CN107002037A - 用于调节th‑gm细胞功能的方法和组合物 - Google Patents

用于调节th‑gm细胞功能的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本文公开了一种T辅助细胞(“TH‑GM”细胞)，所述T辅助细胞受IL‑7/STAT5的调节并且分泌GM‑CSF/IL‑3。还公开了用于调节TH‑GM功能以治疗例如炎症性病症的方法和组合物。还提供了用于特异性鉴定与非TH‑GM介导(例如TNF‑α介导)的炎症性病症不同和/或除了非TH‑GM介导(例如TNF‑α介导)的炎症性病症之外的TH‑GM介导的炎症性病症(例如类风湿性关节炎)的诊断和预后方法。

Description

用于调节TH-GM细胞功能的方法和组合物
相关申请
本申请要求2014年9月26日提交的新加坡专利申请号10201406130P的权益。上述申请的全部教导以引用的方式并入本文。
背景技术
大量的研究已经建立了当前的免疫和炎症以及免疫病症和炎症性病症中的失调的模型。目前了解的是，CD4+辅助T(TH)细胞通过协调适应性免疫应答和先天性免疫应答在宿主防御各种病原体中发挥至关重要的作用。在T细胞受体(TCR)由同源抗原激活时，初始CD4+T细胞被定向为分化成至少五个主要的子集：TH1、TH2、TH17、iTreg以及TFH，它们是受细胞因子环境调节的。已知TH1细胞和TH17细胞是炎症的主要效应细胞。然而，TH1或TH17在各种炎症性病症中的致病作用仍是不清楚的。举例来说，最近的研究与先前了解的TH17在多发性硬化(MS)致病方面的范例(Haak等,2009)矛盾，这使得鉴定用于MS治疗的潜在药物靶标更具挑战性。类似地，虽然类风湿性关节炎(RA)在传统上被理解成是一种由肿瘤坏死因子α(TNF-α)介导的病症，但是高达40％的RA患者不能对抗TNF-α治疗作出响应。
因此，对于用于自身免疫性病症和炎症性病症，如MS和RA的有效治疗方法仍然存在重要的未满足的需求。
发明内容
本公开部分地涉及对白细胞介素-7(IL-7)/信号转导和转录激活因子5(STAT5)调节的产生粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)/IL-3的TH细胞的鉴定，所述细胞被称作TH-GM，代表了具有独特的发育和功能特征的不同的辅助T细胞子集。在本文鉴定的是由TH-GM细胞介导的炎症通路(TH-GM介导的炎症通路)，它代表了除已知的非TH-GM介导的炎症通路(例如TNF-a、IL-6、以及IL-1b炎症通路)之外的独立的炎症通路。本公开提供了用于诊断由TH-GM介导的炎症性病症以及调节TH-GM细胞功能以治疗由TH-GM通路介导的炎症性病症的方法和组合物。
因此，在一个方面，本公开提供了一种诊断患有炎症性病症的患者的由TH-GM介导的炎症性病症的方法，所述方法包括：a)使从患有炎症性病症的患者采集的样品与检测剂接触，所述检测剂检测STAT5(例如磷酸化STAT5(Tyr694))、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的多肽水平或核酸水平；以及b)定量STAT5(例如磷酸化STAT5(Tyr694))、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的多肽水平或核酸水平，其中相对于参考水平，STAT5(例如磷酸化STAT5(Tyr694))、白细胞介素-7(IL-7)、GM-CSF或白细胞介素-3(IL-3)、或其组合的水平增加则表明所述患者患有TH-GM介导的炎症性病症。
在另一个方面，本公开提供了一种分离的GM-CSF分泌型T辅助细胞(TH-GM)群体，其中所述TH-GM细胞是在IL-7和激活的STAT5存在下从分化簇4(CD4+)前体细胞分化的，并且其中所述TH-GM细胞表达GM-CSF和IL-3。
在另一个方面，本公开提供了一种调节TH-GM功能的方法，所述方法包括使所述TH-GM或CD4+前体细胞或这两者与调节TH-GM功能的调节剂接触。
在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的由TH-GM介导的炎症性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的调节TH-GM细胞功能的调节剂。
在其它方面，本公开提供了一种治疗对抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)治疗表现出有限的响应的患者的类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的调节TH-GM功能的调节剂。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的由STAT5介导的炎症性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的调节STAT5功能的药剂。
在另外的方面，本公开提供了一种进行筛选以鉴定TH-GM细胞功能的调节剂的方法，所述方法包括使分离的TH-GM细胞群体或分离的CD4+前体细胞群体与候选药剂接触，以及确定在存在或不存在所述候选药剂的情况下TH-GM功能的读数，其中TH-GM功能的读数发生变化则表明所述候选药剂是TH-GM功能的调节剂。
本公开使得能够在主要是TH-GM介导的炎症性病症或主要是非TH-GM介导(例如由TNF-α、IL-6和/或IL-1β介导)的炎症性病症、或这两者之间进行鉴定或分类。因此，使用本文所述的方法，有可能确定患有例如RA的患者是否患有主要是TH-GM介导的RA、或主要是非TH-GM介导的RA、或这两者。该区别允许治疗诸如RA的炎症性病症的更具靶向性和定制性的方法，对于所述炎症性病症，当前的治疗仅40％有效。此外，本公开提供了用于预测炎症性病症的进展以根据疾病的阶段定制治疗的方法和组合物。本文还提供了用于治疗炎症性病症，特别是由TH-GM介导的那些炎症性病症的组合物和方法。
附图说明
根据以下对本发明的示例性实施方案的更具体说明，上文将是显而易见的。
图1A-1D描绘了Stat5条件突变型小鼠对EAE具有抗性。接受MOG35-55/CFA的两次免疫接种的Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠的临床EAE分数(图1A)和发病率(图1B)。数据代表了三次独立实验(图1A)或是从三次实验汇集的(图1B，每组n＝18)。接受MOG35-55/CFA的一次免疫接种的EAE小鼠(图1C，每组n＝5)或接受MOG35-55/LPS的两次免疫接种的EAE小鼠(图1D)的临床分数。数据代表了两次独立实验。
图2A-2D描绘了Stat5条件突变型小鼠中神经炎症减轻。在第二次免疫接种之后第9天时从EAE小鼠获得的脊髓切片的组织学(图1A)。所示的图像代表了两次独立实验，其中每组有三只小鼠。比例尺：200μm(顶部)，50μm(底部)。通过免疫荧光将脊髓切片中的CD4+细胞和CD11b+细胞染色(图1B)。所示的图像代表了两次独立实验，其中每组有三只小鼠。比例尺：200μm。在疾病高峰期时，通过流式细胞术分析CNS单核细胞(图2C和2D)。右图是从两次实验(n＝9)汇集的细胞比例(图2C，右侧)或细胞数(图2D，右侧)。
图3A和3B描绘了Stat5缺陷型小鼠对EAE的抗性与TH1细胞、TH17细胞或Treg细胞无关。在疾病高峰期时CNS浸润性CD4+T细胞的IL-17和IFN-γ表达的流式细胞术分析(图3A)。数据代表三次独立实验。通过流式细胞术分析在疾病高峰期时Stat5+/+EAE小鼠和Stat5-/-EAE小鼠的CNS中CD4+T细胞当中CD25+的百分比(图3B)。
图4A-4C描绘了条件Stat5突变型小鼠在外周中CD4+T细胞产生方面没有缺陷。在第7天(图4A)和第21天(图4B)从接受MOG35-55/CFA免疫接种的Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠获得脾脏。通过流式细胞术分析CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。计算CD4+T细胞的绝对数量(右图)。数据代表了两次独立实验(图4A)或是从两次独立实验汇集(图4B)。通过细胞内细胞因子染色来确定Stat5+/+EAE小鼠和Stat5-/-EAE小鼠的脾脏CD4+T细胞的IL-17和IFN-γ表达(图4C)。数据代表三次独立实验。*p<0.5，**p<0.005，***p<0.0005。
图5A-5D描绘了Stat5缺陷型CD4+T细胞可以浸润CNS，但是不能诱发有效神经炎症。测量Stat5+/+EAE小鼠和Stat5-/-EAE小鼠的脾脏CD4+T细胞的CCR6、CXCR3以及CD69表达。数据代表了两次独立实验，其中每组有三只至五只小鼠(图5A)。在第一次MOG35-55/CFA免疫接种之后第7天、第9天以及第21天时分析CNS浸润性CD4+T细胞(图5B-5D)。计算细胞数(图5D)。数据代表了两次独立实验，其中每组有三只小鼠。*p<0.5。
图6A-6C示出了Stat5-/-小鼠对EAE的抗性不是由在不存在STAT5的情况下CD4+T细胞存活方面的任何缺陷所引起。接受不同数目的Stat5+/+和Stat5-/-CD4+T细胞转移的Rag2-/-接受体小鼠的CD4+T细胞浸润(图6A)和临床分数(图6B)。在EAE诱发的第21天(疾病高峰期)时CNS中CD4+T细胞的临床分数和出现率(图6C)。*p<0.05，***p<0.0005。
图7A-7C描绘了Stat5缺陷型CD4+T细胞在致脑炎作用中的内在缺陷。在分别过继转移200万个MOG35-55特异性Stat5+/+或Stat5-/-CD4+T细胞之后Rag2-/-小鼠(每组n＝5)的临床EAE分数(图7A)和发病率(图7B)。在疾病高峰期时测量CNS浸润性CD4+T细胞的IL-17和IFN-γ表达(图7C)。数据代表了两次独立实验。*p<0.05。
图8A-8D描绘了在脾脏Stat5-/-CD4+T细胞中对GM-CSF的诱导减弱。在图8A-8D中，在疾病发病之前从接受MOG35-55/CFA免疫接种的Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠(每组n＝3)获得脾细胞并且用各种浓度的MOG35-55对所述脾细胞攻击24小时。通过ELISA测量GM-CSF分泌(图8A)。在MOG35-55(20μg/ml)攻击的最后4小时内添加Golgiplug并且测量在CD4+CD44hi T细胞当中IL-17+和GM-CSF+细胞的出现率(图8B)。在图8C和8C中，从接受MOG35-55/CFA免疫接种的Stat5-/-小鼠、Stat3-/-小鼠或野生型对照小鼠获得脾细胞，并且在Golgiplug存在下用PMA/离子霉素将所述脾细胞刺激4小时。通过细胞内细胞因子染色来测量脾脏CD4+CD44hi T细胞当中IL-17+和GM-CSF+细胞的出现率。*p<0.05，***p<0.001。
图9A-9C描绘了在CNS浸润性Stat5-/-CD4+T细胞中对GM-CSF的诱导减弱。在图9A中，在疾病高峰期时测量Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠的CNS浸润性CD4+T细胞的IL-17、IFN-γ以及GM-CSF表达。计算IL-17+细胞或IFN-γ+细胞当中GM-CSF+细胞的百分比(右下，图9A)。在过继转移EAE的疾病高峰期时Rag2-/-接受体小鼠的CNS浸润性CD4+T细胞的IL-17、IFN-γ以及GM-CSF表达(图9B)。未实验过和接受MOG35-55/CFA免疫接种的Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠的CNS中细胞因子mRNA表达的时间过程分析(在每一个时间点，每组n＝3)。将RT-PCR数据相对于Rn18S归一化，并且将未实验过的小鼠的表达设定为1(图9C)。数据代表了两次独立实验。*p<0.05。
图10A-10C示出了STAT5介导的GM-CSF诱导与IL-23或IL-1β信号转导无关。在图10A中，将纯化的CD4+T细胞与TGF-β和IL-6一起培养3天，继而饥饿6小时。然后将细胞用各种细胞因子处理30分钟，并且通过免疫印迹法来确定pSTAT3和pSTAT5。在剥离之后进一步检测STAT3和STAT5。图10B示出了Stat5+/+EAE小鼠和Stat5-/-EAE小鼠(每组n＝3)的脾脏CD4+T细胞中IL-23R和IL-1R1的mRNA表达。将RT-PCR数据相对于β-肌动蛋白归一化。在图10C中，在疾病发病之前从接受MOG35-55/CFA免疫接种的野生型小鼠获得脾细胞并且在不存在或存在IL-2的情况下用MOG35-55(20μg/ml)对所述脾细胞攻击48小时。通过流式细胞术测量CD4+CD44hi T细胞当中GM-CSF+和IL-17+细胞的出现率。*p<0.05。
图11A-11C描绘了IL-7诱导的STAT5激活促进自身反应性CD4+T细胞中GM-CSF的表达。在疾病发病之前从接受MOG35-55/CFA免疫接种的Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠获得脾细胞并且在不存在或存在IL-7的情况下用MOG35-55(20μg/ml)对所述脾细胞攻击48小时。通过流式细胞术测量CD4+CD44hi T细胞当中GM-CSF+和IL-17+细胞的出现率(图11A)。通过ELISA测量GM-CSF分泌(图11B)。数据代表了两次独立实验，其中每组有两只至三只小鼠。分选出来自接受MOG35-55/CFA免疫接种的小鼠的脾脏CD62LhiCD44lo和CD62LlECD44hi T细胞。在不存在或存在IL-7的情况下用抗CD3和抗CD28将细胞刺激4小时，然后收集所述细胞以通过RT-PCR分析GM-CSF表达(图11C)。*p<0.05。
图12A-12F描绘了IL-7Rα中和减弱GM-CSF表达并且改善EAE。从第二次免疫接种之后第5天起每隔一天给予抗IL-7Rα或正常IgG来处理的EAE小鼠(n＝5)的临床分数，如由箭头所指示。数据代表了两次独立实验(图12A)。在第二次免疫接种之后第11天时从EAE小鼠获得脊髓切片。组织学评估免疫细胞浸润。所示的图像代表了每组三个个体。比例尺：200μm(顶部)，50μm(图12B，底部)。EAE小鼠的脾脏中CD4+和CD8+T细胞的百分比。数据代表了两次独立实验(图12C)。图12D和12E图示了在接受不同处理的EAE小鼠的CNS中CD4+T细胞当中GM-CSF+、IL-17+以及IFN-γ+细胞的出现率。EAE小鼠的CNS中IFN-γ、IL-17以及GM-CSF的mRNA表达(图12F)。*p<0.05。
图13A和13B描绘了表达GM-CSF的TH细胞的分化不同于TH17和TH1。在如所示的各种细胞因子和中和抗体的组合存在下，用板结合的抗CD3和可溶性抗CD28使初始CD4+T细胞致敏。通过细胞内染色(图13A)或RT-PCR(图13B)分析GM-CSF、IL-17以及IFN-γ的表达。
图14A-14D示出了IL-2和IL-6对初始T细胞的TH-GM分化的作用。用抗CD3单独或抗CD3加上抗CD28激活72小时的初始CD4+T细胞中GM-CSF和IFN-γ的表达(图14A)。在图14B中，在针对IL-12和IFN-γ的中和抗体存在下，在不添加或添加IL-6的情况下，将分选的初始CD4+T细胞用抗CD3和抗CD28刺激。通过细胞内染色来测量GM-CSF+和IL-17+细胞的出现率(图14B)。在图14C中，在如所示的条件下将来自Stat3+/+小鼠和Stat3-/-小鼠的初始CD4+T细胞极化72小时。分析GM-CSF+和IL-17+细胞的出现率。在图14D中，在IL-2或抗IL-2存在下将初始CD4+T细胞用抗CD3和抗CD28激活。分析GM-CSF+、IL-17+以及IFN-γ+细胞的出现率。
图15A-15F描绘了IL-7-STAT5信号转导将初始前体细胞的TH-GM分化程序化。在如所示的各种浓度的IL-7存在下用板结合的抗CD3和可溶性抗CD28使初始CD4+T细胞致敏。通过细胞内染色(图15A)或ELISA(图15B)分析GM-CSF和IFN-γ表达。在图15C和15D中，在IL-7存在下将Stat5+/+和Stat5-/-初始CD4+T细胞用抗CD3和抗CD28激活3天。通过细胞内细胞因子染色来分析GM-CSF、IL-17以及IFN-γ的表达(图15C)。通过ELISA测量GM-CSF分泌(图15D)。从Stat5-/-小鼠或对照小鼠分离的受IL-7刺激的CD4+T细胞中pSTAT5和STAT5的免疫印迹(图15E)。使用Stat5+/+和Stat5-/-CD4+T细胞，使用正常IgG或STAT5特异性抗体来进行ChIP测定。通过RT-PCR检测抗体与Csf2启动子区的结合(图15F)。
图16A和16B描绘了TH-GM子集的分化条件。在如所示的IL-7或/和抗IFN-γ存在下将初始CD4+T细胞用抗CD3和抗CD28激活。分析GM-CSF、IL-17以及IFN-γ的表达(图16A)。初始TH1(IL-12+抗IL-4)、TH17(TGF-β+IL-6+抗IFN-γ+抗IL-4)以及TH-GM细胞(IL-7+抗IFN-γ)中T-bet和RORγt的mRNA表达(图16B)。将RT-PCR数据相对于Gapdh归一化，并且将初始T细胞中的表达设定为1。
图17A-17E图示了IL-7在初始CD4+T细胞中诱导STAT5激活和GM-CSF表达，但是IL-2不是这样。图17A-17C示出了在如所示的各个时间点初始CD4+T细胞或用抗CD3和抗CD28激活的细胞的表面上CD25和CD127的流式细胞术。用IL-2或IL-7刺激30分钟的初始CD4+T细胞中STAT5的激活(图17D)。图17E示出了在IL-2或IL-7存在下用抗CD3和抗CD28刺激的初始CD4+T细胞中GM-CSF的mRNA表达。将RT-PCR数据相对于β-肌动蛋白归一化，并且将在不存在细胞因子的情况下激活2小时的初始T细胞中的表达设定为1。
图18A-18C示出了IL-2和IL-7这两者均可以在激活的CD4+T细胞中诱导STAT5激活和GM-CSF表达。如图18A和18B中所示，将CD4+T细胞用抗CD3和抗CD28激活3天。在新鲜培养基中静置之后，在各个时间点用IL-2或IL-7刺激细胞。通过免疫印迹法检测pTyr-STAT5和β-肌动蛋白(图18A)。通过RT-PCR测量GM-CSF mRNA表达(图18B)。将RT-PCR数据相对于β-肌动蛋白归一化，并且将在没有细胞因子刺激的情况下细胞中的表达设定为1。用正常IgG或STAT5特异性抗体进行图18C中所示的ChIP测定。通过RT-PCR检测抗体与Csf2启动子区的结合。
图19描绘了如由微阵列分析所表征的TH-GM子集中以高水平或低水平选择性表达的表面分子。对于每一个谱系来说具有特异性的这些表面分子用作新型诊断、治疗以及预防包括但不限于多发性硬化和类风湿性关节炎的自身免疫性炎症的标志物、特征以及潜在靶标。这些细胞表面分子详细列于表1中。插图中所示的初始、Th1、Th17、以及Th-GM的顺序与每一个图表中对于条柱所显示的顺序相同。
图20A-20D示出了IL-3优先在TH-GM细胞中表达。在图20A和20B中，在TH1(IL-12+抗IL-4)、TH17(TGF-β+IL-6+抗IFN-γ+抗IL-4)以及TH-GM(GM-CSF+TH、IL-7+抗IFN-γ+抗IL-4)极化条件下将初始CD4+T细胞用抗CD3和抗CD28激活。通过细胞内染色来分析GM-CSF和IL-3的表达(图20A)。通过RT-PCR测量IL-3、EBI-3、PENK或RANKL细胞因子的mRNA表达(图20B)。在不存在或存在IL-7的情况下分化的IL-3+细胞的出现率(图20C)。产生GM-CSF的野生型或STAT5缺陷型TH细胞的GM-CSF和IL-3的表达(图20D)。
图21描绘了在过继转移6×105个各种MOG35-55特异性TH子集之后Rag2-/-小鼠(每组n＝3只-6只小鼠)的临床EAE分数。
图22A-27E描绘了抑制STAT5激活会抑制体外TH-GM细胞分化。将CD4+T细胞与所示浓度的STAT5抑制剂(Calbiochem公司)(图22A)或JAK3抑制剂(图22B)或媒介物(-)一起预孵育1小时，之后用IL-7刺激30分钟。通过免疫印迹法确定STAT5的激活(Tyr694磷酸化)。将CD4+T细胞与所示浓度的STAT5抑制剂或媒介物(-)一起预孵育1小时，之后用IL-6刺激30分钟。通过免疫印迹法确定STAT3的激活(Tyr705磷酸化)(图22C)。在图22D中，将CD4+T细胞与所示浓度的STAT5抑制剂或媒介物(-)一起预孵育1小时，之后用IFN-γ刺激30分钟。通过免疫印迹法确定STAT1的激活(Tyr701磷酸化)。在图22E中，将初始CD4+T细胞分离并且在中性条件或有利于TH-GM细胞的条件下在添加不同浓度的STAT5抑制剂的情况下激活3天。通过细胞内细胞因子染色和流式细胞术分析GM-CSF和IFN-γ的表达。
图23A-23D描绘了通过化学抑制剂靶向STAT5激活会改善EAE。(图23A)野生型对照小鼠(n＝5)或接受STAT5抑制剂(Calbiochem公司)施用的小鼠的临床EAE分数。箭头指示了处理点。(图23B)接受不同处理的EAE小鼠在第18天时脊髓的组织学。(图23C)在疾病高峰期时CNS浸润性CD4+T细胞的细胞内染色和流式细胞术。(图23D)收集整个CNS以进行RNA提取。通过RT-PCR分析GM-CSF mRNA表达。数据代表了两次独立实验。*p<0.05。
图24A-24E描绘了产生GM-CSF的TH细胞与人类RA相关。通过ELISA定量健康对照HC(n＝32)和RA(n＝47)中GM-CSF和TNF-α的血浆浓度(图24A)。在图24B和24C中，从健康对照(HC)和类风湿性关节炎(RA)患者采集外周血单核细胞(PBMC)，并且在Golgiplug存在下用PMA/离子霉素刺激4小时，继而进行细胞内细胞因子染色。示出了CD4+T细胞中GM-CSF、IFN-γ以及IL-17的代表性流式细胞术(图24B)和每组n>＝9的统计值(图24C)。图24D示出了RA患者(n＝18)的外周血中GM-CSF+IFN-γ-TH细胞的出现率与血浆GM-CSF的水平之间的相关性。通过细胞内细胞因子染色和流式细胞术分析源自于RA患者的滑液的CD4+T细胞的细胞因子表达(图24E)。示出了三例的代表性图像。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns，没有显著性。
