非特異的反応であることに対する更なる反証を示した。
この遺伝子シグネチャー(そのバリアントを含む)の核酸のNCBI(米国立生物工学情報センター)参照番号及び核酸配列、並びにその核酸によってコードされるタンパク質の配列は、Table 7(表1)及びwww.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/に見出すことができる。
まとめると、これらの結果は、TTFields処置が、pDC及びcDCを含むT1IFN経路を構成する免疫細胞の初回刺激後に、GBMを有する患者において獲得免疫の効果的な活性化をもたらすということを実証する。
(実施例5)
考察
抗腫瘍免疫を刺激することにおける細胞質DNAセンサーのインフラマソームの決定的な役割に対する近年の認識のために、STING及びAIM2の薬理学的アゴニストの研究及び開発は癌免疫療法における近年の取り組みにおいて優位を占めている92～99。この目的のために、これらの結果はTTFieldsを、裸の細胞質小核の大きなクラスターの形成を介する両方のインフラマソームの二重アクチベーターという固有のカテゴリーに位置付けている。脳腫瘍の場合、この目的でのTTFieldsの使用は、医薬のCNS送達を限定することが多い血液脳関門を迂回するという追加の利益を有する。等しく重要なことに、TTFieldsのこの新規作用機序は、一般化可能であり得、肺癌細胞株A549及び膵癌細胞株PANC-1に示されるように、他の腫瘍における免疫療法のために使用することができる。
TTFields誘導小核クラスターにはS期移行が必要であったが(図1、図S4)、影響を受けた細胞は、核エンベロープの局所的破裂のみを呈し、M期ではなく、TTFields誘導核膜破壊が細胞周期のS及びG2期の間に起こる可能性が最も高いことを示唆した。核エンベロープは、S期の終了までに増加したDNA含量を収容するように拡大し、このプロセスにおいて、前期における消失の準備として弱体化する100、101。このプロセスは、核エンベロープの硬さがより低いことが示されている癌細胞ではより際立っている場合があり102、これにより、おそらく、癌細胞はTTFieldsの効果をより受けやすくなる。重要なチェックポイントにおける停止を標的とした高分解能顕微鏡検査は、TTFields誘導核破壊の正確なタイミング及び性質を決定するために必要となり得る。
真核ではなく、cGASが動員及び活性化される大きなTTFields誘導細胞質小核クラスターにおける、cGAS-STINGインフラマソーム成分IRF3及びp65の強力な活性化、並びにその後のPIC及びT1IRG発現の実質的な増加は、これらの大きな小核クラスターの少なくとも一部が、クラスターに存在するPIC遺伝子及びT1IRGに対して転写活性であることを示唆する(図1～図2)。しかしながら、とりわけ、大きな細胞質小核クラスターを有するか又は有しないTTFields処理細胞においてcGASが核周辺領域に再分布するという観察(図S2)に基づくと、おそらくはTTFields誘導核膜破壊のために、活性化IRF3及びp65のある程度の核移行は排除することができない。
KR158細胞を、免疫化に使用する前にTTFieldsを単独で用いて前処理して、TiMEにおける間質細胞に対するTTFieldsの交絡効果を回避した。しかしながら、そのような効果が好影響であれ悪影響であれ、抗腫瘍免疫の誘導は不明確である。TiME細胞は、200kHzでは比較的強力ではない可能性が高いにもかかわらず、他の癌細胞(図S6)及び更には正常な線維芽細胞(データは示していない)において観察されたように、cGAS及びAIM2を動員及び活性化させる小核クラスターの形成を含む、TTFieldsに対する類似した応答を呈すると予測される。TTFields曝露TiME細胞由来の拮抗効果を排除することはできないが、頭蓋内TTFields処置を伴うヒト患者では、TTFieldsとT1IRG刺激免疫細胞、例えば、pDC、cDC、単球及びNK細胞との間の関連性が、調査された12名のGBM患者において一貫して観察されたため(図5、図S19～図S21)、そのような拮抗作用は存在するとしても小さいことが予測される。
KR158モデルにおいて観察された強制的なTTFields誘導抗腫瘍免疫は、TTFields後のGBM患者において観察された獲得免疫活性化が、TTFieldsに対する直接的な応答である可能性が最も高く、TMZ誘導リンパ球減少症後に生じ得るいかなる潜在的なリンパ性恒常性増殖に起因するものでもないことを強力に主張する。反跳現象は、用量強化TMZ(すなわち、毎日100mg/m2のTMZ×21日)において認められ、この試験において用いられた標準用量のTMZ(毎日150mg/m2を5日間)においてはそれほど認められず、これは、前者が、より急激な恒常性増殖を促進する、より重度のリンパ球枯渇を引き起こしたことに起因した103、104。それにもかかわらず、DCワクチン接種等の免疫療法は、DC及びT細胞を活性化する反跳それ自体よりもむしろ、より急激な恒常性増殖に関してより効果的であり103、恒常性増殖は、TMZ前のT細胞レパートリー指標を再構成し、TTFieldsを追加した場合に観察されたようにT細胞クローンを選択的に増殖することはない105ことが認められた(図6、図S25)。
実際、リンパ球減少症、疲弊T細胞状態、並びにMDSC及びTregの増加を含む、標準的な投与量におけるTMZの持続的な免疫抑制効果は、GBM及び他の腫瘍において一般的に観察され42、104、106～112、ヒト(TTFields+TMZ)並びにKR158モデル(TTFields単独)におけるTTFields処置の場合に観察された、pDC、cDC、T1IFN標的NK及び単球亜型の選択的増殖若しくは活性化又はその両方、並びにTCRクローナル増殖と非常に対照的である。TMZを加えたTTFieldsは、本発明者らの施設及び多くの他の施設において確立された処置標準であるため、今後の研究は、とりわけ、TMZには比較的耐性がある1がTTFieldsには比較的耐性がない5MGMT非メチル化GBMにおいて、TMZを加えたアジュバントTTFieldsの免疫状況をTTFields単独と比較することに焦点を当てるべきである。加えて、本発明者らのデータは、治療上の潜在的な相乗効果を生み出すためにTTFieldsを免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせることについて説得力のある根拠を提供する。TTFieldsの免疫学的効果に関する遺伝子シグネチャーはこの研究において同定された(図6f、Table 7(表1))。
(実施例6)
材料及び方法
抗体
