KR102360824B1 - Th-gm 세포 기능 조절 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 IL-7/STAT5에 의해 조절되고 GM-CSF/IL-3을 분비하는 T-헬퍼 세포("TH-GM" 세포)를 개시한다. 또한 예를 들어 염증 질환의 치료를 위해 TH-GM 기능을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 개시한다. 비-TH-GM-매개된(예를 들어 TNF-α-매개된) 염증 질환과 다른, 및/또는 상기 질환 외에, TH-GM-매개된 염증 질환(예를 들어 류머티스성 관절염)을 특이적으로 식별하기 위한 진단 및 예측 방법을 또한 제공한다.

Description

TH-GM 세포 기능 조절 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING TH-GM CELL FUNCTION}
관련 출원
본 출원은 2014년 9월 26일자로 출원된 싱가포르 특허 출원 제 10201406130P의 이점을 청구한다. 상기 출원의 전체 교시는 본 발명에 참고로 인용된다.
상당한 일련의 연구는 면역 및 염증 질환의 조절장애뿐만 아니라 면역 및 염증의 현행 모델을 도출하였다. 현재 CD4+ 헬퍼 T(TH) 세포는 후천성 및 선천성 면역 반응들을 조화시킴으로써 다양한 병원체들에 대한 숙주 방어에 중대한 역할을 하는 것으로 이해된다. 동족 항원에 의한 T-세포 수용체(TCR) 활성화시, 나이브 CD4+ T 세포는 적어도 5개의 주요 부분집합: TH1, TH2, TH17, iTreg 및 TFH(이들은 사이토킨 환경에 의해 조절됨)로의 분화를 실행한다. TH1 및 TH17 세포는 염증의 1차 효과기인 것으로 공지되어 있다. 그러나, 다양한 염증 질환에서 TH1 또는 TH17의 발병 역할은 여전히 불명확한 채로 있다. 예를 들어, 최근의 연구들은 다발성 경화증(MS) 병원성에서 앞서 이해된 TH17의 패러다임과 상충하여(Haak et al., 2009), MS 요법에 대한 잠재적인 약물 표적의 식별을 보다 더 어렵게 하고 있다. 유사하게, 류머티스성 관절염(RA)은 전통적으로 종양 괴사 인자 α(TNF-α)에 의해 매개되는 질환인 것으로 이해되고 있지만, RA 환자의 40% 이하는 항-TNF-α 치료에 응답하지 않는다.
따라서, 예를 들어 MS 및 RA와 같은 자가면역 및 염증 질환에 유효한 치료 방법에 대한 충족되지 않은 상당한 요구가 여전히 존재한다.
본 명세는 부분적으로, 인터류킨-7(IL-7)/전사 신호 변환인자 및 활성인자 5(signal transducer and activator of transcription 5: STAT5)-조절된 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)/IL-3-생성 TH 세포(TH-GM이라 칭한다)(특유의 발생 및 기능 특성을 갖는 독특한 헬퍼 T 세포 부분집합을 나타낸다)의 식별에 관한 것이다. 본 명세서에서 TH-GM 세포에 의해 매개되는 염증 경로(TH-GM-매개된 염증 경로)가 식별되며, 상기 경로는 공지된 비-TH-GM-매개된 염증 경로(예를 들어 염증의 TNF-a, IL-6, 및 IL-1b 경로)와 별개의 독립적인 염증 경로를 나타낸다. 본 명세는 TH-GM-매개된 염증 질환을 진단하고 상기 TH-GM 경로에 의해 매개된 염증 질환의 치료를 위해 TH-GM 기능을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
따라서, 하나의 태양에서, 본 명세는 염증 질환을 앓고 있는 환자에서 TH-GM-매개된 염증 질환을 진단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 염증 질환을 앓고 있는 환자로부터 수집된 샘플을 STAT5(예를 들어 포스포-STAT5(Tyr694)), IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 검출하는 검출제와 접촉시키고; b) 상기 STAT5(예를 들어 포스포-STAT5(Tyr694)), IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 정량분석함을 포함하고, 여기에서 참조 수준에 비해 STAT5(예를 들어 포스포-STAT5(Tyr694)), 인터류킨-7(IL-7), GM-CSF 또는 인터류킨(IL-3), 또는 이들의 조합의 증가된 수준은 상기 환자가 TH-GM-매개된 염증 질환을 앓고 있음을 가리킨다.
또 다른 태양에서, 본 명세는 GM-CSF-분비 T-헬퍼 세포(TH-GM)의 단리된 집단을 제공하며, 여기에서 상기 TH-GM 세포는 IL-7 및 활성화된 STAT5의 존재하에서 분화 4(CD4+) 전구 세포의 집단으로부터 분화되고 상기 TH-GM 세포는 GM-CSF 및 IL-3을 발현한다.
또 다른 태양에서, 본 명세는 상기 TH-GM 또는 CD4+ 전구세포, 또는 이 둘을 모두 TH-GM 기능을 조절하는 조절제와 접촉시킴을 포함하는, TH-GM 기능의 조절 방법을 제공한다.
일부 태양에서, 본 명세는 TH-GM-매개된 염증 질환의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 TH-GM 세포 기능을 조절하는 조절제를 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 태양에서, 본 명세는 항-종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 요법에 대해 제한된 응답을 나타내는 환자에게 유효량의 TH-GM 기능을 조절하는 조절제를 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 류머티스성 관절염을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 명세는 STAT5-매개된 염증 질환의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 STAT5 기능을 조절하는 작용제를 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 태양에서, 본 명세는 TH-GM 세포 기능의 조절제를 식별하기 위한 선별 방법을 제공하며, 상기 방법은 TH-GM 세포의 단리된 집단 또는 CD4+ 전구세포의 단리된 클러스터를 후보 작용제와 접촉시키고, 상기 후보 작용제의 존재 또는 부재하에서 TH-GM 기능의 판독정보(readout)를 측정함을 포함하며, 여기에서 상기 TH-GM 기능의 판독정보의 변화는 상기 후보 작용제가 TH-GM 기능의 조절제임을 가리킨다.
본 명세는 주로 TH-GM-매개되거나 또는 주로 비-TH-GM-매개되거나(예를 들어 TNF-α, IL-6 및/또는 IL-1β에 의해 매개되거나) 또는 이 둘 모두인 염증 질환들간의 식별 또는 분류를 가능하게 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법들을 사용하여, 예를 들어 RA를 앓고 있는 환자가 주로 TH-GM-매개되거나 또는 주로 비-TH-GM-매개되거나 또는 이 둘 모두인 RA를 앓고 있는지를 판정할 수 있다. 상기 구별은 염증 질환, 예를 들어 RA(상기에 대한 현행 치료는 단지 40% 유효하다)의 보다 표적화되고 잘 맞는 치료 방법을 허용한다. 더욱이, 본 명세는 염증 질환의 질환 단계에 따라 상기 치료를 맞추기 위해서 상기 질환의 진행을 예측하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 명세서는 또한 염증 질환, 특히 TH-GM-매개된 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
상기는 하기 본 발명의 보다 특정한 예시적인 실시태양의 설명으로부터 자명할 것이다.
도 1A 내지 1D는 Stat5-조건(Stat5-conditional) 돌연변이 마우스가 EAE에 내성임을 묘사한다. MOG35-55/CFA로 2회 면역시킨 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스의 임상적 EAE 점수(도 1A) 및 발병률(도 1B). 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타내거나(도 1A) 또는 3개의 실험으로부터 풀링된(pooled) 것을 나타낸다 (도 1B, 그룹당 n=18). MOG35-55/CFA로 1회 면역시킨 (도 1C, 그룹당 n=5) 또는 MOG35-55/LPS로 2회 면역시킨(도 1D) EAE 마우스의 임상적 점수. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 2A 내지 2D는 Stat5 조건 돌연변이 마우스에서 감소된 신경염증을 묘사한다. 2차 면역 후 9일째에 EAE 마우스로부터 수득된 척수 절편의 조직학(도 1A). 나타낸 상들은 그룹당 3마리 마우스에 의한 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. 스케일 막대, 200 ㎛(상부), 50 ㎛(기부). 척수 절편 중 CD4+ 및 CD11b+ 세포는 면역형광에 의해 염색되었다(도 1B). 나타낸 상들은 그룹당 3마리 마우스에 의한 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. 스케일 막대, 200 ㎛. CNS 단핵세포를 질병의 피크에서 유식 세포측정에 의해 분석하였다(도 2C 및 2D). 우측 패널은 2개의 실험(n=9)으로부터 풀링된 세포 비율(도 2C, 우측) 또는 세포수(도 2D, 우측)이다.
도 3A 및 3B는 Stat5-결핍 마우스에서 EAE에 대한 내성이 TH1, TH17 또는 Treg 세포와 독립적임을 묘사한다. 질병의 피크에서 CNS-침윤 CD4+ T 세포에 의한 IL-17 및 IFN-γ 발현의 유식 세포측정 분석(도 3A). 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. 질병의 피크에서 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- EAE 마우스의 CNS 중의 CD4+ T 세포 중 CD25+의 비율을 유식 세포측정에 의해 분석하였다(도 3B).
도 4A 내지 4C는 조건 Stat5 돌연변이 마우스가 말초에서 CD4+ T 세포 생성에 결함이 없음을 묘사한다. 비장을 7일째(도 4A) 및 21일째(도 4B)에 MOG35-55/CFA-면역된 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스로부터 수득하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율을 유식 세포측정에 의해 분석하였다. CD4+ T 세포의 절대수를 계산하였다(우측 패널). 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타내거나(도 4A) 또는 2개의 독립적인 실험으로부터 풀링된 것이다(도 4B). Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- EAE 마우스의 비장 CD4+ T 세포에 의한 IL-17 및 IFN-γ 발현이 세포내 사이토킨 염색에 의해 측정되었다(도 4C). 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. *p<0.5, **p<0.005, ***p<0.0005.
도 5A 내지 5D는 Stat5-결핍 CD4+ T 세포가 CNS를 침윤할 수 있지만 유효한 신경염증을 유도하지는 못함을 묘사한다. Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- EAE 마우스의 비장 CD4+ T 세포에 의한 CCR6, CXCR3 및 CD69 발현을 측정하였다. 데이터는 그룹당 3 내지 5마리 마우스에 의한 2개의 독립적인 실험을 나타낸다(도 5A). CNS-침윤 CD4+ T 세포를, 첫 번째 MOG35-55/CFA 면역 후 7, 9 및 21일째에 분석하였다(도 5B 내지 5D). 세포수를 계산하였다(도 5D). 데이터는 그룹당 3마리 마우스에 의한 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. *p<0.5.
도 6A 내지 6C는 Stat5 -/- 마우스에서 EAE에 대한 내성이 STAT5 부재하의 CD4+ T 세포 생존의 임의의 결함에 의해 야기되지 않음을 나타낸다. 상이한 수의 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- CD4+ T 세포가 전달된 Rag2 -/- 수용(recipient) 마우스의 CD4+ T 세포 침윤(도 6A) 및 임상 점수(도 6B). EAE 유도 21일째(질병 피크)에 CNS 중의 CD4+ T 세포의 임상 점수 및 빈도(도 6C). *p<0.05, ***p<0.0005.
도 7A 내지 7C는 뇌염유발성에서 Stat5-결핍 CD4+ T 세포의 본래 결함을 묘사한다. 2백만 개의 MOG35-55-특이성 Stat5 +/+ 또는 Stat5 -/- CD4+ T 세포 각각의 양자 전이(adoptive transfer) 후 Rag2 -/- 마우스(그룹당 n=5)의 임상 EAE 점수(도 7A) 및 발병률(도 7B). CNS-침윤 CD4+ T 세포에 의한 IL-17 및 IFN-γ 발현을 질병의 피크에서 측정하였다(도 7C). 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. *p<0.05.
도 8A 내지 8D는 비장 Stat5 -/- CD4+ T 세포에서 GM-CSF의 감소된 유도를 묘사한다. 도 8A 내지 8D에서, 비장세포를 질병 개시전에 MOG35-55/CFA-면역된 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스(그룹당 n=3)로부터 수득하고 24시간 동안 다양한 농도의 MOG35-55로 항원접종(challenged)하였다. GM-CSF 분비를 ELISA에 의해 측정하였다(도 8A). 골지플러그를 MOG35-55(20 ㎍/㎖) 항원접종의 최종 4시간 후에 가하고 CD4+CD44hi T 세포 중 IL-17+ 및 GM-CSF+ 세포의 빈도를 측정하였다(도 8B). 도 8C 및 8C에서, 비장세포를 MOG35-55/CFA-면역된 Stat5 -/- , Stat3 -/- 또는 야생형 대조용 마우스로부터 수득하고 4시간 동안 골지플러그의 존재하에서 PMA/이오노마이신으로 자극하였다. 비장 CD4+CD44hi T 세포 중 IL-17+ 및 GM-CSF+ 세포의 빈도를 세포내 사이토킨 염색에 의해 측정하였다. *p<0.05, ***p<0.001.
도 9A 내지 9C는 CNS-침윤 Stat5 -/- CD4+ T 세포에서 GM-CSF의 감소된 유도를 묘사한다. 도 9A에서, Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스의 CNS-침윤 CD4+ T 세포에 의한 IL-17, IFN-γ 및 GM-CSF 발현을 질병의 피크에서 측정하였다. IL-17+ 또는 IFN-γ+ 세포 중 GM-CSF+ 세포의 비율을 계산하였다(기부 우측, 도 9A). 양자 전이 EAE에서 질병의 피크에서 Rag2 -/- 수용 마우스의 CNS-침윤 CD4+ T 세포에 의한 IL-17, IFN-γ 및 GM-CSF 발현(도 9B). 나이브 및 MOG35-55/CFA-면역된 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스(각 시점에서 그룹당 n=3)의 CNS에서 사이토킨 mRNA 발현의 시간-과정 분석. RT-PCR 데이터는 Rn18S에 표준화되었으며, 나이브 마우스에서의 발현을 1로 설정하였다(도 9C). 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. *p<0.05.
도 10A 내지 10C는 STAT5-매개된 GM-CSF 유도가 IL-23 또는 IL-1β 신호전달과 독립적임을 나타낸다. 도 10A에서, 정제된 CD4+ T 세포를 TGF-β 및 IL-6과 3일 동안 배양한 다음 6시간 동안 기아처리(starvation)하였다. 이어서 세포를 30분 동안 다양한 사이토킨으로 처리하고, pSTAT3 및 pSTAT5를 면역블럿팅에 의해 측정하였다. STAT3 및 STAT5를 스트립핑 후에 추가로 검출하였다. 도 10B는 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- EAE 마우스(그룹당 n=3)의 비장 CD4+ T 세포 중의 IL-23R 및 IL-1R1의 mRNA 발현을 나타낸다. RT-PCR 데이터는 β-액틴에 표준화되었다. 도 10C에서, 비장세포를 질병 개시전 MOG35-55/CFA-면역된 WT 마우스로부터 수득하고 48시간 동안 IL-2의 부재 또는 존재하에서 MOG35-55(20 ㎍/㎖)로 항원접종하였다. CD4+CD44hi T 세포 중 IL-17+ 및 GM-CSF+ 세포의 빈도를 유식 세포측정에 의해 측정하였다. *p<0.05.
도 11A 내지 11C는 IL-7-유도된 STAT5 활성화가 자가반응성 CD+ T 세포에서 GM-CSF 발현을 촉진함을 묘사한다. 비장세포를 질병 개시전 MOG35-55/CFA-면역된 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스로부터 수득하고 48시간 동안 IL-7의 부재 또는 존재하에서 MOG35-55(20 ㎍/㎖)로 항원접종하였다. CD4+CD44hi T 세포 중 IL-17+ 및 GM-CSF+ 세포의 빈도를 유식 세포측정에 의해 측정하였다(도 11A). GM-CSF 분비를 ELISA에 의해 측정하였다(도 11B). 데이터는 그룹당 2 내지 3마리의 마우스에 의한 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. MOG35-55/CFA-면역된 마우스로부터의 비장 CD62LhiCD44lo 및 CD62LloCD44hi T 세포를 분류해 냈다. 세포를 4시간 동안 IL-7의 부재 또는 존재하에서 항-CD3 및 항-CD28로 자극하고 이어서 RT-PCR에 의한 GM-CSF 발현의 분석을 위해 수확하였다(도 11C). *p<0.05.
도 12A 내지 12F는 IL-7Rα 중화가 GM-CSF 발현을 약화시키고 EAE를 개선시킴을 묘사한다. 화살표로 가리키는 바와 같이, 2차 면역후 5일째부터 이틀마다 제공된 항-IL-7Rα 또는 통상적인 IgG로 처리된 EAE 마우스(n=5)의 임상 점수. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다(도 12A). 척수 절편을 2차 면역 후 11일째에 EAE 마우스로부터 수득하였다. 면역세포 침윤을 조직학적으로 평가하였다. 나타낸 상들은 그룹당 3마리의 개체를 나타낸다. 스케일 막대, 200 ㎛(상부), 50 ㎛(도 12B, 기부). EAE 마우스의 비장 중 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다(도 12C). 도 12D 및 12E는 상이한 처리를 받은 EAE 마우스의 CNS 중의 CD4+ T 세포 중의 GM-CSF+, IL-17+ 및 IFN-γ+ 세포의 빈도를 예시한다. EAE 마우스의 CNS 중의 IFN-γ, IL-17 및 GM-CSF의 mRNA 발현(도 12F). *p<0.05.
도 13A 및 13B는 GM-CSF-발현 TH 세포의 분화가 TH17 및 TH1과 다름을 묘사한다. 나이브 CD4+ T 세포를, 가리킨 바와 같은 다양한 사이토킨 및 중화 항체의 조합의 존재하에서 플레이트-결합된 항-CD3 및 가용성 항-CD28로 초회항원자극(primed)하였다. GM-CSF, IL-17 및 IFN-γ 발현을 세포내 염색(도 13A) 또는 RT-PCR(도 13B)에 의해 분석하였다.
도 14A 내지 14D는 나이브 T 세포로부터의 TH-GM 분화에 대한 IL-2 및 IL-6의 영향을 나타낸다. 항-CD3 단독 또는 +항-CD28에 의해 72시간 동안 활성화된 나이브 CD4+ T 세포에서의 GM-CSF 및 IFN-γ 발현(도 14A). 도 14B에서, 분류된 나이브 CD4+ T 세포를 IL-6의 첨가 없이 또는 첨가와 함께 IL-12 및 IFN-γ에 대한 중화 항체의 존재하에서 항-CD3 및 항-CD28로 자극하였다. GM-CSF+ 및 IL-17+ 세포의 빈도를 세포내 염색에 의해 측정하였다(도 14B). 도 14C에서, Stat3 +/+ 및 Stat3 -/- 마우스로부터의 나이브 CD4+ T 세포를 72시간 동안 가리킨 바와 같은 조건하에서 양극화시켰다. GM-CSF+ 및 IL-17+ 세포의 빈도를 분석하였다. 도 14D에서, 나이브 CD4+ T 세포를 IL-2 또는 항-IL-2의 존재하에서 항-CD3 및 항-CD28로 활성화시켰다. GM-CSF+, IL-17+ 및 IFN-γ+ 세포의 빈도를 분석하였다.
도 15A 내지 15F는 IL-7-STAT5 신호전달이 나이브 전구세포로부터 TH-GM 분화를 프로그램화함을 묘사한다. 나이브 CD4+ T 세포를 가리킨 바와 같은 다양한 농도의 IL-7의 존재하에서 플레이트-결합된 항-CD3 및 가용성 항-CD28로 초회항원자극하였다. GM-CSF 및 IFN-γ 발현을 세포내 염색(도 15A) 또는 ELISA(도 15B)에 의해 분석하였다. 도 15C 및 15D에서, Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 나이브 CD4+ T 세포를 3일 동안 IL-7의 존재하에서 항-CD3 및 항-CD28로 활성화시켰다. GM-CSF, IL-17 및 IFN-γ 발현을 세포내 사이토킨 염색에 의해 분석하였다(도 15C). GM-CSF 분비를 ELISA에 의해 측정하였다(도 15D). Stat5 -/- 또는 대조용 마우스로부터 단리된 IL-7-자극된 CD4+ T 세포 중 pSTAT5 및 STAT5의 면역블럿팅(도 15E). ChIP 분석을 통상적인 IgG 또는 STAT5-특이성 항체를 사용하여 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- CD4+ T 세포로 수행하였다. Csf2 프로모터 영역에 대한 항체의 결합을 RT-PCR에 의해 검출하였다(도 15F).