图25A-25E描绘了在小鼠AIA中GM-CSF和TNF-α的可区分的作用。图25A示出了在AIA模型中关节内注射100μg的mBSA之后7天内野生型小鼠的膝关节肿胀，所述AIA模型在所示的时间(箭头)接受对照IgG、GM-CSF特异性中和抗体和TNF-α特异性中和抗体单独或组合处理(每组n＝5)。图25B示出了在诱发关节炎之后7天内Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠(每组n＝6)的膝关节肿胀。数据代表了多于三次独立实验。在如图25C中诱发关节炎之后第7天时用H&E(图25C)或番红精-O/固绿(Fast Green)(图25D)染色的关节切片的代表性图像。比例尺：500μm(图25C上图和图25D)或100μm(图25C下图)。上图(图25C)中的箭头指示骨破坏。在图25E中，通过ELISA定量Stat5+/+AIA小鼠和Stat5-/-AIA小鼠的GM-CSF、IFN-γ以及TNF-α的血清浓度。示出了每组n>＝8的统计值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图26A-26D描绘了T细胞中Stat5缺失的小鼠对CIA具有抗性。(图26A)在CIA模型中免疫接种胶原II/CFA之后第40天时Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠的足肿胀的代表性图像。(图26B)在胶原II/CFA免疫接种之后40天内Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠(每组n＝5)的临床分数。数据代表了两次独立实验。(图26C)在第40天时用H&E染色的足切片的代表性图像。(图26D)通过ELISA定量TNF-α的血清浓度(每组n＝8)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图27A-27E描绘了STAT5缺陷型CD4+T细胞在致关节炎潜能方面有缺陷。(图27A和27B)在诱发AIA之后第7天时Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠的脾脏(图27A)和腹股沟淋巴结(图27B)中CD4+T细胞的代表性流式细胞术。(图27C和27D)在诱发AIA之后第7天时从Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠收集滑膜组织，并且将其解离成单细胞。计算CD45+白细胞的细胞数(图27C)。通过流式细胞术分析CD45+级分当中CD4+T细胞的百分比，并且计算细胞数(图27D)。(图27E)在接受体外扩增的抗原反应性CD4+T细胞转移并且随后关节内注射mBSA之后第7天时，来自野生型未实验过的小鼠的关节切片的组织学分析。比例尺：100μm。数据代表了两次独立实验。*p<0.05；ns，没有显著性。
图28A-28G描绘了STAT5调节的产生GM-CSF的TH细胞对于AIA是至关重要的。在诱发关节炎之后第7天时从Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠采集脾脏和滑膜组织。(图28A)在所示的条件下将野生型AIA小鼠(n＝3)的脾脏级分刺激18小时。通过ELISA定量上清液中GM-CSF的水平。(图28B-28D)在Golgiplug存在下用PMA/离子霉素再刺激4小时之后脾脏CD4+CD44hi效应T细胞(图28B)或滑膜浸润性CD4+T细胞(图28C和28D)中GM-CSF、IL-17以及IFN-γ的细胞内染色和流式细胞术。示出了代表性图像和每组n＝5(图28B，右图)或n＝3(图28D，右图)的统计值。数据代表了两次独立实验。(图28E)通过ELISA测量滑膜组织中几种促炎性细胞因子的蛋白质表达。(图28F和28G)在将mBSA单独关节内注射到右膝关节中并且将补充有GM-CSF的mBSA关节内注射到左膝关节中之后第7天时用H&E(图28F)或番红精-O/固绿(图28G)染色的关节切片的代表性图像。比例尺：500μm、50μm或200μm，如所示。数据代表了两次独立实验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns，没有显著性。“脾细胞”代表每一组中最左侧的条柱，“耗尽CD4+T细胞的脾细胞”代表每一组中的中间条柱，并且“CD4+T细胞”代表每一组中最右侧的条柱。
图29A-29C描绘了丧失STAT5会造成抗原特异性CD4+T细胞的GM-CSF产生受损。在诱发关节炎之后第7天时从Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠采集脾脏和腹股沟LN，并且将它们解离成单细胞悬浮液。然后，将细胞用mBSA(20μg/ml)刺激24小时。(图29A)在培养的最后4小时内添加Golgiplug，继而进行细胞内染色和流式细胞术。示出了CD4+CD44hi效应T细胞中GM-CSF、IL-17以及IFN-γ表达的代表图，代表了两次独立实验。(图29B和29C)通过ELISA定量上清液(每组n＝3)中分泌的细胞因子。数据代表了两次独立实验。*p<0.05；ns，没有显著性。
图30A-30C描绘了丧失STAT5会减损关节炎小鼠的滑膜组织中IL-6和IL-1β的表达。(图30A-30C)通过qPCR和ELISA测量在诱发关节炎之后第5天或第7天时Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠(每组n>＝3)的滑膜组织中几种促炎性细胞因子的mRNA(图30A和30C)和蛋白质(图30B)表达。将qPCR数据相对于Rn18S归一化。
图31A-31D描绘了SAT5诱导的GM-CSF表达介导了发炎的滑膜组织中CD11b+细胞的积聚。(图31A)通过流式细胞术分析Stat5+/+AIA小鼠和Stat5-/-AIA小鼠的脾脏中CD11b+细胞的出现率。示出了每组n＝3的统计值(右图)。(图31B)在诱发关节炎之后第7天时从Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠收集滑膜组织，并且将其解离成单细胞悬浮液。通过流式细胞术分析CD45+级分当中CD11b+骨髓细胞的百分比。每组n＝5的统计值示于右图中。(图31C)在诱发关节炎之后7天内在滑膜CD45+级分上门控的CD11b+和CD4+细胞的代表性流式细胞术。(图31D)在将mBSA单独关节内注射到右膝关节中并且将补充有GM-CSF的mBSA关节内注射到左膝关节中之后第7天时Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠的滑膜组织中CD4+、CD11b+以及B220+细胞浸润的流式细胞术分析。示出了代表性图像。所示的所有数据代表了两次独立实验。**p<0.01；ns，没有显著性。
图32A-32D描绘了GM-CSF在关节炎小鼠中介导中性粒细胞积聚。(图32A)在诱发关节炎之后7天内在滑膜CD45+CD11b+级分上门控的Ly6C和Ly6G表达的流式细胞术分析。(图32B)来自AIA小鼠的滑膜组织的分选的Ly6ChiLy6G-细胞和Ly6CloLy6Ghi细胞的吉姆萨染色(Giemsa stain)。比例尺：100μm(左)或20μm(右)。(图32C)在将mBSA单独关节内注射到右膝关节中并且将补充有GM-CSF的mBSA关节内注射到左膝关节中之后第7天时Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠的滑膜组织中Ly6ChiLy6G-和Ly6CloLy6Ghi群体的流式细胞术分析。(图32D)在AIA模型中关节内注射mBSA之后3天内接受Ly6G特异性中和抗体(1A8)或IgG对照处理的野生型小鼠(每组n＝5)的膝关节肿胀。箭头指示抗体施用的时间点。*p<0.05。
图33A-33C描绘了GM-CSF在体外增强中性粒细胞游出并且延迟细胞凋亡。(图33A)在游出测定中在开始后3小时之时在存在或不存在作为化学吸引剂的GM-CSF的情况下迁移的中性粒细胞的百分比。(图33B)在游出测定中下室的底部中CFSE标记的中性粒细胞的显微镜图像。(图33C)将分选的中性粒细胞在存在或不存在GM-CSF(20ng/ml)的情况下在体外培养24小时。通过膜联蛋白V和碘化丙锭(PI)共染色来研究经历细胞凋亡的中性粒细胞。示出了三次重复实验的代表性流式细胞术。*p<0.05。
图34A-34I描绘了GM-CSF介导关节炎小鼠的骨髓细胞和滑膜成纤维细胞的促炎性细胞因子表达。从野生型AIA小鼠解剖滑膜组织并且将其解离成单细胞悬浮液。(图34A)描绘了基于表面标志物的差异表达分级分离成不同群体的流式细胞术图。(图34B)通过qPCR测量分选的CD45+TCRβ+(简称为TCRβ+)、CD45+TCRβ-CD11c-CD11b+(CD11b+)以及CD45+TCRβ-CD11c+(CD11c+)群体中几种促炎性细胞因子的mRNA表达。将qPCR数据相对于GAPDH归一化。(图34C)分选的Ly6ChiLy6G-和Ly6CloLy6Ghi群体(在CD11b+细胞上门控)中IL-6、IL-1β以及TNF-α的mRNA表达。将qPCR数据相对于GAPDH归一化。(图34D和34E)在用20ng/ml的GM-CSF刺激1小时之时BMDM(图34D)和BMDC(图34E)的IL-6和IL-1β的mRNA表达。将qPCR数据相对于GAPDH归一化。(图34F和34G)将BMDM(图34F)和BMDC(图34G)用所示浓度的GM-CSF刺激18小时(每组n＝3)。通过ELISA定量培养上清液中IL-6的分泌。(图34H)将BMDM在所示浓度的GM-CSF存在下用LPS(100μg/ml)致敏6小时(每组n＝3)，继而用ATP(5mM)刺激30分钟。通过ELISA定量培养上清液中IL-1β的分泌。(图34I)将细胞在补充有10％FBS的DMEM培养基中培养超过20天，其中传代多于5次以获得滑膜成纤维细胞。将滑膜成纤维细胞用GM-CSF(20ng/ml)刺激1小时并且收集所述滑膜成纤维细胞以进行RNA提取。通过qPCR测量IL-1β的mRNA表达。将qPCR数据相对于GAPDH归一化。所示的所有数据代表了两次独立实验。*p<0.05，**p<0.01。
具体实施方式
本发明的示例性实施方案的说明如下。
本公开部分地涉及对被称作“TH-GM”的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)分泌型T辅助细胞的鉴定。如本文所详述，IL-7/STAT5信号转导将前体CD4+细胞向TH-GM的分化程序化，该过程受IL-2和IL-23信号转导进一步调节。TH-GM细胞的特征在于例如GM-CSF和IL-3的产生。TH-GM细胞与已知的辅助T细胞TH1和TH17在例如分化条件、转录调节以及效应细胞因子表达方面不同。举例来说，分别介导TH1和TH17(例如促进它们发育)的IL-12/IFN-γ和TGF-β/IL-6强效地抑制初始CD4+前体细胞发育成TH-GM，从而确定的是，TH-GM细胞经由不同于TH1和TH17的谱系发育。因此，本公开提供了一种独特于已知介导TH1或TH17的因子的介导TH-GM功能(例如它的分化和致病性)的不同的因子网络。
如本文所示，与TH1细胞和TH17细胞相比，TH-GM细胞优先诱发EAE，这表明TH-GM细胞代表了人类的自身免疫性神经炎症的发病中的主要效应细胞。此外，阻断IL-7信号转导和/或抑制STAT5功能(例如消除表达或抑制STAT5活性)会减轻与TH-GM细胞的GM-CSF产生减少相关的自身免疫性神经炎症。此外，阻断TH-GM细胞分泌的GM-CSF以非TNF-α依赖性方式改善实验性关节炎，这表明了一种用于治疗例如对TNF-α拮抗药无响应的类风湿性关节炎患者的方法。因此，本公开使得能够辨别由TH-GM通路介导的炎症性病症(例如RA)(例如由TH-GM经由例如GM-CSF和/或IL-3或与TH-GM通路相关的任何因子的作用所产生的致病性而引起的病症)或由例如TNF-α、IL-6和/或IL-1β通路(即非TH-GM介导的通路)介导的炎症性病症。举例来说，患有例如RA的患者可能患有主要是TH-GM介导的或主要是非TH-GM介导(例如TNF-α介导或IL-6介导)的类型的RA。本公开使得能够在TH-GM介导的炎症与非TH-GM介导的炎症之间分类，从而允许对患有诸如RA或MS的炎症性病症的个体进行更精确的诊断、预后、以及治疗。
如本文所示，本公开鉴定出一种辅助T细胞子集(TH-GM)，提供了在体外和体内这一子集从初始前体细胞定向和发育的分子基础，并且证实了TH-GM细胞为例如MS和RA的自身免疫性疾病和炎症性病症中的主要致病细胞。因此，本文提供了用于诊断主要由TH-GM细胞介导的炎症性病况，从而使得能够鉴定例如对TNF-α治疗(例如基于TNF-α抑制剂的治疗)无响应的RA患者的组合物和方法；以及用于调节TH-GM功能以治疗自身免疫性病症和炎症性病症的组合物和方法。调节TH-GM功能的方法包括例如施用有效量的调节介导TH-GM功能的因子(例如IL-2/IL-7/STAT5/GM-CSF/IL-3)网络的功能(例如信号转导、表达或活性)的药剂以调节TH-GM细胞的功能(例如发育和致病性)。具体来说，本公开提供了用于将炎症性病症，例如多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)辨别和诊断为主要由TH-GM细胞介导(即TH-GM通路介导)或主要由非TH-GM机制(例如TNF-α、IL-6和/或IL-1β通路)介导、或这两者的方法和组合物。本文还提供了用于治疗炎症性病症，特别是由TH-GM介导的那些炎症性病症的组合物和方法。
因此，在一个方面，本公开提供了一种诊断患有炎症性病症的患者的由TH-GM介导的炎症性病症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使从患有炎症性病症的患者采集的样品与检测剂接触，所述检测剂检测TH-GM介导因子，如STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的多肽水平或核酸水平；以及定量TH-GM介导因子(例如STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合)的多肽水平或核酸水平，其中相对于参考水平，TH-GM介导因子(例如STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合)的水平增加则表明所述患者患有TH-GM介导的炎症性病症，从而诊断出患有炎症性病症的患者的由TH-GM介导的炎症性病症。
如本文所用的“TH-GM介导的”炎症性病症指的是炎症性病症的一个亚型(例如RA或MS的一个亚型)，该亚型是由如本文所述调节TH-GM功能的通路中因子(“TH-GM介导因子”)的网络中的任何一种或多种的生理作用所引起的。这样的因子包括例如GM-CSF、激活的STAT5、IL-7、IL-2、以及IL-3。在一个具体实施方案中，STAT5是激活的STAT5，其中位置694处的酪氨酸被磷酸化。
在一些实施方案中，相对于参考水平，TH-GM介导因子(例如STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合)的水平没有增加则表明所述患者患有非TH-GM介导的炎症性病症。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括如果相对于参考水平，TH-GM介导因子(例如STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合)的水平没有增加，那么向患者施用如本文所述的TNF-α治疗。
如本文所用的“非TH-GM介导的”炎症性病症指的是主要由例如TNF-α、IL-6、或IL-1β(和/或TNF-α通路、IL-6通路或IL-1β通路中的因子)所引起的炎症性病症(例如RA或MS)。因而，“TH-GM介导的”炎症性病症主要(或仅仅)由与导致“非TH-GM介导的”炎症性病症的通路(例如与TNF-α、IL-6、或IL-1β相关的通路)中的一种或多种不同的通路所引起。
然而，如本领域技术人员所将了解的那样，TH-GM介导的炎症性病症不一定排除以下的可能性，即所述炎症性病症也可以部分是非TH-GM介导的(例如由TNF-α、IL-6、或IL-1β、和/或TNF-α通路、IL-6通路、或IL-1β通路中的因子介导)。因此，分类或诊断为“TH-GM介导的”与“主要/基本上是TH-GM介导的”同义，并且分类为“非TH-GM介导的”与“主要/基本上是非TH-GM介导的”同义。举例来说，不希望受任何具体理论所束缚，炎症性病症在它的早期阶段时可能是TH-GM介导的。随着炎症性病况发展到特征在于例如组织损伤的晚期阶段，所述炎症性病症逐渐变成非TH-GM介导的。在一些实施方案中，TH-GM介导的炎症性病症是如通过临床标准所确定，对TH-GM功能的调节有响应的病况；非TH-GM介导的炎症性病症是如由临床标准所确定，对例如TNF-α治疗、IL-6治疗、或IL-1β治疗有响应的病况。在某些实施方案中，炎症性病症可以对TH-GM功能的调节以及TNF-α治疗、IL-6治疗和/或IL-1β治疗有响应。
在一些实施方案中，所述样品可以是例如外周血、脑脊髓液、滑液、或滑膜、或其组合。
在一些实施方案中，所述炎症性病症是自身免疫性病症。在某些实施方案中，所述炎症性病症可以是由TH-GM细胞介导的任何炎症性病症，并且包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、强直性脊柱炎、克罗恩氏病(Crohn's disease)、糖尿病、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、肠易激综合征(IBS)、红斑狼疮、风湿性多肌痛、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏综合征/现象(Raynaud's syndrome/phenomenon)、反应性关节炎(赖特综合征(Reiter syndrome))、类肉瘤病、硬皮病、休格伦氏综合征( syndrome)、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、或血管炎。
如本文所用的“检测剂”指的是例如结合待检测的多肽或核酸(例如STAT5(例如磷酸化STAT5(Tyr694))、IL-7、GM-CSF或IL-3)并且使得能够定量待检测的多肽或核酸的抗体、肽、小分子、或核酸。所述检测剂可以是可检测地标记的或可通过本领域已知的其它手段定量的。
在一些实施方案中，所述检测剂是结合STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3的多肽的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是如本文所述结合激活的STAT5(例如磷酸化STAT5)的抗体。适用于本发明的方法中的针对STAT5(例如磷酸化STAT5(Tyr694))、IL-7、GM-CSF或IL-3的抗体是本领域已知的并且可商购获得的(例如STAT5Ab：来自圣克鲁斯生物科技公司(SantaCruz Biotech)的C-17；磷酸化STAT5(Tyr694)Ab：来自细胞信号转导公司(CellSignaling)的#9351或#9359；IL-7Ab：来自BD Pharmingen公司的克隆BVD10-40F6；IL-7RAb：来自BD Pharmingen公司的克隆SB/14；GM-CSF Ab：来自BD Pharmingen公司的克隆MP1-22E9；IL-3Ab：来自BD Pharmingen公司的克隆MP2-8F8。
在其它实施方案中，所述检测剂是结合STAT5、IL-7、GM-CSF和/或IL-3的核酸的核酸。在高严格度下与编码例如STAT5、IL-7、GM-CSF和/或IL-3多肽序列的核酸分子杂交的编码例如STAT5、IL-7、GM-CSF和/或IL-3序列的核酸分子或其片段或寡核苷酸可以用作探针来监测用于本公开的诊断方法中的样品中STAT5、IL-7、GM-CSF和/或IL-3的核酸水平的表达。定量核酸水平的方法是本领域常规的和可获得的。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品与检测剂接触，所述检测剂检测表1中所列的一种或多种基因(以及基因产物)的多肽水平或核酸水平。如本文所述，表1列出了与TH1细胞或TH17细胞相比，在TH-GM细胞中差异表达的基因以及在TH-GM细胞的表面上差异表达的基因。
在一个具体的实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品与检测剂接触，所述检测剂检测碱性螺旋-环-螺旋家族成员e40(BHLHe40)、趋化因子(C-C基序)受体4(CCR4)和/或CCR6的多肽水平或核酸水平。
可以使用标准方法来定量任何样品中的多肽水平。这些方法包括例如本领域已知的ELISA、蛋白质印迹、免疫组织化学、使用针对多肽的抗体的荧光激活细胞分选(FACS)、以及定量酶免疫测定技术。这些方法是本领域常规的和可获得的。类似地，用于定量核酸水平(例如mRNA)的方法是本领域已知的。
在本公开的诊断方法中，相对于参考水平，STAT5(例如激活的磷酸化STAT5(Tyr694))、IL-7、GM-CSF和/或IL-3的水平增加则表明所述患者患有TH-GM介导的炎症性病症。
在一些实施方案中，相对于参考水平，STAT5(例如激活的磷酸化STAT5(Tyr694))、IL-7、GM-CSF和/或IL-3水平增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％、至少200％、至少220％、至少240％、至少260％、至少280％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％、至少550％、或至少600％则表明所述患者患有TH-GM介导的炎症性病症。在一个具体的实施方案中，相对于参考水平，增加至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少150％则表明所述患者患有TH-GM介导的炎症性病症。
在一些实施方案中，相对于参考水平，STAT5(例如激活的磷酸化STAT5(Tyr694))、IL-7、GM-CSF和/或IL-3水平没有增加至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少150％则表明所述患者患有非TH-GM介导的炎症性病症。
在某些实施方案中，相对于参考水平，STAT5(例如激活的磷酸化STAT5(Tyr694))、IL-7、GM-CSF和/或IL-3水平相当(或不变)则表明所述患者患有非TH-GM介导的病症。如本文所用的，与参考水平“相当”的水平指的是水平保持不变，或相对于参考水平的变化根据临床标准是统计学上不显著的。在某些实施方案中，相当的水平(或不变的水平)可以包括相对于参考水平，没有增加至少40％、至少50％、至少60％、或至少70％的水平，这是因为例如它可能不指示有临床意义的变化。在一些实施方案中，相对于参考水平，TH-GM介导因子(例如STAT5(例如激活的磷酸化STAT5(Tyr694))、IL-7、GM-CSF和/或IL-3)的水平降低也可以表明所述患者患有非TH-GM介导的病症。