免疫蛍光及びウェスタンブロッティングのために、以下のものを使用した:一次抗体-LAMIN A/C(Santa Cruz社、カタログ番号sc-7292及び376248-AF488)、cGAS(Santa Cruz社、カタログ番号sc-515802)、STING(Novus Biologicals社、カタログ番号NBP2-24683SS)、AIM2(CST社、カタログ番号12948;Proteintech社、カタログ番号14357-1-AP)、IRF3(Santa Cruz社、カタログ番号sc-33641)、p-IRF3(CST社、29047S)、p65(Santa Cruz社、カタログ番号sc-8008)、p-p65(Santa Cruz社、カタログ番号sc-136548)、GSDMD(SIGMA、カタログ番号G7422)、カスパーゼ-1(Santa Cruz社、カタログ番号sc-514)、ActinGreen 488(Thermo Fisher社、カタログ番号R37110)、β-チューブリン(Santa Cruz社、カタログ番号sc-5274)、及びβ-アクチン(Santa Cruz社、カタログ番号sc-47778)。二次抗体-ヤギ抗マウス-A555(Jackson Immunoresearch社、カタログ番号111-295-003)、ヤギ抗ウサギIgG-A647(Jackson Immunoresearch社、カタログ番号111-605-003)、HRPコンジュゲート抗マウス(Santa Cruz社、カタログ番号sc-516102)、及びHRPコンジュゲート抗ウサギ(Enzo社、カタログ番号ADI-SAB-300-J)。FACSのために、抗体をBiolegend社から購入し、別段の指定がない限り1:200に希釈した:CD45(クローン:30-F11、カタログ番号103126、103108、103112)、MHC II(クローン:M5/114.15.2、Invitrogen社、カタログ番号48-5321-32、1:400)、CD4(クローン:RM4-5、Invitrogen社、カタログ番号47-0042-80)、CD44(クローン:IM7、カタログ番号103012、1:100)、ly6g/ly6c(クローン:RB6-8C5、カタログ番号108411)、CD8α(クローン:53-6.7、カタログ番号100721)、CD11b(クローン:M1/70、カタログ番号101215)、CD80(クローン:16-10A1、カタログ番号104733)、CD62L(クローン:MEL-14、カタログ番号104405)、CD86(クローン:GL-1、カタログ番号105005、1:150)、CD69(クローン:H1.2F3、カタログ番号104507)、F4/80(クローン:BM8、カタログ番号123110)、及びCD11c(クローン:N418、カタログ番号117307、1:100)。
細胞培養
以下のものを細胞培養のために使用した:HEK 293T(ATCC製)並びにヒトGBM細胞U87MG(ATTC製)、LN4281、LN8272、A549、及びPANC-1(ATTC製)を、10%FBS及び1%pen/strepを補充したDMEM培地において成長させ、マウスGBM細胞株KR158-luc3を、10%FBS及び1%pen/strepを補充したRIPA 1640培地において成長させた。レンチウイルスを産生するために、PEI(1μg/μl)を、pLKO.1骨格(μg)において2:1のPEI(μg):総DNA比で使用して、HEK 293T細胞にトランスフェクトした。PSPAX2及びPMD2.Gプラスミドを、それぞれウイルスのパッケージング及び封入のために、1.25%FBS、10mM HEPES、1×ピルビン酸及び10mM酪酸ナトリウムを補充した改良DMEM培地において使用した。Inovitro(商標)システム(Novocure社、Israel)を使用して、TTFieldsを癌細胞株に印加した。細胞を、200kHz(U87、LN827、LN428及びKR158-luc)及び150kHz(A549、PANC-1)の周波数のTTFieldsを用いて処理した。
免疫蛍光
カバースリップ上で成長させた細胞を、4%パラホルムアルデヒドを用いて4℃で30分間固定し、示された抗原に対する一次抗体の種々の組合せ(希釈率1:500)と共に4℃で一晩、次いで、適切な蛍光色素コンジュゲート二次抗体(希釈率1:500)と共に室温で2時間、インキュベートした。標識細胞を1μgm/mlのDAPI(Thermo Fisher社、カタログ番号D1306)を用いて対比染色し、Zeiss 800倒立型共焦点顕微鏡を使用して画像を捕捉及び解析した。画像を63倍油浸対物レンズで捕捉し、顕微鏡、曝露及びソフトウェア設定の全ての条件を全ての試料について同一に保持した。
定量RT-PCR
QIAGEN RNeasy Mini Kit(カタログ番号74106)を使用して、製造業者のプロトコルに従って細胞/組織からRNAを抽出した。1μgの総RNAを、iScript cDNA Synthesis Kit(BIO-RAD社、カタログ番号1708891)を使用して逆転写に供した。qPCRを、PowerUp SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems社、カタログ番号A25741)を使用して、Applied Biosystems社製のQuantStudio 3において実施した。使用したプライマーは以下の通りである:hISG15フォワード(fw)GGTGGACAAATGCGACGAA、リバース(rev)TGCTGCGGCCCTTGTTAT;hCXCL10 fw AAGTGCTGCCGTCATTTTCT、rev CCTATGGCCCTCATTCTCAC;hSTING fw GCCAGCGGCTGTATATTCTC、rev GCTGTAAACCCGATCCTTGA;hIFNα fw GACTCCATCTTGGCTGTGA、rev TGATTTCTGCTCTGACAACCT;hIFNβ fw GAATGGGAGGCTTGAATACTGCCT、rev TAGCAAAGATGTTCTGGAGCATCTC;hGAPDH fw GGCATGGACTGTGGTCATGA、rev ACCACCATGGAGAAGGC;hIL1α fw TGTAAGCTATGGCCCACTCCA、rev AGAGACACAGATTGATCCATGCA;hIL1β fw CTCTCTCCTTTCAGGGCCAA、rev GAGAGGCCTGGCTCAACAAA;hIL6 fw CACCGGGAACGAAAGAGAAG、rev TCATAGCTGGGCTCCTGGAG;hIL8 fw ACATGACTTCCAAGCTGGCC、rev CAGAAATCAGGAAGGCTGCC;hAIM2 fw