도 16A 및 16B는 TH-GM 부분집합에 대한 분화 조건을 묘사한다. 나이브 CD4+ T 세포를 가리킨 바와 같이 IL-7 및/또는 항-IFN-γ의 존재하에서 항-CD3 및 항-CD28로 활성화시켰다. GM-CSF, IL-17 및 IFN-γ 발현을 분석하였다(도 16A). 나이브, TH1(IL-12 + 항-IL-4), TH17(TGF-β + IL-6 + 항-IFN-γ + 항-IL-4) 및 TH-GM 세포(IL-7 + 항-IFN-γ)에서 T-bet 및 RORγt의 mRNA 발현(도 16B). RT-PCR 데이터는 Gapdh에 표준화되었으며, 나이브 T 세포에서의 발현을 1로 설정하였다.
도 17A 내지 17E는 IL-7(IL-2는 아닌)이 나이브 CD4+ T 세포에서 STAT5 활성화 및 GM-CSF 발현을 유도함을 예시한다. 도 17A 내지 17C는 나이브 CD4+ T 세포 또는 가리킨 바와 같은 다양한 시점들에서 항-CD3 및 항-CD28로 활성화된 세포의 표면상의 CD25 및 CD127의 유식 세포측정을 나타낸다. 30분 동안 IL-2 또는 IL-7로 자극된 나이브 CD4+ T 세포에서 STAT5의 활성화(도 17D). 도 17E는 IL-2 또는 IL-7의 존재하에서 항-CD3 및 항-CD28로 자극된 나이브 CD4+ T 세포 중의 GM-CSF의 mRNA 발현을 나타낸다. RT-PCR 데이터는 β-액틴에 표준화되었으며 사이토킨 없이 2시간 동안 활성화된 나이브 T 세포에서의 발현을 1로 설정하였다.
도 18A 내지 18C는 IL-2 및 IL-7이 모두 활성화된 CD4+ T 세포에서 STAT5 활성화 및 GM-CSF 발현을 유도할 수 있음을 보인다. 도 18A 및 18B에 나타낸 바와 같이, CD4+ T 세포를 3일 동안 항-CD3 및 항-CD28로 활성화시켰다. 새로운 배지에서 휴지 후에, 세포를 다양한 시점에서 IL-2 또는 IL-7로 자극하였다. pTyr-STAT5 및 β-액틴을 면역블럿팅에 의해 검출하였다(도 18A). GM-CSF mRNA 발현을 RT-PCR에 의해 측정하였다(도 18B). 상기 RT-PCR 데이터는 β-액틴에 표준화되었으며, 사이토킨 자극 없이 세포에서의 발현을 1로 설정하였다. 도 18C에 나타낸 ChIP 분석을 통상적인 IgG 또는 STAT5-특이성 항체로 수행하였다. Csf2 프로모터 영역에의 항체의 결합을 RT-PCR에 의해 검출하였다.
도 19는 미세배열 분석에 의해 특성화된 바와 같은 TH-GM 부분집합에서 높은 수준 또는 낮은 수준으로 선택적으로 발현된 표면 분자들을 묘사한다. 각 계통에 특이적인 상기 표면 분자들은 자가면역 염증, 예를 들어 비제한적으로 다발성 경화증 및 류머티스성 관절염의 새로운 진단, 치료 및 예방에 대한 마커, 특징 및 잠재적인 표적으로서 작용한다. 상기 세포 표면 분자들을 표 1에 상세히 나열한다. 도면 삽입물에 가리킨 바와 같은 나이브, Th1, Th17 및 Th-GM의 순서는 각 그래프 중의 막대에 대해 나타난 것과 동일하다.
도 20A 내지 20D는 IL-3이 TH-GM 세포에서 우세하게 발현됨을 나타낸다. 도 20A 및 20B에서, 나이브 CD4+ T 세포를 TH1-(IL-12 + 항-IL-4), TH17-(TGF-β + IL-6 + 항-IFN-γ + 항-IL-4) 및 TH-GM-(GM-CSF+ TH, IL-7 + 항-IFN-γ + 항-IL-4) 양극화 조건하에서 항-CD3 및 항-CD28로 활성화시켰다. GM-CSF 및 IL-3 발현을 세포내 염색에 의해 분석하였다(도 20A). IL-3, EBI-3, PENK 또는 RANKL 사이토킨의 mRNA 발현을 RT-PCR에 의해 측정하였다(도 20B). IL-7의 존재 또는 부재하에서 분화된 IL-3+ 세포의 빈도(도 20C). WT 또는 STAT5-결핍 GM-CSF-생성 TH 세포에 의한 GM-CSF 및 IL-3 발현(도 20D).
도 21은 6 X 105개의 다양한 MOG35-55-특이성 TH 부분집합의 양자 전이 후 Rag2 -/ - 마우스(그룹당 n=3 내지 6 마우스)의 임상적인 EAE 점수를 묘사한다.
도 22A 내지 27E는 STAT5 활성화의 억제가 시험관내에서 TH-GM 세포 분화를 억제함을 묘사한다. CD4+ T 세포를 30분 동안 IL-7로 자극하기 전에 지시된 농도의 STAT5 억제제(칼바이오켐(Calbiochem))(도 22A) 또는 JAK3 억제제(도 22B) 또는 비히클(-)과 1시간 동안 예비-인큐베이션하였다. STAT5의 활성화(Tyr694 인산화)를 면역블럿팅에 의해 측정하였다. CD4+ T 세포를 30분 동안 IL-6으로 자극하기 전에 지시된 농도의 STAT5 억제제 또는 비히클(-)과 1시간 동안 예비-인큐베이션하였다. STAT3의 활성화(Tyr705 인산화)를 면역블럿팅에 의해 측정하였다(도 22C). 도 22D에서, CD4+ T 세포를 30분 동안 IFN-γ로 자극하기 전에 지시된 농도의 STAT5 억제제 또는 비히클(-)과 1시간 동안 예비-인큐베이션하였다. STAT1의 활성화(Tyr701 인산화)를 면역블럿팅에 의해 측정하였다. 도 22E에서, 나이브 CD4+ T 세포를 단리하고 중성 조건 또는 TH-GM 세포-유리한 조건(cell-favoring condition)하에서 3일 동안 상이한 농도의 STAT5 억제제의 첨가로 활성화시켰다. GM-CSF 및 IFN-γ 발현을 세포내 사이토킨 염색 및 유식 세포측정에 의해 분석하였다.
도 23A 내지 23D는 화학적 억제제에 의한 STAT5 활성화의 표적화가 EAE를 개선시킴을 묘사한다. (도 23A) 야생형 대조용 마우스(n=5) 또는 STAT5 억제제(칼바이오켐)가 투여된 임상 EAE 점수. 화살표는 처리 점들을 가리킨다. (도 23B) 상이한 처리를 받은 EAE 마우스의 18일째의 척수의 조직학. (도 23C) 질병의 피크에서 CNS-침윤 CD4+ T 세포의 세포내 염색 및 유식 세포측정. (도 23D) 전체 CNS를 RNA 추출을 위해 수확하였다. GM-CSF mRNA 발현을 RT-PCR에 의해 분석하였다. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. *p<0.05.
도 24A 내지 24E는 GM-CSF-생성 TH 세포가 인간 RA와 관련됨을 묘사한다. 건강한 대조용 HC(n=32) 및 RA(n=47)에서 GM-CSF 및 TNF-α의 혈장 농도를 ELISA에 의해 정량분석하였다(도 24A). 도 24B 및 24C에서, 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 건강한 대조군(HC) 및 류머티스성 관절염(RA) 환자로부터 수집하고, 4시간 동안 골지플러그의 존재하에서 PMA/이오노마이신으로 자극한 다음 세포내 사이토킨 염색하였다. CD4+ T 세포 중 GM-CSF, IFN-γ 및 IL-17의 전형적인 세포 유식측정(도 24B) 및 그룹당 n>=9의 통계학(도 24C)을 나타낸다. 도 24D는 RA 환자(n=18)의 말초 혈액 중 GM-CSF+IFN-γ- TH 세포의 빈도와 혈장 GM-CSF의 수준간의 상관성을 나타낸다. RA 환자의 활액(synovial fluid)으로부터 유래된 CD4+ T 세포에 의한 사이토킨 발현을 세포내 사이토킨 염색 및 유식 세포측정에 의해 분석하였다(도 24E). 3가지 경우의 전형적인 상을 나타내었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; ns, 유의수준 아님.
도 25A 내지 25E는 마우스 AIA에서 GM-CSF 및 TNF-α의 구분 가능한 효과를 묘사한다. 도 25A는 대조용 IgG, GM-CSF-특이성 및 TNF-α-특이성 중화 항체로 지시된 시간(화살표)에서 별도로 또는 함께(그룹당 n=5) 처리된, AIA 모델에서 100 ㎍ mBSA의 관절내 주사 후 7일에 걸친 야생형 마우스의 무릎 관절 종창(joint swelling)을 나타낸다. 도 25B는 관절염 유도 후 7일에 걸친 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스(그룹당 n=6)의 무릎 관절 종창을 나타낸다. 데이터는 3개를 초과하는 독립적인 실험을 나타낸다. 도 25C에서와 같이 관절염 유도 후 7일째에 H&E(도 25C) 또는 사프라닌-O/패스트 그린(도 25D)으로 염색된 관절 절편의 전형적인 상들. 막대, 500 ㎛(도 25C 상부 패널 및 도 25D) 또는 100 ㎛(도 25C 하부 패널). 상부 패널(도 25C)에서 화살표는 골 파괴를 나타내었다. 도 25E에서, Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- AIA 마우스에서 GM-CSF, INF-γ 및 TNF-α의 혈청 농도를 ELISA에 의해 정량분석하였다. 그룹당 n>=8의 통계학을 나타내었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 26A 내지 26D는 T 세포에서 Stat5 결실된 마우스가 CIA에 내성임을 묘사한다. (도 26A) CIA 모델에서 콜라겐 II/CFA 면역후 40일째에 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스의 발 종창의 전형적인 상들. (도 26B) 콜라겐 II/CFA 면역후 40일에 걸친 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스(그룹당 n=5)의 임상 점수. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. (도 26C) 40일째에 H&E로 염색된 발 절편의 전형적인 상들. (도 26D) TNF-α(그룹당 n=8)의 혈청 농도를 ELISA에 의해 정량분석하였다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 27A 내지 27E는 STAT5-결핍 CD4+ T 세포가 관절염유발 잠재성(arthritogenic potential)에 결함이 있음을 묘사한다. (도 27A 및 28B) AIA 유도 후 7일째에 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스의 비장(도 27A) 및 서혜부(inguinal) 림프절(도 27B) 중 CD4+ T 세포의 전형적인 유식 세포측정. (도 27C 및 27D) 활액 조직을 AIA 유도 후 7일째에 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스로부터 수확하고 단일 세포에 용해시켰다. CD45+ 백혈구의 세포수를 계산하였다(도 27C). CD45+ 분획 중 CD4+ T 세포의 비율을 유식 세포측정에 의해 분석하고, 세포수를 계산하였다(도 27D). (도 27E) 시험관내-확대된 항원-반응성 CD4+ T 세포와 함께 전달된 후 및 mBSA의 관절내 주사에 이어서 7일째에 야생형 나이브 마우스로부터의 관절 절편의 조직학적 분석. 막대, 100 ㎛. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. *p<0.05; ns, 유의수준 아님.
도 28A 내지 28G는 STAT5-조절된 GM-CSF-생성 TH 세포가 AIA에 중요함을 묘사한다. 비장 및 활액 조직을 관절염 유도 후 7일째에 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스로부터 수집하였다. (도 28A) 야생형 AIA 마우스(n=3)의 비장 분획을 18시간 동안 지시된 조건하에서 자극하였다. 상등액 중의 GM-CSF 수준을 ELISA에 의해 정량분석하였다. (도 28B 내지 28D) 골지플러그의 존재하에서 PMA/이오노마이신으로 4시간 동안 재자극 후 비장 CD4+CD44hi 효과기 T 세포(도 28B) 또는 활액 침윤 CD4+ T 세포(도 28C 및 28D) 중 GM-CSF, IL-17 및 IFN-γ의 세포내 염색 및 유식 세포측정. 그룹당 n=5(도 28B, 우측 패널) 또는 n=3(도 28D, 우측 패널)의 전형적인 상 및 통계학을 나타낸다. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. 활액 조직 중 다수의 염증전(proinflammatory) 사이토킨의 단백질 발현을 ELISA에 의해 측정하였다(도 28F 및 28G). 우측 무릎 관절에의 mBSA 단독 및 좌측 무릎 관절에의 GM-CSF가 보충된 mBSA의 관절내 주사 후 7일째에 H&E(도 28F) 또는 사프라닌-O/패스트 그린(도 28G)으로 염색된 관절 절편의 전형적인 상. 막대, 가리킨 바와 같이 500, 50 또는 200 ㎛. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; ns, 유의수준 아님. "비장세포"는 각 그룹에서 가장 좌측의 막대를 나타내고, "CD4+ T 세포가 고갈된 비장세포"는 각 그룹에서 중간 막대를 나타내며, "CD4+ T 세포"는 각 그룹에서 가장 우측의 막대를 나타낸다.
도 29A 내지 29C는 STAT5의 상실이 항원-특이성 CD4+ T 세포에 의한 GM-CSF 생성을 손상시킴을 묘사한다. 비장 및 서혜부 LN을 관절염 유도 후 7일째에 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스로부터 수집하고, 단일 세포 현탁액에 용해시켰다. 이어서, 세포를 24시간 동안 mBSA(20 ㎍/㎖)로 자극하였다. (도 29A) 골지플러그를 배양의 최종 4시간 후에 가한 다음 세포내 염색 및 유식 세포측정을 수행하였다. CD4+CD44hi 효과기 T 세포 중의 GM-CSF, IL-17 및 IFN-γ의 전형적인 플롯을 나타내었으며, 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. (도 29B 및 29C) 상등액(그룹당 n=3) 중의 분비된 사이토킨을 ELISA에 의해 정량분석하였다. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. *p<0.05; ns, 유의수준이 아님.
도 30A 내지 30C는 STAT5의 상실이 관절염 마우스에서 활액 조직 중 IL-6 및 IL-1β 발현을 손상시킴을 묘사한다. (도 30A 내지 30C) 관절염 유도 후 5일 또는 7일째에 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스(그룹당 n>=3)의 활액 조직 중 다수의 염증전 사이토킨의 mRNA(도 30A 및 30C) 및 단백질(도 30B) 발현을 qPCR 및 ELISA에 의해 측정하였다. qPCR 데이터를 Rn18S에 표준화하였다.
도 31A 내지 31D는 SAT5-유도된 GM-CSF 발현이 염증이 발생한 활액 조직 중 CD11b+ 세포 축적을 매개함을 묘사한다. (도 31A) Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- AIA 마우스의 비장에서 CD11b+ 세포의 빈도를 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 그룹당 n=3의 통계학(우측 패널)을 나타내었다. (도 31B) 활액 조직을 관절염 유도 후 7일째에 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스로부터 수확하고, 단일 세포 현탁액에 용해시켰다. CD45+ 분획 중 CD11b+ 골수 세포의 비율을 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 그룹당 n=5의 통계학을 우측 패널에 나타내었다. (도 31C) 관절염 유도 후 7일에 걸쳐 활액 CD45+ 분획상에서 게이트 처리된 CD11b+ 및 CD4+ 세포의 전형적인 유식 세포측정. (도 31D) 우측 무릎 관절에의 mBSA 단독 및 좌측 무릎 관절에의 GM-CSF가 보충된 mBSA의 관절내 주사 후 7일째에 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스의 활액 조직 중 CD4+, CD11b+ 및 B220+ 세포 침윤의 유식 세포측정 분석. 전형적인 상들을 나타내었다. 나타낸 모든 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. **p<0.01; ns, 유의수준 아님.
도 32A 내지 32D는 GM-CSF가 관절염 마우스에서 호중구 축적을 매개함을 묘사한다. (도 32A) 관절염 유도 후 7일에 걸쳐 활액 CD45+CD11b+ 분획상에서 게이트 처리된 Ly6C 및 Ly6G 발현의 유식 세포측정 분석. (도 32B) AIA 마우스의 활액 조직으로부터 분류된 Ly6ChiLy6G- 및 Ly6CloLy6Ghi 세포의 김자 염색(Giemsa stain). 스케일 막대, 100 ㎛(좌측) 또는 20 ㎛(우측). (도 32C) 우측 무릎 관절에의 mBSA 단독 및 좌측 무릎 관절에의 GM-CSF가 보충된 mBSA의 관절내 주사 후 7일째에 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스의 활액 조직 중 Ly6ChiLy6G- 및 Ly6CloLy6Ghi 집단의 유식 세포측정 분석. (도 32D) AIA 모델에서 mBSA의 관절내 주사 후 3일에 걸쳐 Ly6G-특이성 중화 항체(1A8) 또는 IgG 대조군(그룹당 n=5)으로 처리된 야생형 마우스의 무릎 관절 종창. 화살표는 항체 투여 시점들을 가리킨다. *p<0.05.
도 33A 내지 33C는 GM-CSF가 시험관내에서 호중구 이행을 증대시키고 세포사멸을 지연시킴을 묘사한다. (도 33A) 출발 후 3시간째에 이행 분석(transmigration assay)에서 화학유인물질로서 GM-CSF의 존재 또는 부재하에서 이동된 호중구의 비율. (도 33B) 이행 분석에서 하부 챔버의 기부 중 CFSE-표지된 호중구의 현미경상. (도 33C) 분류된 호중구들을 시험관내에서 24시간 동안 GM-CSF(20 ng/㎖)의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. 세포사멸을 겪는 호중구들을 애넥신(Annexin) V 및 프로피디움 요오다이드(PI) 공-염색에 의해 검사하였다. 3개의 반복물에 대한 전형적인 유식 세포측정을 나타내었다. *p<0.05.
도 34A 내지 34I는 GM-CSF가 관절염 마우스에서 골수 세포 및 활액 섬유아세포에 의한 염증전 사이토킨 발현을 매개함을 묘사한다. 활액 조직을 야생형 AIA 마우스로부터 절제하고 단일 세포 현탁액에 용해시켰다. (도 34A) 표면 마커들의 차별적인 발현에 근거한 상이한 집단에서의 분획화를 묘사하는 유식 세포측정 플롯. (도 34B) 분류된 CD45+TCRβ+(간략히 TCRβ+), CD45+TCRβ-CD11c-CD11b+(CD11b+) 및 CD45+TCRβ-CD11c+(CD11c+) 집단 중의 다수의 염증전 사이토킨의 mRNA 발현을 qPCR에 의해 측정하였다. 상기 qPCR 데이터는 GAPDH에 표준화되었다. (도 34C) 분류된 Ly6ChiLy6G- 및 Ly6CloLy6Ghi 집단(CD11b+ 세포상에서 게이트 처리된)에서 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현. 상기 qPCR 데이터는 GAPDH에 표준화되었다. (도 34D 및 34E) 1시간 동안 20 ng/㎖ GM-CSF로 자극시 BMDM(도 34D) 및 BMDC(도 34E)에 의한 IL-6 및 IL-1β의 mRNA 발현. 상기 qPCR 데이터는 GAPDH에 표준화되었다. (도 34F 및 34G) BMDM(도 34F) 및 BMDC(도 34G)를 18시간 동안 지시된 농도(그룹당 n=3)에서 GM-CSF로 자극하였다. 상기 배양 상등액 중의 IL-6의 분비를 ELISA에 의해 정량분석하였다. (도 34H) BMDM을 6시간 동안 지시된 농도(그룹당 n=3)에서 GM-CSF의 존재하에 LPS(100 ㎍/㎖)로 초회항원자극한 다음 30분 동안 ATP(5 mM)로 자극하였다. 배양 상등액 중의 IL-1β의 분비를 ELISA에 의해 정량분석하였다. (도 34I) 세포를 5회 초과의 계대로 20일에 걸쳐 10% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 배양하여 활액 섬유아세포를 수득하였다. 활액 섬유아세포를 1시간 동안 GM-CSF(20 ng/㎖)로 자극하고 RNA 추출을 위해 수확하였다. IL-1β의 mRNA 발현을 qPCR에 의해 측정하였다. 상기 qPCR 데이터는 GAPDH에 표준화되었다. 나타낸 모든 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01.