在一些实施方案中，参考水平是用于比较目的的水平，并且可以从例如以下各项获得：先前取自同一患者的样品；正常健康受试者；来自没有自身免疫性疾病或炎症性病症的受试者的样品；被诊断为有患自身免疫性疾病的倾向，但是尚末表现出疾病症状的受试者；已经针对自身免疫性疾病接受治疗的患者；或已知的正常浓度的本公开的纯化参考多肽或核酸分子(例如STAT5)的样品。“参考标准或参考水平”意指源自于参考样品的值或数值、或本领域中被接受为指示健康(例如没有炎症性病症的个体)的值或范围。正常参考标准或参考水平也可以是源自于没有自身免疫性疾病的正常受试者的值或数值。在一个实施方案中，所述参考样品、参考标准、或参考水平通过以下标准中的至少一个与受试者的样品相匹配：年龄、体重、身体质量指数(BMI)、疾病分期、以及总体健康情况。正常参考范围内纯化的DNA、RNA或mRNA的水平的标准曲线也可以用作参考。正常参考范围内纯化的蛋白质的水平的标准曲线也可以用作参考。
在一些实施方案中，已经被诊断或分类为患有TH-GM介导的炎症性病症的患有炎症性病症的患者没有非TH-GM介导的炎症性病症(即没有TNF-α、IL-6、或IL-1β介导的炎症性病症)。也就是说，被诊断为患有TH-GM介导的炎症性病症的患者对TH-GM功能的调节(例如抑制STAT5、IL-7、GM-CSF和/或IL-3)作出响应，但是不对TNF-α治疗作出响应(或表现出有限的响应)，如通过临床标准所确定的那样。然而，如本文所述，TH-GM介导的炎症性病症不排除以下可能性，即所述炎症性病症也部分地(尽管不是主要)由非TH-GM介导的通路(例如TNF-α、IL-6、IL-1β)所引起。
在一些实施方案中，本公开的方法进一步包括向被诊断或分类为患有TH-GM介导的炎症性病症的患者施用有效量的调节TH-GM细胞功能的调节剂。如本文所述，在一些实施方案中，所述调节剂抑制TH-GM功能。
在一些实施方案中，本公开的方法进一步包括向被诊断或分类为患有非TH-GM介导的炎症性病症的患者施用有效量的例如TNF-α治疗、IL-6治疗、或IL-1β治疗，如本文所述的那样。
在一些方面，本公开还提供了一种将患有炎症性病症的患者分类为患有TH-GM介导的炎症性病症或非TH-GM介导的炎症性病症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使从患有炎症性病症的患者采集的样品与检测剂接触，所述检测剂检测TH-GM介导因子，如STAT5(例如磷酸化STAT5(Tyr694))、IL-7、GM-CSF或IL-3或其组合的多肽水平或核酸水平。在某些方面，所述方法进一步包括定量TH-GM介导因子，如STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的多肽水平或核酸水平，其中相对于参考水平，TH-GM介导因子，如STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的水平增加则表明所述患者患有TH-GM介导的炎症性病症；或相对于参考水平，TH-GM介导因子，如STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的水平相当则表明所述患者患有非TH-GM介导的炎症性病症，从而将患有炎症性病症的患者分类为TH-GM介导的炎症性病症或非TH-GM介导的炎症性病症。
在本公开的其它方面，本文所公开的方法可以进一步包括测量介导非TH-GM介导的炎症性病症的因子的多肽水平或核酸水平。这样的因子包括例如TNF-α、IL-6以及IL-1β。
举例来说，在一些方面，本公开提供了一种确定患有炎症性病症的患者的治疗方案的方法。为了说明，所述方法包括定量从患有炎症性病症的患者采集的样品中例如激活的STAT5或GM-CSF的多肽水平或核酸水平，以及定量从所述患者采集的样品中例如TNF-α的多肽水平或核酸水平。可以考虑至少四种情况。
在第一种情况下，如果相对于第一参考水平，激活的STAT5或GM-CSF的水平增加(例如增加至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少150％)并且TNF-α水平与第二参考水平相当，则将所述患者分类为患有TH-GM介导的炎症性病症并且可以用调节TH-GM功能的药剂治疗所述患者，如本文所述。
在第二种情况下，如果激活的STAT5或GM-CSF的水平与第一参考水平相当并且相对于第二参考水平，TNF-α水平增加(例如增加至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少150％)，则将所述患者分类为患有非TH-GM介导的炎症性病症并且可以用例如TNF-α治疗来治疗所述患者。
在第三种情况下，如果相对于第一参考水平，激活的STAT5或GM-CSF的水平增加，并且相对于第二参考水平，TNF-α水平也增加，并且所述增加在临床标准和/或统计标准内是等同的(例如GM-CSF和TNF-α这两者相对于对应的参考水平均增加了至少50％)，则将所述患者分类为患有在同等程度上是TH-GM介导和非TH-GM介导(例如TNF-α介导)的炎症性病症。在这样的情况下，可以用有效量的调节TH-GM功能的药剂和有效量的例如TNF-α治疗来治疗所述患者。如本文所示，这两种药剂的组合可以具有协同作用。
在第四种情况下，如果相对于第一参考水平，激活的STAT5或GM-CSF的水平增加，并且相对于第二参考水平，TNF-α水平也增加，但是一个比另一个增加得更多，则所述炎症性病症主要是由显示出更大增加的通路所介导的。举例来说，如果GM-CSF相对于参考水平增加了40％，并且TNF-α相对于参考水平增加了90％，则所述炎症性病症主要是非TH-GM介导的。然而，在这种情况下，患者可以接受用调节TH-GM功能的药剂以及TNF-α治疗(例如抗TNF-α治疗)的联合治疗，这是因为GM-CSF相对于参考水平增加了例如至少40％。
在一些实施方案中，所述第一参考水平和所述第二参考水平是从相同的参考样品获得的。
在一个相关方面，本公开还提供了一种根据患者的炎症性病症的进展来定制患有炎症性病症的患者的治疗的方法。在上述说明性实例中，第一种情况(TH-GM介导因子，例如STAT5或GM-CSF增加，但是TNF-α水平与参考水平相当)可以表明所述患者处在炎症性病症的早期阶段。不希望受任何具体理论所束缚，在例如炎症性病症的早期阶段期间，初始T细胞受到抗原的刺激并且由IL-7/STAT5程序化以分化成产生GM-CSF/IL-3的TH-GM细胞。在例如炎症性病症的晚期阶段期间，TH-GM细胞因子(例如IL-3和GM-CSF)逐渐刺激更多的炎性细胞，如巨噬细胞和中性粒细胞，从而引起例如TNF-α、IL-6、IL-1β的产生，进而导致全面炎症。因此，在上述说明性实例中，第二种情况(激活的STAT5或GM-CSF的水平与第一参考水平相当并且TNF-α水平增加)可以表明所述患者处在炎症性病症的晚期阶段，该阶段的特征在于例如组织损伤。因此，本公开使得能够根据一种或多种TH-GM介导因子(例如STAT5(例如激活的磷酸化STAT5(Tyr694))、IL-7、GM-CSF和/或IL-3)以及一种或多种非TH-GM介导因子(例如TNF-α、IL-6、IL-1β)的可定量水平来对患者进行预后，从而根据疾病的进展定制治疗。因此，如本领域技术人员所将了解的那样，可以根据如本文所述的一种或多种TH-GM介导因子、以及一种或多种非TH-GM介导因子(例如TNF-α、IL-6、IL-1β)的水平监测患有炎症性病症的患者的疾病进展以确保有效和定制的治疗。
在相关方面，本公开还提供了一种预测有需要的患者的炎症性病症的进展的方法。在一些实施方案中，所述方法包括a)定量从患有炎症性病症的患者采集的第一样品中TH-GM介导因子，如STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的多肽水平或核酸水平；以及b)定量从所述患者采集的第二样品中例如TNF-α、IL-6、或IL-1β或其组合的多肽水平或核酸水平，其中i)相对于第一参考水平，TH-GM介导因子，如STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的水平增加，并且相对于第二参考水平，TNF-α、IL-6、或IL-1β、或其组合的水平不变则表明所述患者处在炎症性病症的早期阶段，如本文所述；或ii)相对于第一参考水平，TH-GM介导因子，如STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的水平不变，并且相对于第二参考水平，TNF-α、IL-6或IL-1β、或其组合的水平增加则表明所述患者处在炎症性病症的晚期阶段，如本文所述。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用有效量的调节TH-GM功能的药剂和/或例如TNF-α治疗，如本文所述。
在一些实施方案中，所述第一样品和所述第二样品是相同的。
在各个方面，本公开还提供了一种分离的GM-CSF分泌型T辅助细胞(TH-GM)群体。在一个实施方案中，所述TH-GM细胞是在信号转导和转录激活因子5(STAT5)和/或IL-7存在下从前体细胞(例如CD4+细胞)分化的，并且其中所述TH-GM细胞表达GM-CSF和IL-3。
在一些实施方案中，所述TH-GM细胞是在抑制IL-12、IFN-γ、TGF-β、和/或IL-6的试剂存在下从前体细胞(例如CD4+细胞)分化的。类似地，前体细胞(例如CD4+前体细胞)向TH-GM细胞的分化受IL-12、IFN-γ、TFG-β和/或IL-6的抑制。
在一些实施方案中，TH-GM细胞是在体外在人工条件下从前体细胞分化的，但是其中所述TH-GM细胞保留如本文所述的生理特性。
在一些实施方案中，所述TH-GM细胞的特征进一步在于表1中所列的一种或多种基因的过表达。举例来说，TH-GM细胞的特征进一步在于例如碱性螺旋-环-螺旋家族成员e40(BHLHe40)、前脑啡肽原(PENK)、IL-2、丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制因子进化枝B成员6b(丝氨酸蛋白酶抑制因子b6b)、神经突蛋白1(Nrn1)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Scd1)、或磷酸三酯酶相关C1q样蛋白3(Pter)、或其组合的过表达。
在一些实施方案中，所述TH-GM细胞的特征进一步在于表1中所列的一种或多种基因的低表达。举例来说，所述TH-GM细胞的特征进一步在于淋巴细胞抗原6复合物基因座A(Ly6a)；CD27；或淋巴细胞选择素(Sell)的低表达。
如本文所述，鉴定介导TH-GM功能(例如它的分化和致病性)的不同的因子(独特于已知介导TH1或TH17的因子)网络使得能够靶向调节TH-GM功能以治疗TH-GM介导的病症，例如由异常的TH-GM功能所引起的病症。因此，在一些方面，本公开提供了一种调节TH-GM功能的方法，所述方法包括使所述TH-GM或分化簇4(CD4+)前体细胞或这两者与调节TH-GM功能的调节剂接触。在一个实施方案中，在体外或体内使所述调节剂与所述TH-GM细胞或CD4+前体细胞接触。
如本文所用的“TH-GM功能”指的是TH-GM细胞的定向、发育、维持、存活、增殖、或活性、或其组合。因此，调节(例如增强或抑制)TH-GM功能的药剂是调节TH-GM细胞的TH-GM定向、发育、存活、增殖、或活性、或其组合的药剂。举例来说，TH-GM功能可以通过调节它的以下方面来调节：从CD4+前体T细胞的定向；已经被定向到TH-GM发育通路的CD4+前体细胞的发育；TH-GM表型的维持；在效应TH-GM细胞发育过程中的存活或增殖；和/或效应TH-GM细胞的活性(例如调节诸如GM-CSF或IL-3的分泌因子的功能)。举例来说，调节TH-GM功能包括但不限于调节：TH-GM细胞的数目；TH-GM细胞的存活；TH-GM细胞的增殖；和/或TH-GM细胞的活性。TH-GM细胞的活性在本文包括如本文所述由细胞因子、趋化因子、生长因子、酶以及TH-GM细胞分泌的其它因子所诱导的活性、以及由与TH-GM细胞直接接触所诱导的活性。
如本文所用的T辅助细胞子集细胞“TH-GM”指的是如下的细胞，所述细胞类似于TH1细胞和TH17细胞，从前体CD4+前体细胞分化，但是经由由不同于和独特于使TH1或TH17细胞亚型定向和发育的已知的因子子集的因子(TH-GM介导因子)子集所介导的通路来定向和发育，如本文所述。在一些实施方案中，TH-GM细胞产生不同的和独特的一组基因(参见例如表1)并且经由与介导TH1或TH17细胞亚型的致病性的已知因子不同的机制和通路产生致病性。举例来说，TH-GM细胞通过IL-7/STAT5功能(它的调节因子)来定向和发育，并且通过GM-CSF/IL-3(它的效应因子)产生致病性。
在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的由TH-GM介导的炎症性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的调节TH-GM细胞功能的调节剂。在某些实施方案中，所述患者先前被诊断为患有如本文所述的TH-GM介导的炎症性病症。
在一些方面，本公开还提供了一种治疗对TNF-α治疗表现出有限的响应的患者的类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的调节TH-GM功能的调节剂。
如本文所用的“有限响应”指的是没有响应或有不显著的响应以使得患者没有被所述治疗所治疗，如通过临床标准所确定。
“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”指的是治疗、预防以及防范并且特别指的是向患者施用药物或进行医疗程序以防范(预防)在患者受到困扰的情况下的病况或事件发生或降低其发生的程度或可能性。它还指的是降低与疾病或病况相关的一个或多个症状的严重程度。在本申请中，它可以指的是改善以下各项中的一个或多个：与炎症性病况或自身免疫性疾病相关的疼痛、肿胀、发红或炎症。如本文所用并且如本领域所完全了解的是，“治疗”是用于获得有益结果或所期望的结果，包括临床结果的方法。出于本公开的目的，有益结果或所期望的临床结果包括但不限于减轻或改善一个或多个症状、降低疾病的程度、使疾病状态稳定(例如不恶化)、延迟或减慢疾病进展、和/或改善或缓和疾病状态。“治疗”还可以意指与在没有接受治疗的情况下预期的存活期相比延长存活期。
药剂的“有效量”是足以实现有益结果或所期望的结果，包括临床结果的量。“有效量”取决于其中应用它的背景。在施用调节自身免疫响应的组合物的背景下，作为TH-GM功能的调节剂的药剂的有效量是与在不施用药剂时所获得的响应相比足以实现这样的调节的量。有效量可以赋予疾病缓解，如压制和/或抑制如本文所定义的TH-GM功能的即时、短期或长期益处。有效量可以在一次或多次施用中施用。如本文所用的“有效量”意图指足以使患者的一个或多个有临床意义的症状减少至少10％、至少25％、至少50％、至少75％的量、或足以使患者的一个或多个有临床意义的症状改善的量。
在一些实施方案中，所述调节剂抑制TH-GM功能以例如减轻炎症。由调节剂(抑制剂)所赋予的抑制作用并不意味着特异性的生物作用机制。实际上，如本文所用的术语“拮抗剂”或“抑制剂”包括与介导TH-GM功能的因子(例如IL-7、IL-7受体、STAT5、GM-CSF、IL-3、IL-2、IL-2受体、PENK、RANKL、JAK1/3、或在TH-GM细胞中差异表达的基因中的任一种，例如表1和表2中的基因)的所有可能的药理学、生理学、以及生物化学相互作用，无论是直接的还是间接的，并且包括与在蛋白质水平和/或核酸水平、或经由另外的机制介导TH-GM功能的因子(或它的活性片段)的相互作用。
在某些实施方案中，抑制TH-GM功能的调节剂包括阻止介导TH-GM功能的因子的功能(例如表达和/或活性)的抗体、多肽(例如结合并且抑制例如IL-7的可溶性受体)、小分子、核酸(例如反义、小干扰RNA分子、短发夹RNA、微RNA)、或蛋白质(例如细胞因子)、或其组合。设计、产生、以及使用这样的抑制剂的方法是本领域已知的和可获得的。
如本文所用的“结合”可与“特异性结合”互换使用，意指识别并且结合天然地包括本公开的多肽的样品，例如生物样品中本公开的多肽，但是基本上不识别并且结合所述样品中的其它分子的多肽(例如可溶性受体)或抗体。在一个实施例中，抗体特异性结合激活的STAT5多肽，而不结合非STAT5多肽。
如本文所用的“抗体”指的是完整抗体或抗体的抗原结合片段，包括已经被修饰或工程化或作为人类抗体的完整抗体或抗原结合片段。
在一个具体的实施方案中，所述抗体结合介导TH-GM功能的因子中的任何一种或多种并且抑制其功能。举例来说，所述抗体结合IL-7、IL-7受体(IL-7R)、IL-2、IL-2受体(IL-2R)、STAT5或詹纳斯激酶1/3(JAK1/3)、或其组合并且抑制其功能。在其它实施例中，所述抗体结合GM-CSF(或它的受体)、IL-3、PENK、或RANKL或其组合并且抑制其功能。在一些实施方案中，所述抗体结合表1中所列的基因并且抑制其功能。在一些实施方案中，所述抗体结合并且抑制蛋白质或其任何功能片段。设计、产生以及使用合适抗体的方法是本领域技术人员已知的和可获得的。适用于本公开中的抗体的实例包括例如达利珠单抗(daclizumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、马利木单抗(mavrilimumab)、MOR103、KB003、那米鲁单抗(namilumab)、以及MOR Ab-022。
术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，并且可以包括全长多肽或其功能片段(例如降解产物、多肽的可变剪接同工型、多肽的酶切割产物)、与底物或配体结合的多肽、或多肽的游离(未结合)形式。术语“功能片段”指的是全长蛋白质的一部分，它保留全长多肽的一些或所有活性(例如生物活性，如结合同源配体或受体的能力)。
在一些实施方案中，抑制TH-GM功能的调节剂可以是直接或间接抑制介导TH-GM功能的因子中的一种或多种的特定生物蛋白(例如细胞因子)。这样的细胞因子包括例如IL-12、IFN-γ、TGF-β以及IL-6。
在一些实施方案中，抑制TH-GM功能的调节剂可以是直接或间接抑制介导TH-GM功能的因子中的一种或多种的小分子。如本文所用的“小分子”是具有生物活性并且不是聚合物的有机化合物或与无机化合物(例如金属)络合的这样的化合物。小分子一般具有小于约3千道尔顿的分子量。已知小分子的实例包括CAS 285986-31-4(Calbiochem公司)、匹莫齐特(pimozide)、以及托法替尼(tofacitinib)。
在其它实施方案中，调节剂在诸如病毒感染、真菌感染以及细菌感染、癌症和/或与其相关的病况的病症中增强TH-GM功能。在一个实施方案中，增强TH-GM功能的调节剂包括例如CD28激活剂；初始(前体)CD4+T细胞上的IL-7和/或IL-2；STAT5的激活剂；或TH-GM细胞的效应因子(例如GM-CSF、IL-3)。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的由STAT5介导的炎症性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的调节STAT5功能的药剂。
如本文所用的“STAT5介导的”炎症性病症指的是一种炎症性病症，所述炎症性病症是由异常的STAT5功能(异常增强或抑制)所引起，并且对STAT5功能的调节有响应，如通过临床标准所确定。在一些实施方案中，STAT5是激活的STAT5(例如磷酸化STAT5(Tyr694))。
在一些实施方案中，所述炎症性病症是自身免疫性病症。在某些实施方案中，所述炎症性病症可以是由STAT5(例如激活的STAT5)介导的任何炎症性病症，并且包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、糖尿病、桥本氏甲状腺炎、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、肠易激综合征(IBS)、红斑狼疮、风湿性多肌痛、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏综合征/现象、反应性关节炎(赖特综合征)、类肉瘤病、硬皮病、休格伦氏综合征、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、或血管炎。
在一些实施方案中，术语“患者”指的是哺乳动物，优选是人类，但也可以包括需要兽医治疗的动物，例如伴侣动物(例如狗、猫等)、农畜(例如牛、羊、猪、马等)、以及实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
在一些实施方案中，所述药剂抑制STAT5功能(例如表达和/或活性)。抑制STAT5(例如激活的STAT5(Tyr694))的药剂的实例描述于本文中。
在某些实施方案中，本公开的方法进一步包括向患者施用TNF-α治疗。在某些实施方案中，向被确定为患有非TH-GM介导的炎症性病况的患者施用TNF-α治疗。如本文所述，在某些实施方案中，如果定量的TNF-α水平相对于参考水平增加了例如至少40％，那么施用TNF-α治疗。
TNF-α治疗的实例包括基于TNF-α抑制剂的治疗、以及不基于TNF-α抑制剂的治疗。具体来说，基于TNF-α抑制剂的治疗包括依那西普(etanercept)、阿达木单抗(adalimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、戈利木单抗(golimumab)、以及聚乙二醇结合赛妥珠单抗(certolizumab pegol)。不基于TNF-α抑制剂的治疗的实例包括皮质类固醇药物(例如泼尼松(prednisone))、非类固醇抗炎药(例如甲氨蝶呤(methotrexate))、以及JAK抑制剂(例如托法替尼)。不基于TNF-α抑制剂的治疗的其它实例包括阿那白滞素(anakinra)、阿巴西普(abatacept)、利妥昔单抗(rituximab)以及托珠单抗(tocilizumab)。
可以在施用有效量的调节TH-GM功能的药剂之前、同时或之后施用TNF-α治疗。因此，调节TH-GM功能的药剂和TNF-α治疗可以共同在单次剂量中施用，或可以在分开的剂量中施用，例如同时或依次、或这两者。施用调节TH-GM功能的药剂与TNF-α治疗之间的持续时间将取决于一种或多种治疗剂的性质。此外，调节TH-GM功能的药剂和TNF-α治疗可能按照或可能不按照相似的给药方案来施用。举例来说，调节TH-GM功能的药剂和TNF-α治疗可能具有不同的半衰期和/或在不同的时间标度上起作用以使得调节TH-GM功能的药剂比TNF-α治疗以更大的频率施用，或反之亦然。施用治疗剂之间的天数可以由本领域普通技术人员，根据每一种药物的安全性和药效动力学来适当地确定。