GCTGCACCAAAAGTCTCTCC、rev ACATCTCCTGCTTGCCTTCT;hIFIT1 fw TGAAGTGGACCCTGAAAACC;hIFIT1 rev TAAAGCCATCCAGGCGATAG;hMX1 fw GGGAAGGAATGGGAATCAGT;hMX1 rev CCCACAGCCACTCTGGTTAT;hIFI44L fw GATGAGCAACTGGTGTGTCG;hIFI44L rev ACTGACGGTGGCCATAAAAC;mAIM2 fw CATGGAGGTCACCAGTTCCT、rev TTTGTTTTGCTTGGGTTTCC;mIFNβ fw CCCTATGGAGATGACGGAGA、rev CTGTCTGCTGGTGGAGTTCA;mIL6 fw CCGGAGAGGAGACTTCACAG、rev TCCACGATTTCCCAGAGAAC;mISG15 fw AAGAAGCAGATTGCCCAGAA、rev CGCTGCAGTTCTGTACCAC;mIFIT1 fw GCCCAGATCTACCTGGACAA;mIFIT1 rev CCTCACAGTCCATCTCAGCA;mMX1 fw TGTGCAGGCACTATGAGGAG;mMX1 rev ACTCTGGTCCCCAATGACAG;mIFI44L fw GGGGTCTGACGAAAGCAGTA;mIFI44L rev CCCATTGAATCACACAGCAT;mSTING fw GTTTGCCATGTCACAGGATG、rev CAATGAGGCGGCAGTTATTT;mGAPDH fw GGAGCGAGACCCCACTAACA、rev ACATACTCAGCACCGGCCTC。
ウェスタンブロッティング
細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社)を含有するRIPA緩衝液(150mM NaCl、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、25mM、PH7.4トリス)を用いて氷上で20分間処理し、続いて13,000gで20分間4℃にて遠心分離した。上清を回収し、タンパク質アッセイ色素試薬(Bio-Rad社)を使用してタンパク質濃度を決定した。等量のタンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜上に移した。膜を、TBST中5%非脂肪乳を用いてブロッキングし、次いで示された一次抗体(1:500)を用いて4℃で一晩探索し、TBSTを用いて洗浄し、HRPコンジュゲート抗ウサギ又は抗マウス二次抗体(1:500)と共に室温で1時間インキュベートした。
フローサイトメトリー
単一細胞懸濁液は、示された蛍光色素コンジュゲート抗体と共に4℃で20分間、暗所にてインキュベートする前にFcをブロッキングされた細胞であった。FACSをBD FACS Canto IIにおいて実施し、FlowJo_V10によって解析した。生細胞をSSC-A(y)対FSC-A(x)ドットプロットにおいて細胞片から分離し、ダブレットを、FSC-H(y)対FSC-A(x)/SSC-H(y)対SSC-A(x)ドットプロットを用いて除去した。シングレットを指示通りに解析及びゲーティングした。
カスパーゼ-1活性化アッセイ
カスパーゼ-1活性化アッセイを製造業者のプロトコルに従って実施した(FAM-FLICA(登録商標)Caspase-1 Assay Kit、ImmunoChemistry社、カタログ番号97)。接着細胞をトリプシン処理し、洗浄緩衝液中で2回洗浄し、再懸濁し、FLICAと共に1:30の希釈率で37℃にて1時間インキュベートし、洗浄し、BD FACS Canto IIによってFTICチャネルにおいて解析した。細胞片及びダブレットは解析から除去した。
ELISA
細胞培養培地又は全細胞溶解物を、DuoSet(登録商標)ELISA Development Systems(R&D社、カタログ番号DY007)を使用して解析した。プレートを、一次抗体(R&D社、カタログ番号DY814-05)を用いて、アッセイの1日前に一晩コーティングした。試料及び標準物質を一次抗体コーティングプレートに2連で添加し、それぞれビオチン化抗体及びHRPコンジュゲートストレプトアビジンと共に室温で2時間インキュベートし、続いてHRP発色試薬と共に20分間インキュベートし、各工程の間に3回洗浄した。停止溶液を添加した後、450nm～570nmにおける光学密度を測定した。試料定量を標準曲線に基づいて算出した。
LDH放出アッセイ
細胞培養培地を等容量のCytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試薬と共に、製造業者のプロトコルに従って(Promega社、カタログ番号G1780)、室温で30分間インキュベートした。490nm波長における吸光度を、Molecular Device SpectraMax i3xマイクロプレートリーダーを使用して測定した。データを、LDH放出(%)=[(未知-陰性)/(陽性-陰性)]×100%として提示した。
共培養実験
スクランブルshRNA或いはSTING若しくはAIM2又はその両方に対するshRNAを安定に発現する2組の2×104個のKR158-luc細胞を各60mmセラミック皿に播種し、次いで3日間、未処理のままとしたか又は200kHzのTTFieldsを用いて処理した。次いで、上清を回収し、0.45μmフィルターを使用して濾過し、次いで、各ウェルが10%FBS及び6～8週齢の雄C57BL/6Jマウスから採取したばかりの106個の脾細胞を有するRPMIを含有する12ウェルプレートに添加し、3日間共培養した。4及び5日目に、残りのセラミック皿からの培養培地を回収して、共培養に補充した。6日目に、共培養脾細胞(CD45+)の免疫表現型をフローサイトメトリーによって解析した。
頭蓋内ワクチン接種プロトコル
全ての動物実験は、施設のIACUCの規制及び規則に準拠して実施した。スクランブルshRNA又はSTING、AIM2若しくはその両方に対するshRNAを安定に発現するKR158-luc細胞を3日間、未処理としたか又は200kHzのTTFieldsを用いて処理した。3μlのPBSに懸濁した3×105個のこれらのTTFields処理KR158-luc細胞を、6週齢の雄同系C57BL/6Jマウス(Jackson Laboratory社)の脳の前頭葉後部に、ブレグマを参照点として右側方に2mm、深さ3.5mmの位置に、自動マウス定位固定装置(Stoelting社の)を使用してゆっくり(1μl/分)移植した。同所性腫瘍成長を生物発光イメージング(下記を参照されたい)によってモニタリングした。1つのコホートを免疫表現型解析のために移植の2週間後に安楽死させ、残りは生存エンドポイントまで進めた。免疫表現型解析のために、血液、頸部リンパ節、脾臓、骨髄を回収し、単一細胞懸濁液に消化し、40μmフィルターを介して濾過し、必要に応じて溶解緩衝液(BD社、カタログ番号555899)を使用して赤血球溶解に供した。マウス脳をOCTに包埋し、解析まで-80℃で保存した。