본 발명의 예시적인 실시태양의 설명은 하기와 같다.
본 명세는 부분적으로, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)-분비 T 헬퍼 세포("TH-GM"이라 칭한다)의 식별에 관한 것이다. 본 명세서에 상세한 바와 같이, IL-7/STAT5 신호전달은 전구 CD4+ 세포의 TH-GM으로의 분화(IL-2 및 IL-23 신호전달에 의해 추가로 조절되는 과정임)를 프로그램화한다. TH-GM 세포는 예를 들어 GM-CSF 및 IL-3 생성을 특징으로 한다. TH-GM 세포는 예를 들어 분화 조건, 전사 조절 및 효과기 사이토킨 발현에 관하여 공지된 헬퍼 T 세포 TH1 및 TH17과 다르다. 예를 들어 IL-12/IFN-γ 및 TGF-β/IL-6(이들은 각각 TH1 및 TH17을 매개한다(예를 들어 이들의 발생을 촉진한다))은 나이브 CD4+ 전구세포로부터 TH-GM의 발생을 효능 있게 억제하며, 이는 TH-GM 세포가 TH1 및 TH17과 다른 계통을 통해 발생함을 확립시킨다. 따라서, 본 명세는 TH-GM 기능(예를 들어 그의 분화 및 병원성)을 매개하는, TH1 또는 TH17을 매개하는 것으로 공지된 인자들과 다른 특유의 인자들의 네트워크를 제공한다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, TH-GM 세포는 TH1 및 TH17 세포에 비해 EAE를 우선적으로 유도하며, 이는 TH-GM 세포가 인간에서 자가면역 신경염증의 병인에 주요 효과기를 나타냄을 가리킨다. 더욱이, IL-7 신호전달의 차단 및/또는 STAT5 기능의 억제(예를 들어 STAT5 활성의 발현의 파기 또는 억제)는 TH-GM 세포에 의해 감소된 GM-CSF 생성과 관련된 자가면역 신경염증을 약화시킨다. 더욱이, TH-GM 세포-분비된 GM-CSF의 차단은 TNF-α-독립적인 방식으로 실험상 관절염을 개선시키며, 이는 예를 들어 TNF-α 길항작용성 약물에 응답성이지 않은 류머티스성 관절염 환자의 치료를 위한 접근법을 가리킨다. 따라서, 본 명세는 상기 TH-GM 경로에 의해 매개되는 염증 질환(예를 들어 RA)(예를 들어 GM-CSF 및/또는 IL-3, 또는 상기 TH-GM 경로와 관련된 임의의 인자의 작용을 통해 TH-GM 병원성으로부터 생성되는 질환), 또는 예를 들어 TNF-α, IL-6 및/또는 IL-1β 경로(즉 비-TH-GM-매개된 경로)에 의해 매개되는 염증 질환을 구분할 수 있게 한다. 예를 들어, RA가 있는 환자는 주로 TH-GM-매개되거나, 또는 주로 비-TH-GM-매개되는(예를 들어 TNF-α-매개되거나 IL-6 매개되는) RA의 유형에 걸릴 수 있다. 본 명세는 TH-GM-매개된 및 비-TH-GM-매개된 염증간의 분류를 가능하게 하여, RA 또는 MS와 같은 염증 질환을 앓고 있는 개인에서 보다 정확한 진단, 예측 및 치료를 허용한다.
본 명세서에 설명된 바와 같이, 본 명세는 헬퍼 T 세포 부분집합(TH-GM)을 식별하며, 시험관내 및 생체내에서 나이브 전구세포로부터 상기 부분집합의 실행 및 발생을 위한 분자 토대를 제공하고, 자가면역 질병 및 염증 질환, 예를 들어 MS 및 RA에서 1차 병원성 세포로서 TH-GM 세포를 설명한다. 따라서, 본 명세서는 주로 TH-GM 세포에 의해 매개되는 염증성 병증를 진단하기 위한 조성물 및 방법[이에 의해 예를 들어 TNF-α 요법(예를 들어 TNF-α 억제제 기반 요법)에 무응답성인 RA 환자의 식별이 가능하다]뿐만 아니라, 자가면역 및 염증 질환을 치료하기 위한 TH-GM 기능의 조절을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. TH-GM 기능을 조절하는 방법은 예를 들어 TH-GM 세포의 기능(예를 들어 발생 및 병원성)을 조절하기에 유효한 양으로, TH-GM 기능을 매개하는 인자들의 네트워크(예를 들어 IL-2/IL-7/STAT5/GM-CSF/IL-3)의 기능(예를 들어 신호전달, 발현 또는 활성)을 조절하는 작용제를 투여함을 포함한다. 특히, 본 명세는 TH-GM 세포에 의해(즉 TH-GM 경로 매개되는) 또는 비-TH-GM 기전(예를 들어 TNF-α, IL-6 및/또는 IL-1β 경로), 또는 이 둘 모두에 의해 주로 매개되는 염증 질환, 예를 들어 다발성 경화증(MS), 류머티스성 관절염(RA)의 구별 및 진단을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 또한 본 명세서는 염증 질환, 특히 TH-GM-매개되는 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
따라서, 하나의 태양에서, 본 명세는 염증 질환을 앓고 있는 환자에서 TH-GM-매개된 염증 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 염증 질환을 앓고 있는 환자로부터 수집한 샘플을, TH-GM-매개 인자, 예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 검출하는 검출제와 접촉시키고; 상기 TH-GM-매개 인자(예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합)의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 정량분석함을 포함하며, 여기에서 참조 수준에 비해 TH-GM-매개 인자(예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합)의 증가된 수준은 상기 환자가 TH-GM-매개된 염증 질환을 앓고 있음을 가리키며, 이에 의해 염증 질환을 앓고 있는 환자에서 TH-GM-매개된 염증 질환을 진단한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "TH-GM-매개된" 염증 질환은 본 명세서에 기재된 바와 같은, TH-GM 기능을 조절하는 경로에서 인자들("TH-GM-매개 인자")의 네트워크 중 임의의 하나 이상의 생리학적 작용으로부터 생성되는 염증 질환의 하위유형(예를 들어 RA 또는 MS의 하위유형)을 지칭한다. 상기와 같은 인자는 예를 들어 GM-CSF, 활성화된 STAT5, IL-7, IL-2 및 IL-3을 포함한다. 특정한 실시태양에서, STAT5는 활성화된 STAT5이며, 여기에서 694번 위치의 티로신이 인산화된다.
일부 실시태양에서, 참조 수준에 비해 증가되지 않은 TH-GM-매개 인자(예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합)의 수준은 상기 환자가 비-TH-GM-매개된 염증 질환을 앓고 있음을 가리킨다.
몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 TH-GM-매개 인자(예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합)의 수준이 참조 수준에 비해 증가되지 않는 경우, 상기 환자에게 본 명세서에 기재된 바와 같이, TNF-α 요법을 적용함을 추가로 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비-TH-GM-매개된" 염증 질환은 주로, 예를 들어 TNF-α, IL-6, 또는 IL-1β(및/또는 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β 경로 중의 인자)에 의해 야기되는 염증 질환(예를 들어 RA 또는 MS)을 지칭한다. 이와 같이, "TH-GM-매개된" 염증 질환은 주로(또는 독점적으로) "비-TH-GM-매개된" 염증 질환에 이르는 경로들(예를 들어 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β와 관련된 경로들) 중 하나 이상과 다른 경로로부터 발생한다.
그러나, 당해 분야의 숙련가들이 이해하는 바와 같이, TH-GM-매개된 염증 질환은 상기 염증 질환이 또한 부분적으로 비-TH-GM-매개될 수도(예를 들어 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β, 및/또는 상기 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β 경로 중의 인자에 의해 매개될 수도) 있을 가능성을 반드시 배재하는 것은 아니다. 따라서, "TH-GM-매개된"으로서의 분류 또는 진단은 "주로/우세하게 TH-GM-매개된"과 동의어이며 "비-TH-GM-매개된"으로서의 분류는 "주로/우세하게 비-TH-GM-매개된"과 동의어이다. 예를 들어, 임의의 특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 염증 질환은 그의 초기 단계에서 TH-GM-매개될 수도 있다. 상기 염증성 병증가 예를 들어 조직 손상을 특징으로 하는 말기 단계로 진행함에 따라, 상기 염증 질환은 점차적으로 비-TH-GM-매개로 된다. 일부 실시태양에서, TH-GM-매개된 염증 질환은 임상 표준에 의해 측정되는 바와 같이, TH-GM 기능의 조절에 응답성인 병증이며; 비-TH-GM-매개된 염증 질환은 임상 표준에 의해 측정되는 바와 같이, 예를 들어 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β 요법에 응답성인 상태이다. 몇몇 실시태양에서, 염증 질환은 TNF-α, IL-6 및/또는 IL-1β 요법뿐만 아니라 TH-GM 기능의 조절에 응답성일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 샘플은 예를 들어 말초 혈액, 뇌척수액, 활액, 또는 활막, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 염증 질환은 자가면역 질환이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 염증 질환은 TH-GM 세포에 의해 매개되는 임의의 염증 질환일 수 있으며, 비제한적으로 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 크론병, 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 갑상성 기능항진, 갑상성 기능저하, 과민성 장 증후군(IBS), 홍반성 루푸스, 류머티스성 다발성 근육통, 건선, 건선성 관절염, 레이노 증후군/현상, 반응성 관절염(라이터 증후군), 유육종증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 궤양성 대장염, 포도막염 또는 혈관염을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "검출제"는 예를 들어 검출하고자 하는 폴리펩티드 또는 핵산(예를 들어 STAT5(예를 들어 포스포-STAT5(Tyr694)), IL-7, GM-CSF 또는 IL-3)에 결합하는 항체, 펩티드, 소분자, 또는 핵산을 지칭하며, 상기 검출하고자 하는 폴리펩티드 또는 핵산의 정량분석을 가능하게 한다. 상기 검출제를 검출 가능하게 표지하거나, 또는 당해 분야에 공지된 다른 수단에 의해 정량분석할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 검출제는 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3의 폴리펩티드에 결합하는 항체이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 활성화된 STAT5(예를 들어 인산화된 STAT5)에 결합하는 것이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 STAT5(예를 들어 포스포-STAT5(Tyr694)), IL-7, GM-CSF 또는 IL-3에 대한 항체는 당해 분야에 공지되어 있으며 상업적으로 입수할 수 있다(예를 들어 STAT5 Ab: C-17 (산타 크루즈 바이오테크(Santa Cruz Biotech)로부터; 포스포-STAT5 (Tyr694) Ab: #9351 또는 #9359 (셀 시그널링(Cell Signaling)으로부터; IL-7 Ab: 클론 BVD10-40F6 (BD 파밍겐(BD Pharmingen)으로부터); IL-7R Ab: 클론 SB/14 (BD 파밍겐으로부터); GM-CSF Ab: 클론 MP1-22E9 (BD 파밍겐으로부터); IL-3 Ab: 클론 MP2-8F8 (BD 파밍겐으로부터)).
다른 실시태양에서, 상기 검출제는 STAT5, IL-7, GM-CSF 및/또는 IL-3의 핵산에 결합하는 핵산이다. 예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 및/또는 IL-3 서열을 암호화하는 핵산 분자, 또는 예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 및/또는 IL-3 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산 분자에 높은 엄격성으로 하이브리드화하는 그의 단편 또는 올리고뉴클레오티드를 탐침으로서 사용하여 본 명세의 진단 방법에 사용하기 위한 샘플 중의 STAT5, IL-7, GM-CSF 및/또는 IL-3의 핵산 수준의 발현을 모니터할 수 있다. 핵산 수준을 정량분석하는 방법은 통상적이며 이를 당해 분야에서 입수할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 샘플을 표 1에 나열된 하나 이상의 유전자(뿐만 아니라 유전자 산물)의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 검출하는 검출제와 접촉시킴을 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 표 1은 TH1 또는 TH17 세포에 비해, TH-GM 세포의 표면상에서 차별적으로 발현되는 유전자들뿐만 아니라 TH-GM 세포에서 차별적으로 발현되는 유전자들을 나열한다.
특정한 실시태양에서, 상기 방법은 상기 샘플을 기본 나선-루프-나선패밀리 구성원 e40(BHLHe40), 케모킨(C-C 모티프) 수용체 4(CCR4), 및/또는 CCR6의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 검출하는 검출제와 접촉시킴을 추가로 포함한다.
표준 방법을 사용하여 임의의 샘플 중의 폴리펩티드 수준을 정량분석할 수 있다. 상기와 같은 방법은 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블럿팅, 면역조직화학, 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하는 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 및 당해 분야에 공지된 정량적인 효소 면역분석 기법을 포함한다. 상기와 같은 방법은 통상적이며 이를 당해 분야에서 입수할 수 있다. 유사하게, 핵산 수준(예를 들어 mRNA)을 정량분석하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 명세의 진단 방법에서, 참조 수준에 비해 STAT5(예를 들어 활성화된 포스포-STAT5(Tyr694)), IL-7, GM-CSF 및/또는 IL-3의 증가된 수준은 환자가 TH-GM-매개된 염증 질환을 앓고 있음을 가리킨다.
일부 실시태양에서, 참조 수준에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 220%, 적어도 240%, 적어도 260%, 적어도 280%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 적어도 500%, 적어도 550%, 또는 적어도 600% 까지 증가된 STAT5(예를 들어 활성화된 포스포-STAT5(Tyr694)), IL-7, GM-CSF 및/또는 IL-3 수준은 환자가 TH-GM-매개된 염증 질환을 앓고 있음을 가리킨다. 특정한 실시태양에서, 참조 수준에 비해 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 150%의 증가는 환자가 TH-GM-매개된 염증 질환을 앓고 있음을 가리킨다.
일부 실시태양에서, 참조 수준에 비해 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 150%까지 증가되지 않은 STAT5(예를 들어 활성화된 포스포-STAT5(Tyr694)), IL-7, GM-CSF 및/또는 IL-3 수준은 환자가 비-TH-GM-매개된 염증 질환을 앓고 있음을 가리킨다.
일부 실시태양에서, 참조 수준에 필적하는(또는 변하지 않은) STAT5(예를 들어 활성화된 포스포-STAT5(Tyr694)), IL-7, GM-CSF 및/또는 IL-3 수준은 환자가 비-TH-GM-매개된 질환을 앓고 있음을 가리킨다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 참조 수준에 "필적하는" 수준은 참조 수준에 비해 변하지 않은 수준 또는 임상 표준에 따라 통계학적으로 무의미한 변화를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 필적하는 수준(또는 변하지 않은 수준)은 참조 수준에 비해 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 70%까지 증가하지 않은 수준(예를 들어 상기는 임상적으로 유의수준의 변화를 가리키지 않을 수 있기 때문이다)을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 참조 수준에 비해 감소된 TH-GM-매개 인자(예를 들어 STAT5(예를 들어 활성화된 포스포-STAT5(Tyr694)), IL-7, GM-CSF 및/또는 IL-3)의 수준은 또한 환자가 비-TH-GM-매개된 질환을 앓고 있음을 가리킬 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 참조 수준은 비교를 목적으로 사용되는 수준이며, 예를 들어 동일한 환자로부터 취한 이전 샘플; 통상적인 건강한 피실험자; 자가면역 질병 또는 염증 질환이 없는 피실험자로부터의 샘플; 자가면역 질병이 발병할 성향이 있는 것으로 진단되지만 아직 상기 질병의 증상은 보이지 않는 피실험자; 자가면역 질병 때문에 치료된 적이 있는 환자; 또는 공지된 통상적인 농도의 본 명세서의 정제된 참조 폴리펩티드 또는 핵산 분자(예를 들어 STAT5)의 샘플로부터 획득될 수 있다. "참조 표준 또는 수준"은 참조 샘플로부터 유래된 값 또는 수, 또는 건강한(예를 들어 염증 질환을 갖지 않는 개인) 것으로 표시되는 당해 분야에 허용되는 값 또는 범위를 의미한다. 통상적인 참조 표준 또는 수준은 또한 자가면역 질병을 갖지 않는 정상적인 피실험자로부터 유래된 값 또는 수일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 참조 샘플, 표준 또는 수준은 하기의 기준 중 적어도 하나에 의해 샘플 피실험자와 합치된다: 연령, 체중, 체질량 지수(BMI), 질환 단계, 및 전체적인 건강. 상기 통상적인 참조 범위내의 정제된 DNA, RNA 또는 mRNA의 수준의 표준 곡선을 또한 참조로서 사용할 수 있다. 상기 통상적인 참조 범위내의 정제된 단백질의 수준의 표준 곡선을 참조로서 또한 사용할 수 있다.
일부 실시태양에서, TH-GM-매개된 염증 질환을 갖는 것으로서 진단되거나 분류된 염증 질환에 걸린 환자는 비-TH-GM-매개된 염증 질환을 갖지 않는다(즉 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β-매개된 염증 질환을 갖지 않는다). 즉, TH-GM-매개된 염증 질환을 앓고 있는 것으로서 진단된 환자는 임상 표준에 의해 측정된 바와 같이, TH-GM 기능의 조절(예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 및/또는 IL-3의 억제)에 응답하지만, TNF-α 요법에는 응답하지 않는다(또는 제한된 응답을 나타낸다). 그러나, 본 명세서에 기재된 바와 같이, TH-GM-매개된 염증 질환은 상기 염증 질환이 또한 비-TH-GM-매개된 경로(예를 들어 TNF-α, IL-6, IL-1β)에 의해 부분적으로(주로는 아니지만) 기인할 가능성을 배제하지 않는다.
일부 실시태양에서, 본 명세의 방법은 TH-GM-매개된 염증 질환을 갖는 것으로서 진단되거나 분류된 환자에게 유효량의 TH-GM 세포 기능을 조절하는 조절제를 투여함을 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 실시태양에서, 상기 조절제는 TH-GM 기능을 억제한다.
일부 실시태양에서, 본 명세의 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 비-TH-GM-매개된 염증 질환을 갖는 것으로서 진단되거나 분류된 환자에게 유효량의, 예를 들어 TNF-α 요법, IL-6 요법, 또는 IL-1β 요법을 적용함을 추가로 포함한다.
일부 태양에서, 본 명세는 또한 염증 질환을 앓고 있는 환자를 TH-GM-매개된 염증 질환 또는 비-TH-GM-매개된 염증 질환을 갖는 것으로서 분류하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 염증 질환을 앓고 있는 환자로부터 수집한 샘플을, TH-GM-매개 인자, 예를 들어 STAT5(예를 들어 인산화된 STAT5, Tyr694), IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 검출하는 검출제와 접촉시킴을 포함한다. 몇몇 태양에서, 상기 방법은 상기 TH-GM-매개 인자, 예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 정량분석함을 추가로 포함하며, 여기에서 참조 수준에 비해 상기 TH-GM-매개 인자, 예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합의 증가된 수준은 상기 환자가 TH-GM-매개된 염증 질환을 앓고 있음을 가리키거나; 또는 참조 수준에 비해 상기 TH-GM-매개 인자, 예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합의 필적하는 수준은 상기 환자가 비-TH-GM-매개된 염증 질환을 앓고 있음을 가리키며, 이에 의해 염증 질환을 앓고 있는 환자를 TH-GM-매개된 염증 질환 또는 비-TH-GM-매개된 염증 질환으로서 분류한다.
본 명세의 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 방법은 비-TH-GM-매개된 염증 질환을 매개하는 인자의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 측정함을 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 인자는 예를 들어 TNF-α, IL-6 및 IL-1β를 포함한다.
예를 들어, 일부 태양에서, 본 명세는 염증 질환을 앓고 있는 환자에서 치료 섭생을 결정하는 방법을 제공한다. 예시하기 위해서, 상기 방법은 염증 질환을 앓고 있는 환자로부터 수집된 샘플 중의, 예를 들어 활성화된 STAT5 또는 GM-CSF의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 정량분석하고, 상기 환자로부터 수집된 샘플 중의, 예를 들어 TNF-α의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 정량분석함을 포함한다. 적어도 4개의 시나리오가 고려될 수 있다.