鉴定TH-GM细胞以及鉴定相对于TH1或TH17由TH-GM细胞差异产生的基因使得能够使用TH-GM细胞来鉴定用于调节TH-GM功能的新型治疗剂，从而使得用于治疗TH-GM介导的病症(例如炎症性病症)的新治疗剂成为可能。因此，在另外的方面，本公开提供了一种进行筛选以鉴定TH-GM细胞功能的调节剂的方法，所述方法包括使分离的TH-GM细胞群体、或分离的CD4+前体细胞群体与候选药剂接触，以及测量在存在或不存在所述候选药剂的情况下TH-GM功能的读数，其中TH-GM功能的读数发生变化则表明所述候选药剂是TH-GM功能的调节剂。
如本文所用的候选药剂指的是可以通过调节介导TH-GM功能的因子的功能(例如表达和/或活性)来调节TH-GM功能的药剂。这样的候选药剂包括例如抗体、肽、小分子、核酸(例如反义、小干扰RNA分子)、或蛋白质(例如细胞因子)、或其组合。候选药剂可以被设计成靶向如本文所述介导TH-GM功能的因子中的任一种(在蛋白质水平和/或核酸水平)，包括表1中所列的基因(例如在TH-GM细胞中优先上调的基因、在TH-GM细胞表面上优先过表达/低表达的基因)。
如本文所用的“读数”指的是可以被测量或定量的TH-GM功能的任何变化(或没有变化)。举例来说，可以评估候选药剂对例如TH-GM细胞的GM-CSF分泌的作用、或对TH-GM细胞的丰度的作用(经由对TH-GM细胞的定向/发育/增殖的作用)，如本文所述。用于确定这样的读数的测定是本领域已知的和可获得的，并且在本文举例说明。
在一些实施方案中，在候选药剂存在下的变化是读数的测量结果的降低，这表明对TH-GM功能的抑制(例如GM-CSF或IL-3的产生减少、或TH-GM细胞丰度的减少)，从而将所述候选药剂鉴定为TH-GM功能的抑制剂。
在某些实施方案中，在候选药剂存在下的变化是读数的测量结果的增加，这表明TH-GM功能的增强(例如GM-CSF或IL-3的产生增加、或TH-GM细胞丰度增加)，从而将所述候选药剂鉴定为TH-GM功能的增强剂。
在一些实施方案中，所述读数可以是表1和表2中所列的在TH-GM细胞中优先上调或下调的基因中的任何一种或多种。因此，下调在TH-GM细胞中优先上调的基因的候选药剂是TH-GM功能的抑制剂。类似地，上调在TH-GM细胞中优先下调的基因的候选药剂是TH-GM功能的增强剂。
在某些方面，如果用前体CD4+细胞进行，那么在TH-GM极化条件下进行筛选方法，如本文所述。举例来说，可以在IL-7/STAT5、TCR激活、CD28共刺激与阻断IFN-γ和IL-4的组合存在下进行所述方法。
除非另有说明，否则本文所述的术语的定义适用于本公开的所有方面和实施方案。
本公开的实施包括使用分子生物学(如重组DNA)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学、以及免疫学的常规技术，如例如以下文献中所述：Molecular Cloning:ALaboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》),第2版(Sambrook等,1989)和MolecularCloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》),第3版(Sambrook和Russel,2001)，在本文共同和单独地称为“Sambrook”；Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》)(M.J.Gait编著,1984)；Animal Cell Culture(《动物细胞培养》)(R.I.Freshney编著,1987)；Handbook of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》)(J.M.Miller和M.P.Calos编著,1987)；Current Protocols inMolecular Biology(《最新分子生物学方案》)(F.M.Ausubel等编著,1987，包括直到2001年的增刊)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(《PCR：聚合酶链反应》)(Mullis等编著,1994)；Current Protocols in Immunology(《最新免疫学方案》)(J.E.Coligan等编著,1991)；The Immunoassay Handbook(《免疫测定手册》)(D.Wild编著,Stockton Press NY,1994)；Bioconjugate Techniques(《生物缀合技术》)(Greg T.Hermanson编著,AcademicPress,1996)；Methods of Immunological Analysis(《免疫分析方法》)(R.Masseyeff,W.H.Albert以及N.A.Staines编著,Weinheim:VCH Verlags gesellschaft mbH,1993)；Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》),ColdSpring Harbor Publications,New York，以及Harlow和Lane(1999)Using Antibodies:ALaboratory Manual(《使用抗体：实验室手册》),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，在本文共同和单独地称为“Harlow和Lane”)；Beaucage等编著,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(《最新核酸化学方案》)(John Wiley&Sons公司,New York,2000)；以及Agrawal编著,Protocols for Oligonucleotides andAnalogs,Synthesis and Properties(《用于寡核苷酸和类似物、合成以及特性的方案》)(Humana Press公司,New Jersey,1993)。
例证
方法
小鼠
Stat5f/f小鼠是由L.Hennighausen(国家糖尿病和消化病和肾病研究所(NationalInstitute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases))提供的。如所述产生Stat3f/f小鼠2。Cd4-Cre转基因小鼠购自Taconic Farms公司。Rag2-/-小鼠是从Jean-PierreAbastado(新加坡免疫学信息网(Singapore Immunology Network))获得的。所有的小鼠均具有C57BL/6遗传背景并且关养在新加坡国立大学(National University of Singapore)无特定病原体条件下。所有的实验均是用6周-8周大的小鼠进行的并且由NUS的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。
患者和对照
血液样品(n＝47)和滑液样品(n＝3)是从到南京大学医学院(NanjingUniversity Medical School)附属鼓楼医院(Affiliated Drum Tower Hospital)的风湿免疫科(Department of Rheumatology and Immunology)就诊的RA患者采集的。所有患者均符合美国风湿病学会(American College of Rheumatology)RA分类标准。年龄和性别匹配的健康对照(n＝32)是从附属鼓楼医院的体检中心(Medical Examination Center)获得的。研究方案由南京大学医学院附属鼓楼医院的伦理委员会(Ethics Committee)批准。
体外T细胞分化
通过阳性选择和磁性分离(美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotech))从脾脏和淋巴结中获得CD4+T细胞，继而纯化用FACS Aria分选的初始CD4+T细胞群体(CD4+CD25-CD62LhiCD44lo)。将初始CD4+T细胞在中和抗体和细胞因子的不同组合存在下用板结合的抗CD3(3μg/ml；BD Pharmingen公司)和抗CD28(1μg/ml；BD Pharmingen公司)刺激3天-4天：对于中性条件，不添加任何细胞因子或中和抗体；对于TH 1条件，IL-12(10ng/ml)和抗IL-4(10μg/ml，BD Pharmingen公司)；对于TH 17条件，hTGF-β(3ng/ml)、IL-6(20ng/ml)、抗IFN-γ(10μg/ml，eBioscience公司)、以及抗IL-4(10μg/ml)；对于替代的TH 17条件，IL-6(20ng/ml)、IL-23(10ng/ml)、IL-1β(10ng/ml)、抗IFN-γ(10μg/ml)以及抗IL-4(10μg/ml)。对于表达GM-CSF的细胞分化，在添加如所示的IL-7和/或抗IFN-γ(10μg/ml)的情况下，用板结合的抗CD3(2μg/ml)和可溶性抗D28(1μg/ml)刺激初始CD4+T细胞。所有细胞因子均是从R&D系统公司(R&D Systems)获得的。将所有细胞培养在补充有10％FBS、100单位/毫升的青霉素、0.1mg/ml链霉素、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸以及5μMβ-巯基乙醇的RPMI1640中。在3天-4天极化之后，将细胞洗涤并且在Golgiplug存在下用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素再刺激4小时-5小时，继而用来自BD Pharmingen公司的Cytofix/Cytoperm试剂盒固定和细胞内染色。用来自eBioscience公司的试剂盒进行Foxp3染色。在LSR II(碧迪生物科技公司(BD Biosciences))上获取细胞并且使用FlowJo软件(Tree Star公司)分析。
EAE诱发
EAE诱发程序修改自先前的报道3。对于活动性EAE诱发，在第0天和第7天，在后侧腹上的两个部位用于含有5mg/ml热灭活的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)菌株H37Ra(Difco公司)的100μl CFA中300μg的MOG35-55对小鼠进行免疫接种。在第1天和第8天，以每只小鼠500ng的剂量腹膜内施用百日咳毒素(List Bio Lab公司)。对于单次MOG35-55/CFA免疫接种，仅在第0天和第1天进行类似的程序。在替代的活动性EAE诱发中，使用LPS(于IFA中600μg/ml，来自西格玛公司(Sigma)的O111:B4)作为佐剂。对于在Rag2-/-小鼠中的活动性EAE诱发，转移源自于Stat5f/f或Cd4-Cre；Stat5f/f小鼠的CD4+T细胞，继而如上文所述进行MOG35-55/CFA免疫接种。如下对临床症状评分：0分：没有临床体征；1分：丧失尾部紧张度；2分：步态摇摆；3分：后肢麻痹；4分：后肢和前肢麻痹；5分：死亡。每隔一天以每只小鼠200μg腹膜内施用IL-7Rα中和抗体(SB/14，BD Pharmingen公司)和同种型对照。对于分析CNS浸润性细胞，从灌注的小鼠收集脊髓和脑这两者并且切碎，并且通过用Percoll(通用电气医疗公司(GE Healthcare))梯度离心来分离单核细胞。
对于用Stat5+/+或Stat5-/-CD4+T细胞的被动EAE诱发，在免疫接种后的10天-14天时收集脾细胞和LN并且使其通过70μm细胞过滤器(BD Falcon公司)。在IL-23(5ng/ml)和IL-1β(2ng/ml)存在下，将细胞在体外与MOG35-55(20μg/ml)一起培养3天。在收集之后，将CD4+T细胞通过阳性选择纯化到纯度>90％。将CD4+T细胞(于无菌PBS中200万个)腹膜内注射到Rag2-/-小鼠体内，继而在第二天施用百日咳毒素。每天针对如上文所述的EAE体征来观测小鼠。对于通过转移各种TH子集进行的EAE诱发，如上文所述进行类似的程序。不同的子集偏向条件如下：非偏向，仅MOG35-55；TH1：MOG35-55加上IL-12(10ng/ml)和抗IL-4(5μg/ml)；TH17：MOG35-55加上TGF-β(3ng/ml)、IL-6(10ng/ml)、抗IFN-γ(5μg/ml)以及抗IL-4(5μg/ml)；表达GM-CSF的TH：MOG35-55加上IL-7(2ng/ml)和抗IFN-γ(5μg/ml)。每只接受体小鼠转移6×105个CD4+T细胞。
抗原诱发的关节炎(AIA)
简单地说，在第0天，在后侧腹上的两个部位用于含有5mg/ml热灭活的结核分枝杆菌菌株H37Ra(Difco公司)的100μl完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant，CFA)中的100μg甲基化牛血清白蛋白(mBSA，西格玛公司)对小鼠进行皮下免疫接种。在第1天，以每只小鼠250ng的剂量腹膜内施用百日咳毒素(List Bio Lab公司)。通过在免疫接种之后第7天向右后膝关节中关节内注射100μg的mBSA(于10μl盐水中)来诱发关节炎。向左后膝关节中注射相同体积的盐水作为对照。通过在关节炎诱发之后的7天内用卡尺测量右膝关节直径与左膝关节直径之间的差异来记录关节肿胀。为了评估GM-CSF施用的作用，通过向右膝关节中关节内注射单独的mBSA或向左膝关节中关节内注射补充有100ng GM-CSF(ImmunoTools公司)的mBSA来诱发AIA。为了评估阻断GM-CSF和/或TNF-α的作用，在所示的时间向小鼠腹膜内施用对GM-CSF(MP1-22E9，BD Pharmingen公司)和/或TNF-α(MP6-XT3，BDPharmingen公司)具有特异性的中和抗体(每只小鼠每一种抗体100μg)。
对于通过过继转移进行的AIA诱发，在第7天从接受mBSA/CFA免疫接种的小鼠分离脾细胞和腹股沟LN细胞，并且在体外在IL-7(2ng/ml)存在下与mBSA(10μg/ml)一起培养3天。在收集之后，将CD4+T细胞通过阳性选择(美天旎生物技术公司)纯化到纯度>90％。然后，将CD4+T细胞(于无菌PBS中100万个)转移到野生型未实验过的小鼠体内，继而在第二天关节内注射mBSA。
胶原诱发的关节炎(CIA)
以与如上文所述的AIA相似的程序诱发CIA，这是通过用鸡胶原II/CFA乳液(购自Chondrex公司)对小鼠进行免疫接种，继而进行百日咳毒素注射来实现的。监测小鼠并且对关节炎评分：0分：正常；1分：踝关节或腕关节轻度肿胀或限于单个足趾的明显肿胀；2分：整个足爪中度肿胀；3分：整个足爪重度肿胀伴有关节僵硬。将每一只小鼠的四肢分数相加。
组织学分析
对于石蜡包埋的组织，将脊髓在4％PFA中固定。取出膝关节或足爪，在10％福尔马林中固定并且在5％甲酸中脱钙，之后脱水和包埋。将切片(5μm)用苏木精和伊红(H&E)染色以评估免疫细胞浸润和炎症，或用番红精-O/固绿染色以评估软骨消耗。对于冷冻的组织，将脊髓包埋于OCT(Tissue-Tek)中并且在干冰上快速冷冻。将切片(10μm)在冰冷丙酮中固定并且用一级抗CD4(Biolegend公司)和抗CD11b(eBioscience公司)染色，继而与荧光缀合的二抗(英杰公司(Invitrogen))一起孵育。对于AIA实验，将膝关节在10％福尔马林中固定5天，继而在5％甲酸中脱钙5天。将切片(10μm)用苏木精和伊红(H&E)染色以评估免疫细胞浸润和炎症，或用番红精-O/固绿染色以评估软骨破坏。
细胞分选和迈格林华(May Grünwald)-吉姆萨染色
用FACS Aria从脾脏或滑膜单细胞悬浮液中分选在CD45+CD11b+上门控的单核白细胞/巨噬细胞(Ly6ChiLy6G-)和中性粒细胞(Ly6CloLy6Ghi)。将分选的细胞在载玻片上细胞离心涂片，随后遵循标准程序用迈格林华和吉姆萨染料染色。
实时PCR
用RNeasy试剂盒(快而精公司(Qiagen))，根据制造商的说明书从细胞中提取总RNA。用Superscript逆转录酶(英杰公司)合成互补DNA(cDNA)。通过7500实时PCR系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems))，用SYBR qPCR试剂盒(KAPA公司)测量基因表达。使用肌动蛋白b、Gapdh或Rn18S作为内参。引物序列可应要求提供。
ELISA
通过Ready-SET-Go ELISA试剂盒(eBioscience公司)测定TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、GM-CSF以及IL-2的水平，并且通过DuoSet ELISA试剂盒(R&D系统公司)，根据制造商的说明书来测量IL-17水平。
染色质免疫沉淀测定
将从Stat5f/f或Cd4-Cre；Stat5f/f小鼠分离的CD4+T细胞用板结合的抗CD3和抗CD28激活3天。将细胞用IL-7(20ng/ml)或IL-2(25ng/ml)刺激45分钟。通过添加1％最终浓度的甲醛10分钟，继而用甘氨酸淬灭来进行交联。将细胞裂解物通过超声处理破碎并且用蛋白G Dynabeads磁珠预清除，随后在4℃用抗STAT5抗体(圣克鲁斯公司(Santa Cruz))或正常兔IgG(圣克鲁斯公司)沉淀过夜。在洗涤和洗脱之后，通过在65℃孵育8小时来进行交联反转。如先前所述5，通过RT-PCR，用对Csf2启动子具有特异性的引物纯化和分析洗脱的DNA。
统计方法
使用GraphPad Prism 6.01，通过学生t检验(Student's t test)确定统计显著性。p值<0.05被认为具有显著性。通过用于多重比较的双因素多范围方差分析(ANOVA)来确定临床分数的p值。除非另外说明，否则数据是以平均值和平均值的标准误差(平均值±SEM)呈现的。
实施例1：Stat5条件敲除小鼠对EAE具有抗性
STAT5通过限制IL-17产生来负调节TH17分化(Laurence等,2007；Yang等,2011)。然而，STAT5在TH17介导的发病机制中的功能尚未完全了解。为了研究这个问题，在Cd4-Cre；Stat5f/f(Stat5-/-)小鼠(其中Stat5在T细胞隔室中特异性缺失)以及同窝对照中通过在第0天和第7天用MOG35-55/CFA对小鼠进行免疫接种来诱发EAE。通过每天指定临床分数来评估麻痹的发展。惊人的是，观测到在Stat5-/-小鼠中临床疾病的发生率和严重程度减低(图1A和1B)，这一结果与基于STAT5在TH17产生中的拮抗作用的预期是相反的。当进行单次MOG35-55/CFA免疫接种或用LPS代替CFA作为佐剂来诱发EAE时，观测到类似的结果(图1C和1D)。与Stat5-/-小鼠的EAE疾病减轻相一致，观测到Stat5-/-小鼠的脊髓中免疫细胞浸润的显著减少(图2A)。此外，在Stat5-/-小鼠中，各种免疫细胞群体，包括CD4+细胞、CD8+细胞、B220+细胞以及CD11b+细胞的浸润减少(图2B-D并且数据未示)。然而，在Stat5+/+小鼠与Stat5-/-小鼠之间，CNS中CD4+T细胞当中IL-17+和IFN-γ+细胞的出现率是相当的(图3A)，这表明Stat5-/-小鼠对EAE的抗性与TH1和TH17细胞发育无关。然而，检测到Stat5-/-小鼠的CNS中CD4+CD25+Treg群体减少(图3B)，这表明Stat5-/-小鼠对EAE的抗性不太可能是由于Treg细胞发生改变。
实施例2：Stat5突变型小鼠对EAE的抗性归因于抗原特异性CD4+T细胞的内在缺陷而与TH1和TH17产生无关
Stat5缺失(Cd4-cre；Stat5f/-)小鼠被报道会产生外周淋巴细胞减少，伴有CD4+和CD8+T细胞这两者的减少(Yao等,2006)。然而，另一项研究显示Stat5缺失(Cd4-cre；Stat5f /f)不影响外周CD4+T细胞的比例(Burchill等,2007)。在实验环境中，在EAE产生期间没有因Stat5缺失而检测到外周CD4+T细胞的绝对数量的变化(图4A和4B)，这表明Stat5-/-小鼠对EAE的抗性不是由外周淋巴细胞减少所引起。此外，在Stat5-/-小鼠的脾脏中的CD4+T细胞当中检测到IL-17+和IFN-γ+细胞的出现率增加(图4C)，这进一步支持了以下想法，即Stat5-/-小鼠对EAE的抗性可能与TH1和TH17产生无关。为了验证STAT5在TH1和TH17产生中的功能，通过在TH1和TH17极化条件下激活初始CD4+T细胞来进行体外分化。与先前的报道相一致，即STAT5介导了IL-2对TH17分化的抑制作用(数据未示)。有趣的是，没有观测到也经由STAT5进行信号转导的IL-7对TH17分化有明显的作用(数据未示)。然而，当STAT5缺失时，观测到在TH1极化条件下IFN-γ+细胞略微减少(数据未示)。
为了确认Stat5-/-小鼠对EAE的抗性是否是由CD4+T细胞所介导，将Rag2-/-小鼠用Stat5+/+或Stat5-/-CD4+T细胞重建，继而诱发EAE。我们发现与接受野生型细胞的小鼠相比，接受Stat5-/-CD4+T细胞的Rag2-/-小鼠对疾病具有抗性(数据未示)，这证实了Stat5-/-CD4+T细胞在它们促进EAE产生的能力方面受损。
随后，研究缺乏致脑炎作用是否是由Stat5-/-CD4+T细胞向CNS迁移方面的缺陷所引起。已经证实趋化因子受体CCR6对于TH17细胞经由脉络丛进入CNS中来说是必要的(Reboldi等,2009)。因此，研究Stat5-/-和Stat5+/+CD4+T细胞这两者中的CCR6表达。观测到与Stat5+/+对照相比，Stat5-/-小鼠的脾脏中CD4+CCR6+细胞增加(图5A)。还研究了CXCR3和CD69的表达，显示在不存在STAT5的情况下在CD4+T细胞中这两种分子的表达增加(图5A)。这些结果表明Stat5-/-CD4+T细胞可以浸润CNS。此外，观测到(在第7天和第9天)在EAE诱发期间Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠的CNS中存在的CD4+T细胞的数目相当(图5B)。然而，Stat5-/-小鼠的CNS中的CD4+T细胞在疾病发病期间(第21天)显著下降(图5C和5D)。总之，这些结果证实Stat5-/-CD4+T细胞可以浸润CNS，但是不能诱发EAE中CNS中的有效炎症。
为了进一步排除Stat5缺陷型小鼠对EAE的抗性是由CNS中自身反应性CD4+T的存活方面的任何潜在缺陷所引起的可能性，分别将与野生型细胞相比增加数目的Stat5-/-CD4+T细胞转移到Rag2-/-小鼠体内以确保在EAE产生期间在CNS中存在相当数目的自身反应性CD4+T细胞。如图6A和6B中所示，尽管在两组小鼠之间CNS中CD4+T细胞的数目相似，但是在接受Stat5缺陷型CD4+T细胞的小鼠中仍然观测到疾病严重程度减低。此外，观测到一定数目的Stat5缺陷型小鼠在EAE疾病高峰期时在CNS中含有与野生型小鼠相似数目的CD4+T细胞，然而，它们与那些野生型小鼠相比对EAE相对具有抗性(图6C)，这进一步表明Stat5缺陷型小鼠对EAE疾病的抗性不太可能是由于CNS中CD4+T细胞存活受损。
