JP6729911B2

JP6729911B2 - Ｔｈ−ｇｍ細胞の機能を調節するための方法および組成物

Info

Publication number: JP6729911B2
Application number: JP2017516733A
Authority: JP
Inventors: フー，シン−ユエン; ション，ワンチアン; ジャン，ヨンリエン; ヤン，ファン
Original assignee: National University of Singapore
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2020-07-29
Anticipated expiration: 2035-09-25
Also published as: US20200408757A1; AU2015322125A1; KR102221013B1; KR102507694B1; AU2021201241B2; CA3147152A1; CA2962757A1; EP3739039A1; KR102360824B1; WO2016048247A1; EP3198007A4; CN107002037A; JP2017531792A; EP3198007A1; JP2022140482A; CA2962757C; AU2015322125B2; AU2021201241A1; JP2020165991A; AU2022256995A1

Description

関連出願
本願は、２０１４年９月２６日出願のシンガポール特許出願第１０２０１４０６１３０Ｐ号の利益を請求するものである。上記出願の全ての教示は、参照により本明細書に組み込まれる。

数多くの研究が、免疫と炎症のみでなく、免疫性障害および炎症性障害における制御不全に関する現行のモデルに通じている。ＣＤ４^＋ヘルパーＴ（Ｔ_Ｈ）細胞は現在、適応免疫応答および先天免疫応答を編成することによって、様々な病原体に対する宿主防御に重大な役割を果たすことが理解されている。同種の抗原によってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が活性化されると、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞が、少なくとも５つの主なサブセットへの分化に付される。すなわちＴ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、Ｔ_Ｈ１７、ｉＴ_ｒｅｇ、およびＴ_ＦＨ、であり、これらは、サイトカイン環境によって調節される。Ｔ_Ｈ１細胞およびＴ_Ｈ１７細胞は、炎症の主要なエフェクターであることが知られている。しかし、様々な炎症性障害におけるＴ_Ｈ１またはＴ_Ｈ１７のどちらかの病原的な役割は、依然として不明である。例えば、最近の研究は、多発性硬化症（ＭＳ）の病原性において以前理解されていたＴ_Ｈ１７についてのパラダイムと相容れず（Haakら、２００９年）、ＭＳ療法に用いる潜在的な薬物標的を特定することをさらに難度の高いものとしている。同様に、関節リウマチ（ＲＡ）は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）によって媒介される障害であるものと古くから理解されている一方で、ＲＡ患者の４０％までが、抗ＴＮＦ−α治療に応答することができない。

したがって、例えばＭＳおよびＲＡなどの自己免疫性および炎症性障害のための有効な治療方法について、依然として大きなアンメットニーズが残されている。

J Clin Invest 119, 61-69 (2009)

本開示は、一部では、インターロイキン−７（ＩＬ−７）／シグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）制御性の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）／ＩＬ−３産生Ｔ_Ｈ細胞を特定することに関する。この細胞は、Ｔ_Ｈ−ＧＭと呼ばれ、独特の発生上および機能上の特徴を有した別個のヘルパーＴ細胞サブセットを表す。本明細書で特定されるのは、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞によって媒介される炎症経路（Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症経路）であり、この経路は、公知の非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性炎症経路（例えば、炎症のＴＮＦ−ａ、ＩＬ−６、およびＩＬ−１ｂ経路）とは異なる独立した炎症経路を表す。本開示は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を診断するための、およびＴ_Ｈ−ＧＭ経路によって媒介される炎症性障害の治療のためにＴ_Ｈ−ＧＭ細胞の機能を調節するための、方法および組成物を提供する。

したがって、一態様では、本開示は、炎症性障害に罹っている患者のＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を診断する方法であって、ａ）炎症性障害に罹っている患者から採集した試料を、ＳＴＡＴ５［例えばホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）］、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、またはそれらの組合せのポリペプチドまたは核酸のレベルを検出
する検出剤に接触させること、およびｂ）ＳＴＡＴ５［例えばホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）］、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、またはそれらの組合せのポリペプチドまたは核酸のレベルを定量することであって、参照レベルと比べて増加しているＳＴＡＴ５［例えばホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）］、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはインターロイキン−３（ＩＬ−３）、またはそれらの組合せのレベルは、患者がＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害に罹っていることを指し示すこと、を含む方法を提供する。

別の態様では、本開示は、ＧＭ−ＣＳＦを分泌するＴ−ヘルパー細胞（Ｔ_Ｈ−ＧＭ）の単離された集団であって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞がＩＬ−７および活性化ＳＴＡＴ５の存在下で分化抗原群（cluster of differentiation）４（ＣＤ４＋）前駆細胞から分化し、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞がＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を発現する、集団を提供する。

別の態様では、本開示は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する方法であって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する調節剤に、Ｔ_Ｈ−ＧＭ、もしくはＣＤ４＋前駆細胞、またはその両方を接触させることを含む方法を提供する。

態様によっては、本開示は、それを必要とする患者のＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を治療する方法であって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の機能を調節する有効量の調節剤を前記患者に投与することを含む方法を提供する。

他の態様では、本開示は、抗腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）療法に対し限定的な応答を示す患者の関節リウマチを治療する方法であって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する有効量の調節剤を前記患者に投与することを含む方法を提供する。

別の態様では、本開示は、それを必要とする患者のＳＴＡＴ５媒介性の炎症性障害を治療する方法であって、ＳＴＡＴ５の機能を調節する有効量の薬剤を患者に投与することを含む方法を提供する。

さらに別の態様では、本開示は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞機能のモジュレーターを特定するためにスクリーニングする方法であって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の単離された集団、またはＣＤ４＋前駆細胞の単離された集団を候補薬剤に接触させること、および候補薬剤の存在下または不在下でＴ_Ｈ−ＧＭ機能の読出しを決定することを含み、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の読出しの変化は、候補薬剤がＴ_Ｈ−ＧＭ機能のモジュレーターであることを指し示す、方法を提供する。

本開示は、主にＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性であるかもしくは主に非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性である（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、および／またはＩＬ−１βによって媒介される）かのどちらか、またはその両方である炎症性障害を、それらの間で特定または分類することを可能にする。そのため、本明細書に記載の方法を使用して、例えばＲＡに罹っている患者が、主にＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性であるか、もしくは主に非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性であるか、またはその両方であるＲＡに罹っていることを決定することができる。この区別は、現在の治療では有効性が４０％にすぎないＲＡなどの炎症性障害を治療する方法を、より標的が絞られかつ誂えたものとすることを可能にする。さらに、本開示は、疾患のステージに従って治療を誂えるよう炎症性障害の進行を予測するための方法および組成物を提供する。また、本明細書で提供されるのは、炎症性障害、具体的にはＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性のものの治療のための組成物および方法である。