抗原再投与実験のために、5μlのPBS中6×105個の親KR158-luc細胞を、初回注射後100日目に生存していたマウス並びに週齢及び性別を一致させたナイーブマウスに頭蓋内注射した。抗原再投与の1及び2週間後、免疫表現型解析のためにPBMCを尾静脈穿刺により採取した。抗原再投与の20週間後、生存マウスを安楽死させ、dcLN、血液及び脾臓を免疫表現型解析のために回収した。対照については、週齢及び性別を一致させたナイーブマウスのコホートに5μlのPBS中6×105個の親KR158-luc細胞を同所移植し、2週間後に同じ組織を同じ免疫表現型の解析のために回収した。
in vivoイメージングシステム(IVIS)スペクトル
脳腫瘍成長をモニタリングするために、IVISシステム(Xenogen社)を使用して動物をイメージングした。マウスをイソフルラン(5%誘導及び2%維持)によって麻酔した。RediJect D-Luciferin Bioluminescent Substrate(PerkinElmer社、カタログ番号UL08RV01)をマウスに皮下注射し、生物発光シグナルがそのピークに達するまで繰り返し画像を撮影した。データは、Living Imageソフトウェア(Caliper Life Sciences社)を使用して解析した。
単一細胞PBMC RNA-seq解析
試料のプロセシング
患者由来の凍結保存したPBMCを、PBSを用いて洗浄し、生存率をトリパンブルー染色によって検証した(補足表S2)。単一細胞懸濁液をChromium Single Cell Chip(10x Genomics社)に、およそ10,000細胞/試料の標的捕捉率で製造業者の説明書に従って充填した。プールされた単一細胞RNA-seqライブラリーを、Chromium Single Cell 3' Solution(10x Genomics社)を使用して、製造業者の説明書に従って調製した。各患者及び結果として得られたライブラリーの、TTFields処理前(TTF前)及びTTFields処理後(TTF後)のペアになった全ての試料を、同じバッチにおいて並列的にプロセシングした。合計で3つのバッチが存在した。全ての単一細胞ライブラリーを、細胞バーコードと固有分子識別子(UMI)とを含有する28塩基のリード1及びmRNA挿入のための150塩基のリード2を含む8塩基i7試料インデックスリードを用いて、Illumina Novaseqにおいて配列決定した。試料特徴を補足表S3に要約する。
データ処理
主要な操作は、別段の記述がない限りSeurat Rパッケージ(3.2.2)4、5を使用して実施した。関数のオプション引数が初期値から逸脱した場合、変化の詳細を提供した。デフォルトオプションに対する変化の大半は、大きなサイズのデータセットを収容し、活用するために行った。
Cell Ranger集計:生配列決定データのbclからfastqフォーマットへの変換、並びにその後の参照ゲノムGRCh38(GENCODE v.24)に対するアラインメント及び遺伝子計数を、cellrangerソフトウェア(10x Genomics社、バージョン4.0.0)を使用して、それぞれコマンドcellranger mkfastq、STAR aligner、及びコマンドcellranger countにより実施した。全てのライブラリー及びバッチの結果を、下流において行うために死細胞についての正規化を行わずに、コマンドcellranger aggrを使用して一緒にプールした。この工程から取得した、フィルタリングされたバックグラウンドフィーチャーバーコードマトリックスを、逐次解析のための入力として使用した。
UMIの正規化:グローバルスケーリング正規化法を使用して、各細胞の特徴発現を総発現で除算し、スケール因数(10,000)を乗算し、Seurat R関数NormalizeDataを方法「Log Normalize」で使用して対数変換した。
Seurat集計及びバッチ効果の補正:カウント数が3つの異なるバッチからのものだったので、細胞をアラインメントし、次元削減及びクラスタリングのためにバッチ効果を取り除くために、マルチデータセット統合戦略を、以前に記載されたように採用した5。簡潔に述べると、「アンカー細胞」をデータセットのペア間で同定し、異なるバッチからの複数のデータセットを正規化するために使用した。本発明者らのデータセットのサイズ(合計で193760個の細胞)を考慮して、Seurat Rパッケージに詳述されている方法の参照基準相互PCA変法(reference-based, reciprocal PCA variant)を選択した4、5。初めに、以前に統合されたデータセットを、Seurat関数SplitObjectを使用してバッチ数で分割した。次に、各分割オブジェクトに対して、関数FindVariableFeaturesを使用して変数特徴選択(variable feature selection)を実施した。統合のための特徴を、関数SelectIntegrationFeaturesを使用して選択し、各分割オブジェクトに対して、選択した特徴に関するPCAを実施した。関数FindIntegrationAnchorsを、参照を3つのバッチ間で最大のものとして選択し、削減オプションを「rpca」に設定して使用することによって、アンカー細胞を同定した。最後に、3つのバッチからの全データセットを、関数IntegrateDataを同定されたアンカー細胞に関して使用して、再統合した。
UMAP次元削減:統合された複数のバッチデータセットをUMAP次元削減6のための入力として使用した。特徴発現を、Seurat関数ScaleDataを使用してスケーリングし、続いて関数RunPCA(Seurat)を主成分(PC)の総数で使用してPCAを実行し、100のオプションを計算及び保存した。RunUMAP関数(Seurat)を、入力特徴量として上位75のPC(dims=1:75)、min.dist=0.75、及びエポックを学習する数n.epochs=2000で使用して、単一細胞のUMAP座標を取得した。