为了进一步研究这些观测结果与Stat5-/-CD4+T细胞的内在损伤之间的因果关系，分别将MOG35-55特异性Stat5+/+和Stat5-/-CD4+T细胞转移到Rag2-/-小鼠体内而不进行进一步的免疫接种以测试这些细胞是否能够介导EAE产生。如图7A和7B中所示，在转移之后的1周时，接受Stat5+/+CD4+T细胞的小鼠自发地产生EAE疾病。相反，接受Stat5-/-CD4+T细胞的小鼠具有显著降低的疾病严重程度和发病率。在两组之间，Rag2-/-小鼠的CNS中CD4+T细胞当中IL-17+和IFN-γ+细胞的出现率是相当的(图7C)，这进一步表明Stat5-/-CD4+T细胞的致脑炎作用的内在缺陷与TH1和TH17无关。为了排除CD8+T细胞在Stat5-/-小鼠中所观测到的对EAE的抗性中的可能作用，将Rag2-/-小鼠用MOG35-55特异性Stat5+/+或Stat5-/-CD4+T细胞以及相等数目的Stat5+/+CD8+T细胞重建。Stat5-/-CD4+T细胞以及Stat5+/+CD8+T细胞的转移仍不能诱发EAE(数据未示)。总之，这些数据证实Stat5-/-CD4+T细胞在致脑炎作用方面具有内在缺陷。本文所引用的所有专利、公开的申请以及参考文献的相关教导以引用的方式整体并入本文。
实施例3：Stat5-/-CD4+T细胞中GM-CSF的表达减少
为了测试GM-CSF的产生是否因Stat5缺失而受损，在MOG35-55特异性Stat5+/+和Stat5-/-CD4+T细胞中研究它的表达。将源自于接受MOG35-55/CFA免疫接种的Stat5+/+小鼠和Stat5-/-小鼠的脾细胞用各种浓度的MOG35-55攻击24小时，以研究GM-CSF的分泌。观测到在Stat5+/+细胞中，GM-CSF的产生以MOG35-55剂量依赖性方式增加(图8A)。相反，在所有条件下，在Stat5-/-细胞中，GM-CSF的产生严重减少。为了进一步验证这一点，在EAE产生期间，在GolgiPlug存在下用PMA/离子霉素刺激源自于小鼠的脾细胞以进行GM-CSF和IL-17细胞内染色。尽管在Stat5-/-细胞中IL-17的表达增强，但是在不存在STAT5的情况下在CD4+CD44hi细胞当中观测到GM-CSF+IL-17-细胞和GM-CSF+IL-17+细胞的比例显著减少(图8B)。此外，在Stat5-/-小鼠的脾脏中，MOG35-55特异性GM-CSF+T细胞的出现率也显著减少(图8C)。总之，这些结果表明STAT5是为自身反应性CD4+T细胞中GM-CSF的表达所需的。然而，STAT3作为TH17分化中的一种重要的转录因子是为GM-CSF表达所需的(图8D)。
随后，研究在EAE产生期间CNS中GM-CSF的诱导。尽管CNS浸润性CD4+T细胞的IL-17和IFN-γ产生没有因Stat5缺陷而受损，但是与对照小鼠相比，检测到Stat5-/-小鼠的CNS中CD4+GM-CSF+细胞的出现率减少(图9A)。进一步分析显示CD4+IL-17+细胞当中和CD4+IFN-γ+细胞当中GM-CSF+的百分比减少(图9A)。类似地，与对照小鼠相比，接受MOG35-55特异性Stat5-/-CD4+T细胞转移的Rag2-/-小鼠也显示出CNS中CD4+GM-CSF+T细胞的出现率减少(图9B)。在EAE诱发之后第8天，当在Stat5-/-小鼠和Stat5+/+小鼠中检测到相当的CD4+T细胞浸润(图5C和5D)时，Stat5-/-小鼠的CNS中GM-CSF的mRNA表达显著低于Stat5+/+小鼠(图9C)。同时，在Stat5-/-小鼠与Stat5+/+小鼠之间没有检测到IL-17和IFN-γ表达的显著性差异(图9C)。在后期阶段(第14天，图9C)Stat5-/-小鼠的CNS中细胞因子诱导(IL-17和IFN-γ)受损可以由Stat5-/-CD4+T不能维持神经炎症来说明(图5C和5D)。有趣的是，在CNS中GM-CSF诱导在IL-23诱导之前(图9C)，这表明IL-23可能不为在EAE的诱发阶段中GM-CSF的表达所需。综上所述，所述结果表明自身反应性CD4+T细胞中GM-CSF的表达是受STAT5调节的并且在不存在STAT5的情况下GM-CSF的产生受损使得所述小鼠对EAE具有抗性。
实施例4：IL-7-STAT5信号转导诱导自身反应性CD4+T细胞中GM-CSF的表达并且促进神经炎症
随后，研究STAT5调节GM-CSF表达的机制。如本公开所表明的那样，IL-23和IL-1β似乎都不是强效的STAT5刺激物(图10A)。此外，在Stat5-/-CD4+T细胞中，IL-1R1表达没有变化，而IL-23Rα表达增加(图10B)。这些数据表明STAT5诱导GM-CSF表达的能力可能与IL-23和IL-1β信号转导无关。相反，IL-2和IL-7这两者通过诱导酪氨酸磷酸化来强效地激活STAT5(图10A)。因此，进一步研究这两种细胞因子对自身反应性T细胞中的GM-CSF诱导的作用。用MOG35-55单独或MOG35-55加上IL-2来攻击源自于接受MOG35-55免疫接种的野生型小鼠的脾细胞。通过细胞内细胞因子染色来分析CD4+T细胞的GM-CSF和IL-17产生。如图10C中所示，IL-2对GM-CSF+T细胞的出现率显示出不太大的作用。相反，IL-7显著地促进IL-17-CD4+CD44hi T细胞和IL-17+CD4+CD44hi T细胞这两者中GM-CSF的表达(图11A)。此外，IL-7以STAT5依赖性方式发挥这一功能，这是因为Stat5缺失会消除它对GM-CSF表达的作用，如通过细胞内细胞因子染色和ELISA所评估(图11A下图和图11B)。
IL-7Rα在CD62LhiCD44lo T细胞和CD62LloCD44hi T细胞这两者中表达，这表明IL-7可以直接作用于CD4+T细胞以调节GM-CSF表达。因此，在EAE产生期间从Stat5-/-小鼠和同窝对照分选CD62LhiCD44lo T细胞和CD62LloCD44hi T细胞，然后在存在或不存在IL-7的情况下激活细胞。如图11C中所示，CD62LloCD44hi T细胞强效地表达GM-CSF，而CD62LhiCD44lo T细胞表达1/30的GM-CSF量。STAT5缺失使得CD62LloCD44hi T细胞中基础GM-CSF的产生减少。如所预期，IL-7以STAT5依赖性方式促进CD4+T细胞的这两个子集中GM-CSF的表达(图11C)。
为了研究自身反应性CD4+T细胞中由IL-7诱导的GM-CSF表达对EAE产生的作用，在EAE产生期间用IL-7Rα特异性抗体(克隆SB/14)处理小鼠。所述处理使得疾病严重程度显著降低，这伴随着CNS炎症减轻(图12A和12B)。与先前的报道(Lee等,2012)相一致，这种中和抗体没有T细胞消耗活性(图12C)。值得注意的是，阻断IL-7信号转导使得CNS浸润性CD4+T细胞中GM-CSF的表达减少(图12D-12F)。综上所述，本发明的发现表明IL-7诱导自身反应性CD4+T细胞中的STAT5依赖性GM-CSF表达，这促进神经炎症的产生。
实施例5：表达GM-CSF的TH细胞不同于TH17和TH1
由于TH17和TH1这两者均可以产生GM-CSF，因此确定IL-7刺激的表型是否与这些子集中的任一个有关。为了进一步了解表达GM-CSF的CD4+细胞的特征，在TH1或TH17极化条件下用板结合的抗CD3和可溶性抗CD28刺激初始CD4+T细胞。观测到抗CD3以及抗CD28诱导GM-CSF的表达(图14A)。然而，虽然如所预期，TH1分化条件促进IFN-γ表达并且TH17条件促进IL-17表达，但是TH1分化条件和TH17分化条件这两者均极大地抑制了GM-CSF的产生(图13A和13B)。相反，IL-12和IFN-γ的中和促进了表达GM-CSF的细胞的产生(图13A)，这与先前的报道一致(Codarri等,2011)。IL-23和IL-1β不增加初始CD4+T细胞分化成表达GM-CSF的细胞(图13A)，这与发现初始CD4+T细胞不表达它们的受体相一致。TGF-β抑制GM-CSF表达(El-Behi等,2011)。IL-6作为对于TH17分化来说一种必要的细胞因子对GM-CSF表达有深远的抑制作用(图14B)，这表明STAT3可能是负调节因子。为了解决这个问题，从Stat3-/-小鼠纯化初始CD4+T细胞以进行细胞分化。惊人的是，在不存在STAT3的情况下，在TH17条件下极化的细胞表达GM-CSF(图14C)。有趣的是，即使在没有外源性IL-6的情况下，STAT3对表达GM-CSF的细胞分化仍有中等的抑制作用(图14C)。此外，RORγt和T-bet已经被报道对于CD4+T细胞中GM-CSF的表达是不必要的(El-Behi等,2011)。因此，本发明的数据支持了其中表达GM-CSF的CD4+T细胞经由不同于TH17和TH1的谱系发育的模型。
实施例6：IL-7-STAT5将表达GM-CSF的TH细胞分化程序化
本文所公开的本发明的发现(包括例如，在体内Stat5-/-CD4+T细胞中GM-CSF的表达减少；初始CD4+T细胞中由IL-7/STAT5介导的对GM-CSF表达的诱导；以及表达GM-CSF的TH细胞与TH1细胞和TH17细胞相比具有不同的特征)表明了一种由IL-7-STAT5信号转导调节的不同的TH细胞子集。通过在不同浓度的IL-7存在下用抗CD3和抗CD28激活初始CD4+T细胞以在体外研究表达GM-CSF的TH细胞的分化来进一步研究这一发现。如图15A和15B中所示，IL-7强烈地促进表达GM-CSF的细胞的产生和GM-CSF分泌。此外，STAT5介导了由IL-7所引起的表达GM-CSF的TH的产生。在没有STAT5的情况下，IL-7不能促进表达GM-CSF的细胞的产生(图15C和15D)。进一步研究显示IL-7诱导的STAT5激活直接结合Csf2基因的启动子区(图15E和15F)。
在表达GM-CSF的TH分化期间产生小比例的表达IFN-γ的细胞(图15A)。因此，测试了阻断IFN-γ对表达GM-CSF的细胞产生的作用，显示IL-7和IFN-γ中和的组合诱导了GM-CSF+细胞的最高出现率，其中检测到很少的IL-17+细胞或IFN-γ+细胞(图16A)。此外，研究了表达GM-CSF的TH中子集限定转录因子的表达并且观测到在表达GM-CSF的TH中，RORγt或T-bet的表达分别显著低于TH17细胞或TH1细胞(图16B)，这确认了表达GM-CSF的TH细胞不同于TH1细胞和TH17细胞。总之，这些数据表明IL-7-STAT5信号转导引导被称作TH-GM的新型的表达GM-CSF的辅助T细胞子集的分化。
随后，确定IL-2信号转导是否可以影响TH-GM从初始CD4+T细胞的分化。添加IL-2或针对IL-2的抗体仅对GM-CSF+细胞的出现率有不太大的作用(图14D)，这表明IL-2对TH-GM分化有极小的作用。不同于IL-7Rα，IL-2高亲和力受体IL-2Rα在初始CD4+T细胞中不表达，但是TCR激活逐渐地诱导它的表达(图17A-17C)。因此，IL-2的极小作用至少部分地是由于初始CD4+T细胞对IL-2刺激无响应。为了支持这个观点，IL-7在初始CD4+T细胞中诱导STAT5激活并且上调GM-CSF mRNA表达，但是IL-2不是这样(图17D和17E)。为了进一步确认这一想法，用IL-2或IL-7刺激激活的CD4+T细胞，显示这两种细胞因子均诱导STAT5激活、Csf2启动子结合以及GM-CSF mRNA上调(图18A-18C)。值得注意的是，与IL-7相比，IL-2诱导延长的STAT5激活(图18A)。
实施例7：TH-GM的不同基因表达谱
为了证实TH-GM不同于已知的T细胞子集(例如TH1和TH17)，通过微阵列来进行全转录组分析以验证它与已知的T细胞子集，特别是TH17细胞相比的特异性。使初始CD4+T细胞分化成TH1、TH17以及TH-GM。进行微阵列分析以研究它们的基因表达谱。全转录组聚类表明TH-GM细胞代表了一种不同于TH1细胞或TH17细胞的新型子集。T细胞谱系特异性基因表达示于表1中。与初始细胞、TH17细胞或TH-GM细胞相比，鉴定出在TH1细胞中优先表达的202种基因的列表(倍数变化>1.7)，其中IFN-γ和T-bet处在该列表的顶部(表1)。类似地，在该列表中鉴定出TH17特征基因，如IL-17、IL-17F、RORγt以及RORα，该列表包括对TH17细胞具有特异性的411种基因(表1)。TH-GM细胞特异性基因列表(“TH-GM中优先上调的基因”——TH-GM特征基因)含有210种基因，包括作为该列表中的顶部基因的编码GM-CSF的基因(表1)。鉴定出与其它子集相比，在TH-GM子集中以高水平选择性表达的一组表面分子、以及在TH-GM子集中以低水平选择性表达的另一组表面分子(图19和表1)。这些分子(也为TH-GM特征基因)可以用于通过表面标志物进一步表征以鉴定T细胞的TH-GM子集。还鉴定出几种所关注的其它基因，包括编码细胞因子和转录因子，特别是IL-3的基因。使各种辅助T细胞在体外分化并且确认TH-GM细胞与TH1细胞和TH17细胞相比是强效的IL-3产生细胞(图20A、20C以及20D)。此外，发现几种其它细胞因子，包括EBI-3、PENL以及RANKL在TH-GM细胞中优先表达(图20B)，这表明了TH-GM细胞的各种各样的生物功能。
实施例8：TH-GM细胞是主要的致病群体
为了测试表达GM-CSF的TH子集(TH-GM)是主要的致脑炎效应细胞的假设，将MOG35-55特异性CD4+T细胞的不同子集过继转移到Rag2-/-小鼠体内以诱发EAE。如图21中所示，与TH17子集和TH1子集相比，表达GM-CSF的TH细胞能够优先诱发EAE。
实施例9：通过化学抑制剂抑制STAT5活性减弱了TH-GM的GM-CSF表达并且改善EAE
研究了通过化学抑制剂破坏STAT5激活的作用以探究治疗自身免疫性神经炎症的可能的方法。SH2结构域中关键酪氨酸残基上的磷酸化对于STAT5的激活和功能来说是至关重要的。市售的STAT5抑制剂(CAS285986-31-4，Calbiochem公司)已经被报道选择性地破坏STAT5的酪氨酸磷酸化和DNA结合(Muller等,2008)。首先，测试这种抑制剂在CD4+T细胞中用IL-7刺激时对STAT5的激活的抑制作用。在50μM的浓度，所述抑制剂具有约50％的抑制作用，这随着浓度的增加而进一步增强(图22A)。STAT5抑制剂具有低亲和力并且因此需要高浓度来完全阻断STAT5激活，而JAK3抑制剂甚至在低浓度也显示出强效的抑制作用(图22B)。随后通过研究STAT5抑制剂对STAT3和STAT1的激活的作用来测试它的特异性。如图22C和22D中所示，这种STAT5抑制剂在相对更低的浓度(50μM或100μM)对STAT3和STAT1的激活显示出极小的抑制作用。
研究了抑制STAT5对TH-GM分化的影响。如所示，STAT5抑制剂以剂量依赖性方式抑制TH-GM分化(图22E)。观测到在STAT5抑制剂处理时TH1分化减少(数据未示)，但是TH17分化没有受到STAT5抑制剂抑制(数据未示)。
为了研究靶向STAT5激活在EAE疾病中的治疗作用，在疾病发病之后每隔一天向野生型小鼠腹膜内施用市售的STAT5抑制剂。通过每天指定临床分数来评估麻痹的发展。抑制STAT5减轻了EAE严重程度，这与CNS中免疫细胞浸润减少相关(图23A和23B)。相反，尽管JAK3抑制剂可以强效地阻断STAT5激活(图22B)，但是它对EAE显示出有害作用(图23B)。值得注意的是，STAT5抑制剂引起CNS浸润性CD4+T细胞中GM-CSF的产生减少(图23C和23D)。这项研究表明通过化学抑制剂靶向STAT5可用于MS的治疗干预。
实施例10：产生GM-CSF的TH细胞与人类RA有关
与性别/年龄匹配的健康对照(HC)相比，研究RA患者的外周血中GM-CSF和TNF-α的血浆浓度，并且发现这两种细胞因子在RA中升高(图24A)。在RA和HC中定量产生IFN-γ、IL-17或GM-CSF的TH细胞的离体出现率。在所有样品中检测到产生IFN-γ和/或GM-CSF的TH细胞的高出现率，但是观测到产生IL-17的TH细胞的低出现率(<1％)(图24B)。单独产生GM-CSF(GM-CSF+IFN-γ-)的TH细胞代表了RA和HC这两者中的一个相当大的群体(图24B)。更重要的是，RA的外周血中这一群体的出现率显著高于HC(图24C)。相反，在RA与HC之间，双重产生GM-CSF/IFN-γ的TH细胞和单独产生IFN-γ的TH细胞在它们的出现率方面都没有显示出任何显著性差异(图24C)。因此，在RA中，外周血中单独产生GM-CSF的TH细胞的出现率选择性地升高，这表明TH细胞分泌的GM-CSF与RA的功能关联。此外，在RA中观测到血浆GM-CSF浓度与单独产生GM-CSF的TH细胞出现率之间的显著相关性(图24D)。
为了进一步评价产生GM-CSF的TH细胞与RA的关联，从RA患者的滑液中分离单核细胞并且分析这些细胞的丰度。与外周血相比，在滑液中观测到产生GM-CSF的TH细胞出现率的显著升高，但是这些细胞中的大部分共表达IFN-γ(图24E)。类似地，TH1和TH17这两者的出现率在滑液中也增加，其中与TH1相比，TH17仍是一个较小的群体(图24E)。
实施例11：GM-CSF以非TNF-α依赖性方式介导实验性关节炎
与HC相比RA的血浆中GM-CSF和TNF-α水平的升高可以提示通过靶向这两种细胞因子的治疗方法。在抗原诱发的关节炎(AIA)模型中，通过处理关节炎小鼠来测试阻断GM-CSF和TNF-α这两者的功效，所述模型是一种T细胞驱动的RA模型并且容易以快速和同步化的疾病发病在C57BL/6品系中诱发，从而促进对RA发病机制的探究。GM-CSF或TNF-α的单独阻断削弱了AIA产生(图25A)。有趣的是，GM-CSF特异性中和抗体和TNF-α特异性中和抗体的组合在控制关节炎产生方面显示出优于单独处理的功效(图25A)。也就是说，靶向GM-CSF可能以独立于TNF-α活性的方式在治疗关节炎方面具有有益的功效。为了进一步研究GM-CSF和TNF-α在介导关节炎产生方面的可区分的作用，使用在T细胞中具有条件Stat5缺失的小鼠品系(Cd4-Cre；Stat5f/f，或简称为Stat5-/-)进行AIA诱发。这些条件Stat5敲除小鼠能抵抗关节炎产生，如关节肿胀更轻、滑膜中免疫细胞的浸润更少、以及关节破坏减少所举例说明(图25B-25D)，即使是它们具有显著增加的血清TNF-α以及IFN-γ水平(图25E)。相反，在敲除小鼠中，GM-CSF的血清水平显著降低(图25E)，这可能是对关节炎产生具有抗性的起因，如下文所述的结果所进一步支持的那样。在胶原诱发的关节炎(CIA)模型中也观测到一致的结果(图26A-26D)。总之，这些发现表明GM-CSF是RA中的一种重要的致病介质，并且还表明开发抗GM-CSF药物来治疗对抗TNFα药物无响应的RA患者的前景，从而将产生GM-CSF的TH细胞标记为一种用于RA诊断的新生物标志物。
实施例12：自身反应性TH细胞由STAT5调节的GM-CSF分泌介导滑膜炎症
基于GM-CSF与RA的关联，研究关节炎小鼠的GM-CSF产生细胞以及GM-CSF表达的根本调节机制。从野生型AIA小鼠采集脾细胞，并且将细胞分成三个级分：脾细胞、耗尽CD4+T细胞的脾细胞以及CD4+T细胞；并且在各种条件下以相同的细胞数刺激每一个级分。脾细胞在没有刺激的情况下产生低的但是可检测的GM-CSF水平，这在PMA/离子霉素或mBSA抗原刺激下显著增加(图28A)。在所有条件下，耗尽CD4+T细胞的脾细胞几乎完全消除GM-CSF产生(图28A)。相反，在所有条件下，与脾细胞相比，CD4+T细胞产生显著升高的GM-CSF(图28A)。这些结果强烈地支持了CD4+T细胞至少在关节炎小鼠的脾脏中是GM-CSF的主要产生细胞，这在某种程度上与在RA中所观测到的血浆GM-CSF浓度与单独产生GM-CSF的TH细胞出现率的相关性相一致(图24D)。因此，研究TH细胞分泌的GM-CSF在关节炎产生中的功能意义。鉴于T细胞特异性Csf2敲除小鼠是不可获得的并且STAT5是TH细胞中GM-CSF表达的关键调节因子，因此使用条件Stat5敲除小鼠，这些小鼠显示GM-CSF水平降低以及对关节炎产生具有抗性，如上文所述。
与先前的研究(Burchill等,2007)一致，在AIA诱发之后第7天，与野生型小鼠相比，在STAT5缺陷型小鼠的外周淋巴组织以及发炎的滑膜组织中观测到CD4+T细胞的相似出现率(图27A-27D)，这表明丧失STAT5似乎没有使外周中CD4+T细胞的产生以及滑膜组织中的浸润受损。为了确定STAT5是为CD4+T细胞的致关节炎潜能所必需的，将源自于Stat5+/+AIA小鼠和Stat5-/-AIA小鼠的离体扩增的抗原反应性CD4+T细胞分别转移到野生型未实验过的小鼠体内，继而关节内注射mBSA。接受Stat5+/+CD4+T细胞的小鼠在AIA诱发之后第7天显示出滑膜组织中丰富的免疫细胞浸润(图27E)。相反，接受Stat5-/-CD4+T细胞的小鼠有滑膜浸润物的显著减少(图27E)。因此，STAT5缺陷型CD4+T细胞在致关节炎潜能方面是有缺陷的。
多条证据支持了T细胞在RA中的重要作用。然而，T细胞的致病机制仍尚未得到充分的了解。尽管在人类RA中TH1是滑膜浸润性CD4+T细胞当中主要的群体(Berner等,2000；Yamada等,2008)，但是在关节炎动物模型中，有缺陷的IFN-γ信号转导导致疾病易感性增加(Guedez等,2001；Irmler等,2007；Manoury-Schwartz等,1997；Vermeire等,1997)。相反，TH17细胞在关节炎动物模型中被证实是至关重要的(Pernis,2009)，但是TH17细胞的主导地位在人类RA的外周血和滑膜隔室这两者中是有限的(Yamada等,2008以及图1B和1E)。如本文所证实，STAT5调节的产生GM-CSF的TH细胞增强关节炎发病。
为了验证STAT5在GM-CSF产生中的调节作用，用PMA/离子霉素加上Golgiplug离体刺激源自于AIA小鼠的脾细胞，继而进行细胞内细胞因子染色和流式细胞术。如所预期，在Stat5-/-小鼠中，CD4+CD44hi群体当中单独产生GM-CSF的细胞的出现率显著减少(图28、34B)。值得注意的是，在两组之间，在单独产生IL-17的细胞(TH17)或单独产生IFN-γ的细胞(TH1)的出现率方面没有观测到显著性差异(图28B)。通过结合mBSA再刺激和细胞内细胞因子染色所进行的进一步研究显示Stat5-/-小鼠的脾脏中mBSA特异性的产生GM-CSF的效应T细胞的出现率比对照要低得多(图29A)。此外，用mBSA离体再刺激源自于AIA小鼠的脾细胞和腹股沟淋巴结(LN)以测量培养上清液中细胞因子的浓度并且发现在STAT5缺失的情况下GM-CSF显著减少，但是两组之间IL-17和IFN-γ这两者的水平相当(图29B和29C)。总之，所述结果表明丧失STAT5在实验性关节炎中可能特异性地抑制产生GM-CSF的效应Th细胞，但不抑制TH17细胞或TH1细胞。