첫 번째 시나리오에서, 상기 활성화된 STAT5 또는 GM-CSF 수준이 제1 참조 수준에 비해 증가하고(예를 들어 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 150%까지) 상기 TNF-α 수준이 제2 참조 수준에 필적하는 경우, 상기 환자는 TH-GM-매개된 염증 질환을 갖는 것으로서 분류되고 상기 환자를 본 명세서에 기재된 바와 같이, TH-GM 기능을 조절하는 작용제로 치료할 수 있다.
두 번째 시나리오에서, 상기 활성화된 STAT5 또는 GM-CSF 수준이 제1 참조 수준에 필적하고 상기 TNF-α 수준이 제2 참조 수준에 비해 증가하는(예를 들어 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 150%까지) 경우, 상기 환자는 비-TH-GM-매개된 염증 질환을 갖는 것으로서 분류되고 상기 환자를 예를 들어 TNF-α 요법으로 치료할 수 있다.
세 번째 시나리오에서, 상기 활성화된 STAT5 또는 GM-CSF 수준이 제1 참조 수준에 비해 증가하고 상기 TNF-α 수준이 또한 제2 참조 수준에 비해 증가하며, 상기 증가가 임상 및/또는 통계학적 표준내에서 동등한 경우(예를 들어 GM-CSF 및 TNF-α가 각각의 참조 수준에 비해 적어도 50% 증가하는 경우), 상기 환자는 균등하게 TH-GM-매개되고 비-TH-GM 매개되는(예를 들어 TNF-α-매개되는) 염증 질환을 갖는 것으로서 분류된다. 상기와 같은 경우에, 상기 환자를 유효량의, TH-GM 기능을 조절하는 작용제 및 유효량의, 예를 들어 TNF-α 요법으로 치료할 수 있다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 상기 두 작용제의 조합은 상승작용적 효과를 가질 수 있다.
네 번째 시나리오에서, 상기 활성화된 STAT5 또는 GM-CSF 수준이 제1 참조 수준에 비해 증가하고 상기 TNF-α 수준이 또한 제2 참조 수준에 비해 증가하지만, 하나가 다른 것보다 더 증가하는 경우, 상기 염증 질환은 주로 더 큰 증가를 나타내는 경로에 의해 매개된다. 예를 들어 GM-CSF가 참조 수준에 비해 40%까지 증가하고, TNF-α가 참조 수준에 비해 90%까지 증가하는 경우, 상기 염증 질환은 주로 비-TH-GM-매개된다. 그러나, 이 시나리오에서, 상기 환자는, GM-CSF가 예를 들어 참조 수준에 비해 적어도 40%까지 증가하기 때문에, TNF-α 요법(예를 들어 항-TNF-α 요법)뿐만 아니라 TH-GM 기능을 조절하는 작용제에 의한 복합 치료를 받을 수도 있다.
일부 실시태양에서, 상기 제1 및 제2 참조 수준은 동일한 참조 샘플로부터 획득된다.
관련 태양에서, 본 명세는 또한 환자의 염증 질환의 진행에 따라 염증 질환을 앓고 있는 환자를 맞춤 치료하는 방법을 제공한다. 상기 예시적인 예에서, 상기 첫 번째 시나리오(증가된 TH-GM-매개된 인자, 예를 들어 STAT5 또는 GM-CSF, 그러나 TNF-α 수준은 참조 수준에 필적하는)는 상기 환자가 염증 질환의 초기 단계에 있음을 가리킬 수 있다. 임의의 특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 예를 들어 염증 질환의 초기 단계 동안, 나이브 T 세포는 항원에 의해 자극되고 IL-7/STAT5에 의해 GM-CSF/IL-3 생성 TH-GM 세포로 분화되도록 프로그램화된다. 예를 들어 염증 질환의 말기 단계 동안, TH-GM 사이토킨(예를 들어 IL-3 및 GM-CSF)은 보다 많은 염증 세포, 예를 들어 대식세포 및 호중구를 점진적으로 자극하여 예를 들어 TNF-α, IL-6, IL-1β를 생성시켜 완전한 크기의 염증을 생성시킨다. 따라서, 상기 예시적인 예에서, 상기 두 번째 시나리오(활성화된 STAT5 또는 GM-CSF 수준이 제1 참조 수준에 필적하지만 상기 TNF-α 수준은 증가된)는 상기 환자가, 예를 들어 조직 손상을 특징으로 하는 염증 질환의 말기에 있음을 가리킬 수 있다. 따라서, 본 명세는 환자를 하나 이상의 TH-GM-매개 인자(예를 들어 STAT5(예를 들어 활성화된 포스포-STAT5(Tyr694)), IL-7, GM-CSF 및/또는 IL-3) 및 하나 이상의 비-TH-GM-매개 인자(예를 들어 TNF-α, IL-6, IL-1β)의 정량분석 가능한 수준에 따라 예측할 수 있으며, 이에 의해 상기 질병의 진행에 따른 맞춤 치료를 할 수 있다. 따라서, 당해 분야의 숙련가들에 의해 이해되는 바와 같이, 염증 질환을 앓고 있는 환자를 본 명세서에 기재된 바와 같이 하나 이상의 TH-GM-매개 인자, 및 하나 이상의 비-TH-GM-매개 인자(예를 들어 TNF-α, IL-6, IL-1β)의 수준에 따라 유효한 맞춤 치료가 보장되도록 질병 진행에 대해 모니터할 수 있다.
관련 태양에서, 본 명세는 또한 염증 질환의 진행의 예측이 필요한 환자에서 상기 예측 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 a) 염증 질환을 앓고 있는 환자로부터 수집한 첫 번째 샘플 중의 TH-GM-매개 인자, 예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 정량분석하고, b) 상기 환자로부터 수집한 두 번째 샘플 중의, 예를 들어 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β, 또는 이들의 조합의 폴리펩티드 또는 핵산 수준을 정량분석함을 포함하며, 여기에서 i) 제1 참조 수준에 비해 TH-GM-매개 인자, 예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3, 또는 이들의 조합의 증가된 수준, 및 제2 참조 수준에 비해 TNF-α, IL-6, 또는 IL-1β, 또는 이들의 조합의 불변 수준은 상기 환자가 본 명세서에 기재된 바와 같이 염증 질환의 초기 단계 있음을 가리키거나; 또는 ii) 상기 제1 참조 수준에 비해 TH-GM-매개 인자, 예를 들어 STAT5, IL-7, GM-CSF 또는 IL-3 또는 이들의 조합의 불변 수준 및 상기 제2 참조 수준에 비해 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β, 또는 이들의 조합의 증가된 수준은 상기 환자가 본 명세서에 기재된 바와 같이 염증 질환의 말기 단계에 있음을 가리킨다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이, TH-GM 기능 및/또는 예를 들어 TNF-α 요법을 조절하는 유효량의 작용제를 투여함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 첫 번째 샘플 및 두 번째 샘플은 동일하다.
다양한 태양에서, 본 명세는 또한 GM-CSF-분비 T-헬퍼 세포(TH-GM)의 단리된 집단을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 TH-GM 세포는 전사 신호 변환인자 및 활성인자 5(STAT5) 및/또는 IL-7의 존재하에서 전구세포(예를 들어 CD4+ 세포)로부터 분화되며, 상기 TH-GM 세포는 GM-CSF 및 IL-3을 발현한다.
일부 실시태양에서, 상기 TH-GM 세포는 IL-12, IFN-γ, TGF-β 및/또는 IL-6을 억제하는 작용제의 존재하에서 전구세포(예를 들어 CD4+ 세포)로부터 분화된다. 유사하게, 전구세포(예를 들어 CD4+ 전구세포)의 TH-GM 세포로의 분화는 IL-12, IFN-γ, TFG-β, 및/또는 IL-6에 의해 억제된다.
일부 실시태양에서, 상기 TH-GM 세포는 인공적인 조건하에서 시험관내에서 전구세포로부터 분화되지만, 여기에서 상기 TH-GM 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생리학적 성질들을 유지한다.
일부 실시태양에서, 상기 TH-GM 세포는 표 1에 나열된 하나 이상의 유전자의 과발현을 추가의 특징으로 한다. 예를 들어, 상기 TH-GM 세포는 예를 들어 기본 나선-루프-나선패밀리, 구성원 e40(BHLHe40), 프리프로엔케팔린(PENK), IL-2, 세린(또는 시스테인) 펩티다제 억제제, 클레드 B 구성원 6b(Serpinb6b), 뉴리틴 1(Nrn1), 스테아로일-조효소 A 불포화효소 1(Scd1), 또는 포스포트리에스테라제 관련된 C1q-유사 3(Pter), 또는 이들의 조합의 과발현을 추가의 특징으로 한다.
일부 실시태양에서, 상기 TH-GM 세포는 표 1에 나열된 하나 이상의 유전자들의 저발현을 추가의 특징으로 한다. 예를 들어 상기 TH-GM 세포는 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 A(Ly6a); CD27; 또는 셀렉틴, 림프구(Sell)의 저발현을 추가의 특징으로 한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, TH-GM 기능(예를 들어 그의 분화 및 병원성)을 매개하는 인자들의 특유의 네트워크(TH1 또는 TH17을 매개하는 것으로 공지된 인자와 다른)의 식별은 TH-GM-매개된 질환, 예를 들어 이상 TH-GM 기능으로부터 발생하는 질환을 치료하기 위해 TH-GM 기능의 표적화된 조절을 가능하게 한다. 따라서, 일부 태양에서, 본 명세는 상기 TH-GM, 또는 분화 4(CD4+) 전구세포의 클러스터, 또는 이 둘 모두를 TH-GM 기능을 조절하는 조절제와 접촉시킴을 포함하는 TH-GM 기능의 조절 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 조절제를 시험관내 또는 생체내에서 상기 TH-GM 세포 또는 CD4+ 전구세포와 접촉시킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "TH-GM 기능"은 TH-GM 세포의 실행(commitment), 발생, 유지, 생존, 증식 또는 활성, 또는 이들의 조합을 지칭한다. 따라서, TH-GM 기능을 조절하는(예를 들어 증대시키거나 억제하는) 작용제는 TH-GM 세포의 TH-GM 실행, 발생, 생존, 증식 또는 활성 또는 이들의 조합을 조절하는 것이다. 예를 들어 TH-GM 기능을 그의, CD4+ 전구 T 세포로부터의 실행; 상기 TH-GM 발생 경로로 실행된 CD4+ 전구세포의 발생; TH-GM 표현형의 유지; 발생 또는 효과기 TH-GM 세포하의 생존 또는 증식; 및/또는 효과기 TH-GM 세포의 활성을 조절함으로써(예를 들어 GM-CSF 또는 IL-3과 같은 분비된 인자의 기능을 조절함으로써) 조절할 수 있다. 예를 들어 TH-GM 기능의 조절은 비제한적으로 TH-GM 세포의 수; TH-GM 세포의 생존; TH-GM 세포의 증식; 및/또는 TH-GM 세포의 활성의 조절을 포함한다. 본 명세서에서 TH-GM 세포의 활성은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 사이토킨, 케모킨, 성장인자, 효소 및 TH-GM 세포에 의해 분비되는 다른 인자들에 의해 유도된 활성, 및 TH-GM 세포와의 직접 접촉에 의해 유도된 활성을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, T 헬퍼 부분집합 세포 "TH-GM"은 TH1 및 TH17 세포와 유사하게, 전구 CD4+ 전구세포로부터 분화되지만, 본 명세서에 기재되는 바와 같이, TH1 또는 TH17 세포 하위유형을 실행시키고 이를 발생시키는 공지된 인자들의 부분집합과 다른 특유의 인자들의 부분집합(상기 TH-GM-매개 인자)에 의해 매개되는 경로를 통해 실행되고 발생하는 세포를 지칭한다. 일부 실시태양에서, TH-GM 세포는 별개의 특유의 유전자 세트(예를 들어 표 1을 참조하시오)를 생성시키고 TH1 또는 TH17 세포 하위유형의 병원성을 매개하는 공지된 인자는 상이한 기전 및 경로를 통해 병원성을 초래한다. 예를 들어 TH-GM 세포는 IL-7/STAT5 기능(그의 조절인자)에 의해 실행되고 발생되며, GM-CSF/IL-3(그의 효과기)에 의해 병원성을 초래한다.
일부 태양에서, 본 명세는 TH-GM-매개된 염증 질환의 치료가 필요한 환자에서 상기 질환의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 TH-GM 세포 기능을 조절하는 조절제를 투여함을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 환자는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 앞서 TH-GM-매개된 염증 질환을 갖는 것으로서 진단된다.
일부 태양에서, 본 명세는 또한 TNF-α 요법에 제한된 응답을 나타내는 환자에서 류머티스성 관절염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 TH-GM 기능을 조절하는 조절제를 투여함을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "제한된 응답"은 임상 표준에 의해 측정되는 바와 같이, 환자가 상기 요법에 의해 치료되지 않도록 하는 무응답 또는 무의미한 응답을 지칭한다.
"치료" 또는 "치료하는"은 치료, 방지 및 예방을 지칭하며, 특히 예방(방지)을 위해서 또는 환자가 병든 경우 병증 또는 사건의 정도 또는 발생 가능성을 감소시키기 위해서 환자에 대한 약물의 투여 또는 의학적 시술의 수행을 지칭한다. 상기는 또한 상기 질병 또는 병증과 관련된 하나 이상의 증상의 중증도의 감소를 지칭한다. 본 출원에서, 상기는 하기 중 하나 이상의 개선을 지칭할 수 있다: 염증성 병증 또는 자가면역 질병과 관련된 통증, 종창, 발적(redness) 또는 염증. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 및 당해 분야에서 충분히 이해되는 바와 같이, "치료"는 임상적 결과를 포함하여 이롭거나 목적하는 결과를 획득하기 위한 접근법이다. 본 명세의 목적을 위해서, 이롭거나 목적하는 임상적 결과는 비제한적으로 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선, 질병의 정도의 감소, 질병의 안정화된(예를 들어 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 느려짐, 및/또는 질병 상태의 개선 또는 완화를 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우의 기대 생존에 비해 연장된 생존을 의미할 수 있다.
작용제의 "유효량"은 임상적 결과를 포함하여 이롭거나 목적하는 결과를 초래하기에 충분한 양이다. "유효량"은 적용되는 상황에 따라 다르다. 자가면역 반응을 조절하는 조성물을 투여하는 상황에서, TH-GM 기능의 조절제인 작용제의 유효량은 작용제가 투여되지 않는 경우 획득되는 응답에 비해 상기와 같은 조절을 성취하기에 충분한 양이다. 유효량은 본 명세서에 정의된 바와 같은 질병 변형의 즉시, 단기 또는 장기 이점, 예를 들어 TH-GM 기능의 억제 및/또는 저해를 부여할 수 있다. 유효량을 1회 이상의 투여로 투여할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "유효량"은 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%까지 감소시키기에 충분한 양, 또는 환자에서 하나 이상의 임상적으로 의미있는 증상의 개선을 일으키기에 충분한 양을 의미하고자 한다.
일부 실시태양에서, 상기 조절제는 예를 들어 염증을 감소시키기 위해 TH-GM 기능을 억제한다. 상기 조절제(억제제)에 의해 부여된 억제는 특정한 생물학적 작용 기전을 의미하지 않는다. 실제로, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "길항제" 또는 "억제제"란 용어는 직접적이든 간접적이든 간에, TH-GM 기능을 매개하는 인자들(예를 들어 IL-7, IL-7 수용체, STAT5, GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-2 수용체, PENK, RANKL, JAK1/3, 또는 TH-GM 세포에서 차별적으로 발현되는 유전자들, 예를 들어 표 1 및 2의 유전자들 중 어느 하나)과의 모든 가능한 약물학적, 생리학적 및 생화학적 상호작용을 포함하며, 단백질 및/또는 핵산 수준에서 또는 또 다른 기전을 통해 TH-GM 기능을 매개하는 인자(또는 그의 활성 단편)와의 상호작용을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, TH-GM 기능을 억제하는 조절제는 TH-GM 기능을 매개하는 인자의 기능(예를 들어 발현 및/또는 활성)을 방지하는 항체, 폴리펩티드(예를 들어 IL-7에 결합하여 상기를 억제하는 가용성 수용체), 소분자, 핵산(예를 들어 안티센스, 작은 간섭 RNA 분자, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로RNA), 또는 단백질(예를 들어 사이토킨), 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기와 같은 억제제의 설계, 생산 및 사용 방법은 공지되어 있으며 이를 당해 분야에서 입수할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합하다"는 "특이적으로 결합하다"와 호환적으로 사용되며, 이는 본 명세의 폴리펩티드를 인식하여 상기에 결합하지만 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플(당연히 본 명세의 폴리펩티드를 포함한다) 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하여 결합하지 않는 폴리펩티드(예를 들어 가용성 수용체) 또는 항체를 의미한다. 일례로, 항체는 활성화된 STAT5 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지만 비-STAT5 폴리펩티드에는 결합하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항체"는 변형되거나 조작된 또는 인간 항체인 완전(intact) 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한, 완전 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 지칭한다.
특정한 실시태양에서, 상기 항체는 TH-GM 기능을 매개하는 인자들 중 임의의 하나 이상과 결합하여 그의 기능을 억제한다. 예를 들어 상기 항체는 IL-7, IL-7 수용체(IL-7R), IL-2, IL-2 수용체(IL-2R), STAT5 또는 야누스 키나제 1/3(JAK1/3), 또는 이들의 조합에 결합하여 이들의 기능을 억제한다. 다른 예에서, 상기 항체는 GM-CSF(또는 그의 수용체), IL-3, PENK, 또는 RANKL, 또는 이들의 조합에 결합하여 이들의 기능을 억제한다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 표 1에 나열된 유전자에 결합하여 그의 기능을 억제한다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 단백질 또는 그의 임의의 기능 단편에 결합하여 상기를 억제한다. 적합한 항체의 설계, 생산 및 사용 방법은 공지되어 있으며 이를 당해 분야에서 입수할 수 있다. 본 명세에 사용하기에 적합한 항체의 예는 예를 들어 다클리주맙, 바실릭시맙, 마브릴리뮤맙, MOR103, KB003, 나밀루맙, 및 MOR Ab-022를 포함한다.
"단백질" 및 "폴리펩티드"란 용어는 호환적으로 사용되며, 전장 폴리펩티드 또는 그의 기능 단편(예를 들어 분해 산물, 상기 폴리펩티드의 선택적으로 이어맞춰진 동형, 상기 폴리펩티드의 효소적 절단 산물), 기질 또는 리간드에 결합된 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드의 유리(결합되지 않은) 형태를 포함할 수 있다. "기능 단편"이란 용어는 상기 전장 폴리펩티드의 활성(예를 들어 생물학적 활성, 예를 들어 동족 리간드 또는 수용체에 결합하는 능력) 중 일부 또는 전부를 유지하는 전장 단백질의 일부를 지칭한다.
일부 실시태양에서, TH-GM 기능을 억제하는 조절제는 TH-GM 기능을 매개하는 인자들 중 하나 이상을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 특정한 생물학적 단백질(예를 들어 사이토킨)일 수 있다. 상기와 같은 사이토킨은 예를 들어 IL-12, IFN-γ, TGF-β 및 IL-6을 포함한다.
일부 실시태양에서, TH-GM 기능을 억제하는 조절제는 TH-GM 기능을 매개하는 인자들 중 하나 이상을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 소분자일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "소분자"는, 생물 활성을 갖고 중합체가 아닌 유기 화합물 또는 무기 화합물(예를 들어 금속)과 착화된 상기와 같은 화합물이다. 소분자는 일반적으로 약 3 킬로달톤 미만의 분자량을 갖는다. 공지된 소분자의 예는 CAS 285986-31-4(칼바이오켐), 피모지드 및 토파시티닙을 포함한다.
다른 실시태양에서, 상기 조절제는 예를 들어 바이러스, 진균 및 세균 감염, 암 및/또는 이와 관련된 상태와 같은 질환에서 TH-GM 기능을 증대시킨다. 하나의 실시태양에서, TH-GM 기능을 증대시키는 조절제는 예를 들어 CD28 활성제; 나이브(전구체) CD4+ T 세포상의 IL-7 및/또는 IL-2; STAT5의 활성제; 또는 TH-GM 세포의 효과기(예를 들어 GM-CSF, IL-3)를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 명세는 STAT5-매개된 염증 질환의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 STAT5 기능을 조절하는 작용제를 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "STAT5-매개된" 염증 질환은 임상 표준에 의해 측정된 바와 같이, 이상 STAT5 기능(이상 증대되거나 또는 억제된)에 의해 야기되고 STAT5 기능의 조절에 응답성인 염증 질환을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 STAT5는 활성화된 STAT5(예를 들어 포스포-STAT5, Tyr694)이다.