以上は、本発明の例示的な実施形態に関する以下のさらに具体的な記載から明らかになろう。

Ｓｔａｔ５−コンディショナル変異マウスがＥＡＥに抵抗性であることを描いた図である。ＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡを用いて２回免役したＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスの臨床ＥＡＥスコア（図１Ａ）および発生率（図１Ｂ）である。データは、３回の独立した実験（図１Ａ）の代表であるか、または３つの実験からプールされている（図１Ｂ、１群当たりｎ＝１８）。ＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡを用いて１回免疫されたか（図１Ｃ、１群当たりｎ＝５）、またはＭＯＧ_{３５−５５}／ＬＰＳを用いて２回免疫された（図１Ｄ）、ＥＡＥマウスの臨床スコアである。データは、２回の独立した実験の代表である。Ｓｔａｔ５コンディショナル変異マウスで神経炎症が減少したことを描いた図である。２回目の免疫後９日目にＥＡＥマウスから得た脊髄切片の組織学である（図１Ａ）。示されている画像は、１群当たり３頭のマウスを用いた２回の独立した実験の代表である。スケールバーは、２００μｍ（上部）、５０μｍ（下部）である。脊髄切片中のＣＤ４^＋細胞およびＣＤ１１ｂ^＋細胞を、免疫蛍光によって染色した（図１Ｂ）。示されている画像は、１群当たり３頭のマウスを用いた２回の独立した実験の代表である。スケールバーは、２００μｍである。ＣＮＳの単核細胞を、疾患のピーク時にフローサイトメトリーによって分析した（図２Ｃおよび図２Ｄ）。右パネルは、２つの実験（ｎ＝９）からプールした細胞の割合（図２Ｃ、右）または細胞数（図２Ｄ、右）である。Ｓｔａｔ５欠損マウスでのＥＡＥに対する抵抗性が、Ｔ_Ｈ１細胞、Ｔ_Ｈ１７細胞、またはＴ_ｒｅｇ細胞とは無関係であることを描いた図である。疾患のピーク時のＣＮＳ浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの発現のフローサイトメトリー解析（図３Ａ）である。データは、３回の独立した実験の代表である。疾患のピーク時のＳｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のＥＡＥマウスにおけるＣＮＳのＣＤ４^＋Ｔ細胞の中でのＣＤ２５^＋のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって分析した（図３Ｂ）。コンディショナルＳｔａｔ５変異マウスが、末梢中のＣＤ４^＋Ｔ細胞の生成に欠陥を持たないことを描いた図である。ＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡで免役したＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスから、７日目（図４Ａ）および２１日目（図４Ｂ）に脾臓を得た。ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞の絶対数を計算した（右パネル）。データは、２回の独立した実験（図４Ａ）の代表であるか、または２回の独立した実験からプールされている（図４Ｂ）。Ｓｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のＥＡＥマウスの脾臓ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの発現を、細胞内サイトカイン染色によって判定した（図４Ｃ）。データは、３回の独立した実験の代表である。^＊ｐ＜０．５、^＊＊ｐ＜０．００５、^＊＊＊ｐ＜０．０００５である。Ｓｔａｔ５欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＣＮＳを浸潤することができるが、実効性のある神経炎症を誘導できないことを描いた図である。Ｓｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のＥＡＥマウスの脾臓ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＣＣＲ６、ＣＸＣＲ３、およびＣＤ６９の発現を測定した。データは、１群当たり３頭から５頭のマウスを用いた２回の独立した実験の代表である（図５Ａ）。最初のＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡ免疫後の７日目、９日目、および２１日目に、ＣＮＳ浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞を分析した（図５Ｂ〜５Ｄ）。細胞数を計算した（図５Ｄ）。データは、１群当たり３頭のマウスを用いた２回の独立した実験の代表である。^＊ｐ＜０．５である。Ｓｔａｔ５^−／−マウスでのＥＡＥに対する抵抗性が、ＳＴＡＴ５不在下のＣＤ４^＋Ｔ細胞の生存における何らかの欠陥によって引き起こされるのではないことを示す図である。異なる数のＳｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のＣＤ４^＋Ｔ細胞を移入されたＲａｇ２^−／−レシピエントマウスのＣＤ４^＋Ｔ細胞の浸潤（図６Ａ）および臨床スコア（図６Ｂ）である。ＥＡＥ誘導の２１日目（疾患のピーク）の臨床スコアおよびＣＮＳ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞の頻度である（図６Ｃ）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．０００５である。脳炎惹起性におけるＳｔａｔ５欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞の内因的な欠陥を描いた図である。２００万個のＭＯＧ_{３５−５５}特異的なＳｔａｔ５^＋／＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＳｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞をそれぞれ養子移入した後のＲａｇ２^−／−マウス（１群当たりｎ＝５）の臨床ＥＡＥスコア（図７Ａ）および発生率（図７Ｂ）である。ＣＮＳ浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの発現を、疾患のピーク時に測定した（図７Ｃ）。データは、２回の独立した実験を代表する。^＊ｐ＜０．０５である。脾臓Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦの誘導の漸減を描いた図である。図８Ａ〜図８Ｄでは、ＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡで免疫したＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウス（１群当たりｎ＝３）から、疾患の発症前に脾細胞を得て、様々な濃度でＭＯＧ_{３５−５５}を用いて２４時間負荷を与えた。ＧＭ−ＣＳＦの分泌をＥＬＩＳＡによって測定した（図８Ａ）。ＭＯＧ_{３５−５５}（２０μｇ／ｍＬ）への曝露の最後の４時間にＧｏｌｇｉｐｌｕｇを添加し、ＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉＴ細胞の中でのＩＬ−１７^＋細胞およびＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞の頻度を測定した（図８Ｂ）。図８Ｃおよび８Ｃでは、ＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡで免疫したＳｔａｔ５^−／−マウス、Ｓｔａｔ３^−／−マウス、または野生型対照マウスから脾細胞を得て、Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇの存在下、ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて４時間刺激した。脾臓ＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉＴ細胞の中でのＩＬ−１７^＋細胞およびＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞の頻度を、細胞内サイトカイン染色によって測定した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１である。ＣＮＳ浸潤Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞でのＧＭ−ＣＳＦの誘導の漸減を描いた図である。図９Ａでは、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスのＣＮＳ浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦの発現を、疾患のピーク時に測定した。ＩＬ−１７^＋細胞またはＩＦＮ−γ^＋細胞の中でのＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞のパーセンテージを計算した（右下、図９Ａ）。養子移入ＥＡＥでの疾患のピーク時の、Ｒａｇ２^−／−レシピエントマウスのＣＮＳ浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦの発現である（図９Ｂ）。ナイーブマウス、ならびにＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡで免役したＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウス（各時点で１群当たりｎ＝３）のＣＮＳにおけるサイトカインのｍＲＮＡ発現の経時的解析である。ＲＴ−ＰＣＲデータをＲｎ１８Ｓに正規化し、ナイーブマウスでの発現を１に設定した（図９Ｃ）。データは、２回の独立した実験を代表する。^＊ｐ＜０．０５である。ＳＴＡＴ５媒介性のＧＭ−ＣＳＦの誘導がＩＬ−２３またはＩＬ−１βのシグナリングとは無関係であることを示す図である。図１０Ａでは、精製したＣＤ４^＋Ｔ細胞をＴＧＦ−βおよびＩＬ−６と共に３日間培養し、続いて、６時間飢餓させた。次いで、細胞を、様々なサイトカインを用いて３０分間処理し、イムノブロッティングによって、ｐＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ５を決定した。ストリッピング後、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５をさらに検出した。図１０Ｂは、Ｓｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のＥＡＥマウス（１群当たりｎ＝３）の脾臓ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２３ＲおよびＩＬ−１Ｒ１のｍＲＮＡ発現を示す。ＲＴ−ＰＣＲデータをβ−アクチンに正規化した。図１０Ｃでは、ＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡを免疫したＷＴマウスから疾患の発症前に脾細胞を得て、ＩＬ−２の不在下または存在下で、ＭＯＧ_{３５−５５}（２０μｇ／ｍＬ）を用いて４８時間、負荷を与えた。ＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉＴ細胞の中でのＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞およびＩＬ−１７^＋細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって測定した。^＊ｐ＜０．０５である。ＩＬ−７で誘導したＳＴＡＴ５の活性化によって、自己反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞でＧＭ−ＣＳＦの発現が促進されることを描いた図である。ＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡで免疫したＳｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のマウスから疾患の発症前に脾細胞を得て、ＩＬ−７の不在下または存在下で、ＭＯＧ_{３５−５５}（２０μｇ／ｍＬ）を用いて４８時間、負荷を与えた。ＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉＴ細胞のうちＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞およびＩＬ−１７^＋細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって測定した（図１１Ａ）。ＧＭ−ＣＳＦの分泌を、ＥＬＩＳＡによって測定した（図１１Ｂ）。データは、１群当たり２頭から３頭のマウスを用いた２回の独立した実験を表す。ＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡで免疫したマウス由来の脾臓のＣＤ６２Ｌ^ｈｉＣＤ４４^ｌｏＴ細胞およびＣＤ６２Ｌ^ｌｏＣＤ４４^ｈｉＴ細胞を、選別して取り出した。細胞をＩＬ−７の不在下または存在下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて４時間刺激し、次いで、ＲＴ−ＰＣＲによるＧＭ−ＣＳＦの発現の解析のために回収した（図１１Ｃ）。^＊ｐ＜０．０５である。ＩＬ−７Ｒαの中和によって、ＧＭ−ＣＳＦの発現が弱められ、ＥＡＥが寛解することを描いた図である。矢印で指示されるように、抗ＩＬ−７Ｒαまたは標準ＩｇＧを２回目の免疫後５日目から１日おきに与えることで処理した、ＥＡＥマウス（ｎ＝５）の臨床スコアである。データは、２回の独立した実験を代表する（図１２Ａ）。２回目の免疫後１１日目に、ＥＡＥマウスから脊髄切片を得た。免疫細胞の浸潤を組織学的に評価した。示されている画像は、１群当たり３頭の個体の代表である。スケールバーは、２００μｍ（上部）、５０μｍ（図１２Ｂ、下部）である。ＥＡＥマウスの脾臓中のＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージである。データは、２回の独立した実験を代表する（図１２Ｃ）。図１２Ｄは、異なる処理を受けたＥＡＥマウスのＣＮＳにおけるＣＤ４^＋Ｔ細胞の中でのＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞、ＩＬ−１７^＋細胞、およびＩＦＮ−γ^＋細胞の頻度を図説する。^＊ｐ＜０．０５である。ＩＬ−７Ｒαの中和によって、ＧＭ−ＣＳＦの発現が弱められ、ＥＡＥが寛解することを描いた図である。図１２Ｅは、異なる処理を受けたＥＡＥマウスのＣＮＳにおけるＣＤ４^＋Ｔ細胞の中でのＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞、ＩＬ−１７^＋細胞、およびＩＦＮ−γ^＋細胞の頻度を図説する。ＥＡＥマウスのＣＮＳにおけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７およびＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ発現である（図１２Ｆ）。^＊ｐ＜０．０５である。ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈ細胞の分化が、Ｔ_Ｈ１７およびＴ_Ｈ１とは別個であることを描いた図である。指示されるような様々なサイトカインおよび中和抗体の組合せの存在下で、プレートに結合された抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８を用いて、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞をプライミングした。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１７、およびＩＦＮ−γの発現を、細胞内染色（図１３Ａ）またはＲＴ−ＰＣＲ（図１３Ｂ）によって分析した。ナイーブＴ細胞からのＴ_Ｈ−ＧＭの分化に及ぼすＩＬ−２およびＩＬ−６の効果を示す図である。抗ＣＤ３のみまたは抗ＣＤ２８を追加して用いて７２時間活性化した、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞でのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γの発現である（図１４Ａ）。図１４Ｂでは、選別したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γに対する中和抗体の存在下で、ＩＬ−６を添加しないかまたは添加して、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて刺激した。ＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞およびＩＬ−１７^＋細胞の頻度を、細胞内染色によって測定した（図１４Ｂ）。図１４Ｃでは、Ｓｔａｔ３^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ３^−／−マウスからのナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、指示された条件下で７２時間、極性化させた。ＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞およびＩＬ−１７^＋細胞の頻度を分析した。図１４Ｄでは、ＩＬ−２または抗ＩＬ−２の存在下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化した。ＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞、ＩＬ−１７^＋細胞、およびＩＦＮ−γ^＋細胞の頻度を分析した。ＩＬ−７−ＳＴＡＴ５シグナリングがナイーブ前駆細胞からのＴ_Ｈ−ＧＭの分化をプログラムすることを描いた図である。指示されるような様々な濃度のＩＬ−７の存在下で、プレートに結合された抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８を用いて、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞をプライミングした。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γの発現を、細胞内染色（図１５Ａ）またはＥＬＩＳＡ（図１５Ｂ）によって分析した。ＩＬ−７−ＳＴＡＴ５シグナリングがナイーブ前駆細胞からのＴ_Ｈ−ＧＭの分化をプログラムすることを描いた図である。指示されるような様々な濃度のＩＬ−７の存在下で、プレートに結合された抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８を用いて、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞をプライミングした。図１５Ｃおよび図１５Ｄでは、ＩＬ−７の存在下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて、Ｓｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を３日間活性化した。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１７、およびＩＦＮ−γの発現を、細胞内サイトカイン染色（図１５Ｃ）によって分析した。ＧＭ−ＣＳＦの分泌を、ＥＬＩＳＡ（図１５Ｄ）によって測定した。Ｓｔａｔ５^−／−マウスまたは対照マウスから単離し、ＩＬ−７で刺激されたＣＤ４^＋Ｔ細胞中の、ｐＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ５のイムノブロッティングである（図１５Ｅ）。標準ＩｇＧまたはＳＴＡＴ５特異的な抗体を使用して、Ｓｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のＣＤ４^＋Ｔ細胞を用いて、ＣｈＩＰアッセイを実施した。Ｃｓｆ２プロモーター領域への抗体の結合が、ＲＴ−ＰＣＲによって検出された（図１５Ｆ）。Ｔ_Ｈ−ＧＭサブセットのための分化条件を描いた図である。指示されるようなＩＬ−７または／および抗ＩＦＮ−γの存在下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化した。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１７、およびＩＦＮ−γの発現を分析した（図１６Ａ）。ナイーブ細胞、Ｔ_Ｈ１細胞（ＩＬ−１２＋抗ＩＬ−４）、Ｔ_Ｈ１７細胞（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６＋抗ＩＦＮ−γ＋抗ＩＬ−４）、およびＴ_Ｈ−ＧＭ細胞（ＩＬ−７＋抗ＩＦＮ−γ）中の、Ｔ−ｂｅｔおよびＲＯＲγｔのｍＲＮＡ発現である（図１６Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲデータをＧａｐｄｈに正規化し、ナイーブＴ細胞での発現を１に設定した。ＩＬ−７がナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞中でＳＴＡＴ５の活性化およびＧＭ−ＣＳＦの発現を誘導し、ＩＬ−２はしないことを説明する図である。図１７Ａ〜図１７Ｃは、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞、または指示されるように抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を様々な時点で用いて活性化した細胞の、表面のＣＤ２５およびＣＤ１２７のフローサイトメトリーを示す。ＩＬ−２またはＩＬ−７を用いて３０分間刺激されたナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞中でのＳＴＡＴ５の活性化である（図１７Ｄ）。図１７Ｅは、ＩＬ−２またはＩＬ−７の存在下で抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて刺激された、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ発現を示す。ＲＴ−ＰＣＲデータをβ−アクチンに正規化し、サイトカイン不含で２時間活性化したナイーブＴ細胞での発現を１に設定した。ＩＬ−２およびＩＬ−７の両方が、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞中でＳＴＡＴ５の活性化およびＧＭ−ＣＳＦの発現を誘導することができることを示す図である。図１８Ａおよび図１８Ｂに示されるように、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を３日間活性化した。新鮮な培地にとどまらせた後、様々な時点でＩＬ−２またはＩＬ−７を用いて細胞を刺激した。ｐＴｙｒ−ＳＴＡＴ５およびβ−アクチンを、イムノブロッティングによって検出した（図１８Ａ）。ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した（図１８Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲデータをβ−アクチンに正規化し、サイトカイン刺激のない細胞での発現を１に設定した。標準ＩｇＧまたはＳＴＡＴ５特異的な抗体を用いて、図１８Ｃに示されるＣｈＩＰアッセイを実施した。抗体のＣｓｆ２プロモーター領域への結合を、ＲＴ−ＰＣＲによって検出した。マイクロアレイ解析によって特徴を明らかにされたように、Ｔ_Ｈ−ＧＭサブセットにおいて高レベルまたは低レベルで選択的に発現する、表面分子を描いた図である。各系譜に特異的なこれらの表面分子は、自己免疫性炎症の新規の診断、治療、および防止のためのマーカー、シグネチャー、および潜在的な標的として役割を果たし、そのような自己免疫性炎症としては、以下に限定されないが、多発性硬化症および関節リウマチが挙げられる。これらの細胞表面分子は、表１に詳細に挙げられている。図中挿入部に指示されるようなナイーブ、Ｔｈ１、Ｔｈ１７、およびＴｈ−ＧＭの順番は、各グラフ内のバーについて現れているものと同じである。ＩＬ−３がＴ_Ｈ−ＧＭ細胞中で優先的に発現されることを示す図である。図２０Ａおよび図２０Ｂでは、Ｔ_Ｈ１（ＩＬ−１２＋抗ＩＬ−４）、Ｔ_Ｈ１７（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６＋抗ＩＦＮ−γ＋抗ＩＬ−４）、およびＴ_Ｈ−ＧＭ（ＧＭ−ＣＳＦ^＋Ｔ_Ｈ，ＩＬ−７＋抗ＩＦＮ−γ＋抗ＩＬ−４）の極性化条件下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化した。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の発現を、細胞内染色によって分析した（図２０Ａ）。ＩＬ−３、ＥＢＩ−３、ＰＥＮＫ、またはＲＡＮＫＬサイトカインのｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した（図２０Ｂ）。ＩＬ−７不含または含有で分化したＩＬ−３＋細胞の頻度である（図２０Ｃ）。ＷＴまたはＳＴＡＴ５欠損のＧＭ−ＣＳＦ産生ＴＨ細胞によるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の発現である（図２０Ｄ）。６×１０^５個の様々なＭＯＧ_{３５−５５}特異的なＴ_Ｈサブセットの養子移入の、Ｒａｇ２^−／−マウス（１群当たりｎ＝３〜６のマウス）の臨床ＥＡＥスコアを描いた図である。ＳＴＡＴ５の活性化の阻害によって、ｉｎｖｉｔｒｏでＴ_Ｈ−ＧＭ細胞の分化が抑制されることを描いた図である。ＳＴＡＴ５阻害剤（カルビオケム社）（図２２Ａ）もしくはＪＡＫ３阻害剤（図２２Ｂ）を指示の濃度で用いるか、またはビヒクル（−）を用いて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を１時間プレインキュベーションした後、ＩＬ−７を用いて３０分間刺激した。ＳＴＡＴ５の活性化（Ｔｙｒ６９４リン酸化）を、イムノブロッティングによって判定した。ＳＴＡＴ５阻害剤を指示の濃度で用いるか、またはビヒクル（−）を用いて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を１時間プレインキュベーションした後、ＩＬ−６を用いて３０分間刺激した。ＳＴＡＴ３の活性化（Ｔｙｒ７０５リン酸化）を、イムノブロッティングによって判定した（図２２Ｃ）。図２２Ｄでは、ＳＴＡＴ５阻害剤を指定の濃度で用いるか、またはビヒクル（−）を用いて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を１時間プレインキュベーションした後、ＩＦＮ−γを用いて３０分間刺激した。ＳＴＡＴ１の活性化（Ｔｙｒ７０１リン酸化）を、イムノブロッティングによって判定した。図２２Ｅでは、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を単離し、中性条件またはＴ_Ｈ−ＧＭ細胞に好ましい条件下で、異なる濃度のＳＴＡＴ５阻害剤を添加して３日間、活性化した。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γの発現を、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによって分析した。化学阻害剤によりＳＴＡＴ５の活性化を標的とすることによって、ＥＡＥが寛解することを描いた図である。（図２３Ａ）野生型対照マウス（ｎ＝５）またはＳＴＡＴ５阻害剤（カルビオケム社）を投与されたものの臨床ＥＡＥスコアである。矢印は、処理点を指し示す。（図２３Ｂ）異なる処理を受けたＥＡＥマウスの１８日目での脊髄の組織学である。（図２３Ｃ）疾患のピーク時のＣＮＳ浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞の細胞内染色およびフローサイトメトリーである。（図２３Ｄ）ＲＮＡ抽出に用いるため、全ＣＮＳを回収した。ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。データは、２回の独立した実験を代表する。^＊ｐ＜０．０５である。ＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞が、ヒトＲＡと関連があることを描いた図である。健康な対照ＨＣ（ｎ＝３２）およびＲＡ（ｎ＝４７）におけるＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの血漿濃度が、ＥＬＩＳＡによって定量された（図２４Ａ）。図２４Ｂおよび図２４Ｃでは、健康な対照（ＨＣ）および関節リウマチ（ＲＡ）患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採集し、Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇの存在下、ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて４時間刺激し、続いて、細胞内サイトカイン染色を行った。ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１７の代表的なフローサイトメトリー（図２４Ｂ）、ならびに１群当たりｎ≧９の統計（図２４Ｃ）を示す。図２４Ｄは、ＲＡ患者（ｎ＝１８）の末梢血中のＧＭ−ＣＳＦ^＋ＩＦＮ−γ⁻Ｔ_Ｈ細胞の頻度と血漿ＧＭ−ＣＳＦのレベルとの相関を示す。ＲＡ患者の滑液に由来するＣＤ４^＋Ｔ細胞によるサイトカイン発現を、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによって分析した（図２４Ｅ）。３つのケースの代表的な画像を示した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓは有意差なしである。マウスＡＩＡにおけるＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−αとの区別可能な効果を描いた図である。図２５Ａは、ＡＩＡモデルにおいて１００μｇのｍＢＳＡを関節内注射後７日間にわたる野生型マウスの膝関節腫脹を示し、指示される時間（矢印）に、対照ＩｇＧ、ＧＭ−ＣＳＦ特異的中和抗体、およびＴＮＦ−α特異的中和抗体を別々に、または組合せて処理を受けた（１群当たりｎ＝５）後、。図２５Ｂは、関節炎の誘導後７日間にわたるＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウス（１群当たりｎ＝６）の膝関節腫脹を示す。