为了研究在滑膜炎症中产生GM-CSF的TH细胞的参与以及STAT5对它们的调节，从AIA小鼠解剖滑膜组织并且研究TH细胞的细胞因子产生。尽管GM-CSF有多种细胞来源(Cornish等,2009)，但是CD4+TH细胞是AIA小鼠的滑膜组织中GM-CSF的主要产生细胞(图28C)，这与在脾脏中的观测结果相一致(图28A)。此外，在Stat5-/-小鼠中检测到比Stat5+/+小鼠显著更低的产生GM-CSF的滑膜TH细胞的百分比(图28D)。另一方面，在两组之间TH1细胞和TH17细胞这两者表现出相似的百分比(图28C)。预期与对照相比，Stat5-/-小鼠的滑膜隔室中GM-CSF的水平降低。为了解决这个问题，从AIA小鼠收集发炎的滑膜组织以进行RNA提取和蛋白质提取来通过qPCR和ELISA研究细胞因子水平。实际上，在关节炎诱发之后第5天或第7天，与Stat5+/+小鼠相比，在Stat5-/-小鼠中检测到更低的滑膜GM-CSF，但是IFN-γ或IL-17不是这样(图28E和30A-30C)。此外，还发现在STAT5缺陷型小鼠中两种重要的促炎性细胞因子IL-6和IL-1β持续地和显著地减少(图28E和30A-30C)，这表明滑膜炎症减轻。值得注意的是，在STAT5缺陷型小鼠中，TNF-α的产生在第7天而不是在第5天减少(图28E和30A-C)。总之，这些结果表明致关节炎性TH细胞由STAT5调节的GM-CSF表达对于诱发滑膜炎症是至关重要的。
为了确定TH细胞由STAT5调节的GM-CSF产生在介导滑膜炎和关节炎产生中的关键作用，将与mBSA混合的GM-CSF经由关节内注射到接受mBSA/CFA免疫接种的小鼠的左膝关节中来施用，而将mBSA单独注射到右膝关节中。单独注射mBSA足以在Stat5+/+小鼠的滑膜隔室中诱导丰富的免疫细胞浸润，但是不能在Stat5-/-小鼠中做到这样(图28F)。施用GM-CSF连同mBSA有效地恢复了Stat5-/-小鼠的滑膜炎症(图34F)。一致的是，番红精-O/固绿染色揭示了在Stat5-/-小鼠中，在GM-CSF/mBSA注射后严重的软骨消耗，但是在单独注射mBSA的情况下不是这样(图28G)。这些结果因此提供了对以下观点的支持，即致关节炎性TH细胞由STAT5调节的GM-CSF产生对于介导关节炎发病来说是必要的。
实施例13：源自于Th细胞的GM-CSF介导滑膜组织中中性粒细胞的积聚
研究了产生GM-CSF的Th细胞诱发滑膜炎症和驱动关节炎产生的机制。骨髓谱系衍生细胞，包括中性粒细胞、DC以及巨噬细胞表达GM-CSF受体并且是常见的GM-CSF靶标(Hamilton,2008)。重要的是，那些细胞在RA患者和小鼠关节炎模型中侵袭滑膜隔室，并且促进滑膜炎(McInnes和Schett,2011)。研究了骨髓谱系衍生细胞在AIA小鼠的滑膜隔室中的浸润。CD11b+骨髓细胞代表了滑膜浸润性白细胞当中主要的群体(约70％)(图31B)。尽管STAT5缺失没有使CD4+TH细胞的浸润发生改变，但是当在关节炎诱发之后第7天进行研究时，与Stat5+/+小鼠相比，在Stat5-/-小鼠中滑膜CD11b+细胞浸润显著减少(图31B)。这种减少不太可能是因为造血有缺陷，这是因为在两组的脾脏中检测到相似的CD11b+细胞出现率(图31A)。此外，在7天的时间过程中，CD11b+细胞在野生型小鼠的滑膜组织中不断增加，但是在STAT5缺陷型小鼠中不是这样(图31C)。值得注意的是，在STAT5缺陷型小鼠中滑膜CD11b+细胞积聚的选择性消融可以部分地通过在关节炎诱发期间局部施用GM-CSF来恢复(图31D)。总之，这些结果表明骨髓细胞在滑膜隔室中的积聚可以通过T细胞特异性STAT5缺失和所引起的GM-CSF功能不全而被特异性抑制。
随后，分析CD11b+细胞的不同群体，包括DC、巨噬细胞、以及中性粒细胞。最近报道被表征为CD11cintCD11bhiLy6C+/hiMHCIIhi的单核白细胞衍生树突状细胞(MoDC)参与mBSA/IL-1β关节炎模型(Campbell等,2011)。在本研究的AIA模型中，在脾脏和滑膜组织中以低丰度鉴定出MoDC(数据未示)。此外，在Stat5+/+小鼠与Stat5-/-小鼠之间在外周淋巴组织和滑膜组织这两者中检测到相当的MoDC出现率(数据未示)。这些结果与先前的研究相一致，该先前研究证实了GM-CSF在MoDC分化中不必要的作用(Greter等,2012)。
中性粒细胞具有巨大的细胞毒性潜能并且以多种方式促进RA的引发和进展(Wright等,2014)。已经表明RA疾病活动性和关节破坏与中性粒细胞流入关节中直接相关(Wright等,2014)。基于Ly6C和Ly6G的差异表达，CD11b+骨髓细胞可以被分为Ly6CloLy6Ghi群体(中性粒细胞)和Ly6ChiLy6G-群体(单核白细胞/巨噬细胞)。本研究显示在野生型小鼠中，在7天的时间过程中Ly6CloLy6Ghi群体在滑膜组织中持续积聚，并且在AIA诱发之后第7天代表了滑膜CD11b+细胞当中主要的群体，而这一群体在STAT5缺陷型小鼠中持续地和显著地减少(图32A)。使用吉姆萨染色，验证了滑膜浸润性Ly6CloLy6Ghi群体是中性粒细胞，它们显示出具有环形核的典型多形核特征(图32B)。相反，滑膜浸润性Ly6ChiLy6G-群体具有单核形态并且可能是单核白细胞/巨噬细胞(图32B)。重要的是，在关节炎诱发期间关节内施用GM-CSF有效地恢复了STAT5缺陷型小鼠的滑膜隔室中中性粒细胞的积聚(图32C)，这表明源自于TH细胞的GM-CSF在介导中性粒细胞向发炎关节的积聚中的关键作用。
中性粒细胞在炎症期间被募集，其中中性粒细胞与血管内皮细胞之间复杂的相互作用引导中性粒细胞粘附和从循环游出到发炎组织(Kolaczkowska和Kubes,2013)。在体外游出测定中，中性粒细胞粘附和迁移穿过内皮细胞的单层由作为化学吸引剂的GM-CSF显著增强(图33A和33B)，这表明GM-CSF可以介导AIA中中性粒细胞向发炎关节的募集。有效的中性粒细胞凋亡对于炎症消退来说是至关重要的。然而，在滑膜炎中，中性粒细胞凋亡延迟，从而导致延长的存活和持续性炎症(Wright等,2014)。因此，测试GM-CSF对中性粒细胞存活的作用，并且发现GM-CSF在延迟中性粒细胞凋亡方面有显著的功效(图33C)。总之，这些结果表明GM-CSF可以在滑膜隔室中介导中性粒细胞募集并且维持中性粒细胞存活以及促进持续性滑膜炎。为了确定中性粒细胞在AIA中的关键作用，使用对Ly6G具有特异性的中和抗体(1A8)在体内消耗中性粒细胞。中和抗体的施用使得AIA中的关节肿胀显著改善(图32D)。因此，由源自于TH细胞的GM-CSF所介导的中性粒细胞积聚对于AIA产生来说是重要的。
实施例14：GM-CSF增强骨髓细胞和滑膜成纤维细胞的促炎性细胞因子产生
细胞因子是先天性免疫与适应性免疫之间交互中重要的介质。如本文所示，与RA发病机制相关(Choy和Panayi,2001)的几种促炎性细胞因子(IL-6、IL-1β以及TNF-α)在STAT5缺陷型AIA小鼠的滑膜组织中显著减少(图28E和30A-30C)。为了了解所观测到的细胞因子减少的根本机制，通过基于表面标志物的差异表达将滑膜细胞分级分离成不同的群体来研究这些促炎性细胞因子的细胞来源(图34A)。通过RT-PCR评估CD45+TCRβ+群体(T细胞)、CD45+TCRβ-CD11c-CD11b+群体(主要是单核白细胞/巨噬细胞和中性粒细胞)以及CD45+TCRβ-CD11c+群体(树突状细胞)中的细胞因子mRNA表达水平。与IL-17(作为对照)相似，GM-CSF主要是由滑膜T细胞产生的(图34B)，这进一步增强了产生GM-CSF的TH细胞的重要性。相反，IL-6和IL-1β主要是由骨髓细胞产生的，例如CD11b+群体和CD11c+群体(图34B)。TNF-α由所有三个群体表达，其中在T细胞中的丰度相对较低(图34B)。基于如上文所述的CD11b+群体中Ly6C和Ly6G的差异表达，进一步分析Ly6CloLy6Ghi群体(中性粒细胞)和Ly6ChiLy6G-群体(单核白细胞/巨噬细胞)，显示单核白细胞/巨噬细胞可能是主要的IL-6产生细胞，而中性粒细胞似乎是IL-1β和TNF-α的更好的产生细胞(图34C)。这些结果连同上述发现(图28E和30A-30C)表明TH细胞分泌的GM-CSF在滑膜炎中引出骨髓细胞的促炎性细胞因子表达的联系。
为了测试GM-CSF在IL-6和IL-1β的表达中的调节作用，培养骨髓衍生巨噬细胞(BMDM)和骨髓衍生树突状细胞(BMDC)，并且用GM-CSF刺激。实际上，GM-CSF刺激在1小时内快速地上调了IL-6和IL-1β这两者的mRNA表达(图34D和34E)。此外，GM-CSF以剂量依赖性方式显著增加BMDM的IL-6分泌(图34F)，并且甚至在低剂量也增加了BMDC的IL-6分泌(图34G)。为了诱导成熟IL-1β分泌，将BMDM用LPS致敏6小时，期间添加不同浓度的GM-CSF，继而进行ATP刺激。添加GM-CSF显著地增强了IL-1β向培养上清液中的分泌，如通过ELISA所测量(图34H)。滑膜成纤维细胞作为滑膜炎症中的活性作用细胞(Muller-Ladner等,2007)在GM-CSF刺激时也显示出IL-1βmRNA表达增加(图34I)。在BMDM、BMDC或滑膜成纤维细胞中没有观测到GM-CSF对TNF-α表达的诱导作用(数据未示)。鉴于IL-6和IL-1β在关节炎产生中的功能重要性(Choy和Panayi,2001)，TH细胞分泌的GM-CSF也可能经由引出骨髓细胞和滑膜成纤维细胞的IL-6和IL-1β表达来介导滑膜炎症。
参考文献
Afkarian,M.,Sedy,J.R.,Yang,J.,Jacobson,N.G.,Cereb,N.,Yang,S.Y.,Murphy,T.L.以及Murphy,K.M.(2002).T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12Rexpression in naive CD4+T cells(T-bet是初始CD4+T细胞中IL-12R表达的由STAT1诱导的调节因子),Nature immunology 3,549-557。
Ansel,K.M.,Djuretic,I.,Tanasa,B.以及Rao,A.(2006).Regulation ofTh2differentiation and Il4locus accessibility(Th2分化的调节和Il4基因座可及性),Annual review of immunology 24,607-656。
Baron,J.L.,Madri,J.A.,Ruddle,N.H.,Hashim,G.以及Janeway,C.A.,Jr.(1993).Surface expression of alpha 4integrin by CD4T cells is required fortheir entry into brain parenchyma(CD4T细胞的α4整合素的表面表达是为它们进入脑实质中所需的),J Exp Med 177,57-68。
Bell,A.L.,Magill,M.K.,McKane,W.R.,Kirk,F.以及Irvine,A.E.(1995).Measurement of colony-stimulating factors in synovial fluid:potentialclinical value(滑液中集落刺激因子的测量：潜在临床价值),Rheumatol Int 14,177-182。
Berner,B.,Akca,D.,Jung,T.,Muller,G.A.以及Reuss-Borst,M.A.(2000).Analysis of Th1and Th2cytokines expressing CD4+and CD8+T cells in rheumatoidarthritis by flow cytometry(通过流式细胞术分析类风湿性关节炎中表达Th1和Th2细胞因子的CD4+和CD8+T细胞),J Rheumatol 27,1128-1135。
Bettelli,E.,Carrier,Y.,Gao,W.,Korn,T.,Strom,T.B.,Oukka,M.,Weiner,H.L.以及Kuchroo,V.K.(2006).Reciprocal developmental pathways for the generationof pathogenic effector TH17and regulatory T cells(用于产生致病性效应TH17和调节性T细胞的互补发育通路),Nature 441,235-238。
Brustle,A.,Heink,S.,Huber,M.,Rosenplanter,C.,Stadelmann,C.,Yu,P.,Arpaia,E.,Mak,T.W.,Kamradt,T.以及Lohoff,M.(2007).The development ofinflammatory T(H)-17cells requires interferon-regulatory factor 4(炎性T(H)-17细胞的发育需要干扰素调节因子4),Nature immunology 8,958-966。
Burchill,M.A.,Yang,J.,Vogtenhuber,C.,Blazar,B.R.以及Farrar,M.A.(2007).IL-2receptor beta-dependent STAT5activation is required for thedevelopment of Foxp3+regulatory T cells(IL-2受体β依赖性STAT5激活是为Foxp3+调节性T细胞的发育所需的),J Immunol 178,280-290。
Campbell,I.K.,Rich,M.J.,Bischof,R.J.,Dunn,A.R.,Grail,D.以及Hamilton,J.A.(1998).Protection from collagen-induced arthritis in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-deficient mice(在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子缺陷型小鼠中防止胶原诱发的关节炎的保护作用),J Immunol 161,3639-3644。
Campbell,I.K.,van Nieuwenhuijze,A.,Segura,E.,O'Donnell,K.,Coghill,E.,Hommel,M.,Gerondakis,S.,Villadangos,J.A.以及Wicks,I.P.(2011).Differentiationof inflammatory dendritic cells is mediated by NF-kappaB1-dependent GM-CSFproduction in CD4T cells(炎性树突状细胞的分化是由CD4T细胞中的NF-κB1依赖性GM-CSF产生所介导的),J Immunol 186,5468-5477。
Choy,E.H.和Panayi,G.S.(2001).Cytokine pathways and joint inflammationin rheumatoid arthritis(类风湿性关节炎中的细胞因子通路和关节炎症),N Engl JMed 344,907-916。
Codarri,L.,Gyulveszi,G.,Tosevski,V.,Hesske,L.,Fontana,A.,Magnenat,L.,Suter,T.以及Becher,B.(2011).RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells,which is essential for the effector phase of autoimmuneneuroinflammation(RORγt驱动辅助T细胞中细胞因子GM-CSF的产生——对于自身免疫性神经炎症的效应阶段来说是必要的),Nat Immunol 12,560-567。
Cook,A.D.,Braine,E.L.,Campbell,I.K.,Rich,M.J.以及Hamilton,J.A.(2001).Blockade of collagen-induced arthritis post-onset by antibody togranulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF):requirement for GM-CSF in the effector phase of disease(在发病后由针对粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的抗体阻止胶原诱发的关节炎：在疾病的效应阶段需要GM-CSF),ArthritisRes 3,293-298。
Cope,A.P.,Schulze-Koops,H.以及Aringer,M.(2007).The central role of Tcells in rheumatoid arthritis(T细胞在类风湿性关节炎中的重要作用),Clin ExpRheumatol 25,S4-11。
Cornish,A.L.,Campbell,I.K.,McKenzie,B.S.,Chatfield,S.以及Wicks,I.P.(2009).G-CSF and GM-CSF as therapeutic targets in rheumatoid arthritis(G-CSF和GM-CSF作为类风湿性关节炎中的治疗靶标),Nat Rev Rheumatol 5,554-559。
Croxford,A.L.,Mair,F.以及Becher,B.(2012).IL-23:one cytokine incontrol of autoimmunity(IL-23：一种控制自身免疫的细胞因子),European journal ofimmunology 42,2263-2273。
Cua,D.J.,Sherlock,J.,Chen,Y.,Murphy,C.A.,Joyce,B.,Seymour,B.,Lucian,L.,To,W.,Kwan,S.,Churakova,T.等(2003).Interleukin-23rather than interleukin-12is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain(白细胞介素-23而非白细胞介素-12是脑的自身免疫性炎症的关键细胞因子),Nature 421,744-748。
El-Behi,M.,Ciric,B.,Dai,H.,Yan,Y.,Cullimore,M.,Safavi,F.,Zhang,G.X.,Dittel,B.N.以及Rostami,A.(2011).The encephalitogenicity of T(H)17 cells isdependent on IL-1-and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF(T(H)17细胞的致脑炎作用取决于IL-1和IL-23诱导的细胞因子GM-CSF产生),Nat Immunol 12,568-575。
Gran,B.,Zhang,G.X.,Yu,S.,Li,J.,Chen,X.H.,Ventura,E.S.,Kamoun,M.以及Rostami,A.(2002).IL-12p35-deficient mice are susceptible to experimentalautoimmune encephalomyelitis:evidence for redundancy in the IL-12system inthe induction of central nervous system autoimmune demyelination(IL-12p35缺陷型小鼠易患实验性自身免疫性脑脊髓炎：在诱发中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘中IL-12系统中冗余的证据),J Immunol 169,7104-7110。
Gregory,S.G.,Schmidt,S.,Seth,P.,Oksenberg,J.R.,Hart,J.,Prokop,A.,Caillier,S.J.,Ban,M.,Goris,A.,Barcellos,L.F.等,(2007).Interleukin 7receptoralpha chain(IL7R)shows allelic and functional association with multiplesclerosis(白细胞介素7受体α链(IL7R)显示与多发性硬化的等位基因和功能关联),Nature genetics 39,1083-1091。
Greter,M.,Helft,J.,Chow,A.,Hashimoto,D.,Mortha,A.,Agudo-Cantero,J.,Bogunovic,M.,Gautier,E.L.,Miller,J.,Leboeuf,M.等,(2012).GM-CSF controlsnonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for thedifferentiation of inflammatory dendritic cells(GM-CSF控制非淋巴组织树突状细胞稳态，但对于炎性树突状细胞的分化是不必要的),Immunity 36,1031-1046。
Guedez,Y.B.,Whittington,K.B.,Clayton,J.L.,Joosten,L.A.,van de Loo,F.A.,van den Berg,W.B.以及Rosloniec,E.F.(2001).Genetic ablation ofinterferon-gamma up-regulates interleukin-1beta expression and enables theelicitation of collagen-induced arthritis in a nonsusceptible mouse strain(干扰素-γ的遗传切除上调白细胞介素-1β的表达并且使得能够在非易感小鼠品系中引发胶原诱发的关节炎),Arthritis Rheum 44,2413-2424。
Gutcher,I.和Becher,B.(2007).APC-derived cytokines and T cellpolarization in autoimmune inflammation(自身免疫性炎症中源自于APC的细胞因子和T细胞极化),J Clin Invest 117,1119-1127。
Haak,S.,Croxford,A.L.,Kreymborg,K.,Heppner,F.L.,Pouly,S.,Becher,B.以及Waisman,A.(2009).IL-17A and IL-17F do not contribute vitally to autoimmuneneuro-inflammation in mice(IL-17A和IL-17F对小鼠的自身免疫性神经炎症没有至关重要的作用),J Clin Invest 119,61-69。