細胞のクラスタリング:類似した細胞間にエッジを引いたK近傍グラフに細胞を埋め込み、ネットワーク内のノードをコミュニティに分割する、グラフに基づくクラスタリング手法をSeuratパッケージにおいて実行した。簡潔に述べると、FindNeigbhors関数を、入力された削減のオプション次元dims=1:75、エラーバウンドnn.eps=0.5で使用して、共有近傍グラフを構築した。この関数は、それぞれの細胞とそのk.param個の近傍細胞との間の近傍重複(ジャッカード指数)を算出する7。FindClusters関数を解像度パラメータについて種々の値で使用して、グラフをクラスターに分割した。解像度が高いほど、クラスターサイズは小さい。0.1、1、3、5、10の解像度値を試験した。解像度0.3では、細胞亜型を有しない、B及びT細胞等の全ての主要な細胞型の大きなクラスターが得られた。解像度3、5及び10では、過剰に小さいクラスターが得られ、これは、大半は患者特異的で、患者間の一般化を困難にした。解像度1は、適度なクラスターサイズを生じ、細胞を生物学的に認識される細胞亜型に分割したため、それを選択して下流解析を実施した。FindAllMarkers関数を、陽性マーカーのみを戻すオプションで、マーカーを有する細胞の最小比率を0.25として使用して、各クラスターの発現変動遺伝子マーカーを見出した。デフォルトのウィルコクソンの順位和検定を使用して、各細胞クラスターにおける統計的な差を算出した。
死細胞排除における解析計画:上記解析の全てにおいて、死細胞はクラスタリング前にフィルタリングによる除去が行われず、クラスターに基づく死細胞排除を使用した。死細胞のフィルタリングによる除去は、ミトコンドリア遺伝子含量及び読み取られたUMIの平均数又は遺伝子1つ当たりのUMIの平均数によって、クラスタリング前に試験した。特定の患者データセットの適度な閾値は同定されなかった。15%未満のミトコンドリア含量という緩い閾値の使用でさえ、一部の患者では40%超の細胞を除去した。トリパンブルー染色を使用して死細胞比率を推定したが、死細胞比率は常に10%以下であった(表S2)。本発明者らのデータセットにおけるミトコンドリア遺伝子の含量の異常な上昇は、癌の診断、近年の放射線療法及び化学療法、並びにTTFields処置、並びにステロイド処置等を含む、これらの患者が受けた著しいストレスに起因し得る。結果として、全ての細胞は、クラスタリング前に死細胞についてのプレフィルタリングをせずに解析された。代わりに、死細胞は、クラスタリング後に同定され、死細胞は、UMAPマップの中央に、明確な細胞特異的同一性を伴わず、上昇したミトコンドリア遺伝子及びハウスキーピング遺伝子を有するスメア状のクラスターを形成した(解像度1のUMAPにおけるクラスター16、24、28、及び30)。これらのクラスターにおける細胞は、更なる解析から排除した。
TTFields処置解析
クラスター割合変化。各クラスターのTTFields処置後のクラスター割合変化を、TTFields処置前及びTTFields処置後の各患者のペアになった対数比例値についてウィルコクソンの符号順位検定を使用し、Rプログラミング環境(バージョン4.0.3)においてwilcox.testをオプションペア=TRUEで使用して、実施した。
クラスター割合変化と多様性変化との相関。各患者のクラスター割合、及びTTFields処置前とTTFields処置後との間のTCR多様度指数の対数倍率変化を算出した。次に、スピアマンの相関検定を、割合変化及びTCR多様度変化のlogFCを入力として使用して、Rプログラミング環境(バージョン4.0.3)において関数cor.test、方法=「spearman」を使用して実施した。
ペアになったTTFields前試料とTTFields後試料との間の遺伝子発現変動解析。発現変動解析を、LIMMA/Voom法(LIMMA Rパッケージ)を使用して行った8～10。簡潔に述べると、各クラスターの単一細胞UMIカウント数マトリックスを、平均-分散関係の推定値を用いてlog2カウント数毎100万(log2-counts per million、logCPM)に変換し、voom関数を使用して適切な観察レベルの重みを計算するために使用した。次いで、変換したマトリックスを、関数lmfitを使用して、時点及び患者を因子として用いて線形モデルにフィッティングさせた。調整された(moderated)t統計量を、関数eBayesを使用して、全体の値に対する標準誤差の経験的ベイズ調整を使用して計算した。次に、TTFields前及びTTFields後の時点の差異の推定係数及び標準誤差を、関数contrasts.fitを使用して算出した。次いで、差異特異的な調整されたt統計量を、関数eBayesを使用して計算した。logFC、t統計量、p値を、関数topTableを使用してエクスポートした。
経路発現変動解析。遺伝子セットエンリッチメント解析(GSEA)を、目的の免疫特異的経路の解析のために、以前に記載されたように使用した11。各クラスターについて、全ての遺伝子を、上記の遺伝子発現変動解析工程からの調整されたt検定を使用して順位付けした。次いで、http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jspからダウンロードしたGSEAのコマンドライン及びJava実装を使用して、GSEA(予め順位付けされた、「classic」モード、10,000の順列)を実施して、目的の経路の濃縮を算出した。
各クラスターの遺伝子発現及び経路活性のlogFCのヒートマップ。各クラスターについて、各ライブラリーの遺伝子カウント数を、細胞の全ての関連UMIカウント数を合計することによって算出し、カウント数をキロベース単位の遺伝子の長さで除算することによって転写物毎100万(transcript per million、tpm)単位に正規化して、リード毎キロベース(read per kilobase、RPK)を取得した。RPKを、各ライブラリーの総RPK値で除算することによって正規化し、100万単位で表し、log2変換した。次いで、各患者のTTFields処置前とTTFields処置後との間の遺伝子発現のlogFCを、それぞれの対数tpm値を減算することによって算出した。
全経路活性logFC算出のために、経路及び遺伝子メンバーシップを遺伝子オントロジーhttp://geneontology.org/からダウンロードして、生物学的プロセスに関連するもののみを選択した。各経路の活性を、その経路における全ての遺伝子のtpm平均値として算出し、各患者のTTFields処置前とTTFields処置後との間の経路のlogFCを、TTFields後の経路活性の値をTTFields前の値で除算することによって算出し、続いてヒートマップによって報告及び可視化した。