データは、３つを超える独立した実験の代表である。図２５Ｃに示されるような関節炎の誘導後７日目に、Ｈ＆Ｅ（図２５Ｃ）またはサフラニン−Ｏ／ＦａｓｔＧｒｅｅｎ（図２５Ｄ）を用いて染色した関節切片の代表的な画像である。バーは、５００μｍ（図２５Ｃの上部パネルおよび図２５Ｄ）または１００μｍ（図２５Ｃ下部パネル）である。上部パネル（図２５Ｃ）の矢印は、骨破壊を指し示す。図２５Ｅでは、Ｓｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のＡＩＡマウスにおけるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αの血清濃度を、ＥＬＩＳＡによって定量した。１群当たりｎ≧８の統計を示した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１である。Ｔ細胞にＳｔａｔ５欠失を有したマウスがＣＩＡに抵抗性であることを描いた図である。（図２６Ａ）ＣＩＡモデルにおいてコラーゲンＩＩ／ＣＦＡ免疫後４０日目のＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスの脚腫脹の代表的な画像である。（図２６Ｂ）コラーゲンＩＩ／ＣＦＡ免疫後４０日間にわたるＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウス（１群当たりｎ＝５）の臨床スコアである。データは、２回の独立した実験の代表である。（図２６Ｃ）４０日目にＨ＆Ｅを用いて染色した脚切片の代表的な画像である。（図２６Ｄ）ＴＮＦ−αの血清中濃度（１群当たりｎ＝８）を、ＥＬＩＳＡによって定量した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１である。ＳＴＡＴ５欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、潜在的な関節炎発症能に欠陥があることを描いた図である。（図２７Ａおよび図２７Ｂ）ＡＩＡ誘導後７日目のＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスの脾臓中（図２７Ａ）および鼠径部リンパ節中（図２７Ｂ）のＣＤ４^＋Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリーである。（図２７Ｃおよび図２７Ｄ）ＡＩＡ誘導後７日目に、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスから滑膜組織を回収し、単細胞に解離させた。ＣＤ４５^＋白血球の細胞数を計算した（図２７Ｃ）。ＣＤ４５^＋画分の中でのＣＤ４^＋Ｔ細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって分析し、細胞数を計算した（図２７Ｄ）。（図２７Ｅ）ｉｎｖｉｔｒｏで拡大した抗原反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞を移入し、続いてｍＢＳＡを関節内注射した後の７日目の野生型ナイーブマウスからの関節切片の組織学解析である。バーは１００μｍである。データは、２回の独立した実験を代表する。^＊ｐ＜０．０５であり、ｎｓは有意差なしである。ＳＴＡＴ５制御性のＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞がＡＩＡに決定的に重要であることを描いた図である。関節炎の誘導後７日目のＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスから、脾臓および滑膜組織を採集した。（図２８Ａ）指示された条件下で、野生型ＡＩＡマウス（ｎ＝３）の脾臓画分を１８時間刺激した。上清中のＧＭ−ＣＳＦレベルをＥＬＩＳＡによって定量した。（図２８Ｂ）Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇの存在下でＰＭＡ／イオノマイシンを用いて４時間再刺激した後の、脾臓ＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉエフェクターＴ細胞のＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１７、およびＩＦＮ−γの細胞内染色およびフローサイトメトリーである。１群当たりｎ＝５（図２８Ｂ、右パネル）の代表的な画像および統計を示した。データは、２回の独立した実験を代表する。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１であり、ｎｓは有意差なしである。「脾細胞」は、各群の最も左のバーを表し、「ＣＤ４＋Ｔ細胞が枯渇した脾細胞」は、各群の中央のバーを表し、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、各群の最も右のバーを表す。ＳＴＡＴ５制御性のＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞がＡＩＡに決定的に重要であることを描いた図である。関節炎の誘導後７日目のＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスから、脾臓および滑膜組織を採集した。（図２８Ｃ〜２８Ｄ）Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇの存在下でＰＭＡ／イオノマイシンを用いて４時間再刺激した後の、滑膜浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１７、およびＩＦＮ−γの細胞内染色およびフローサイトメトリーである。１群当たりｎ＝３（図２８Ｄ、右パネル）の代表的な画像および統計を示した。データは、２回の独立した実験を代表する。（図２８Ｅ）滑膜組織でのいくつかのプロ炎症性サイトカインのタンパク質発現を、ＥＬＩＳＡによって測定した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１であり、ｎｓは有意差なしである。ＳＴＡＴ５制御性のＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞がＡＩＡに決定的に重要であることを描いた図である。関節炎の誘導後７日目のＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスから、脾臓および滑膜組織を採集した。（図２８Ｆおよび図２８Ｇ）ｍＢＳＡのみを右膝関節に、ＧＭ−ＣＳＦを補ったｍＢＳＡを左膝関節に関節内注射した後、７日目にＨ＆Ｅ（図２８Ｆ）またはサフラニン−Ｏ／ＦａｓｔＧｒｅｅｎ（図２８Ｇ）を用いて染色した、関節切片の代表的な画像である。バーは、指示されるように５００、５０、または２００μｍである。データは、２回の独立した実験を代表する。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１であり、ｎｓは有意差なしである。ＳＴＡＴ５の喪失の結果、抗原特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＧＭ−ＣＳＦ産生が損なわれることをを描いた図である。関節炎の誘導後７日目に、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウスまたはＳｔａｔ５^−／−マウスから脾臓および鼠径部ＬＮを採集し、単細胞懸濁液に解離させた。次いで、ｍＢＳＡ（２０μｇ／ｍＬ）を用いて、細胞を２４時間刺激した。（図２９Ａ）培養の最後の４時間にＧｏｌｇｉｐｌｕｇを添加し、続いて、細胞内染色およびフローサイトメトリーを行った。ＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉエフェクターＴ細胞中のＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１７、およびＩＦＮ−γの発現の代表的なプロットを示したが、これらは２回の独立した実験を代表する。（図２９Ｂおよび図２９Ｃ）上清中に分泌されたサイトカイン（１群当たりｎ＝３）をＥＬＩＳＡによって定量した。データは、２回の独立した実験を代表する。^＊ｐ＜０．０５であり、ｎｓは有意差なしである。ＳＴＡＴ５の喪失によって、関節炎マウスの滑膜組織でのＩＬ−６およびＩＬ−１βの発現が損なわれることを描いた図である。（図３０Ａ〜図３０Ｃ）関節炎の誘導後５日目または７日目のＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウス（１群当たりｎ≧３）の滑膜組織中のいくつかのプロ炎症性サイトカインのｍＲＮＡ（図３０Ａおよび図３０Ｃ）ならびにタンパク質（図３０Ｂ）の発現を、ｑＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによって測定した。ｑＰＣＲデータを、Ｒｎ１８Ｓに正規化した。ＳＡＴ５で誘導されたＧＭ−ＣＳＦ発現によって、炎症を生じた滑膜組織中のＣＤ１１ｂ^＋細胞の蓄積が媒介されたことを描いた図である。（図３１Ａ）Ｓｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のＡＩＡマウスの脾臓中のＣＤ１１ｂ^＋細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって分析した。１群当たりｎ＝３（右パネル）の統計を示した。（図３１Ｂ）関節炎の誘導後７日目に、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスから滑膜組織を回収し、単細胞懸濁液に解離させた。ＣＤ４５^＋画分の中でのＣＤ１１ｂ^＋骨髄系細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって分析した。１群当たりｎ＝５の統計を右パネルに示す。（図３１Ｃ）関節炎の誘導後７日間にわたる、滑膜のＣＤ４５^＋画分にゲートをかけたＣＤ１１ｂ^＋細胞およびＣＤ４^＋細胞の代表的なフローサイトメトリーである。（図３１Ｄ）ｍＢＳＡのみを右膝関節に、ＧＭ−ＣＳＦを補ったｍＢＳＡを左膝関節に、関節内注射した後７日目のＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスの滑膜組織における、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ１１ｂ^＋細胞、およびＢ２２０^＋細胞の浸潤のフローサイトメトリー解析である。代表的な画像を示した。示された全てのデータは、２回の独立した実験の代表である。^＊＊ｐ＜０．０１であり、ｎｓは有意差なしである。ＧＭ−ＣＳＦが関節炎マウスでの好中球の蓄積を媒介することを描いた図である。（図３２Ａ）関節炎の誘導後７日間にわたる、滑膜のＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋画分にゲートをかけたＬｙ６ＣおよびＬｙ６Ｇの発現のフローサイトメトリー解析である（図３２Ｂ）。ＡＩＡマウスの滑膜組織由来の選別したＬｙ６Ｃ^ｈｉＬｙ６Ｇ⁻細胞およびＬｙ６Ｃ^ｌｏＬｙ６Ｇ^ｈｉ細胞のギムザ染色である。スケールバーは、１００μｍ（左）または２０μｍ（右）である。（図３２Ｃ）ｍＢＳＡのみを右膝関節に、ＧＭ−ＣＳＦを補ったｍＢＳＡを左膝関節に、関節内注射した後７日目の、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスの滑膜組織における、Ｌｙ６Ｃ^ｈｉＬｙ６Ｇ⁻集団およびＬｙ６Ｃ^ｌｏＬｙ６Ｇ^ｈｉ集団のフローサイトメトリー解析である（図３２Ｄ）。Ｌｙ６Ｇ特異的な中和抗体（１Ａ８）またはＩｇＧ対照（１群当たりｎ＝５）を用いて処理された、野生型マウスの膝関節腫脹であり、ＡＩＡモデルにおいてｍＢＳＡの関節内注射後３日間にわたるものである。矢印は、抗体投与の時点を指し示す。^＊ｐ＜０．０５である。ＧＭ−ＣＳＦがｉｎｖｉｔｒｏで好中球の遊出を亢進し、アポトーシスを遅延させることをを描いた図である。（図３３Ａ）開始から３時間後の遊出アッセイにおける、ケモアトラクタントとしてのＧＭ−ＣＳＦ含有または不含での遊走好中球のパーセンテージである。（図３３Ｂ）遊出アッセイにおける下部チャンバーの底部のＣＦＳＥ標識した好中球の顕微鏡画像である。（図３３Ｃ）選別した好中球をｉｎｖｉｔｒｏで、ＧＭ−ＣＳＦ含有（２０ｎｇ／ｍＬ）または不含で２４時間培養した。アポトーシスを経た好中球を、アネキシンＶおよびプロピジウムイオダイド（ＰＩ）の共染色によって検討した。３回の繰り返しのうち代表的なフローサイトメトリーを示した。^＊ｐ＜０．０５である。ＧＭ−ＣＳＦが、関節炎マウスで、骨髄系細胞および滑膜線維芽細胞によるプロ炎症性サイトカインの発現を媒介することを描いた図である。滑膜組織を野生型ＡＩＡマウスから切り出し、単細胞懸濁液に解離させた。（図３４Ａ表面マーカーの示差的な発現に基づく、異なる集団への分画を描いた、フローサイトメトリーのプロットである。（図３４Ｂ）選別したＣＤ４５^＋ＴＣＲβ^＋（短く言えばＴＣＲβ^＋）集団、ＣＤ４５^＋ＴＣＲβ⁻ＣＤ１１ｃ⁻ＣＤ１１ｂ^＋（ＣＤ１１ｂ^＋）集団、およびＣＤ４５^＋ＴＣＲβ⁻ＣＤ１１ｃ^＋（ＣＤ１１ｃ^＋）集団におけるいくつかのプロ炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現を、ｑＰＣＲによって測定した。ｑＰＣＲデータをＧＡＰＤＨに正規化した。（図３４Ｃ）選別したＬｙ６Ｃ^ｈｉＬｙ６Ｇ⁻集団およびＬｙ６Ｃ^ｌｏＬｙ６Ｇ^ｈｉ集団（ＣＤ１１ｂ^＋細胞にゲートをかけた）における、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現である。ｑＰＣＲデータをＧＡＰＤＨに正規化した。（図３４Ｄおよび３４Ｅ）２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを用いて１時間刺激した時の、ＢＭＤＭ（図３４Ｄ）およびＢＭＤＣ（図３４Ｅ）によるＩＬ−６およびＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現である。ｑＰＣＲデータをＧＡＰＤＨに正規化した。（図３４Ｆおよび３４Ｇ）指示された濃度でＧＭ−ＣＳＦ（１群当たりｎ＝３）を用いて、ＢＭＤＭ（図３４Ｆ）およびＢＭＤＣ（図３４Ｇ）を１８時間刺激した。培養上清中のＩＬ−６の分泌を、ＥＬＩＳＡによって定量した。（図３４Ｈ）指示された濃度のＧＭ−ＣＳＦの存在下で（１群当たりｎ＝３）、ＬＰＳ（１００μｇ／ｍＬ）を用いて、ＢＭＤＭを６時間プライミングし、続いて、ＡＴＰ（５ｍＭ）を用いて３０分間刺激した。培養上清中のＩＬ−１βの分泌を、ＥＬＩＳＡによって定量した。（図３４Ｉ）１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ培地中で、２０日間超、５継代より多くの継代で細胞を培養して、滑膜線維芽細胞を得た。ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を用いて、滑膜線維芽細胞を１時間刺激し、ＲＮＡ抽出のために回収した。ＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現を、ｑＰＣＲによって測定した。ｑＰＣＲデータをＧＡＰＤＨに正規化した。全てのデータは、２回の独立した実験を代表する。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１である。