Hamilton,J.A.(2008).Colony-stimulating factors in inflammation andautoimmunity(炎症和自身免疫中的集落刺激因子),Nat Rev Immunol 8,533-544。
Harrington,L.E.,Hatton,R.D.,Mangan,P.R.,Turner,H.,Murphy,T.L.,Murphy,K.M.以及Weaver,C.T.(2005).Interleukin 17-producing CD4+effector T cellsdevelop via a lineage distinct from the T helper type 1and 2lineages(产生白细胞介素17的CD4+效应T细胞经由不同于1型和2型T辅助细胞谱系的谱系发育),Nat Immunol6,1123-1132。
Hofstetter,H.H.,Ibrahim,S.M.,Koczan,D.,Kruse,N.,Weishaupt,A.,Toyka,K.V.以及Gold,R.(2005).Therapeutic efficacy of IL-17neutralization in murineexperimental autoimmune encephalomyelitis(IL-17中和在鼠类实验性自身免疫性脑脊髓炎中的治疗功效),Cell Immunol 237,123-130。
Irmler,I.M.,Gajda,M.以及Brauer,R.(2007).Exacerbation of antigen-induced arthritis in IFN-gamma-deficient mice as a result of unrestricted IL-17response(IFN-γ缺陷型小鼠中抗原诱发的关节炎由于不受限制的IL-17响应而恶化),JImmunol 179,6228-6236。
Ivanov,II,McKenzie,B.S.,Zhou,L.,Tadokoro,C.E.,Lepelley,A.,Lafaille,J.J.,Cua,D.J.以及Littman,D.R.(2006).The orphan nuclear receptor RORgammatdirects the differentiation program of proinflammatory IL-17+T helper cells(孤儿核受体RORγt引导促炎性IL-17+T辅助细胞的分化程序),Cell 126,1121-1133。
Kaplan,M.H.,Schindler,U.,Smiley,S.T.以及Grusby,M.J.(1996a).Stat6isrequired for mediating responses to IL-4and for development of Th2cells(Stat6是为介导对IL-4的响应和Th2细胞的发育所必需的),Immunity 4,313-319。
Kaplan,M.H.,Sun,Y.L.,Hoey,T.以及Grusby,M.J.(1996b).Impaired IL-12responses and enhanced development of Th2cells in Stat4-deficient mice(在Stat4缺陷型小鼠中IL-12响应受损和Th2细胞的发育增强),Nature 382,174-177。
Kolaczkowska,E.和Kubes,P.(2013).Neutrophil recruitment and functionin health and inflammation(健康和炎症中的中性粒细胞募集和功能),Nat RevImmunol 13,159-175。
Komatsu,N.和Takayanagi,H.(2012).Autoimmune arthritis:the interfacebetween the immune system and joints(自身免疫性关节炎：免疫系统与关节之间的界面),Adv Immunol 115,45-71。
Korn,T.,Bettelli,E.,Gao,W.,Awasthi,A.,Jager,A.,Strom,T.B.,Oukka,M.以及Kuchroo,V.K.(2007).IL-21initiates an alternative pathway to induceproinflammatory T(H)17cells(IL-21引发诱导促炎性T(H)17细胞的替代通路),Nature448,484-487。
Langrish,C.L.,Chen,Y.,Blumenschein,W.M.,Mattson,J.,Basham,B.,Sedgwick,J.D.,McClanahan,T.,Kastelein,R.A.以及Cua,D.J.(2005).IL-23drives apathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation(IL-23驱动诱发自身免疫性炎症的致病性T细胞群体),J Exp Med 201,233-240。
Laurence,A.,Tato,C.M.,Davidson,T.S.,Kanno,Y.,Chen,Z.,Yao,Z.,Blank,R.B.,Meylan,F.,Siegel,R.,Hennighausen,L.等(2007).Interleukin-2signaling viaSTAT5constrains T helper 17cell generation(白细胞介素-2经由STAT5的信号转导制约T辅助17细胞产生),Immunity 26,371-381。
Lawlor,K.E.,Wong,P.K.,Campbell,I.K.,van Rooijen,N.以及Wicks,I.P.(2005).Acute CD4+T lymphocyte-dependent interleukin-1-driven arthritisselectively requires interleukin-2and interleukin-4,joint macrophages,granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,interleukin-6,and leukemiainhibitory factor(急性CD4+T淋巴细胞依赖性白细胞介素-1驱动的关节炎选择性地需要白细胞介素-2和白细胞介素-4、关节巨噬细胞、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-6、以及白血病抑制因子),Arthritis Rheum 52,3749-3754。
Lee,L.F.,Logronio,K.,Tu,G.H.,Zhai,W.,Ni,I.,Mei,L.,Dilley,J.,Yu,J.,Rajpal,A.,Brown,C.等,(2012).Anti-IL-7receptor-alpha reverses established type1diabetes in nonobese diabetic mice by modulating effector T-cell function(抗IL-7受体α通过调节效应T细胞功能来逆转非肥胖糖尿病小鼠中建立的1型糖尿病),ProcNatl Acad Sci U S A 109,12674-12679。
Leonard,J.P.,Waldburger,K.E.以及Goldman,S.J.(1995).Prevention ofexperimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against interleukin12(通过针对白细胞介素12的抗体预防实验性自身免疫性脑脊髓炎),J Exp Med 181,381-386。
Lighvani,A.A.,Frucht,D.M.,Jankovic,D.,Yamane,H.,Aliberti,J.,Hissong,B.D.,Nguyen,B.V.,Gadina,M.,Sher,A.,Paul,W.E.以及O'Shea,J.J.(2001).T-bet israpidly induced by interferon-gamma in lymphoid and myeloid cells(T-bet在淋巴细胞和骨髓细胞中由干扰素-γ快速诱导),Proc Natl Acad Sci U S A 98,15137-15142。
Liu,X.,Lee,Y.S.,Yu,C.R.以及Egwuagu,C.E.(2008).Loss of STAT3in CD4+Tcells prevents development of experimental autoimmune diseases(CD4+T细胞中STAT3的丧失阻止实验性自身免疫性疾病的产生),J Immunol 180,6070-6076。
Lock,C.,Hermans,G.,Pedotti,R.,Brendolan,A.,Schadt,E.,Garren,H.,Langer-Gould,A.,Strober,S.,Cannella,B.,Allard,J.等(2002).Gene-microarrayanalysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated inautoimmune encephalomyelitis(多发性硬化病变的基因微阵列分析获得在自身免疫性脑脊髓炎中验证的新靶标),Nat Med 8,500-508。
Lundmark,F.,Duvefelt,K.,Iacobaeus,E.,Kockum,I.,Wallstrom,E.,Khademi,M.,Oturai,A.,Ryder,L.P.,Saarela,J.,Harbo,H.F.等(2007).Variation ininterleukin 7receptor alpha chain(IL7R)influences risk of multiple sclerosis(白细胞介素7受体α链(IL7R)的变异影响多发性硬化的风险),Nature genetics 39,1108-1113。
Manoury-Schwartz,B.,Chiocchia,G.,Bessis,N.,Abehsira-Amar,O.,Batteux,F.,Muller,S.,Huang,S.,Boissier,M.C.以及Fournier,C.(1997).High susceptibilityto collagen-induced arthritis in mice lacking IFN-gamma receptors(缺乏IFN-γ受体的小鼠对胶原诱发的关节炎的高度易感性),J Immunol 158,5501-5506。
McGeachy,M.J.,Chen,Y.,Tato,C.M.,Laurence,A.,Joyce-Shaikh,B.,Blumenschein,W.M.,McClanahan,T.K.,O'Shea,J.J.以及Cua,D.J.(2009).Theinterleukin 23receptor is essential for the terminal differentiation ofinterleukin 17-producing effector T helper cells in vivo(白细胞介素23受体对于体内产生白细胞介素17的效应T辅助细胞的终末分化来说是必要的),Nat Immunol 10,314-324。
McInnes,I.B.和Schett,G.(2007).Cytokines in the pathogenesis ofrheumatoid arthritis(类风湿性关节炎的发病机制中的细胞因子),Nat Rev Immunol 7,429-442。
McInnes,I.B.和Schett,G.(2011).The pathogenesis of rheumatoidarthritis(类风湿性关节炎的发病机制),N Engl J Med 365,2205-2219。
Muller-Ladner,U.,Ospelt,C.,Gay,S.,Distler,O.以及Pap,T.(2007).Cells ofthe synovium in rheumatoid arthritis.Synovial fibroblasts(类风湿性关节炎中滑膜的细胞：滑膜成纤维细胞),Arthritis Res Ther 9,223。
Muller,J.,Sperl,B.,Reindl,W.,Kiessling,A.以及Berg,T.(2008).Discoveryof chromone-based inhibitors of the transcription factor STAT5(转录因子STAT5的基于色酮的抑制剂的发现),Chembiochem:a European journal of chemical biology9,723-727。
Nurieva,R.,Yang,X.O.,Martinez,G.,Zhang,Y.,Panopoulos,A.D.,Ma,L.,Schluns,K.,Tian,Q.,Watowich,S.S.,Jetten,A.M.以及Dong,C.(2007).Essentialautocrine regulation by IL-21in the generation of inflammatory T cells(IL-21在炎性T细胞的产生中的必要自分泌调节),Nature 448,480-483。
Okada,Y.,Wu,D.,Trynka,G.,Raj,T.,Terao,C.,Ikari,K.,Kochi,Y.,Ohmura,K.,Suzuki,A.,Yoshida,S.等(2014).Genetics of rheumatoid arthritis contributes tobiology and drug discovery(类风湿性关节炎的遗传学有助于生物学和药物发现),Nature 506,376-381。
Pernis,A.B.(2009).Th17cells in rheumatoid arthritis and systemiclupus erythematosus(类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮中的Th17细胞),J Intern Med265,644-652。
Plater-Zyberk,C.,Joosten,L.A.,Helsen,M.M.,Hepp,J.,Baeuerle,P.A.以及van den Berg,W.B.(2007).GM-CSF neutralisation suppresses inflammation andprotects cartilage in acute streptococcal cell wall arthritis of mice(GM-CSF中和在小鼠的急性链球菌细胞壁关节炎中抑制炎症并且保护软骨),Ann Rheum Dis 66,452-457。
Ponomarev,E.D.,Shriver,L.P.,Maresz,K.,Pedras-Vasconcelos,J.,Verthelyi,D.以及Dittel,B.N.(2007).GM-CSF production by autoreactive T cellsis required for the activation of microglial cells and the onset ofexperimental autoimmune encephalomyelitis(自身反应性T细胞的GM-CSF产生是为小胶质细胞的激活和实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病所需的),J Immunol 178,39-48。
Reboldi,A.,Coisne,C.,Baumjohann,D.,Benvenuto,F.,Bottinelli,D.,Lira,S.,Uccelli,A.,Lanzavecchia,A.,Engelhardt,B.以及Sallusto,F.(2009).C-Cchemokine receptor 6-regulated entry of TH-17cells into the CNS through thechoroid plexus is required for the initiation of EAE(C-C趋化因子受体6调节的TH-17细胞经由脉络丛进入CNS中是为引发EAE所需的),Nat Immunol 10,514-523。
Segal,B.M.和Shevach,E.M.(1996).IL-12unmasks latent autoimmune diseasein resistant mice(IL-12揭示了抗性小鼠中的潜伏性自身免疫性疾病),J Exp Med 184,771-775。
Shimoda,K.,van Deursen,J.,Sangster,M.Y.,Sarawar,S.R.,Carson,R.T.,Tripp,R.A.,Chu,C.,Quelle,F.W.,Nosaka,T.,Vignali,D.A.等(1996).Lack of IL-4-induced Th2response and IgE class switching in mice with disrupted Stat6gene(具有破坏的Stat6基因的小鼠中缺乏IL-4诱导的Th2响应和IgE类别转换),Nature 380,630-633。
Sonderegger,I.,Iezzi,G.,Maier,R.,Schmitz,N.,Kurrer,M.以及Kopf,M.(2008).GM-CSF mediates autoimmunity by enhancing IL-6-dependent Th17celldevelopment and survival(GM-CSF通过增强IL-6依赖性Th17细胞发育和存活来介导自身免疫),J Exp Med 205,2281-2294。
Steinman,L.(2007).A brief history of T(H)17,the first major revisionin the T(H)1/T(H)2hypothesis of T cell-mediated tissue damage(T(H)17的简史：T细胞介导的组织损伤的T(H)1/T(H)2假说的首次重大修改),Nat Med 13,139-145。
Stritesky,G.L.,Yeh,N.以及Kaplan,M.H.(2008).IL-23promotes maintenancebut not commitment to the Th17lineage(IL-23促进维持，但不促进向Th17谱系的定向),J Immunol 181,5948-5955。
Szabo,S.J.,Sullivan,B.M.,Stemmann,C.,Satoskar,A.R.,Sleckman,B.P.以及Glimcher,L.H.(2002).Distinct effects of T-bet in TH1lineage commitment andIFN-gamma production in CD4and CD8T cells(T-bet在CD4和CD8T细胞中TH1谱系定向和IFN-γ产生中的不同作用),Science 295,338-342。
Takeda,K.,Tanaka,T.,Shi,W.,Matsumoto,M.,Minami,M.,Kashiwamura,S.,Nakanishi,K.,Yoshida,N.,Kishimoto,T.以及Akira,S.(1996).Essential role ofStat6in IL-4signalling(Stat6在IL-4信号转导中的必要作用),Nature 380,627-630。
Thierfelder,W.E.,van Deursen,J.M.,Yamamoto,K.,Tripp,R.A.,Sarawar,S.R.,Carson,R.T.,Sangster,M.Y.,Vignali,D.A.,Doherty,P.C.,Grosveld,G.C.以及Ihle,J.N.(1996).Requirement for Stat4in interleukin-12-mediated responses ofnatural killer and T cells(在白细胞介素-12介导的自然杀伤细胞和T细胞响应中需要Stat4),Nature 382,171-174。
Veldhoen,M.,Hirota,K.,Westendorf,A.M.,Buer,J.,Dumoutier,L.,Renauld,J.C.以及Stockinger,B.(2008).The aryl hydrocarbon receptor links TH17-cell-mediated autoimmunity to environmental toxins(芳烃受体使TH17细胞介导的自身免疫与环境毒素相联系),Nature 453,106-109。
Veldhoen,M.,Hocking,R.J.,Atkins,C.J.,Locksley,R.M.以及Stockinger,B.(2006).TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports denovo differentiation of IL-17-producing T cells(在炎性细胞因子环境的背景下TGFβ支持产生IL-17的T细胞的从头分化),Immunity 24,179-189。
Vermeire,K.,Heremans,H.,Vandeputte,M.,Huang,S.,Billiau,A.以及Matthys,P.(1997).Accelerated collagen-induced arthritis in IFN-gamma receptor-deficient mice(在IFN-γ受体缺陷型小鼠中胶原诱发的关节炎加速),J Immunol 158,5507-5513。
Willenborg,D.O.,Fordham,S.,Bernard,C.C.,Cowden,W.B.以及Ramshaw,I.A.(1996).IFN-gamma plays a critical down-regulatory role in the induction andeffector phase of myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced autoimmuneencephalomyelitis(IFN-γ在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱发的自身免疫性脑脊髓炎的诱发阶段和效应阶段中起关键的下调作用),J Immunol 157,3223-3227。