単一細胞レベルでのT1IRG経路スコアのヒートマップ。スコアは、遺伝子オントロジー「response to type I interferon」GO:0034340に属するとアノテーションされた遺伝子の平均発現(Seurat関数NormalizeDataによって正規化した;簡潔に述べると、各細胞の特徴カウント数を、その細胞の総カウント数で除算し、10000を乗算し、次いでlog1pを使用して自然対数変換した)として定義した。遺伝子セットは、//www.gsea-msigdb.orgからダウンロードし、99の遺伝子を含んだ:ABCE1、ADAR、BST2、CACTIN、CDC37、CNOT7、DCST1、EGR1、FADD、GBP2、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HSP90AB1、IFI27、IFI35、IFI6、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IKBKE、IP6K2、IRAK1、IRF1、IRF2、IRF3、IRF4、IRF5、IRF6、IRF7、IRF8、IRF9、ISG15、ISG20、JAK1、LSM14A、MAVS、METTL3、MIR21、MMP12、MUL1、MX1、MX2、MYD88、NLRC5、OAS1、OAS2、OAS3、OASL、PSMB8、PTPN1、PTPN11、PTPN2、PTPN6、RNASEL、RSAD2、SAMHD1、SETD2、SHFL、SHMT2、SP100、STAT1、STAT2、TBK1、TREX1、TRIM56、TRIM6、TTLL12、TYK2、UBE2K、USP18、WNT5A、XAF1、YTHDF2、YTHDF3、ZBP1。
単離Tリンパ球のバルクRNA-seq及びTCRクローン型解析
試料調製
何も付着していない(untouched)T細胞を、ヒト汎T細胞単離キットを製造業者の説明書に従って使用して(Miltenyi Biotec社、カタログ番号130-096-535)、PBMC単一細胞懸濁液から選択した。RNAを、QIAGEN RNeasy Midi Kit(カタログ番号75144)を製造業者の説明書に従って利用して抽出した。University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research Gene Expression & Genotyping/NextGen Sequencing Coreにおいて、バルクRNAseqライブラリーを構築し、プールし、NovaSeq 6000 Illumina機器において配列決定した。
配列決定解析
ペアエンドリードを、trimmomatic v/0.36を用いてトリミングした。アノテーションGeneCode release 28をデフォルトオプション及びquantmode=GeneCountsのSTAR v2.6.0bによって使用して、アラインメント及び遺伝子カウント数をGRCh38.p12ゲノムアセンブリに対して生成した(表S4)。遺伝子発現及び経路活性のlogFCのヒートマップを、上記の単一細胞解析に記載した手順と同様に作成した。
TCRクローン型解析
T細胞受容体クローンをバルクRNA-seqデータから抽出するために、バルク非標的RNA-seqからのペアエンドリードを、T及びB細胞受容体レパートリー配列決定データを解析するための汎用ツールであるMiXCR v.3.0.13(https://milaboratory.com/software/mixcr/)に供給し、コマンドanalyze shotgunを、出発材料rna、産生性のみのオプションで使用した。このコマンドは、生配列決定リードのアラインメント、重複する断片化リードのアセンブリ、良好なTCRアラインメントの入力、アラインメントされた配列のクローン型へのアセンブリ、及び結果として得られたクローン型のタブ区切りファイルへのエクスポートを含む複雑なパイプラインを実行した。各試料について、逆シンプソン指数を、vdjtools v1.2.1(https://github.com/mikessh/vdjtools)をコマンドCalcDiversityStats及び直前のMixCR工程からのクローン型の入力と共に使用して算出した。Immunoarch Rパッケージv0.6.5(https://cloud.r-project.org/web/packages/immunarch/index.html)を関数trackClonotypes、オプションcol=「a.a」で使用して、クローナル変化プロットを作成して、同じアミノ酸配列を共有する全てのクローンを折り畳んだ。
統計解析
GraphPad Prism 8ソフトウェアを統計解析のために使用した。全ての統計的検定は両側であり、特定の統計的比較のそれぞれについて、0.05以下のP値(95%信頼区間を伴う)を統計的に有意と見なした(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001)。連続的結果を有するデータは平均±s.e.mとして表す。scRNA-seqについて、比較はアノテーションされたクラスターに基づいており、各患者の処置の前後を比較した。
本明細書に記載される方法は、交流電場を生きている対象の身体の標的領域に(例えば、Novocure Optune(登録商標)システムを使用して)印加することによって、in vivo文脈に適用することもできる。これは、例えば、選択されたサブセットの電極間へのAC電圧の印加により、交流電場を対象の身体の標的領域にかけることになるように、それらの電極を対象の皮膚又はその下に位置付けることによって達成され得る。
例えば、関連する細胞が対象の脳に位置している状況では、1対の電極を対象の頭の前部及び後部に位置付けることができ、第2の対の電極を対象の頭の右及び左側に位置付けることができる。一部の実施形態では、電極は対象の身体に容量結合される(例えば、伝導板を備え、伝導板と対象の身体との間に誘電体層が更に配置されている電極を使用することによって)。しかし、代替的な実施形態では、誘電体層は省略されてもよく、その場合、伝導板は対象の身体と直接接触し得る。別の実施形態では、電極は患者の皮膚の下に皮下挿入され得る。AC電圧生成装置は、選択された周波数(例えば200kHz)のAC電圧を右の電極と左の電極との間に第1の期間(例えば1秒)印加し、これにより、力線の最も重要な成分が対象の身体の横軸に平行である交流電場を誘導する。