本発明の例示的な実施形態を以下に記載する。

本開示は、一部では、「Ｔ_Ｈ−ＧＭ」と呼ばれる、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を分泌するＴヘルパー細胞を特定することに関する。本明細書に詳述されているように、ＩＬ−７／ＳＴＡＴ５シグナリングは、前駆ＣＤ４＋細胞のＴ_Ｈ−ＧＭへの分化をプログラムし、これは、ＩＬ−２およびＩＬ−２３のシグナリングによってさらに調節される過程である。Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、例えばＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の産生という特徴を有する。Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、公知のヘルパーＴ細胞であるＴ_Ｈ１およびＴ_Ｈ１７とは、例えば分化条件、転写制御、およびエフェクターサイトカインの発現の点で別個である。例えば、ＩＬ−１２／ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−β／ＩＬ−６は、Ｔ_Ｈ１およびＴ_Ｈ１７をそれぞれ媒介する（例えば発生を促進する）が、ナイーブＣＤ４^＋前駆細胞からのＴ_Ｈ−ＧＭの発生を抑制する可能性があり、このことは、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞がＴ_Ｈ１およびＴ_Ｈ１７とは別個の系譜を介して発生することを立証している。そのため、本開示は、Ｔ_Ｈ１またはＴ_Ｈ１７を媒介することが知られる因子とは異なる独特のもので
あり、かつＴ_Ｈ−ＧＭ機能（例えば、その分化および病原性）を媒介する、別個の因子のネットワークを提供する。