일부 실시태양에서, 상기 염증 질환은 자가면역 질환이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 염증 질환은 STAT5(예를 들어 활성화된 STAT5)에 의해 매개되는 임의의 염증 질환일 수 있으며, 비제한적으로 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 크론병, 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 갑상성 기능항진, 갑상성 기능저하, 과민성 장 증후군(IBS), 홍반성 루푸스, 류머티스성 다발성 근육통, 건선, 건선성 관절염, 레이노 증후군/현상, 반응성 관절염(라이터 증후군), 유육종증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 궤양성 대장염, 포도막염 또는 혈관염을 포함한다.
일부 실시태양에서, "환자"란 용어는 포유동물, 바람직하게는 인간을 지칭하나, 또한 수의학적 치료가 필요한 동물, 예를 들어 반려 동물(예를 들어 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어 소, 양, 돼지, 말 등), 및 실험용 동물(예를 들어 래트, 마우스, 기니피그 등)을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 작용제는 STAT5 기능(예를 들어 발현 및/또는 활성)을 억제한다. STAT5(예를 들어 활성화된 STAT5, Tyr694)를 억제하는 작용제의 예는 본 명세서에 기재되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 명세의 방법은 상기 환자에게 TNF-α 요법을 적용함을 추가로 포함한다. 몇몇 실시태양에서, TNF-α 요법을 비-TH-GM-매개된 염증성 병증를 갖는 것으로 판정된 환자에 투여한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 몇몇 실시태양에서, 정량분석된 TNF-α 수준이 예를 들어 참조 수준에 비해 적어도 40%까지 증가된 경우 TNF-α 요법을 적용한다.
TNF-α 요법의 예는 TNF-α-억제제 기반 요법, 및 비-TNF-α-억제제 기반 요법을 포함한다. 특히, TNF-α-억제제 기반 요법은 에타너셉트, 아달리뮤맙, 인플릭시맙, 골리뮤맙 및 세르톨리주맙 페골을 포함한다. 비-TNF-α-억제제 기반 요법의 예는 코르티코스테로이드 약물(예를 들어 프레드니손), 비스테로이드성 소염 약물(예를 들어 메토트렉세이트), 및 JAK 억제제(예를 들어 토파시티닙)를 포함한다. 비-TNF-α-억제제 기반 요법의 다른 예는 아나킨라, 아바타셉트, 리툭시맙 및 토실리주맙을 포함한다.
상기 TNF-α 요법을 유효량의 TH-GM 기능을 조절하는 작용제의 투여 전, 상기 투여와 동시에, 또는 상기 투여 후에 투여할 수 있다. 따라서, TH-GM 기능을 조절하는 작용제 및 상기 TNF-α 요법을 단일 용량으로 함께 투여하거나, 또는 별도의 용량으로, 예를 들어 동시에 또는 순차적으로, 또는 이 둘 모두로 투여할 수 있다. TH-GM 기능을 조절하는 작용제 및 TNF-α 요법의 투여 사이의 기간은 상기 치료제(들)의 성질에 따라 변할 것이다. 또한, TH-GM 기능을 조절하는 작용제 및 TNF-α 요법을 유사한 투여 스케줄로 투여할 수도, 투여하지 않을 수도 있다. 예를 들어 TH-GM 기능을 조절하는 작용제 및 TNF-α 요법은 상이한 반감기를 갖고/갖거나, TH-GM 기능을 조절하는 작용제가 TNF-α 요법보다 더 빈번하게 투여되거나, 또는 이와 역으로 투여되도록 상이한 시간-규모로 작용할 수 있다. 치료제들의 투여 사이의 일수는 각 약물의 안전성 및 약역학에 따라 당해 분야의 통상적인 숙련가들에 의해 적합하게 결정될 수 있다.
상기 TH-GM 세포의 식별뿐만 아니라 TH1 또는 TH17에 비해 TH-GM 세포에 의해 차별적으로 생성되는 유전자들의 식별은, TH-GM 세포를 TH-GM 기능을 조절하는 신규 요법의 식별에 사용할 수 있게 하고, 이에 의해 신규 요법이 TH-GM-매개된 질환(예를 들어 염증 질환)을 치료할 수 있게 한다. 따라서, 추가의 태양에서, 본 명세는 TH-GM 세포의 단리된 집단 또는 CD4+ 전구세포의 단리된 클러스터를 후보 작용제와 접촉시키고, 상기 후보 작용제의 존재 또는 부재하에서 TH-GM 기능의 판독정보를 측정함을 포함하는, TH-GM 세포 기능의 조절제를 식별하기 위한 선별 방법을 제공하며, 여기에서 상기 TH-GM 기능의 판독정보의 변화는 상기 후보 작용제가 TH-GM 기능의 조절제임을 가리킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 후보 작용제는 TH-GM 기능을 매개하는 인자의 기능(예를 들어 발현 및/또는 활성)을 조절함으로써 TH-GM 기능을 조절할 수 있는 작용제를 지칭한다. 상기와 같은 후보 작용제는 예를 들어 항체, 펩티드, 소분자, 핵산(예를 들어 안티센스, 작은 간섭 RNA 분자), 또는 단백질(예를 들어 사이토킨), 또는 이들의 조합을 포함한다. 후보 작용제를 본 명세서에 기재된 바와 같이, 표 1에 나열된 유전자들(예를 들어 TH-GM 세포에서 우선적으로 상향조절되는 유전자, TH-GM 세포의 표면상에서 우선적으로 과발현/저발현되는 유전자)을 포함하여, TH-GM 기능을 매개하는 인자들 중 어느 하나를 표적화(단백질 및/또는 핵산 수준에서)하도록 설계할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "판독정보"는 측정되거나 정량분석될 수 있는 TH-GM 기능의 임의의 변화(또는 변화의 결여)를 지칭한다. 예를 들어 후보 작용제를 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 TH-GM 세포에 의한 GM-CSF 분비에 대한 그의 영향, 또는 TH-GM 세포의 풍부성에 대한 그의 영향(TH-GM 세포의 실행/발생/증식에 대한 영향을 통해서)에 대해서 평가할 수 있다. 상기와 같은 판독정보의 측정을 위한 분석은 당해 분야에 공지되어 있으며 이를 입수할 수 있고, 본 명세서에 예시된다.
일부 실시태양에서, 상기 후보 작용제 존재하에서의 변화는 상기 판독정보 크기의 감소[이는 TH-GM 기능의 억제(예를 들어 GM-CSF 또는 IL-3 생성의 감소, 또는 TH-GM 세포의 풍부성의 감소)를 가리킨다]이며, 이에 의해 상기 후보 작용제를 TH-GM 기능의 억제제로서 식별한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 후보 작용제 존재하에서의 변화는 상기 판독정보 크기의 증가[이는 TH-GM 기능의 증대(예를 들어 GM-CSF 또는 IL-3 생성의 증가, 또는 TH-GM 세포의 풍부성의 증가)를 가리킨다]이며, 이에 의해 상기 후보 작용제를 TH-GM 기능의 증강인자(enhancer)로서 식별한다.
일부 실시태양에서, 상기 판독정보는 TH-GM 세포에서 우선적으로 상향조절되거나 하향조절되는 표 1 및 2에 나열된 유전자들 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 따라서, TH-GM 세포에서 우선적으로 상향조절되는 유전자를 하향조절하는 후보 작용제는 TH-GM 기능의 억제제이다. 유사하게 TH-GM 세포에서 우선적으로 하향조절되는 유전자를 상향조절하는 후보 작용제는 TH-GM 기능의 증강인자이다.
몇몇 태양에서, 상기 선별 방법은 전구 CD4+ 세포로 수행되는 경우, 본 명세서에 기재된 바와 같이, TH-GM 양극화 조건하에서 수행된다. 예를 들어, 상기 방법을 IL-7/STAT5, TCR 활성화, CD28 공-침전의 존재하에서 IFN-감마 및 IL-4의 차단과 함께 수행할 수 있다.
달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 용어들의 정의를 본 명세의 모든 태양 및 실시태양에 적용한다.
본 명세의 실시는 예를 들어 하기의 문헌들에 기재된 바와 같은 재조합 DNA와 같은 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학, 및 면역학의 통상적인 기법의 사용을 포함한다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), jointly and individually referred to herein as "Sambrook"); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, and Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (함께 및 개별적으로 본 명세서에서 "할로우 앤드 레인(Harlow and Lane)"으로서 지칭됨), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); 및 Agrawal, ed., Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Humana Press Inc., New Jersey, 1993).
실시예
방법
마우스
Stat5 f/f 마우스는 엘 헨니히하우젠(L. Hennighausen)(국립 당뇨병 및 소화 및 신장병 연구소)에 의해 제공되었다. Stat3 f/f 마우스는 기재된 바와 같이 생성되었다2. Cd4-Cre 트랜스제닉 마우스는 타코닉 팜즈(Taconic Farms)로부터 구입하였다. Rag2 -/- 마우스는 장-피엘 아바스타도(Jean-Pierre Abastado)(싱가포르 면역학 네트워크)로부터 수득하였다. 모든 마우스는 C57BL/6 유전적 배경상에 있으며 싱가포르 국립대학에서 특정-병원체-부재 조건하에서 수용된다. 모든 실험을 6 내지 8주 된 마우스로 수행하였으며 이들 실험은 NUS의 연구 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 승인되었다.
환자 및 대조군
혈액 샘플(n=47) 및 활액 샘플(n=3)을 난징 의대 산하 드럼타워 병원(the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School)의 류머티스 면역내과에 내원한 RA 환자로부터 수집하였다. 모든 환자는 RA의 분류에 대한 미국 류머티스 학회 기준을 충족하였다. 연령 및 성별 합치된 건강한 대조군(n=32)을 산하 드럼타워 병원의 의료 검사 센터로부터 수득하였다. 상기 연구 프로토콜은 난징 의대 산하 드럼타워 병원의 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
시험관내 T 세포 분화
CD4+ T 세포를 양성 선택 및 자기 분리(밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotech))에 이어서 FACS 아리아(Aria)에 의해 분류된 나이브 CD4+ T 세포 집단(CD4+CD25-CD62LhiCD44lo)의 정제에 의해 비장 및 림프절로부터 수득하였다. 나이브 CD4+ T 세포를 3 내지 4일 동안 중화 항체 및 사이토킨의 상이한 조합: 중성 조건의 경우, 임의의 사이토킨 또는 중화 항체의 첨가 없이; TH1 조건의 경우, IL-12(10 ng/㎖) 및 항-IL-4(10 ㎍/㎖, BD 파밍겐); TH17 조건의 경우, hTGF-β(3 ng/㎖), IL-6(20 ng/㎖), 항-IFN-γ(10 ㎍/㎖, 이바이오사이언스(eBioscience)), 및 항-IL-4(10 ㎍/㎖); 또 다른 TH 17 조건의 경우, IL-6(20 ng/㎖), IL-23(10 ng/㎖), IL-1β(10 ng/㎖), 항-IFN-γ(10 ㎍/㎖), 및 항-IL-4(10 ㎍/㎖)의 존재하에서 플레이트-결합된 항-CD3(3 ㎍/㎖; BD 파밍겐) 및 항-CD28(1 ㎍/㎖; BD 파밍겐)로 자극하였다. CM-CSF-발현 세포 분화를 위해서, 나이브 CD4+ T 세포를 지시된 대로 IL-7 및/또는 항-IFN-γ(10 ㎍/㎖)의 첨가와 함께 플레이트-결합된 항-CD3(2 ㎍/㎖) 및 가용성 항-CD28(1 ㎍/㎖)로 자극하였다. 모든 사이토킨을 R&D 시스템스로부터 수득하였다. 모든 세포를 10% FBS, 100 단위/㎖ 페니실린, 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신, 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.1 mM 불필수 아미노산 및 5 μM 베타-머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. 3 내지 4일 양극화 후에, 세포를 세척하고 4 내지 5시간 동안 골지플러그의 존재하에서 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 및 이오노마이신으로 재자극한 다음 BD 파밍겐으로부터의 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm) 키트로 고정 및 세포내 염색하였다. Foxp3 염색을 이바이오사이언스로부터의 키트로 수행하였다. 세포를 LSR II(BD 바이오사이언시즈)상에서 획득하고 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(트리 스타(Tree Star))로 분석하였다.
EAE 유도
EAE 유도 과정을 선행 보고서3로부터 변형시켰다. 능동적인(active) EAE 유도를 위해서, 마우스를 뒷 옆구리 상의 2개 부위에 0일 및 7일째에 5 ㎎/㎖의 열사된 엠. 튜베르큘로시스 균주 H37Ra(디프코(Difco))를 함유하는 100 ㎕ CFA 중의 300 ㎍ MOG35-55로 면역시켰다. 백일해 독소(리스트 바이오 랩(List Bio Lab))를 1일 및 8일째에 마우스당 500 ng의 투여량으로 복강내 투여하였다. 단일 MOG35-55/CFA 면역을 위해서, 유사한 과정을 단지 0일 및 1일째에만 수행하였다. 또 다른 능동적인 EAE 유도에서, LPS(IFA 중의 600 ㎍/㎖, 시그마로부터 O111:B4)를 항원보강제로서 사용하였다. Rag2 -/- 마우스에서 능동적인 EAE 유도를 위해서, Stat5 f/f 또는 Cd4-Cre; Stat5 f/f 마우스로부터 유래된 CD4+ T 세포를 전달한 다음, 상술한 바와 같이 MOG35-55/CFA 면역시켰다. 임상 증상들을 하기와 같이 기록하였다: 0, 임상 징후 없음; 1, 꼬리 색조 상실; 2, 불안정한 보행; 3, 뒷다리 마비; 4, 앞뒷다리 마비; 5, 사망. IL-7Rα 중화 항체(SB/14, BD 파밍겐) 및 아이소타입 대조군을 이틀마다 마우스당 200 ㎍으로 복강내 투여하였다. CNS-침윤 세포의 분석을 위해서, 척수 및 뇌를 모두 관류된 마우스로부터 수집하여 다지고, 퍼콜(Percoll)(GE 헬쓰케어)에 의한 구배 원심분리에 의해 단핵 세포를 단리하였다.
Stat5 +/+ 또는 Stat5 -/- CD4+ T 세포에 의한 수동적인(passive) EAE 유도를 위해서, 비장세포 및 LN을 면역-후 10 내지 14일째에 수확하고 70 ㎛ 세포 스트레이너(BD 팔콘(Falcon))에 통과시켰다. 세포를 시험관내에서 3일 동안 IL-23(5 ng/㎖) 및 IL-1β(2 ng/㎖)의 존재하에서 MOG35-55(20 ㎍/㎖)와 함께 배양하였다. 수확 후에, CD4+ T 세포를 순도 >90%로 양성 선택에 의해 정제하였다. CD4+ T 세포(멸균 PBS 중 2백만개)를 Rag2 -/- 마우스내에 복강내 주사한 다음, 다음날 백일해 독소를 투여하였다. 마우스를 상술한 바와 같이 EAE의 징후에 대해서 매일 관찰하였다. 다양한 TH 부분집합의 전달에 의한 EAE 유도를 위해서, 유사한 과정을 상술한 바와 같이 수행하였다. 상이한 부분집합 치우침 조건(skewing condition)들은 하기와 같았다: 치우치지 않은, MOG35-55 단독; TH1: MOG35-55 + IL-12(10 ng/㎖) 및 항-IL-4(5 ㎍/㎖); TH17: MOG35-55 + TGF-β(3 ng/㎖), IL-6(10 ng/㎖), 항-IFN-γ(5 ㎍/㎖) 및 항-IL-4(5 ㎍/㎖); GM-CSF-발현 TH: MOG35-55 + IL-7(2 ng/㎖) 및 항-IFN-γ(5 ㎍/㎖). 수용 마우스당 6 x 105 CD4+ T 세포를 전달하였다.
항원-유도된 관절염(AIA)
간단히, 마우스를 0일째에 5 ㎎/㎖의 열사된 엠 튜베르큘로시스 균주 H37Ra(디프코)를 함유하는 100 ㎕ 완전 프로인트 항원보강제(CFA) 중의 100 ㎍ 메틸화된 소 혈청 알부민(mBSA, 시그마)으로 뒷 옆구리 상의 2개의 부위에서 피하 면역시켰다. 백일해 독소(리스트 바이오 랩)를 1일째에 마우스당 250 ng의 투여량으로 복강내 투여하였다. 관절염을, 면역후 7일째에 뒤 우측 무릎 관절에 100 ㎍ mBSA(10 ㎕ 염수 중의)의 관절내 주사에 의해 유도하였다. 뒤 좌측 무릎 관절에는 대조용으로서 동일한 부피의 염수를 주사하였다. 관절염 유도 후 7일에 걸쳐 좌우측 무릎 관절 직경간의 차이를 캘리퍼스로 측정함으로써 관절 종창을 기록하였다. GM-CSF 투여의 효과를 평가하기 위해서, 우측 무릎 관절에 mBSA 단독 또는 좌측 무릎 관절에 100 ng GM-CSF(임뮤노툴스(ImmunoTools))가 보충된 mBSA를 관절내 주사함으로써 AIA를 유도하였다. GM-CSF 및/또는 TNF-α 차단의 효과를 평가하기 위해서, 마우스에게 지시된 시간에 GM-CSF(MP1-22E9, BD 파밍겐) 및/또는 TNF-α(MP6-XT3, BD 파밍겐)에 특이적인 중화 항체들(마우스당 각각의 항체에 대해 100 ㎍)을 복강내 투여하였다.
양자 전이에 의한 AIA 유도를 위해서, 비장세포 및 서혜부 LN 세포를 7일째에 mBSA/CFA-면역된 마우스로부터 단리하고, 3일 동안 IL-7(2 ng/㎖)의 존재하에서 mBSA(10 ㎍/㎖)과 함께 시험관내에서 배양하였다. 수확 후에, CD4+ T 세포를 양성 선택(밀테니 바이오텍)에 의해서 >90% 순도로 정제하였다. 이어서 CD4+ T 세포(멸균 PBS 중 백만 개)를 WT 나이브 마우스로 전달한 다음, 다음날 mBSA를 관절내 주사하였다.
콜라겐-유도된 관절염(CIA)
CIA를, 마우스를 치킨 콜라겐 II/CFA 유화액(콘드렉스 인코포레이티드(Chondrex, Inc)로부터 구매함)으로 면역시킨 다음 백일해 독소를 주사함으로써 상술한 바와 같이 AIA와 유사한 과정으로 유도하였다. 마우스를 모니터하고 관절염에 대해서 채점하였다: 0, 정상; 1, 발목 또는 손목의 경도 종창, 또는 개별적인 손발가락으로 제한된 겉보기 종창; 2, 발 전체의 보통의 종창; 3, 관절강직과 함께 발 전체의 심한 종창. 사지에 대한 점수를 각각의 마우스에 대해서 요약하였다.
조직학적 분석
파라핀-매몰된 조직을 위해서, 척수를 4% PFA 중에 고정시켰다. 무릎 관절 또는 발을 제거하고, 10% 포르말린 중에 고정시키고, 탈수 및 매몰 전에 5% 포름산 중에서 석회질을 제거하였다. 절편(5 ㎛)을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 면역세포 침윤 및 염증을 평가하거나, 사프라닌-O/패스트 그린으로 염색하여 연골 고갈을 평가하였다. 동결된 조직을 위해서, 척수를 OCT(티슈-텍(Tissue-Tek))에 매몰하고 드라이 아이스상에서 급속 동결시켰다. 절편(10 ㎛)을 빙냉 아세톤 중에 고정시키고 1차 항-CD4(바이오레전드(Biolegend)) 및 항-CD11b(이바이오사이언스)로 염색한 다음 형광-접합된 2차 항체(인비트로젠(Invitrogen))와 인큐베이션하였다. AIA 실험을 위해서, 무릎 관절을 10% 포르말린에 5일 동안 고정시킨 다음, 5일 동안 5% 포름산에서 석회질 제거하였다. 절편(10 ㎛)을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 면역세포 침윤 및 염증을 평가하거나, 사프라닌-O/패스트 그린으로 염색하여 연골 파괴를 평가하였다.