次いで、AC電圧生成装置は、同じ周波数(又は異なる周波数)のAC電圧を前の電極と後ろの電極との間に第2の期間(例えば1秒)印加し、これにより、力線の最も重要な成分が対象の身体の矢状軸に平行である交流電場を誘導する。次いで、この2工程シーケンスを処置の期間にわたって繰り返す。任意選択で、熱センサーを電極に備え付けてもよく、AC電圧生成装置は、感知された電極の温度があまりにも高くなった場合に、電極に印加されるAC電圧の振幅を減少させるように構成することができる。一部の実施形態では、1対又は複数対の追加の電極を配列に追加及び含めてもよい。代替的な実施形態では、1対のみの電極が使用され、その場合、力線の方向は切り替えられない。このin vivo実施形態のパラメータ(例えば、周波数、電界強度、期間、方向切替え速度、及び電極の位置)のいずれも、in vitro実施形態と関連して、上に記載したように変更することができることに留意されたい。しかし、in vivo文脈では、電場が常に対象にとって安全であり続けることを保証するように注意しなければならない。
本明細書に記載した実験では、交流電場は途切れることのない時間間隔(例えば、72時間又は14日)にわたって印加されたことに留意されたい。しかし、代替的な実施形態では、交流電場の印加は、好ましくは短い中断によって途切れてもよい。例えば、72時間の時間間隔は、交流電場を12時間単位で6回にわたって印加し、それらの単位のそれぞれの間に2時間の中断を設けることによって満たされてもよい。
(参考文献)
Figure 2024507806000003
Figure 2024507806000004
Figure 2024507806000005
Figure 2024507806000006
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Figure 2024507806000009
Figure 2024507806000010
Figure 2024507806000011
Figure 2024507806000012
Figure 2024507806000013
本発明は、ある特定の実施形態を参照して開示されたが、記載された実施形態に対する多数の修正、変更、及び変更は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の領域及び範囲から逸脱することなく可能である。したがって、本発明は、記載された実施形態に限定されるのではなく、以下に列挙される特許請求の範囲の文言及びその均等物によって定義される全範囲を有することが意図される。

Claims (30)

  1. (a)対象の免疫細胞において、以下のバイオマーカー:
    サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子、
    免疫細胞機能調節因子、
    ナイーブ免疫細胞マーカー、
    制御性T細胞因子、若しくは
    免疫抑制受容体、又は
    それらの組合せ
    の第1の発現レベルを決定する工程、
    (b)工程(a)の後且つ工程(c)の前に、50kHz～1MHzの間の周波数の交流電場を対象の腫瘍細胞に印加する工程、並びに
    (c)対象の免疫細胞において、工程(a)のバイオマーカーの第2の発現レベルを決定する工程
    を含む方法。
  2. 周波数が100kHz～500kHzの間である、請求項1に記載の方法。
  3. 工程(a)が、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第1の発現レベルを決定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
  4. 工程(a)が、免疫細胞機能調節因子の第1の発現レベルを決定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
  5. 工程(a)が、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第1の発現レベルを決定する工程、並びに免疫細胞機能調節因子の第1の発現レベルを決定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
  6. 免疫細胞機能調節因子がT細胞機能調節因子である、請求項4又は5に記載の方法。
  7. 工程(a)が、
    サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子、
    免疫細胞機能調節因子、
    ナイーブ免疫細胞マーカー、
    制御性T細胞因子、並びに
    免疫抑制受容体
    の第1の発現レベルを決定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
  8. バイオマーカー発現レベルが、核酸発現又は対応するタンパク質の発現によって決定される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. (i)少なくとも50%のサイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第1の発現レベルが、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第2の発現レベルよりも低いか、
    (ii)少なくとも50%の免疫細胞機能調節因子の第1の発現レベルが、免疫細胞機能調節因子の第2の発現レベルよりも低いか、
    (iii)少なくとも50%のナイーブ免疫細胞マーカーの第1の発現レベルが、ナイーブ免疫細胞マーカーの第2の発現レベルよりも高いか、
    (iv)少なくとも50%の制御性T細胞因子の第1の発現レベルが、制御性T細胞因子の第2の発現レベルよりも高いか、又は
    (v)少なくとも50%の免疫抑制受容体の第1の発現レベルが、免疫抑制受容体の第2の発現レベルよりも高いか若しくはそれと比較して変化していない
    場合にチェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する工程を更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 少なくとも50%のサイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第1の発現レベルが、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第2の発現レベルよりも低い場合にチェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する工程を更に含む、請求項9に記載の方法。
  11. 少なくとも50%の免疫細胞機能調節因子の第1の発現レベルが、免疫細胞機能調節因子の第2の発現レベルよりも低い場合にチェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する工程を更に含む、請求項9に記載の方法。