本明細書に示されるように、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、Ｔ_Ｈ１細胞およびＴ_Ｈ１７細胞に比較して優先的にＥＡＥを誘導し、このことは、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞が、ヒトの自己免疫性神経炎症の病態形成における主要なエフェクターを代表することを指し示している。しかも、ＩＬ−７シグナリングの遮断および／またはＳＴＡＴ５機能の阻害（例えば、発現の抑止もしくはＳＴＡＴ５活性の阻害）によって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞によるＧＭ−ＣＳＦ産生の漸減に関連のある自己免疫性神経炎症が弱められる。さらに、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞によって分泌されるＧＭ−ＣＳＦを遮断することによって、実験的な関節炎がＴＮＦ−α非依存的な様式で寛解するが、このことは、例えば、ＴＮＦ−α拮抗薬に不応性の関節リウマチ患者を治療するためのアプローチがあることを指し示している。そのため、本開示は、ある者を、Ｔ_Ｈ−ＧＭ経路によって媒介される炎症性障害（例えば、Ｔ_Ｈ−ＧＭの病原性の結果として生じる、例えばＧＭ−ＣＳＦおよび／もしくはＩＬ−３、またはＴ_Ｈ−ＧＭ経路に関連のある何らかの因子の作用を通じた障害）（例えばＲＡ）であるか、または、例えばＴＮＦ−α経路、ＩＬ−６経路、および／またはＩＬ−１β経路（すなわち非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性経路）によって媒介される炎症性障害であるかを、識別することができる。例として、例えばＲＡである患者は、主にＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性であるか、または主に非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性（例えばＴＮＦ−α媒介性またはＩＬ−６媒介性）であるタイプのＲＡに罹患していることがある。本開示は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性と非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症とを分類できるようにして、ＲＡやＭＳなどの炎症性障害に罹患している個体でさらに正確に診断、予測、および治療することを可能にする。

本明細書に提示されるように、本開示は、ヘルパーＴ細胞サブセット（Ｔ_Ｈ−ＧＭ）を特定し、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおけるナイーブ前駆細胞からのこのサブセットの関与および発生について分子的基盤を提供し、自己免疫疾患および炎症性障害、例えばＭＳおよびＲＡにおける主要な病原細胞としてのＴ_Ｈ−ＧＭ細胞を実証する。そのため、本明細書で提供されるのは、主にＴ_Ｈ−ＧＭ細胞によって媒介される炎症性状態を診断し、それによって、例えばＴＮＦ−α療法（例えばＴＮＦ−α阻害剤に基づく療法）に不応性のＲＡ患者の特定を可能にするための組成物および方法、ならびにＴ_Ｈ−ＧＭ機能を調節して、自己免疫性障害および炎症性障害を治療するための組成物および方法である。Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する方法は、例えば、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を媒介する因子（例えばＩＬ−２／ＩＬ−７／ＳＴＡＴ５／ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３）のネットワークの機能（例えばシグナリング、発現、または活性）を調節するための薬剤を、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の機能（例えば発生および病原性）を調節するのに有効な量で投与することを含む。具体的には、本開示は、炎症性障害、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）を、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞（すなわちＴ_Ｈ−ＧＭ経路媒介性）によるか、もしくは非Ｔ_Ｈ−ＧＭ機構（例えばＴＮＦ−α経路、ＩＬ−６経路、および／もしくはＩＬ−１β経路）によるかのどちらか、またはその両方によって主に媒介されるものとして、区別および診断するための方法および組成物を提供する。また、本明細書で提供されるのは、炎症性障害、具体的にはＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性であるものの治療のための組成物および方法である。

したがって、一態様では、本開示は、炎症性障害に罹っている患者でＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を診断する方法を提供する。実施形態によっては、本方法は、炎症性障害に罹っている患者から採集した試料を、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介因子、例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、またはそれらの組合せなどのポリペプチドまたは核酸のレベルを検出する検出剤に接触させること；およびＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子（例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、またはそれらの組合せ）のポリペプチドまたは核酸のレベルを定量することであって、参照レベルに比べて増加しているＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子（例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、ま
たはそれらの組合せ）のレベルは、患者が、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害に罹っていることを指し示すことを含み、それによって、炎症性障害に罹っている患者のＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を診断する。

本明細書に使用されるとき、「Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性」炎症性障害は、本明細書に記載されるように、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する経路中の因子（「Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介因子」）のネットワークのうちいずれか１つまたは複数のものの生理作用の結果として生じる、炎症性障害のサブタイプ（例えば、ＲＡまたはＭＳのサブタイプ）を指す。そのような因子としては、例えばＧＭ−ＣＳＦ、活性化ＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＩＬ−２、およびＩＬ−３が挙げられる。具体的な実施形態では、ＳＴＡＴ５は、６９４位のチロシンがリン酸化されている活性化ＳＴＡＴ５である。

実施形態によっては、参照レベルに比べて増加していないＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子（例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、またはそれらの組合せ）のレベルは、患者が非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害に罹っていることを指し示す。

ある特定の実施形態では、本方法は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介因子（例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、またはそれらの組合せ）のレベルが参照レベルに比べて増加していない場合、本明細書に記載されるように、ＴＮＦ−α療法を患者に投与することをさらに含む。

本明細書に使用されるとき、「非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性」炎症性障害は、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＩＬ−１βおよび／またはＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＩＬ−１β経路）中の因子によって主に引き起こされる炎症性障害（例えばＲＡまたはＭＳ）を指す。同じように、「Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性」炎症性障害は、主に（または専ら）、「非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性」炎症性障害につながる経路（例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、またはＩＬ−１βに関連がある経路）のうち１つまたは複数とは別個の経路から結果として生じる。

しかし、当業者が認識することになるように、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害は、炎症性障害が部分的に非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、またはＩＬ−１βおよび／またはＴＮＦ−α、ＩＬ−６、またはＩＬ−１β経路中の因子による媒介性）でもありうる可能性を必ずしも排除するものではない。そのため、「Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性」とする分類または診断は、「主に／優勢にＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性」と同義であり、「非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性」とする分類は、「主に／優勢に非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性」と同義である。例えば、いかなる具体的な理論に縛られることを望むものではないが、早期の段階にある炎症性障害は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性である場合がある。炎症性状態が、例えば組織の損傷という特徴を有した後期の段階に進むにつれて、炎症性障害は、漸次非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性となってゆく。実施形態によっては、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害は、臨床基準によって決定されるように、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の調節に応答性の状態である。そして、非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害は、臨床基準によって決定されるように、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、またはＩＬ−１β療法に応答性の状態である。ある特定の実施形態では、炎症性障害は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の調節、ならびにＴＮＦ−α、ＩＬ−６、および／またはＩＬ−１β療法に応答性である可能性がある。

実施形態によっては、試料は、例えば末梢血、脳脊髄液、滑液、もしくは滑膜、またはそれらの組合せとすることができる。

実施形態によっては、炎症性障害は、自己免疫性障害である。ある特定の実施形態では、炎症性障害は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞によって媒介される任意の炎症性障害である可能性があり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、関節リウマチ、多発性硬化症、強
直性脊椎炎、クローン病、糖尿病、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、紅斑性狼瘡、リウマチ性多発筋痛症、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群／現象、反応性関節炎（ライター症候群）、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、または血管炎が挙げられる。

本明細書に使用されるとき、「検出剤」は、例えば、検出されるポリペプチドまたは核酸［例えばＳＴＡＴ５（例えばホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４））、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−３］に結合する抗体、ペプチド、低分子、または核酸を指し、検出されるポリペプチドまたは核酸の定量を可能にする。検出剤は、検出可能であるように標識するか、または当技術分野で公知の他の手段によって定量可能とすることができる。