세포 분류 및 메이 그륀발트-김자(May Grunwald-Giemsa) 염색
CD45+CD11b+ 상에서 게이트 처리된 단핵세포/대식세포(Ly6ChiLy6G-) 및 호중구(Ly6CloLy6Ghi)를 비장 또는 활액 단세포 현탁액으로부터 FACS 아리아로 분류하였다. 분류된 세포를 유리 슬라이드상에서 세포원심분리시키고 후속으로 표준 과정에 따라 메이 그륀발트 및 김자 염료로 염색하였다.
실시간 PCR
전체 RNA를 제조사의 설명에 따라 RNeasy 키트(퀴아겐(Qiagen))로 세포로부터 추출하였다. 상보성 DNA(cDNA)를 슈퍼스크립트 역 전사효소(인비트로젠)로 합성하였다. 유전자 발현을 SYBR qPCR 키트(KAPA)와 함께 7500 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))에 의해 측정하였다. Actinb, Gapdh 또는 Rn18S를 내부 대조용으로서 사용하였다. 프라이머 서열을 요청시 입수할 수 있다.
ELISA
TNF-α, IL-6, IL-1β, IFN-γ, GM-CSF 및 IL-2 수준을 레디-셋-고(Ready-SET-Go) ELISA 키트(이바이오사이언스)에 의해 분석하고, IL-17 수준을 제조사의 설명에 따라 듀오셋(DuoSet) ELISA 키트(R&D 시스템스)에 의해 측정하였다.
크로마틴 면역침전 분석
Stat5 f/f 또는 Cd4-Cre; Stat5 f/f 마우스로부터 유래된 CD4+ T 세포를 3일 동안 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 활성화시켰다. 세포를 IL-7(20 ng/㎖) 또는 IL-2(25 ng/㎖)로 45분 동안 자극하였다. 10분 동안 1%의 최종 농도로 포름알데히드를 첨가한 다음 글리신으로 급냉시켜 가교결합을 수행하였다. 세포 용해물을 초음파 처리에 의해 단편화하고 단백질 G 다이나비즈(Dynabeads)로 수처리(preclear)하고, 후속으로 4 ℃에서 밤새 항-STAT5 항체(산타 크루즈(Santa Cruz)) 또는 통상적인 토끼 IgG(산타 크루즈)로 침전시켰다. 세척 및 용출 후에, 65 ℃에서 8시간 동안 인큐베이션함으로써 가교결합 역전을 수행하였다. 상기 용출된 DNA를 정제하고 앞서 기재된 바와 같이5 Csf2 프로모터에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 분석하였다.
통계학
통계학적 유의수준을 그래프패드 프리즘 6.01을 사용하여 스튜던츠 t 검정에 의해 측정하였다. p 값<0.05는 유의수준으로 간주되었다. 임상 점수의 p 값들을 다중 비교를 위해서 2원 다중-범위 분산분석(ANOVA)에 의해 측정하였다. 달리 명시되지 않는 한, 데이터를 평균 및 상기 평균의 표준 오차(평균±SEM)로서 제공하였다.
실시예 1. Stat5 조건 녹아웃 마우스는 EAE에 내성이다
STAT5는 IL-17 생성을 억제함으로써 TH17 분화를 조절한다(Laurence et al., 2007; Yang et al., 2011). 그러나, TH17-매개된 병인에서 STAT5의 기능은 충분히 이해되고 있지 않다. 상기 문제를 조사하기 위해서, EAE를 Cd4-Cre; Stat5 f/f (Stat5 -/- ) 마우스(이때 Stat5는 T 세포 구획에서 특이적으로 고갈되었다) 및 한배 새끼 대조군에서, 상기 마우스를 0일 및 7일째에 MOG35-55/CFA로 면역시킴으로써 유도하였다. 임상 점수의 매일 지정에 의해 마비의 발생을 평가하였다. 놀랍게도, Stat5 -/- 마우스에서 임상 질병의 감소된 출현 및 중증도가 관찰되었으며(도 1A 및 1B), 이는 TH17 생성에서 STAT5의 길항작용성 역할에 근거한 예측과 상반된 결과였다. 유사한 결과가, 단일 MOG35-55/CFA 면역을 수행하거나 또는 항원보강제로서 CFA를 LPS로 교체하여 EAE를 유도한 경우 관찰되었다(도 1C 및 1D). Stat5 -/- 마우스에서 감소된 EAE 질병과 일관되게, Stat5 -/- 마우스의 척수 중 면역 세포 침윤의 현저한 감소가 관찰되었다(도 2A). 더욱 또한, CD4+, CD8+, B220+ 및 CD11b+ 세포를 포함한, 다양한 면역 세포 집단의 침윤이 Stat5 -/- 마우스에서 감소되었다(도 2B 내지 D 및 데이터 도시 안됨). 그러나, CNS 중 CD4+ T 세포 가운데 IL-17+ 및 IFN-γ+ 세포의 빈도는 Stat5 +/+ 와 Stat5 -/- 마우스간에 필적하였으며(도 3A), 이는 Stat5 -/- 마우스에서 EAE에 대한 내성이 TH1 및 TH17 세포 발생에 독립적임을 암시한다. 그럼에도 불구하고, Stat5 -/- 마우스의 CNS 중 감소된 CD4+CD25+ Treg 집단이 검출되었으며(도 3B), 이는 Stat5 -/- 마우스에서 EAE에 대한 내성이 변경된 Treg 세포에 기인하지 않는 듯함을 가리킨다.
실시예 2. Stat5 -돌연변이 마우스에서 EAE에 대한 내성은 T H 1 및 T H 17 생성과 독립적으로 항원 특이성 CD4 + T 세포의 본래 결함에 기인한다
Stat5 결실(Cd4-cre; Stat5 f/- ) 마우스는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두의 감소와 함께 말초 림프구감소증을 발생시키는 것으로 보고되었다(Yao et al., 2006). 그러나, 또 다른 연구는 Stat5 결실(Cd4-cre; Stat5 f/f )이 말초 CD4+ T 세포의 비율에 영향을 미치지 않음을 보였다(Burchill et al., 2007). 상기 실험 상황에서, 말초 CD4+ T 세포의 절대 수의 변화는 EAE 발생 도중 Stat5 결실에 의해 검출되지 않았으며(도 4A 및 4B), 이는 Stat5 -/- 마우스에서 EAE의 내성이 말초 림프구감소증에 의해 야기되지 않았음을 암시한다. 더욱 또한, IL-17+ 및 IFN-γ+ 세포의 증가된 빈도가 Stat5 -/- 마우스의 비장 중의 CD4+ T 세포에서 검출되었으며(도 4C), 이는 Stat5 -/- 마우스에서 EAE에 대한 내성이 TH1 및 TH17 생성과 독립적인 듯하다는 생각을 더욱 지지한다. TH1 및 TH17 생성에서 STAT5의 기능을 확인하기 위해서, 시험관내 분화를 TH1- 및 TH17- 양극화 조건하에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킴으로써 수행하였다. 선행 보고서들과 일치하게, STAT5는 TH17 분화에 대한 IL-2의 억제 효과를 매개하였다(데이터 도시 안 됨). 흥미롭게도, IL-7(또한 STAT5를 통해 신호전달한다)이 TH17 분화에 입증할만한 효과를 가짐은 관찰되지 않았다(데이터 도시 안 됨). 그럼에도 불구하고, TH1-양극화 조건하에서 IFN-γ+ 세포의 약간의 감소가, STAT5가 검출되었을 때 관찰되었다(데이터 도시 안 됨).
Stat5 -/- 마우스에서 EAE의 내성이 CD4+ T 세포에 의해 매개되는 지의 여부를 확인하기 위해서, Rag2 -/- 마우스를 Stat5 +/+ 또는 Stat5 -/- CD4+ T 세포로 재조성한 다음 EAE 유도하였다. 우리는 Stat5 -/- CD4+ T 세포를 수용한 Rag2 -/ - 마우스가 야생형 세포를 수용한 마우스에 비해 질병에 대해 내성임을 발견하였으며(데이터 도시 안 됨), 이는 Stat5 -/- CD4+ T 세포가 EAE 발생을 촉진하는 그의 능력이 손상되었음을 입증한다.
이어서, 뇌염유발성의 결여가 Stat5 -/- CD4+ T 세포의 CNS로의 이동의 결함에 의해 야기되는지의 여부를 조사하였다. 케모킨 수용체 CCR6이 맥락총을 통한 TH17 세포의 CNS내로의 진입에 필수적임이 입증되었다(Reboldi et al., 2009). 따라서, Stat5 -/- 및 Stat5 +/+ CD4+ T 세포 모두 중의 CCR6 발현을 조사하였다. Stat5 +/+ 대조용과 비교된 Stat5 -/- 마우스의 비장에서 증가된 CD4+CCR6+ 세포(도 5A)가 관찰되었다. CXCR3 및 CD69 발현을 또한 조사하였으며, STAT5의 부재하에서 CD4+ T 세포 중 상기 두 분자 모두의 증가된 발현이 나타났다(도 5A). 상기 결과는 Stat5 -/- CD4+ T 세포가 CNS를 침윤할 수 있음을 가리킨다. 더욱 또한, EAE 유도 중 Stat5 -/- 및 Stat5 +/+ 마우스의 CNS 중에 존재하는 CD4+ T 세포의 필적하는 수가 관찰되었다(7일 및 9일째에)(도 5B). 그러나, Stat5 -/- 마우스의 CNS 중의 CD4+ T 세포는 질병 개시 중에 대단히 떨어졌다(21일째)(도 5C 및 5D). 종합하면, 이들 결과는 Stat5 -/- CD4+ T 세포가 CNS를 침윤할 수 있지만 EAE에서 CNS 중에 유효한 염증을 유도하지 못함을 입증한다.
EAE에 대한 Stat5-결핍 마우스의 내성이 CNS 중의 자가반응성 CD4+ T의 생존의 임의의 잠재적인 결함에 의해 야기될 가능성을 추가로 배제하기 위해서, 야생형 세포보다 증가된 수의 Stat5 -/- CD4+ T 세포들을 각각 Rag2 -/ - 마우스로 전달하여 EAE 발생 중에 필적하는 수의 자가반응성 CD4+ T 세포가 CNS 중에 확실히 존재하게 하였다. 도 6A 및 6B에 나타낸 바와 같이, 상기 두 그룹의 마우스간에 CNS 중의 CD4+ T 세포의 수가 유사함에도 불구하고, Stat5-결핍 CD4+ T 세포를 수용한 마우스에서 감소된 질병 중증도가 관찰되었다. 추가로, EAE 질병의 피크에서 야생형 마우스로서 CNS 중에 유사한 수의 CD4+ T 세포를 함유하는 일정한 수의 Stat5-결핍 마우스가 관찰되었으나, 이들은 상기 야생형 마우스에 비해 EAE에 비교적 내성이었으며(도 6C), 이는 추가로 Stat5-결핍 마우스에서 EAE 질병에 대한 내성이 상기 CNS 중의 손상된 CD4+ T 세포 생존에 기인하는 듯하지는 않음을 암시한다.
이러한 관찰과 Stat5 -/- CD4+ T 세포의 본래 손상 간의 인과관계를 더욱 진전시키기 위해서, MOG35-55-특이성 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- CD4+ T 세포를 추가의 면역 없이 별도로 Rag2 -/- 마우스로 전달하여 이들 세포가 EAE 발생을 매개할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 도 7A 및 7B에 나타낸 바와 같이, Stat5 +/+ CD4+ T 세포를 수용한 마우스는 전달 후 1주일째에 EAE 질병을 자발적으로 발생시켰다. 대조적으로, Stat5 -/- CD4+ T 세포를 수용한 마우스는 현저하게 감소된 질병 중증도 및 발병률을 가졌다. Rag2 -/- 마우스의 CNS에서 CD4+ T 세포 중 IL-17+ 및 IFN-γ+ 세포의 빈도는 2개 그룹간에 필적하였으며(도 7C), 이는 Stat5 -/- CD4+ T 세포의 뇌염유발성의 본래 결함이 TH1 및 TH17과 독립적임을 추가로 암시한다. Stat5 -/- 마우스에서 관찰된 EAE에 대한 내성에서 CD8+ T 세포의 가능한 역할을 배제하기 위해서, Rag2 -/ - 마우스를, 동일한 수의 Stat5 +/+ CD8+ T 세포와 함께 MOG35-55-특이성 Stat5 +/+ 또는 Stat5 -/- CD4+ T 세포로 재조성하였다. Stat5 +/+ CD8+ T 세포와 함께 Stat5 -/- CD4+의 전달은 여전히 EAE를 유도하지 못했다(데이터 도시 안 됨). 종합하면, 이들 데이터는 Stat5 -/- CD4+ T 세포가 뇌염유발성에 본래 결함을 가짐을 입증한다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고문헌들의 관련된 교시는 내용 전체가 참고로 인용된다.
실시예 3. Stat5 -/- CD4 + T 세포에서 GM-CSF의 감소된 발현
GM-CSF 생성이 Stat5 결실에 의해 손상을 받는지의 여부를 시험하기 위해서, 그의 발현을 MOG35-55-특이성 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- CD4+ T 세포에서 조사하였다. MOG35-55/CFA-면역된 Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- 마우스로부터 유래된 비장세포를 24시간 동안 다양한 농도의 MOG35-55로 항원접종하여 GM-CSF의 분비를 조사하였다. GM-CSF 생성이 Stat5 +/+ 세포에서 MOG35-55 용량-의존적인 방식으로 증가함이 관찰되었다(도 8A). 대조적으로, GM-CSF 생성은 모든 조건에서 Stat5 -/- 세포에서 심하게 감소되었다. 이를 추가로 확인하기 위해서, 마우스로부터 유래된 비장세포를 GM-CSF 및 IL-17 세포내 염색을 위해 골지플러그의 존재하에서 PMA/이오노마이신으로 EAE의 발생 중에 자극하였다. IL-17 발현이 Stat5 -/- 세포에서 증대되었지만, STAT5의 부재하에 CD4+CD44hi 세포 중에서 GM-CSF+IL-17- 및 GM-CSF+IL-17+ 세포의 현저하게 감소된 비율이 관찰되었다(도 8B). 더욱이, MOG35-55-특이성 GM-CSF+ T 세포의 빈도가 또한 Stat5 -/- 마우스의 비장에서 현저하게 감소되었다(도 8C). 종합하면, 이들 결과는 STAT5가 자가반응성 CD4+ T 세포에서 GM-CSF 발현에 필요함을 가리킨다. 그러나, TH17 분화에서 중요한 전사 인자인 STAT3는 GM-CSF 발현에 필요하였다(도 8D).
이어서, EAE 발생 중 CNS 중의 GM-CSF 유도를 조사하였다. CNS-침윤성 CD4+ T 세포에 의한 IL-17 및 IFN-γ 생성은 Stat5 결핍에 의해 손상받지 않았지만, 대조용 마우스에 비해 Stat5 -/- 마우스의 CNS 중의 CD4+GM-CSF+ 세포의 감소된 빈도가 검출되었다(도 9A). 추가의 분석은 CD4+IL-17+ 세포 및 CD4+IFN-γ+ 세포 중 감소된 GM-CSF+ 비율을 나타내었다(도 9A). 유사하게, MOG35-55-특이성 Stat5 -/- CD4+ T 세포가 전달된 Rag2 -/ - 마우스는 또한 대조용 마우스에 비해 CNS에서 CD4+GM-CSF+ T 세포의 감소된 빈도를 나타내었다(도 9B). Stat5 -/- 마우스의 CNS에서 GM-CSF mRNA 발현은, 필적하는 CD4+ T 세포 침윤이 Stat5 -/- 및 Stat5 +/+ 마우스에서 검출되었을 때(도 5C 및 5D), EAE 유도 후 8일째에 Stat5 +/+ 마우스의 경우보다 현저하게 더 낮았다(도 9C). 한편, IL-17 및 IFN-γ 발현의 현저한 차이가 Stat5 -/- 및 Stat5 +/+ 마우스 사이에서 검출되었다(도 9C). 말기 단계에서 Stat5 -/- 마우스의 CNS 중 손상된 사이토킨 유도(IL-17 및 IFN-γ)는 Stat5 -/- CD4+ T가 신경염증을 지속시킬 수 없음에 의해 설명될 수 있었다(도 5C 및 5D). 흥미롭게도, 상기 CNS 중 GM-CSF 유도는 IL-23 유도에 선행하였으며(도 9C), 이는 IL-23이 EAE의 유도 단계에서 GM-CSF 발현에 필요하지 않을 수도 있음을 암시한다. 요약하면, 상기 결과는 자가반응성 CD4+ T 세포에서 GM-CSF 발현이 STAT5에 의해 조절되며 STAT5의 부재하에서 상기 손상된 GM-CSF 생성은 EAE에 대한 상기 마우스의 내성을 야기하였음을 암시한다.
실시예 4. IL-7-STAT5 신호전달은 자가반응성 CD4 + T 세포에서 GM-CSF 발현을 유도하고 신경염증에 기여한다
이어서, STAT5가 GM-CSF 발현을 조절하는 기전을 조사하였다. 본 명세가 가리키는 바와 같이, IL-23도 IL-1β도 효능 있는 STAT5 자극제가 아닌 것으로 생각되었다(도 10A). 더욱 또한, IL-1R1 발현은 변하지 않은 반면, IL-23Rα 발현은 Stat5 -/- CD4+ T 세포에서 증가하였다(도 10B). 이들 데이터는 STAT5의 GM-CSF 발현을 유도하는 능력이 IL-23 및 IL-1β 신호전달과 독립적인 듯함을 암시한다. 대조적으로, IL-2 및 IL-7은 모두 티로신 인산화를 유도함으로써 STAT5를 효능 있게 활성화시켰다(도 10A). 따라서, 자가반응성 T 세포에서 GM-CSF 유도에 대한 이들 두 사이토킨의 영향을 추가로 조사하였다. MOG35-55-면역된 야생형 마우스로부터 유래된 비장세포를 MOG35-55 단독 또는 +IL2로 항원접종하였다. CD4+ T 세포에 의한 GM-CSF 및 IL-17 생성을 세포내 사이토킨 염색에 의해 분석하였다. 도 10C에 나타낸 바와 같이, IL-2는 GM-CSF+ T 세포의 빈도에 적당한 효과를 나타내었다. 대조적으로, IL-7은 IL-17- 및 IL-17+ CD4+CD44hi T 세포 모두에서 GM-CSF 발현을 현저하게 촉진하였다(도 11A). 더욱 또한, IL-7은, Stat5 결실이 세포내 사이토킨 염색 및 ELISA에 의해 평가되는 바와 같이 GM-CSF 발현에 대한 그의 영향을 파기하였기 때문에, STAT5-의존적인 방식으로 상기 기능을 수행하였다(도 11A, 하부 패널, 및 도 11B).
IL-7Rα는 CD62LhiCD44lo T 세포 및 CD62LloCD44hi T 세포 모두에서 발현되며, 이는 IL-7이 CD4+ T 세포에 직접 작용하여 GM-CSF 발현을 조절할 수 있음을 암시한다. 따라서, CD62LhiCD44lo 및 CD62LloCD44hi T 세포는 EAE 발생 중에 Stat5 -/- 마우스 및 한배 새끼 대조군으로부터 분류되었고, 이어서 IL-7의 존재 또는 부재하에서 세포를 활성화하였다. 도 11C에 나타낸 바와 같이, CD62LloCD44hi T 세포는 GM-CSF를 효능 있게 발현한 반면, CD62LhiCD44lo T 세포는 30배 더 낮은 GM-CSF 양을 발현하였다. STAT5 결실은 CD62LloCD44hi T 세포에서 감소된 기본 GM-CSF 생성을 생성시켰다. 예상된 바와 같이, IL-7은 CD4+ T 세포의 두 부분집합 모두에서 STAT5-의존적인 방식으로 GM-CSF 발현을 촉진하였다(도 11C).