  12. (i)少なくとも50%のサイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第1の発現レベルが、サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子の第2の発現レベルよりも低く、且つ
    (ii)少なくとも50%の免疫細胞機能調節因子の第1の発現レベルが、免疫細胞機能調節因子の第2の発現レベルよりも低い
    場合にチェックポイント阻害薬を用いて対象を処置する工程を更に含む、請求項9に記載の方法。
  13. 免疫細胞機能調節因子がT細胞機能調節因子であるか、又はナイーブ免疫細胞マーカーがナイーブT細胞マーカーである、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
  14. サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸が、GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、及びCCL4、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から3、5から10、及び11のいずれか一項に記載の方法。
  15. 免疫細胞機能調節因子を発現する核酸が、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、及びHMGB3、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から2、4から9、及び11から12のいずれか一項に記載の方法。
  16. ナイーブ免疫細胞マーカーを発現する核酸が、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、及びIL7R、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から2及び7から9のいずれか一項に記載の方法。
  17. 制御性免疫細胞因子を発現する核酸が、IL2RA、FOXP3、及びIKZF2、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から2及び7から9のいずれか一項に記載の方法。
  18. 免疫抑制受容体を発現する核酸が、LAG3、TIGIT、PDCD1、及びCTLA4、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から2及び7から9のいずれか一項に記載の方法。
  19. 核酸が、GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、CCL4、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、HMGB3、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、IL7R、IL2RA、FOXP3、IKZF2、LAG3、TIGIT、PDCD1、CTLA4、又はそれらの組合せを含む、請求項1又は9に記載の方法。
  20. チェックポイント阻害薬が、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミリマブ、アテゾリムマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、IDO1阻害薬、TIGIT阻害薬、LAG-3阻害薬、TIM-3阻害薬、VISTA阻害薬、及びB7-H3阻害薬からなる群から選択される、請求項9から19のいずれか一項に記載の方法。
  21. 腫瘍細胞が、脳細胞、血液細胞、乳房細胞、膵細胞、卵巣細胞、肺細胞、及び間葉系細胞からなる群から選択される、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 腫瘍細胞が脳細胞である、請求項21に記載の方法。
  23. 腫瘍細胞が癌細胞である、請求項21に記載の方法。
  24. サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子、T細胞機能調節因子を発現する核酸、ナイーブT細胞マーカーを発現する核酸、制御性T細胞因子を発現する核酸、並びに免疫抑制受容体を発現する核酸の発現を検出するための核酸を含むキット。
  25. サイトカイン及び細胞傷害性遺伝子を発現する核酸が、GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、及びCCL4、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項24に記載のキット。
  26. 免疫細胞機能調節因子を発現する核酸が、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、及びHMGB3、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項24又は25に記載のキット。
  27. ナイーブ免疫細胞マーカーを発現する核酸が、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、及びIL7R、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項24から26のいずれか一項に記載のキット。
  28. 制御型免疫細胞因子を発現する核酸が、IL2RA、FOXP3、及びIKZF2、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項24から27のいずれか一項に記載のキット。
  29. 免疫抑制受容体を発現する核酸が、LAG3、TIGIT、PDCD1、及びCTLA4、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項24から28のいずれか一項に記載のキット。
  30. GZMB、GZMH、GZMK、GNLY、PRF1、INFG、NKG7、CX3CR1、CCL3、CCL4、ZEB2、ZHF683、HOPX、TBX21、ID2、TOX、GF11、EOMES、HMGB3、TCF7、SELL、LEF1、CCR7、IL7R、IL2RA、FOXP3、IKZF2、LAG3、TIGIT、PDCD1、及びCTLA4を検出するための核酸を含む、請求項24に記載のキット。
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