実施形態によっては、検出剤は、ＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−３のポリペプチドに結合する抗体である。一実施形態では，抗体は、本明細書に記載されるように、活性化ＳＴＡＴ５（例えばリン酸化ＳＴＡＴ５）に結合するものである。本願の方法での使用に適したＳＴＡＴ５［例えばホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）］、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−３への抗体は、当技術分野で公知かつ商業的に利用可能である［例えば、サンタクルズバイオテク社からのＳＴＡＴ５Ａｂ：Ｃ−１７、セルシグナリング社からのホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）Ａｂ：＃９３５１または＃９３５９、ＢＤファーミンジェン社からのＩＬ−７Ａｂ：クローンＢＶＤ１０−４０Ｆ６、ＢＤファーミンジェン社からのＩＬ−７ＲＡｂ：クローンＳＢ／１４、ＢＤファーミンジェン社からのＧＭ−ＣＳＦＡｂ：クローンＭＰ１−２２Ｅ９、ＢＤファーミンジェン社からのＩＬ−３Ａｂ：クローンＭＰ２−８Ｆ８。

他の実施形態では，検出剤は、ＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＩＬ−３の核酸に結合する核酸である。例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−３のポリペプチド配列をコードする核酸分子に高いストリンジェンシーでハイブリダイズする、例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−３の配列をコードする核酸分子、またはそれらの断片もしくはオリゴヌクレオチドは、本開示の診断方法での使用のために、試料中のＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−３の核酸レベルの発現をモニターするためのプローブとして使用されてもよい。核酸のレベルを定量する方法は、当技術分野で定型かつ利用可能である。

実施形態によっては、本方法は、表１に挙げられた１つまたは複数の遺伝子（ならびに遺伝子産物）のポリペプチドまたは核酸のレベルを検出する検出剤に、試料を接触させることをさらに含む。本明細書に記載されるように、表１は、Ｔ_Ｈ１細胞またはＴ_Ｈ１７細胞と比較した際に、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞中で示差的に発現されている遺伝子、ならびにＴ_Ｈ−ＧＭ細胞の表面で示差的に発現されている遺伝子を挙げている。

具体的な実施形態では、本方法は、塩基性へリックス−ループ−へリックスファミリーのメンバーｅ４０（ＢＨＬＨｅ４０）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＣＲ４）、および／またはＣＣＲ６のポリペプチドまたは核酸のレベルを検出する検出剤に、試料を接触させることをさらに含む。

標準的な方法を、任意の試料中のポリペプチドのレベルを定量するために使用してもよい。そのような方法としては、例えば、当技術分野で公知のＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、ポリペプチドを指向する抗体を使用した蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、および定量的酵素免疫アッセイ手法が挙げられる。そのような方法は、当技術分野で定型かつ利用可能である。同様に、核酸のレベル（例えばｍＲＮＡ）を定量するための方法は、当技術分野で公知である。

本開示の診断方法では、参照レベルに比べて増加しているＳＴＡＴ５［例えば活性化ホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）］、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−３のレベルは、患者がＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害に罹っていることを指し示す。

実施形態によっては、参照レベルに比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも２２０％、少なくとも２４０％、少なくとも２６０％、少なくとも２８０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、少なくとも５５０％、または少なくとも６００％増加しているＳＴＡＴ５［例えば活性化ホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）］、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−３のレベルは、患者がＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害に罹っていることを指し示す。具体的な実施形態では、参照レベルに比べて、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも１５０％の増加は、患者がＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害に罹っていることを指し示す。

実施形態によっては、参照レベルに比べて、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも１５０％増加しないＳＴＡＴ５［例えば活性化ホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）］、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−３のレベルは、患者が非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害に罹っていることを指し示す。

ある特定の実施形態では、参照レベルに比べて同等である（または変わらない）ＳＴＡＴ５［例えば活性化ホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）］、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−３のレベルは、患者が非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性障害に罹っていることを指し示す。本明細書に使用されるとき、参照レベルのものに「同等である」レベルとは、変わらないレベルか、または参照レベルに比べて臨床規準に従って統計的に有意でない変化を指す。ある特定の実施形態では、同等であるレベル（または変わらないレベル）は、参照レベルに比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％増加しないレベルを含むことができ、例えば、それは、臨床的に有意な変化を指し示さないことがある。実施形態によっては、参照レベルに比べて低下したＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子［例えばＳＴＡＴ５（例えば活性化ホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４））、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＩＬ−３］のレベルはまた、患者が非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性障害に罹っていることを指し示す可能性がある。

実施形態によっては、参照レベルは、比較の目的のために使用されるレベルであり、例えば、同じ患者から採取される事前の試料；正常かつ健康な対象；自己免疫疾患または炎症性障害を持たない対象由来の試料；自己免疫疾患を発病する傾向があることを診断されたが、その疾患の症状を未だに示していない対象；自己免疫疾患に対し治療されている患者；または公知の正常濃度の本開示の精製された参照ポリペプチドまたは核酸分子（例えばＳＴＡＴ５）の試料から得てもよい。「参照基準またはレベル」によって、とは、参照試料に由来する値もしくは数、または健康であること（例えば炎症性障害を持たない個体）を指し示すものとして本技術分野で許容されている値もしくは範囲を意味する。正常な参照基準またはレベルとは、自己免疫疾患を持たない正常な対象に由来する値もしくは数とすることもできる。一実施形態では、参照試料、基準、またはレベルを、以下の判断基準、すなわち年齢、体重、体型指数（ＢＭＩ）、疾患の段階、および健康全般のうち、少なくとも１つで試料対象と一致させる。正常な参照範囲内にある精製ＤＮＡ、ＲＮＡ、ま
たはｍＲＮＡのレベルの標準曲線もまた、参照として使用することができる。正常な参照範囲内にある精製タンパク質のレベルの標準曲線もまた、参照として使用することができる。

実施形態によっては、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を有するものとして診断または分類されている、炎症性障害に罹患している患者は、非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を持たない（すなわちＴＮＦ−α、ＩＬ−６、またはＩＬ−１β媒介性の炎症性障害を持たない）。すなわち、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害に罹っているものとして診断された患者は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の調節（例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−３の阻害）には応答するが、臨床基準によって決定されるように、ＴＮＦ−α療法に応答しない（または、限定的な応答を示す）。しかし、本明細書に記載されるように、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害は、炎症性障害がまた、部分的に（主にではないものの）非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性経路（例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β）による寄与を受ける可能性を排除するものではない。

実施形態によっては、本開示の方法は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を有するものと診断または分類された患者に、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の機能を調節する有効量の調節剤を投与することをさらに含む。本明細書に記載されるように、実施形態によっては、調節剤は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を阻害する。

実施形態によっては、本開示の方法は、本明細書に記載されるように、非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を有するものと診断または分類された患者に、有効量の例えばＴＮＦ−α療法、ＩＬ−６療法、またはＩＬ−１β療法を投与することをさらに含む。

態様によっては、本開示はまた、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害または非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を有するものとして、炎症性障害に罹っている患者を分類する方法を提供する。実施形態によっては、本方法は、炎症性障害に罹っている患者から採集した試料を、例えばＳＴＡＴ５（例えばリン酸化ＳＴＡＴ５であるＴｙｒ６９４）、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、またはそれらの組合せなどのＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子のポリペプチドまたは核酸のレベルを検出する検出剤に接触させることを含む。ある態様では、本方法は、例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、またはそれらの組合せのＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子のポリペプチドまたは核酸のレベルを定量することであって、参照レベルと比べて増加したＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子、例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、もしくはそれらの組合せなどのレベルが、患者がＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害に罹っていることを指し示すか、または、参照レベルと比べて同等なＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子、例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、もしくはそれらの組合せなどのレベルが、患者が非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害に罹っていることを指し示すことをさらに含み、それによって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害または非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害であるものとして、炎症性障害に罹っている患者を分類する。

本開示の他の態様では、本明細書で開示された方法は、非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を媒介する因子のポリペプチドまたは核酸のレベルを測定することを、さらに含むことができる。そのような因子としては、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−１βが挙げられる。

例えば、態様によっては、本開示は、炎症性障害に罹っている患者で治療レジメンを決定する方法を提供する。説明のために、本方法は、炎症性障害に罹っている患者から採集された試料中の例えば活性化ＳＴＡＴ５またはＧＭ−ＣＳＦのポリペプチドまたは核酸のレベルを定量すること、およびその患者から採集された試料中の例えばＴＮＦ−αのポリ
ペプチドまたは核酸のレベルを定量することを含む。少なくとも４つのシナリオを考えることができる。