EAE 발생에 대한 자가반응성 CD4+ T 세포 중의 IL-7-유도된 GM-CSF 발현의 기여를 조사하기 위해서, 마우스를 EAE 발생 중에 IL-7Rα-특이성 항체(클론 SB/14)로 처리하였다. 상기 처리는 질병 중증도의 현저한 감소를 생성시켰으며, 이는 감소된 CNS 염증을 동반하였다(도 12A 및 12B). 선행 보고서(Lee et al., 2012)와 일치되게, 상기 중화 항체는 T 세포 고갈 활성을 갖지 않았다(도 12C). 현저하게, IL-7 신호전달의 차단은 CNS-침윤성 CD4+ T 세포에서 감소된 GM-CSF 발현을 생성시켰다(도 12D 내지 12F). 요약하면, 본 발견은 IL-7이 자가반응성 CD4+ T 세포에서 STAT5-의존적인 GM-CSF 발현을 유도하고, 이는 신경염증의 발생에 기여함을 가리킨다.
실시예 5. GM-CSF-발현 T H 세포는 T H 17 및 T H 1과 다르다
TH17 및 TH1은 모두 GM-CSF를 생성시킬 수 있기 때문에, IL-7-자극된 표현형이 이들 부분집합 중 어느 하나와 관련있는 지를 측정하였다. GM-CSF-발현 CD4+ 세포의 특징을 추가로 이해하기 위해서, 나이브 CD4+ T 세포를 TH17- 또는 TH1-양극화 조건하에서 플레이트-결합된 항-CD3 및 가용성 항-CD28로 자극하였다. 항-CD3은 항-CD28과 함께 GM-CSF의 발현을 유도하는 것으로 관찰되었다(도 14A). 그러나, 예상된 바와 같이 TH1 분화 조건은 IFN-γ 발현을 촉진하였고 TH17 조건은 IL-17 발현을 촉진한 반면, TH17 및 TH1 분화 조건은 모두 GM-CSF의 생성을 크게 억제하였다(도 13A 및 13B). 환언하면, IL-12 및 IFN-γ 중화는 선행 보고서(Codarri et al., 2011)와 일치하게, GM-CSF-발현 세포 발생을 촉진하였다(도 13A). IL-23 및 IL-1β는 나이브 CD4+ T 세포로부터 GM-CSF-발현 세포 분화를 증가시키지 않았으며(도 13A), 이는 나이브 CD4+ T 세포가 그의 수용체를 발현하지 않았다는 발견과 일치하였다. TGF-β는 GM-CSF 발현을 억제한다(El-Behi et al., 2011). TH17 분화에 필수적인 사이토킨인 IL-6은 GM-CSF 발현에 현저한 억제 효과를 가졌으며(도 14B), 이는 STAT3이 음의 조절제일 수 있음을 가리킨다. 이를 다루기 위해서, 나이브 CD4+ T 세포를 세포 분화를 위해 Stat3 -/- 마우스로부터 정제하였다. 현저하게, STAT3의 부재하에서 TH17 조건하에서 양극화된 세포는 GM-CSF를 발현하였다(도 14C). 흥미롭게도, 외인성 IL-6의 부재하에서 조차, STAT3은 여전히 GM-CSF-발현 세포 분화에 적당한 억제 효과를 가졌다(도 14C). 또한, RORγt 및 T-bet는 CD4+ T 세포에서 GM-CSF 발현에 불필요한 것으로 보고되었다(El-Behi et al., 2011). 따라서, 본 데이터는 GM-CSF-발현 CD4+ T 세포가 TH17 및 TH1과 다른 계통을 통해 발생하는 모델을 지지한다.
실시예 6. IL-7-STAT5는 GM-CSF-발현 T H 세포 분화를 프로그램화한다
본 명세서에 개시된 발견(예를 들어 생체내에서 Stat5 -/- CD4+ T 세포에서 감소된 GM-CSF 발현, 나이브 CD4+ T 세포에서 GM-CSF 발현의 IL-7/STAT5-매개된 유도, 및 GM-CSF-발현 TH 세포 대 TH1 및 TH17 세포의 특유의 특징들을 포함하여)은 IL-7-STAT5 신호전달에 의해 조절되는 특유의 TH 세포를 가리킨다. 상기 발견은 상이한 농도의 IL-7의 존재하에서 항-CD3 및 항-CD28로 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킴으로써 시험관내에서 GM-CSF-발현 TH 세포 분화를 조사함으로써 추가로 조사되었다. 도 15A 및 15B에 나타낸 바와 같이, IL-7은 GM-CSF-발현 세포의 생성 및 GM-CSF 분비를 강하게 촉진하였다. 더욱이, IL-7에 의한 GM-CSF-발현 TH의 생성은 STAT5에 의해 매개되었다. STAT5 없이, IL-7은 GM-CSF-발현 세포의 생성을 촉진할 수 없었다(도 15C 및 15D). 추가의 조사는 IL-7-유도된 STAT5 활성화가 Csf2 유전자의 프로모터 영역에 직접 결합함을 보였다(도 15E 및 15F).
작은 비율의 IFN-γ-발현 세포가 GM-CSF-발현 TH 분화 중에 생성되었다(도 15A). 따라서, GM-CSF-발현 세포 생성에 대한 IFN-γ 차단의 영향을 시험하였으며, 이는 IL-7 및 IFN-γ 중화의 조합이 GM-CSF+ 세포의 최고 빈도를 유도하고, 이때 소수의 IL-17+ 또는 IFN-γ+ 세포가 검출됨을 보였다(도 16A). 더욱이, GM-CSF-발현 TH 중의 전사 인자를 한정하는 부분집합의 발현을 조사하였으며 GM-CSF-발현 TH 중의 RORγt 또는 T-bet의 발현이 각각 TH17 또는 TH1 세포에서의 경우보다 현저하게 더 낮은 것으로 관찰되었고(도 16B), 이는 상기 GM-CSF-발현 TH 세포가 TH1 및 TH17 세포와 다름을 입증한다. 종합하면, 이들 데이터는 IL-7-STAT5 신호전달이 TH-GM이라 칭하는, 신규의 GM-CSF-발현 헬퍼 T 세포 부분집합의 분화를 지시함을 암시한다.
이어서, IL-2 신호전달이 나이브 CD4+ T 세포로부터의 TH-GM 분화에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 측정하였다. IL-2 또는 IL-2에 대한 항체의 첨가는 GM-CSF+ 세포의 빈도에 단지 적당한 영향을 미쳤으며(도 14D), 이는 TH-GM 분화에 대한 IL-2의 최소의 영향을 가리킨다. IL-7Rα와 달리, IL-2 고-친화성 수용체 IL-2Rα는 나이브 CD4+ T 세포에서 발현되지 않았고, 그의 발현은 TCR 활성화에 의해 점차적으로 유도되었다(도 17A 내지 17C). 따라서, IL-2의 최소 영향은 적어도 부분적으로 IL-2 자극에 대한 나이브 CD4+ T 세포의 무응답성에 기인한다. 상기 견해에 대한 지지로, IL-7(IL-2는 아닌)은 나이브 CD4+ T 세포에서 STAT5 활성화를 유도하였으며 GM-CSF mRNA 발현을 상향조절하였다(도 17D 및 17E). 이러한 생각을 추가로 입증하기 위해서, 활성화된 CD4+ T 세포를 IL-2 또는 IL-7로 자극하였으며, 이는 상기 두 사이토킨이 모두 STAT5 활성화, Csf2 프로모터 결합 및 GM-CSF mRNA 상향조절을 유도함을 보였다(도 18A 내지 18C). 현저하게, IL-2는 IL-7에 비해 연장된 STAT5 활성화를 유도하였다(도 18A).
실시예 7. T H -GM의 특유의 유전자 발현 프로파일
TH-GM을 공지된 T 세포 부분집합들(예를 들어 TH1 및 TH17)과 다른 것으로서 입증하기 위해서, 전체 전사체 분석을 미세배열에 의해 수행하여 공지된 T 세포 부분집합, 특히 TH17 세포와 비교된 그의 특이성을 확인하였다. 나이브 CD4+ T 세포는 TH1, TH17 및 TH-GM으로 분화되었다. 미세배열 분석을 수행하여 그들의 유전자 발현 프로파일을 조사하였다. 전체 전사체 군집화는 TH-GM 세포가 TH1 또는 TH17 세포와 다른 신규의 부분집합을 나타냄을 가리킨다. T 세포 계통-특이성 유전자 발현을 표 1에 나타낸다. TH1 세포에서 우선적으로 발현되는 202개 유전자의 목록이, 나이브, TH17 또는 TH-GM 세포와 비교하여 식별되었으며(변화 배수 > 1.7), 이 중에서 IFN-γ 및 T-bet가 상기 목록의 상위에 있다(표 1). 유사하게, TH17-특징 유전자, 예를 들어 IL-17, IL-17F, RORγt 및 RORα가, TH17 세포에 특이적인 411개 유전자를 포함하는 목록에서 식별되었다(표 1). 상기 TH-GM 세포-특이성 유전자 목록("TH-GM"에서 우선적으로 상향조절되는 유전자" - TH-GM 특징 유전자)은 상기 목록(표 1) 중의 상위 유전자로서 GM-CSF를 암호화하는 유전자를 포함한 210개 유전자를 함유한다. 다른 부분집합들에 비해 TH-GM 부분집합에서 높은 수준으로 선택적으로 발현된 일련의 표면 분자들, 및 TH-GM 부분집합에서 낮은 수준으로 선택적으로 발현된 또 다른 일련의 표면 분자들이 식별되었다(도 19 및 표 1). 이들 분자(또한 TH-GM 특징 유전자)를 표면 마커들에 의해 추가의 특성화에 사용하여 T 세포의 TH-GM 부분집합을 식별하였다. 사이토킨 및 전사 인자, 특히 IL-3을 암호화하는 유전자를 포함하여 다수의 다른 관심 유전자들이 또한 식별되었다. 다양한 헬퍼 T 세포가 시험관내에서 분화되었으며 TH-GM 세포가 TH1 및 TH17 세포에 비해 효능 있는 IL-3 생산자임을 확인하였다(도 20A, 20C 및 20D). 또한, EBI-3, PENL 및 RANKL을 포함하여, 다수의 다른 사이토킨들이 TH-GM 세포에서 우선적으로 발현되는 것으로 밝혀졌으며(도 20B), 이는 TH-GM 세포의 다양한 생물학적 기능들을 가리킨다.
실시예 8. T H -GM 세포는 1차 병원성 집단이다
GM-CSF-발현 TH 부분집합(TH-GM)이 1차 뇌염유발성 효과기 세포라는 가설을 시험하기 위해서, MOG35-55-특이성 CD4+ T 세포의 상이한 부분집합들의 양자 전이을 EAE 유도를 위해 Rag2 -/- 마우스내로 수행하였다. 도 21에 나타낸 바와 같이, GM-CSF-발현 TH 세포는 TH17 및 TH1 부분집합에 비해 EAE를 우선적으로 유도할 수 있었다.
실시예 9. 화학적 억제제에 의한 STAT5 활성의 억제는 T H -GM에 의한 GM-CSF 발현을 약화시키고 EAE를 개선시킨다
화학적 억제제에 의해 STAT5 활성화를 파괴하는 효과를 조사하여 자가면역 신경염증의 가능한 치료 방법들을 탐구하였다. SH2 도메인 중의 핵심 티로신 잔기상에서의 인산화는 STAT5 활성화 및 기능에 중요하다. 상업적인 STAT5 억제제(CAS 285986-31-4, 칼바이오켐)는 STAT5의 DNA 결합 및 티로신 인산화를 선택적으로 붕괴시키는 것으로 보고되었다(Muller et al., 2008). 먼저, CD4+ T 세포에서 IL-7 자극시 STAT5 활성화에 대한 상기 억제제의 억제 효과를 시험하였다. 50 μM의 농도에서, 상기 억제제는 약 50%의 억제 효과를 가졌으며, 이는 농도의 증가에 따라 추가로 증대되었다(도 22A). STAT5 억제제는 낮은 친화성을 가졌으며 따라서 STAT5 활성화를 완전히 차단시키는데 높은 농도를 요구한 반면, JAK3 억제제는 심지어 낮은 농도에서조차 효능 있는 억제 효과를 나타내었다(도 22B). 이어서 상기 STAT5 억제제의 특이성을 STAT3 및 STAT1의 활성화에 대한 그의 영향을 조사함으로써 시험하였다. 도 22C 및 22D에 나타낸 바와 같이, 상기 STAT5 억제제는 비교적 더 낮은 농도(50 또는 100 μM)에서 STAT3 및 STAT1 모두의 활성화에 대해 최소의 억제 효과를 나타내었다.
TH-GM 분화에 대한 STAT5 억제의 영향을 조사하였다. 나타낸 바와 같이, STAT5 억제제는 TH-GM 분화를 투여량-의존적인 방식으로 억제하였다(도 22E). STAT5 억제제 처리시 감소된 TH1 분화가 관찰되었으나(데이터 도시 안 됨), TH17 분화는 STAT5 억제제에 의해 억제되지 않았다(데이터 도시 안 됨).
EAE 질병에서 STAT5 활성화를 표적화하는 치료 효과를 탐구하기 위해서, 상업적인 STAT5 억제제를 야생형 마우스에게 질병 개시 후 이틀마다 복강내로 투여하였다. 마비의 발생을, 임상 점수의 매일 지정에 의해 평가하였다. STAT5 억제는, CNS 중의 감소된 면역 세포 침윤과 관련하여, EAE 중증도를 개선시켰다(도 23A 및 23B). 대조적으로, JAK3 억제제는 STAT5 활성화를 효능 있게 차단할 수 있지만(도 22B), 상기는 EAE에 유해 효과를 나타내었다(도 23B). 중요하게, STAT5 억제제는 CNS-침윤 CD4+ T 세포에서 GM-CSF 생성을 감소시켰다(도 23C 및 23D). 상기 연구는 화학적 억제제에 의한 STAT5의 표적화가 MS에서 치료학적 중재에 유용함을 가리킨다.
실시예 10. GM-CSF-생성 T H 세포는 인간 RA와 관련된다
RA 환자의 말초 혈액 중 GM-CSF 및 TNF-α의 혈장 농도를 성별/연령-합치된 건강한 대조군(HC)과 비교하여 조사하였으며, 상기 두 사이토킨이 모두 RA에서 상승하였음을 발견하였다(도 24A). IFN-γ, IL-17- 또는 GM-CSF-생성 TH 세포의 생체외 빈도를 RA 및 HC에서 정량분석하였다. IFN-γ-, 및/또는 GM-CSF-생성 TH 세포의 높은 빈도가 모든 샘플에서 검출되었으나, IL-17-생성 TH 세포는 낮은 빈도(<1%)로 관찰되었다(도 24B). GM-CSF-단일-생성(GM-CSF+IFN-γ-) TH 세포는 RA 및 HC 모두에서 상당한 집단을 나타내었다(도 24B). 보다 중요하게, RA의 말초 혈액 중 상기 집단의 빈도는 HC의 경우보다 현저하게 더 높았다(도 24C). 대조적으로, GM-CSF/IFN-γ-이중-생성이나 IFN-γ-단일-생성 TH 세포 중 어느 것도 RA와 HC 간의 그들의 빈도에 어떠한 유의수준의 차이도 나타내지 않았다(도 24C). 따라서, 말초 혈액 중 GM-CSF-단일-생성 TH 세포의 빈도는 RA에서 선택적으로 상승하며, 이는 TH-세포-분비된 GM-CSF와 RA와의 기능적 관련성을 암시한다. 더욱이, 혈장 GM-CSF 농도와 GM-CSF-단일-생성 TH 세포 빈도간의 유의수준의 상관성이 RA에서 관찰되었다(도 24D).
GM-CSF-생성 TH 세포와 RA와의 관련성을 추가로 평가하기 위해서, 단핵 세포를 RA 환자의 활액으로부터 단리하고 상기 세포의 풍부성을 분석하였다. GM-CSF-생성 TH 세포 빈도의 현저한 상승이 말초 혈액에 비해 활액에서 관찰되었으나, 이들 세포 중 대부분은 IFN-γ를 공-발현하였다(도 24E). 유사하게, TH1 및 TH17 모두의 빈도가 활액에서 또한 증가하였으며, 이때 TH17은 TH1에 비해 소수 집단으로 남아있었다(도 24E).
실시예 11. GM-CSF는 TNF-α-독립적인 방식으로 실험 관절염을 매개한다
HC에 비해 RA의 혈장 중 GM-CSF 및 TNF-α의 상승은 상기 두 사이토킨의 표적화에 의한 치료학적 접근법을 제시할 수 있다. GM-CSF 및 TNF-α 모두를 차단하는 효능을 항원-유도된 관절염(AIA) 모델(T-세포 구동된 RA 모델이며 C57BL/6 균주에서 빠르고 동조화된 질병 개시와 함께 쉽게 유도가능하며, 이는 RA 병인의 탐구를 용이하게 한다)에서 관절염 마우스를 치료하는데 시험하였다. GM-CSF 또는 TNF-α 중 어느 하나의 개별적인 차단은 AIA 발생을 약화시켰다(도 25A). 흥미롭게, GM-CSF- 및 TNF-α-특이성 중화 항체의 조합은 개별적인 치료보다 관절염 발병의 억제에 보다 양호한 효능을 나타내었다(도 25A). 즉, GM-CSF 표적화는 TNF-α 활성과 독립적인 방식으로 관절염 치료에 이로운 효능을 가질 수 있다. 관절염 발병의 매개에서 GM-CSF 및 TNF-α의 구분 가능한 효과를 추가로 연구하기 위해서, 조건적 Stat5 결실을 갖는 마우스 균주(Cd4-Cre; Stat5 f/f 또는 간략히 Stat5 -/- )를 AIA 유도를 위해 T 세포에 사용하였다. 이러한 조건적 Stat5-녹아웃 마우스는, IFN-γ뿐만 아니라 혈청 TNF-α의 현저하게 증가된 수준을 가졌음에도 불구하고(도 25E), 보다 순한 관절 셀링, 보다 적은 활액 중 면역세포 침윤, 및 감소된 관절 파괴에 의해 예시되는 바와 같이(도 25B 내지 25D), 관절염 발병을 저지하였다. 대조적으로, GM-CSF의 혈청 수준은 녹아웃 마우스에서 현저하게 감소하였으며(도 25E), 이는 하기에 기재되는 결과에 의해 추가로 지지되는 바와 같이 관절염 발병에 대한 내성의 인과적 인자인 듯하였다. 일관된 결과가 또한 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 모델에서 관찰되었다(도 26A 내지 26D). 종합하면, 이들 발견은 GM-CSF가 RA에서 중요한 병원성 매개인자이며 또한 항-TNFα 약물 무응답성인 RA 환자의 치료를 위한 항-GM-CSF 약물의 개발 가망을 가리키며, 이는 GM-CSF-생성 TH 세포를 RA 진단용의 신규 생물마커로 만든다.
실시예 12. 자가반응성 T H 세포에 의한 STAT5-조절된 GM-CSF 분비가 활액 염증을 매개한다
GM-CSF와 RA와의 관련성을 토대로, GM-CSF의 세포 생산자 및 관절염 마우스에서 GM-CSF 발현에 근원하는 조절 기전을 조사하였다. 비장세포를 야생형 AIA 마우스로부터 수집하였으며 세포를 3개의 분획으로 분리하였고: 비장세포, CD4+ T 세포 고갈된 비장세포 및 CD4+ T 세포; 각각의 분획을 다양한 조건하에서 동일한 세포수로 자극하였다. 비장세포는 자극 없이, 낮지만 검출 가능한 수준의 GM-CSF를 생성시켰으며, 이는 PMA/이오노마이신 또는 mBSA 항원 자극에 의해 현저하게 증가되었다(도 28A). 모든 조건하에서, CD4+ T 세포가 고갈된 비장세포는 GM-CSF 생성을 거의 완전히 파기하였다(도 28A). 대조적으로 CD4+ T 세포는 모든 조건하에서 비장세포에 비해 대단히 상승된 GM-CSF를 생성시켰다(도 28A). 이러한 결과는 CD4+ T 세포가 적어도 관절염 마우스의 비장에서 GM-CSF의 우세한 생산자임을 지지하며, 이는 어쨌든 RA에서 혈장 GM-CSF 농도와 GM-CSF-단일-생성 TH 세포 빈도와의 관찰된 상관성과 일치한다(도 24D). 따라서, TH-세포-분비된 GM-CSF의 기능상 유의수준을 관절염 발병에서 조사하였다. T-세포-특이성 Csf2-녹아웃 마우스를 입수할 수 없고 STAT5가 TH 세포에서 GM-CSF 발현의 핵심 조절 인자임을 고려해 볼 때, 상술한 바와 같이 감소된 GM-CSF 수준 및 관절염 발병에 대한 내성을 나타내는 조건적 Stat5-녹아웃 마우스를 사용하였다.