Wright,H.L.,Moots,R.J.以及Edwards,S.W.(2014).The multifactorial roleof neutrophils in rheumatoid arthritis(中性粒细胞在类风湿性关节炎中的多因素作用),Nat Rev Rheumatol 10,593-601。
Yamada,H.,Nakashima,Y.,Okazaki,K.,Mawatari,T.,Fukushi,J.I.,Kaibara,N.,Hori,A.,Iwamoto,Y.以及Yoshikai,Y.(2008).Th1but not Th17cells predominatein the joints of patients with rheumatoid arthritis(Th1细胞而非Th17细胞在患有类风湿性关节炎的患者的关节中占主导地位),Ann Rheum Dis 67,1299-1304。
Yang,X.O.,Panopoulos,A.D.,Nurieva,R.,Chang,S.H.,Wang,D.,Watowich,S.S.以及Dong,C.(2007a).STAT3regulates cytokine-mediated generation ofinflammatory helper T cells(STAT3调节细胞因子介导的炎性辅助T细胞产生),TheJournal of biological chemistry 282,9358-9363。
Yang,X.O.,Pappu,B.P.,Nurieva,R.,Akimzhanov,A.,Kang,H.S.,Chung,Y.,Ma,L.,Shah,B.,Panopoulos,A.D.,Schluns,K.S.等(2008).T helper 17lineagedifferentiation is programmed by orphan nuclear receptors ROR alpha and RORgamma(T辅助细胞17谱系分化由孤儿核受体RORα和RORγ程序化),Immunity 28,29-39。
Yang,X.P.,Ghoreschi,K.,Steward-Tharp,S.M.,Rodriguez-Canales,J.,Zhu,J.,Grainger,J.R.,Hirahara,K.,Sun,H.W.,Wei,L.,Vahedi,G.等(2011).Opposingregulation of the locus encoding IL-17through direct,reciprocal actions ofSTAT3and STAT5(经由STAT3和STAT5的直接相互作用对编码IL-17的基因座的反向调节),Nat Immunol 12,247-254。
Yang,Y.,Ochando,J.C.,Bromberg,J.S.以及Ding,Y.(2007b).Identificationof a distant T-bet enhancer responsive to IL-12/Stat4and IFNgamma/Stat1signals(鉴定对IL-12/Stat4和IFNγ/Stat1信号有响应的远端T-bet增强因子),Blood 110,2494-2500。
Yang,Y.H.和Hamilton,J.A.(2001).Dependence of interleukin-1-inducedarthritis on granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(白细胞介素-1诱发的关节炎对粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的依赖性),Arthritis Rheum44,111-119。
Yao,Z.,Cui,Y.,Watford,W.T.,Bream,J.H.,Yamaoka,K.,Hissong,B.D.,Li,D.,Durum,S.K.,Jiang,Q.,Bhandoola,A.等(2006).Stat5a/b are essential for normallymphoid development and differentiation(Stat5a/b对于正常的淋巴发育和分化来说是必要的),Proc Natl Acad Sci U S A 103,1000-1005。
Zhang,G.X.,Gran,B.,Yu,S.,Li,J.,Siglienti,I.,Chen,X.,Kamoun,M.以及Rostami,A.(2003).Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis inIL-12receptor-beta 2-deficient mice:IL-12responsiveness is not required inthe pathogenesis of inflammatory demyelination in the central nervous system(在IL-12受体β2缺陷型小鼠中诱发实验性自身免疫性脑脊髓炎：在中枢神经系统的炎症性脱髓鞘的发病机制中不需要IL-12响应性),J Immunol 170,2153-2160。
Zhou,L.,Ivanov,II,Spolski,R.,Min,R.,Shenderov,K.,Egawa,T.,Levy,D.E.,Leonard,W.J.以及Littman,D.R.(2007).IL-6programs T(H)-17cell differentiationby promoting sequential engagement of the IL-21and IL-23pathways(IL-6通过促进IL-21通路和IL-23通路的连续接合来将T(H)-17细胞分化程序化),Nature immunology 8,967-974。
Zhu,J.和Paul,W.E.(2010).Peripheral CD4+T-cell differentiationregulated by networks of cytokines and transcription factors(由细胞因子和转录因子的网络调节的外周CD4+T细胞分化),Immunological reviews 238,247-262。
虽然已经参考本发明的示例性实施方案具体示出并且描述了本发明，但本领域技术人员将了解的是，可以在其中作出形式和细节上的各种变化，而不脱离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围。

Claims (33)

1.一种诊断患有炎症性病症的患者的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)分泌型T辅助细胞(TH-GM)介导的炎症性病症的方法，所述方法包括：
a)使从患有炎症性病症的患者采集的样品与检测剂接触，所述检测剂检测STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的多肽水平或核酸水平；以及
b)定量所述STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的多肽水平或核酸水平，其中相对于参考水平，STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的水平增加则表明所述患者患有TH-GM介导的炎症性病症，
从而诊断所述患有炎症性病症的患者的TH-GM介导的炎症性病症。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述检测剂是结合所述STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3的多肽的抗体。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述STAT5是激活的STAT5。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述检测剂是结合所述STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3的核酸的核酸。
5.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括使所述样品与检测表1中所列的至少一种基因的多肽水平或核酸水平的检测剂接触。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种基因是碱性螺旋-环-螺旋家族成员e40(BHLHE40)、趋化因子(C-C基序)受体4(CCR4)、或趋化因子(C-C基序)受体6(CCR6)。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是外周血、脑脊髓液、滑液、或滑膜、或其组合。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述参考水平是从健康人类获得的。
9.如权利要求1所述的方法，其中相对于所述参考水平，所述STAT5、IL-7、GM-CSF或IL-3、或其组合的水平增加了至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少100％。
10.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括向所述被诊断为患有TH-GM介导的炎症性病症的患者施用有效量的调节TH-GM细胞功能的调节剂。
11.一种分离的GM-CSF分泌型T辅助细胞(TH-GM)群体，其中所述TH-GM细胞是在激活的信号转导和转录激活因子5(STAT5)和IL-7存在下从前体CD4+细胞分化的，并且其中所述TH-GM细胞表达GM-CSF和IL-3。
12.如权利要求11所述的分离细胞，其中所述TH-GM细胞的特征进一步在于表1中所列的一种或多种基因的过表达。
13.如权利要求11所述的分离细胞，其中所述TH-GM细胞的特征进一步在于表1中所列的一种或多种基因的低表达。
14.如权利要求12所述的分离细胞，其中所述TH-GM细胞过表达碱性螺旋-环-螺旋家族成员e40(BHLHe40)、前脑啡肽原(PENK)、IL-2、丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制因子、进化枝B成员6b(丝氨酸蛋白酶抑制因子b6b)、神经突蛋白1(Nrn1)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Scd1)、或磷酸三酯酶相关C1q样蛋白3(Pter)中的一种或多种。
15.如权利要求13所述的分离细胞，其中所述TH-GM细胞低表达淋巴细胞抗原6复合物基因座A(Ly6a)；CD27；或淋巴细胞选择素(Sell)中的一种或多种。
16.一种调节粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)分泌型T辅助细胞(TH-GM)功能的方法，所述方法包括使所述TH-GM、或分化簇4(CD4+)前体细胞、或这两者与调节TH-GM功能的调节剂接触。
17.一种治疗有需要的患者的TH-GM介导的炎症性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的调节TH-GM细胞功能的调节剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述患者先前被诊断为患有TH-GM介导的炎症性病症。
19.一种治疗对肿瘤坏死因子α(TNF-α)治疗表现出有限的响应的患者的类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的调节TH-GM功能的调节剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述TNF-α治疗是基于TNF-α抑制剂的治疗或不基于TNF-α抑制剂的治疗、或这两者。
21.如权利要求10至20中任一项所述的方法，其中所述调节剂抑制TH-GM功能。
22.如权利要求10至20中任一项所述的方法，其中所述调节剂是抗体、多肽、小分子、核酸、或细胞因子、或其组合。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述调节剂抑制以下各项的功能：STAT5、白细胞介素-7(IL-7)、IL-7受体、IL-2、或IL-2受体、GM-CSF、IL-3、前脑啡肽原(PENK)、或核因子κ-B受体激活因子配体(RANKL)、詹纳斯激酶1/3(JAK1/3)、或其组合。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述STAT5是激活的STAT5。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞因子是IL-12、干扰素-γ(IFNγ)、转化生长因子-β(TGF-β)、或IL-6、或其组合。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述调节剂抑制表1中所列的基因或基因产物的功能。
27.如权利要求16所述的方法，其中在体外或体内使所述调节剂与所述TH-GM细胞或CD4+前体细胞接触。
28.如权利要求1、16、17或19中任一项所述的方法，其中所述炎症性病症是类风湿性关节炎或多发性硬化。
29.如权利要求17至28中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述患者施用TNF-α治疗。
30.一种治疗有需要的患者的信号转导和转录激活因子5(STAT5)介导的炎症性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的调节STAT5功能的药剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述药剂抑制STAT5功能。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述炎症性病症是类风湿性关节炎或多发性硬化。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述药剂是抗体、多肽、小分子、核酸、或细胞因子、或其组合。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020216378A1 (zh) 2019-04-26 2020-10-29 健艾仕生物医药有限公司 一种含杂环的化合物、其应用及含其的组合物

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11612595B2 (en) 2017-05-16 2023-03-28 Generos Biopharma Ltd. Compositions and methods for treating rheumatoid arthritis
JP2022528481A (ja) * 2019-04-09 2022-06-10 ジェネラス バイオファーマ リミテッド ピモジドとメトトレキサートの医薬組成物、及びその使用
WO2020216335A1 (zh) * 2019-04-26 2020-10-29 健艾仕生物医药有限公司 一种化合物在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用
CN116369249B (zh) * 2023-01-13 2024-05-17 四川轻化工大学 斑马鱼肠炎模型的构建方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050042751A1 (en) * 2001-10-31 2005-02-24 Michel Goldman Generation and use of new types of dendritic cells
US20060094056A1 (en) * 2003-09-15 2006-05-04 Oklahoma Medical Research Foundation Method of using cytokine assays to diagnose treat, and evaluate inflammatory and autoimmune diseases

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002241303A (ja) * 2001-02-13 2002-08-28 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc Ｅｔｓ転写因子又はそれをコードする遺伝子からなる上皮細胞のｇｍ−ｃｓｆ、及び／又はディフェンシン蛋白質の発現調節剤。
US7776313B2 (en) 2006-05-25 2010-08-17 University Health Network Methods of diagnosing and treating rheumatoid arthritis and osteoarthritis
US20080286234A1 (en) * 2007-05-15 2008-11-20 Eyink Daniel A Method for treating demyelinating diseases
WO2009039199A2 (en) * 2007-09-17 2009-03-26 Intradigm Corporation Compositions comprising stat5 sirna and methods of use thereof
TW200918553A (en) * 2007-09-18 2009-05-01 Amgen Inc Human GM-CSF antigen binding proteins
EA020766B1 (ru) * 2008-07-08 2015-01-30 Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем Ингибиторы пролиферации и активации переносчика сигнала и активатора транскрипции (stats)
EP2193790A1 (en) 2008-12-04 2010-06-09 Klinikum der Universität Regensburg IL-3 Inhibitors in use for treatment of rheumatoid arthritis in an early stage
JP2013520208A (ja) * 2010-02-24 2013-06-06 ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・レランド・スタンフォード・ジュニア・ユニバーシティ 自己免疫疾患の診断、予後判定、及び処置法
KR20120128492A (ko) * 2011-05-17 2012-11-27 연세대학교 산학협력단 골 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
US20140163075A1 (en) * 2011-06-01 2014-06-12 Netherland Cancer Institute Modulation of the ubiquitin-proteasome system (ups)
KR20140103122A (ko) * 2011-11-17 2014-08-25 넨키 인스티튜트 오브 익스페리멘탈 바이올로지 신경교종을 치료하기 위한 조성물 및 방법
EP2669295A1 (en) * 2012-05-29 2013-12-04 Universitätsklinikum Regensburg Diagnostic method for determining the presence and amount of human interleukin-3 in a sample using novel IL-3 antibodies

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050042751A1 (en) * 2001-10-31 2005-02-24 Michel Goldman Generation and use of new types of dendritic cells
US20060094056A1 (en) * 2003-09-15 2006-05-04 Oklahoma Medical Research Foundation Method of using cytokine assays to diagnose treat, and evaluate inflammatory and autoimmune diseases

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JALECO等: "Homeostasis of naive and memory CD4(+) T cells: IL-2 and IL-7 differentially regulate the balance between proliferation and Fas-mediated apoptosis", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *
L SCHAFRANEK等: "Sustained inhibition of STAT5, but not JAK2, is essential for TKI-induced cell death in chronic myeloid leukemia", 《LEUKEMIA》 *
LIN等: "Bhlhe40 controls cytokine production by Tcells and is essential for pathogenicity in autoimmune neuroinflammation", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *
NOSTER等: "IL-17 and GM-CSF Expression Are Antagonistically Regulated by Human T Helper Cells", 《SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE》 *
TIMOTHY等: "Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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