선행 연구(Burchill et al., 2007)와 일관되게, CD4+ T 세포의 유사한 빈도가, AIA 유도후 7일째에 야생형 마우스에 비해 STAT5-결핍 마우스의 염증이 있는 활액 조직뿐만 아니라 말초 림프 조직에서 관찰되었으며(도 27A 내지 27D), 이는 STAT5의 상실이 말초에서 CD4+ T-세포 생성 및 활액 조직 중 침윤을 손상시키지 않는 듯함을 암시한다. CD4+ T 세포의 관절염유발 가능성에 대한 STAT5의 요구를 측정하기 위해서, Stat5 +/+ 및 Stat5 -/- AIA 마우스로부터 유래된, 생체외-확대된 항원-반응성 CD4+ T 세포를 별도로 야생형 나이브 마우스로 옮긴 다음, mBSA를 관절내 주사하였다. Stat5 +/+ CD4+ T 세포를 수용한 마우스는 AIA 유도후 7일째에 활액 조직에서 풍부한 면역세포 침윤을 나타내었다(도 27E). 대조적으로, Stat5 -/- CD4+ T 세포를 수용한 마우스는 활액 침윤물이 현저하게 감소하였다(도 27E). 따라서, STAT5-결핍 CD4+ T 세포는 관절염유발 가능성에 결함이 있다.
여러 줄의 증거가 RA에서 T 세포의 중심 역할을 지지한다. 그러나, T 세포의 발병 기전은 여전히 불충분하게 이해된 채로 있다. TH1이 인간 RA에서 활액 침윤성 CD4+ T 세포 가운데 우세한 집단이긴 하지만((Berner et al., 2000; Yamada et al., 2008), 결함성 IFN-γ 신호전달은 관절염의 동물 모델에서 증가된 질병 민감성을 생성시킨다(Guedez et al., 2001; Irmler et al., 2007; Manoury-Schwartz et al., 1997; Vermeire et al., 1997). 대조적으로, TH17 세포는 관절염의 동물 모델에서 중요한 것으로 입증되었으나(Pernis, 2009), TH17 세포의 우세는 인간 RA의 말초 혈액 및 활액 구획 모두에서 제한된다(Yamada et al., 2008 및 도 1B 및 1E). 본 명세서에서 입증된 바와 같이, STAT5-조절된 GM-CSF-생성 TH 세포는 관절염 병인을 강화시킨다.
GM-CSF 생성에서 STAT5의 조절 역학을 확인하기 위해서, AIA 마우스로부터 유래된 비장세포를 생체외에서 PMA/이오노마이신 + 골지플러그로 자극한 다음, 세포내 사이토킨 염색 및 유식 세포측정을 수행하였다. 예상한 대로, CD4+CD44hi 집단 중 GM-CSF-단일-생성 세포의 빈도는 Stat5 -/- 마우스에서 현저하게 감소하였다(도 28 34B). 현저하게, 2개 그룹간에 IL-17-단일-생성(TH17) 또는 IFN-γ-단일-생성(TH1) 세포의 빈도에서 유의수준의 차이는 관찰되지 않았다. mBSA 재자극과 세포내 사이토킨 염색의 병행에 의한 추가의 연구는 mBSA-특이성 GM-CSF-생성 효과기 T 세포의 빈도가 대조용의 경우보다 Stat5 -/- 마우스의 비장에서 훨씬 더 낮음을 보였다(도 29A). 또한, AIA 마우스-유래된 비장세포 및 서혜부 림프절(LN)을 생체외에서 mBSA로 재자극하여 배양 상등액 중의 사이토킨 농도를 측정하였으며 STAT5의 결실에 의한 GM-CSF의 현저한 감소, 그러나 이들 두 그룹간에 IL-17 및 IFN-γ 모두의 필적하는 수준을 발견하였다(도 29B 및 29C). 종합하면, 이들 결과는 STAT5의 상실이 실험 관절염에서 GM-CSF-생성 효과기 Th 세포를 특이적으로 억제할 수 있지만 TH17 또는 TH1 세포는 억제할 수 없음을 가리킨다.
활액 염증에서 GM-CSF-생성 TH 세포 및 STAT5에 의한 그들의 조절의 관련성을 조사하기 위해서, 활액 조직을 AIA 마우스로부터 절제하고 TH 세포에 의한 사이토킨 생성을 조사하였다. GM-CSF의 다수의 세포 공급원에도 불구하고(Cornish et al., 2009), CD4+ TH 세포는 AIA 마우스의 활액 조직에서 GM-CSF의 현저한 생산자였으며(도 28C), 이는 비장에서의 관찰과 일치하였다(도 28A). 더욱이, 활액 GM-CSF-생성 TH 세포의 현저하게 더 낮은 비율이 Stat5 +/+ 마우스에서보다 Stat5 -/- 마우스에서 검출되었다(도 28D). 다른 한편으로, TH1 및 TH17 세포는 모두 2개 그룹간에 유사한 비율을 나타내었다(도 28C). 대조용에 비해 Stat5 -/- 마우스의 활액 구획에서 GM-CSF 수준의 감소가 예상되었다. 이를 다루기 위해서, 염증 활액 조직을 RNA 및 단백질 추출을 위해 AIA 마우스로부터 수확하여 qPCR 및 ELISA에 의해 사이토킨 수준을 조사하였다. 실제로, 보다 낮은 활액 GM-CSF(그러나 IFN-γ 또는 IL-17은 아닌)가 관절염 유도후 5일 또는 7일째에 Stat5 +/+ 마우스에서보다 Stat5 -/- 마우스에서 검출되었다(도 28E 및 도 30A 내지 30C). 또한, 2개의 중요한 염증전 사이토킨 IL-6 및 IL-1β가 또한 STAT5-결핍 마우스에서 지속적이고 현저하게 감소되는 것으로 밝혀졌으며(도 28E 및 도 30A 내지 30C), 이는 약화된 활액 염증을 가리킨다. 현저하게, TNF-α 생성이 STAT5-결핍 마우스에서 7일째에(그러나 5일째에는 아닌) 감소하였다(도 28E 및 도 30A 내지 C). 종합하면, 이들 결과는 관절염유발 TH 세포에 의한 STAT5-조절된 GM-CSF 발현이 활액 염증의 발생에 중요함을 가리킨다.
활막염 및 관절염 발병을 매개함에 있어서 TH 세포에 의한 STAT5-조절된 GM-CSF 생성의 중요한 역할을 측정하기 위해서, GM-CSF를 mBSA와의 혼합물 중에서 관절내 주사를 통해 mBSA/CFA-면역된 마우스의 좌측 무릎 관절에 투여한 반면, mBSA를 단독으로 우측 무릎 관절에 주사하였다. mBSA 단독 주사는 Stat5 +/+ 마우스의 활액 구획에서 풍부한 면역 세포 침윤을 유도하기에 충분하였지만, Stat5 -/- 마우스에서는 그렇게 하지 못했다(도 28F). mBSA와 함께 GM-CSF의 투여는 Stat5 -/- 마우스에서 활액 염증을 효율적으로 복원시켰다(도 34F). 일관되게, 사프라닌-O/패스트 그린 염색은 Stat5 -/- 마우스에서 GM-CSF/mBSA 주사시 심한 연골 고갈을 밝혀내었지만, mBSA 단독의 경우는 아니었다(도 28G). 따라서 이들 결과는 관절염유발성 TH 세포에 의한 STAT5-조절된 GM-CSF 생성이 관절염 발병을 매개하는데 필수적이라는 개념에 대한 지지를 제공한다.
실시예 13. Th-세포-유래된 GM-CSF는 활액 조직 중 호중구 축적을 매개한다
GM-CSF-생성 Th 세포가 활액 염증을 일으키고 관절염 발병을 구동하는 기전을 조사하였다. 호중구, DC 및 대식세포를 포함한 골수 계통-유래된 세포는 GM-CSF 수용체를 발현하며 GM-CSF의 공통 표적이다(Hamilton, 2008). 중요하게 상기 세포들은 RA 환자 및 마우스 관절 모델에서 활액 구획을 침입하며 활막염의 원인이다(McInnes and Schett, 2011). AIA 마우스의 활액 구획에서 골수 계통-유래된 세포의 침윤을 조사하였다. CD11b+ 골수 세포는 활액 침윤 백혈구 중 우세한 집단(∼70%)을 차지하였다(도 31B). CD4+ TH 세포 침윤이 STAT5 고갈에 의해 변경되지 않았지만, 활액 CD11b+ 세포 침윤은 관절염 유도후 7일째에 검사시 Stat5 +/+ 마우스에 비해 Stat5 -/- 마우스에서 현저하게 감소하였다(도 31B). 상기 감소는, CD11b+ 세포의 유사한 빈도가 2개 그룹의 비장에서 검출되었기 때문에(도 31A), 결함성 조혈작용에 기인하는 듯하지 않다. 더욱이, CD11b+ 세포는 7-일 시간 과정에 걸쳐 야생형 마우스의 활액 조직에서 계속해서 증가하였지만, STAT5-결핍 마우스에서는 증가하지 않았다(도 31C). 현저하게, STAT5-결핍 마우스에서 활액 CD11b+ 세포 축적의 선택적인 제거는 관절염 유도 중 GM-CSF의 국소 투여에 의해 부분적으로 복원될 수 있다(도 31D). 종합하면, 이들 결과는 활액 구획 중 골수 세포 축적이 T-세포-특이성 STAT5 결실 및 생성된 GM-CSF 부족에 의해 특이적으로 완충될(dampened) 수 있음을 가리킨다.
이어서, DC, 대식세포 및 호중구를 포함한 CD11b+ 세포의 상이한 집단들을 분석하였다. CD11cintCD22bhiLy6C+/hiMHCIIhi로서 특성화된 단핵세포-유래된 수지상 세포(MoCD)가 최근에 mBSA/IL-1β 관절염 모델에 관련되는 것으로 보고되었다(Campbell et al., 2011). 본 연구의 AIA 모델에서, MoDC는 비장 및 활액 조직에서 낮은 풍부성으로 식별되었다(데이터 도시 안 됨). 더욱 또한, Stat5 +/+ 와 Stat5 -/- 마우스 간에 MoDC의 필적하는 빈도가 말초 림프 조직 및 활액 조직 모두에서 검출되었다(데이터 도시 안 됨). 이러한 결과는 MoDC 분화에서 GM-CSF의 중요치않은 역할을 나타내는 선행 연구와 일치한다(Greter et al., 2012).
호중구는 큰 세포독성 잠재성을 가지며 RA 개시 및 진행에 다수의 방식으로 기여한다(Wright et al., 2014). RA 질병 활성 및 관절 파괴가 관절내로의 호중구 유입과 직접적으로 상관 있음이 제시되었다(Wright et al., 2014). Ly6C 및 Ly6G의 차별적인 발현을 근거로, CD11b+ 골수 세포를 Ly6CloLy6Ghi 집단(호중구) 및 Ly6ChiLy6G- 집단(단핵세포/대식세포)으로 분류할 수 있다. 본 연구는 Ly6CloLy6Ghi 집단이 7-일의 시간 과정에 걸쳐 활액 조직에서 계속해서 축적되었으며, AIA 유도후 7일째에 야생형 마우스에서 활액 CD11b+ 세포 중에 우세한 집단을 나타낸 반면, 상기 집단은 STAT5-결핍 마우스에서는 지속적이고 극적으로 감소되었음을 보인다(도 32A). 김자 염색을 사용하여, 활액-침윤성 Ly6CloLy6Ghi 집단이 호중구임을 확인하였으며, 상기 호중구는 고리 모양 핵을 갖는 전형적인 다형핵 특성을 나타내었다(도 32B). 대조적으로, 활액-침윤성 Ly6ChiLy6G- 집단은 단핵 형태를 가졌으며 단핵세포/대식세포인 듯하였다(도 32B). 중요하게, 관절염 유도 중 GM-CSF의 관절내 투여는 STAT5-결핍 마우스의 활액 구획에서 호중구 축적을 효율적으로 복원하였으며(도 32C), 이는 염증 관절에의 호중구 축적을 매개함에 있어서 TH-세포-유래된 GM-CSF의 중요한 역할을 암시한다.
호중구는 염증 동안 보충되며, 여기에서 호중구와 혈관 내피 세포간의 복잡한 상호작용은 호중구 부착, 및 순환으로부터 염증 조직으로의 이행을 지시한다(Kolaczkowska and Kubes, 2013). 시험관내 이행 분석에서, 내피세포의 단층을 가로지르는 이동 및 호중구 부착이 화학유인물질로서 GM-CSF에 의해 현저하게 증대되었으며(도 33A 및 33B), 이는 GM-CSF가 AIA에서 염증 관절로의 호중구 동원(recruitment)을 매개할 수 있음을 암시한다. 유효한 호중구 세포사멸은 염증의 해결에 중요하다. 그러나, 활막염에서, 호중구 세포사멸은 연장된 생존 및 지속적인 염증의 결과로 지연된다(Wright et al., 2014). 따라서, 호중구 생존에 대한 GM-CSF의 영향을 시험하였으며 GM-CSF가 호중구 세포사멸의 지연에 상당한 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 33C). 종합하면, 이들 결과는 GM-CSF가 호중구 동원을 매개하고 활액 구획에서 호중구 생존을 지속시키며 지속적인 활막염에 기여할 수 있음을 가리킨다. AIA에서 호중구의 중요한 역할을 측정하기 위해서, Ly6G에 특이적인 중화 항체(1A8)를 사용하여 생체내에서 호중구를 고갈시켰다. 중화 항체의 투여는 AIA에서 관절 종창의 상당한 개선을 생성시켰다(도 32D). 따라서, TH-세포-유래된 GM-CSF에 의해 매개된 호중구 축적은 AIA 발병에 중요하다.
실시예 14. GM-CSF는 골수 세포 및 활액 섬유아세포에 의한 염증전 사이토킨 생성을 증대시킨다
사이토킨은 선천성 및 후천성 면역 간의 혼선(cross-talk)에 중요한 매개체이다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, RA 병인과 관련된 다수의 염증전 사이토킨(IL-6, IL-1β및 TNF-α)(Choy and Panayi, 2001)은 STAT5-결핍 AIA 마우스의 활액 조직에서 현저하게 감소되었다(도 28E 및 30A 내지 30C). 상기 관찰된 사이토킨 감소에 근원하는 기전을 간파하기 위해서, 이들 염증전 사이토킨의 세포 공급원을, 활액 세포를 표면 마커들의 차별적인 분화에 근거하여 상이한 집단들로 분획화시킴으로써 조사하였다(도 34A). CD45+TCRβ+ 집단(T 세포), CD45+TCRβ-CD11c-CD11b+ 집단(주로 단핵세포/대식세포 및 호중구) 및 CD45+TCRβ-CD11c+ 집단(수지상 세포) 중의 사이토킨 mRNA 발현 수준을 RT-PCR에 의해 평가하였다. GM-CSF는 IL-17(대조용)과 유사하게, 활액 T 세포에 의해 우세하게 생성되었으며(도 34B), 이는 GM-CSF-생성 TH 세포의 중요성을 더욱 보강하였다. 대조적으로, IL-6 및 IL-1β는 주로 골수 세포, 예를 들어 CD11b+ 집단 및 CD11c+ 집단에 의해 생성되었다(도 34B). TNF-α는 3개의 집단 모두에 의해 발현되었으며, T 세포에서 비교적 더 낮은 풍부성으로 발현되었다(도 34B). 상기에 논의된 바와 같이 CD11b+ 집단에서 Ly6C 및 Ly6G의 차별적인 발현을 근거로, Ly6ChiLy6G- 집단(단핵세포/대식세포) 및 Ly6CloLy6Ghi 집단(호중구)을 추가로 분석하였으며, 이는 단핵세포/대식세포가 주요 IL-6 생산자인 듯한 반면 호중구는 IL-1β 및 TNF-α의 보다 양호한 생산자인 듯함을 보였다(도 34C). 이들 결과는 상기 발견(도 28E 및 30A 내지 30C)과 함께, TH-세포-분비된 GM-CSF가 활막염에서 골수 세포로부터 염증전 사이토킨 발현을 이끌어낸다는 관련성을 가리킨다.
IL-6 및 IL-1β의 발현에서 GM-CSF의 조절 역할을 시험하기 위해서, 골수-유래된 대식세포(BMDM) 및 골수-유래된 수지상 세포(BMDC)를 배양하였으며, GM-CSF로 자극하였다. 실제로, GM-CSF 자극은 1시간 이내에 IL-6 및 IL-1β 모두의 mRNA 발현을 신속히 상향조절하였다(도 34D 및 34E). 또한, GM-CSF는 BMDM으로부터 투여량-의존적인 방식으로(도 34F), 및 심지어 낮은 투여량에서조차 BMDC로부터(도 34G) IL-6의 분비를 현저하게 증가시켰다. 성숙한 IL-1β 분비를 유도하기 위해서, BMDM을 6시간 동안(그 동안 상이한 농도의 GM-CSF를 가한다) LPS로 초회 항원자극한 다음 ATP 자극하였다. GM-CSF의 첨가는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 IL-1β의 배양 상등액내로의 분비를 현저하게 증대시켰다(도 34H). 활액 염증에서 활성 작용자(Muller-Ladner et al., 2007)인 활액 섬유아세포가 또한 GM-CSF 자극시 증가된 IL-1β mRNA 발현을 보였다(도 34I). TNF-α 발현에 대한 GM-CSF의 유도 효과는 BMDM, BMDC 또는 활액 섬유아세포에서 관찰되지 않았다(데이터 도시 안 됨). 관절염 발병에서 IL-6 및 IL-β의 기능상 중요성을 고려해 볼 때(Choy and Panayi, 2001), TH-세포-분비된 GM-CSF는, 또한 골수 세포 및 활액 섬유아세포로부터 IL-6 및 IL-1β의 발현을 이끌어냄을 통하여 활액 염증을 매개할 수 있다.
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본 발명은 그 예시적인 실시예를 참고하여 구체적으로 도시되고 설명되었지만, 첨부된 청구 범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항에서 다양한 변경이 행해질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

Claims (15)

  1. STAT5(Signal Transducer and Activator of Transcription 5) 억제제를 포함하는, TNF-α-독립적인 염증 경로와 관련된 염증 질환의 치료를 위한 조성물로서, 상기 염증 질환이 GM-CSF-분비 T-헬퍼 (TH-GM) 세포에 의해 매개되고, TH-GM 세포가 활성화된 STAT5 및 IL-7의 존재 하에서 전구 CD4+ 세포로부터 분화된, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 염증 질환이 류마티스성 관절염인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 염증 질환이 다발성 경화증인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, STAT5 억제제가 피모지드인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, STAT5 억제제가 CAS 285986-31-4인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, STAT5 억제제가 STAT5에 특이적으로 결합하는 항체인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, STAT5 억제제가 안티센스 핵산 또는 siRNA인, 조성물.
  8. STAT5(Signal Transducer and Activator of Transcription 5) 억제제를 포함하는, TNF-α-독립적인 염증 경로와 관련된 염증 질환의 치료를 위한 조성물로서, 상기 염증 질환이 GM-CSF-분비 T-헬퍼 (TH-GM) 세포에 의해 매개되고, STAT5 억제제가 대상체에서 GM-CSF의 혈청 수준을 감소시켜, TNF-α 독립적인 방식으로 대상체에 치료적 이점을 제공하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 염증 질환이 류마티스성 관절염인, 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 염증 질환이 다발성 경화증인, 조성물.
  11. 제8항에 있어서, TH-GM 세포가 활성화된 STAT5 및 IL-7의 존재 하에서 전구 CD4+ 세포로부터 분화된, 조성물.
  12. 제8항에 있어서, STAT5 억제제가 피모지드인, 조성물.
  13. 제8항에 있어서, STAT5 억제제가 CAS 285986-31-4인, 조성물.
  14. 제8항에 있어서, STAT5 억제제가 STAT5에 특이적으로 결합하는 항체인, 조성물.
  15. 제8항에 있어서, STAT5 억제제가 안티센스 핵산 또는 siRNA인, 조성물.
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