第１のシナリオでは、活性化ＳＴＡＴ５またはＧＭ−ＣＳＦのレベルが第１の参照レベルに比べて増加し（例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも１５０％）、かつＴＮＦ−αのレベルが第２の参照レベルに同等である場合、本明細書に記載されるように、患者は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を有するものとして分類され、患者を、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する薬剤を用いて治療することができる。

第２のシナリオでは、活性化ＳＴＡＴ５またはＧＭ−ＣＳＦのレベルが第１の参照レベルと同等であり、かつＴＮＦ−αのレベルが第２の参照レベルに比べて増加する場合（例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも１５０％）、患者は、非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を有するものとして分類され、患者を、例えばＴＮＦ−α療法を用いて治療することができる。

第３のシナリオでは、活性化ＳＴＡＴ５またはＧＭ−ＣＳＦのレベルが第１の参照レベルに比べて増加し、ＴＮＦ−αのレベルも第２の参照レベルに比べて増加し、その増加が、臨床的および／または統計的基準内で等価である場合（例えばＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの両方が、それぞれの参照レベルと比べて少なくとも５０％増加する）、患者は、等しくＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性でありかつ非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性（例えばＴＮＦ−α媒介性）である炎症性障害を有するものとして分類される。そのような場合、患者は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する有効量の薬剤、および有効量の例えばＴＮＦ−α療法を用いて治療することができる。本明細書に提示されるように、両薬剤の組合せは、相乗的な効果を奏することができる。

第４のシナリオでは、活性化ＳＴＡＴ５またはＧＭ−ＣＳＦのレベルが第１の参照レベルに比べて増加し、ＴＮＦ−αのレベルも第２の参照レベルに比べて増加するが、一方が他方よりも増加する場合、炎症性障害は、より大きな増加を示す経路によって主に媒介される。例えば、ＧＭ−ＣＳＦが参照レベルに比べて４０％増加し、ＴＮＦ−αが参照レベルに比べて９０％増加する場合、炎症性障害は、主に非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性である。しかし、このシナリオでは、ＧＭ−ＣＳＦが参照レベルに比べて例えば少なくとも４０％増加するため、患者は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する薬剤ならびにＴＮＦ−α療法（例えば抗ＴＮＦ−α療法）を用いた併用治療を受けることがある。

実施形態によっては、第１および第２の参照レベルを、同じ参照試料から得る。

関連する態様では、本開示はまた、炎症性障害に罹っている患者の治療を、患者の炎症性障害の進行に従って誂える方法を提供する。説明に役立つ上記の例では、第１のシナリオ（Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介因子、例えばＳＴＡＴ５またはＧＭ−ＣＳＦは増加するが、ＴＮＦ−αのレベルは参照レベルと同等である）は、患者が炎症性障害の早期の段階にあることを指し示す場合がある。具体的な理論に縛られることを望むものではないが、例えば炎症性障害の早期の段階の間、ナイーブＴ細胞は、抗原によって刺激され、ＩＬ−７／ＳＴＡＴ５によって、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３産生Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞に分化するようプログラムされる。例えば炎症性障害の後期の段階の間、Ｔ_Ｈ−ＧＭサイトカイン（例えばＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦ）は、マクロファージや好中球など、さらに炎症性の高い細胞を漸次刺激し、その結果、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βが産生され、本格的な炎症が生じる。そのため、説明に役立つ上記の例では、第２のシナリオ（活性化ＳＴＡＴ５またはＧＭ−ＣＳＦのレベルが第１の参照レベルと同等であり、ＴＮＦ−αのレベルが増加する
）は、患者が、炎症性障害の後期の段階、例えば組織損傷という特徴を有する段階にあることを指し示す場合がある。したがって，本開示は、１つまたは複数のＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子［例えばＳＴＡＴ５（例えば活性化ホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４））、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＩＬ−３］ならびに１つまたは複数の非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介因子（例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β）の定量可能なレベルに応じて、患者の予測を可能とし、それによって、疾患の進行に従って治療を誂える。したがって、当業者が認識することになるように、炎症性障害に罹っている患者を、疾患の進行についてモニターして、本明細書に記載されるような１つまたは複数のＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子、および１つまたは複数の非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介因子（例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β）のレベルに従った有効かつ誂えた治療を保証することができる

関連する態様では、本開示はまた、それを必要とする患者の炎症性障害の進行を予測する方法を提供する。実施形態によっては、本方法は、ａ）炎症性障害に罹っている患者から採集された第１の試料中のＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子、例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、またはそれらの組合せなどのポリペプチドまたは核酸のレベルを定量すること、およびｂ）その患者から採集された第２の試料中の、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＩＬ−１β、もしくはそれらの組合せのポリペプチドまたは核酸のレベルを定量することを含み、ここで、ｉ）第１の参照レベルに比べて増加しているＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子、例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、もしくはそれらの組合せなどのレベル、および第２の参照レベルに比べて変化がないＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＩＬ−１β、もしくはそれらの組合せのレベルが、本明細書に記載されるように、患者が炎症性障害の早期の段階にあることを指し示すか、または、ｉｉ）第１の参照レベルに比べて変わらないＴ_Ｈ−ＧＭ媒介因子、例えばＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−３、もしくはそれらの組合せなどのレベル、および第２の参照レベルに比べて増加しているＴＮＦ−α、ＩＬ−６、もしくはＩＬ−１β、もしくはそれらの組合せのレベルが、本明細書に記載されるように、患者が、炎症性障害の後期の段階にあることを指し示す。実施形態によっては、本方法は、本明細書に記載されるように、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する有効量の薬剤および／または例えばＴＮＦ−α療法を投与することをさらに含む。

実施形態によっては、第１の試料および第２の試料は、同じである。

様々な態様では、本開示はまた、ＧＭ−ＣＳＦを分泌するＴ−ヘルパー細胞（Ｔ_Ｈ−ＧＭ）の単離された集団を提供する。一実施形態では、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、シグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）および／またはＩＬ−７の存在下で、前駆細胞（例えばＣＤ４＋細胞）から分化し、その場合、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を発現する。

実施形態によっては、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、および／またはＩＬ−６を阻害する薬剤の存在下で、前駆細胞（例えばＣＤ４＋細胞）から分化する。同様に、前駆細胞（例えばＣＤ４＋前駆細胞）のＴ_Ｈ−ＧＭ細胞への分化は、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＦＧ−β、および／またはＩＬ−６によって阻害される。

実施形態によっては、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、人工条件下、ｉｎｖｉｔｒｏで前駆細胞から分化するが、ここで、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、本明細書に記載されるような生理学的特性を保持する。

実施形態によっては、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、表１に挙げられた１つまたは複数の遺伝子の過剰発現という特徴をさらに有する。例えば、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、例えば塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスファミリーのメンバーｅ４０（ＢＨＬＨｅ４０）、プレプロエン
ケファリン（ＰＥＮＫ）、ＩＬ−２、セリン（またはシステイン）ペプチダーゼインヒビターのクレイドＢメンバー６ｂ（Ｓｅｒｐｉｎｂ６ｂ）、ニューリチン１（Ｎｒｎ１）、ステロイル−コエンザイムＡデサチュラーゼ１（Ｓｃｄ１）、もしくはホスホトリエステラーゼ関連Ｃ１ｑ様３（Ｐｔｅｒ）、またはそれらの組合せの過剰発現という特徴をさらに有する。

実施形態によっては、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、表１に挙げられた１つまたは複数の遺伝子の過小発現という特徴をさらに有する。例えば、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ａ（Ｌｙ６ａ）、ＣＤ２７、またはリンパ球セレクチン（Ｓｅｌｌ）の過小発現という特徴をさらに有する。

本明細書に記載されるように、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能（例えばその分化および病原性）を媒介する因子（Ｔ_Ｈ１またはＴ_Ｈ１７を媒介することが知られている因子とは異なる独特のもの）の別個のネットワークを特定することによって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を標的として調節し、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性障害、例えば、異常なＴ_Ｈ−ＧＭ機能の結果として生じる障害を治療することが可能になる。そのため、態様によっては、本開示は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する方法であって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する調節剤に、Ｔ_Ｈ−ＧＭ、もしくは分化抗原群４（ＣＤ４＋）前駆細胞、またはその両方を接触させることを含む方法を提供する。一実施形態では、調節剤は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞またはＣＤ４＋前駆細胞にｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで接触させられる。

本明細書に使用されるとき、「Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能」は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の関与、発生、維持、生存、増殖、もしくは活性、またはそれらの組合せを指す。そのため、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する（例えば促進または阻害する）薬剤は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の関与、発生、維持、生存、増殖、もしくは活性、またはそれらの組合せを調節するものである。例えば、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能は、ＣＤ４^＋前駆Ｔ細胞からの関与、Ｔ_Ｈ−ＧＭ発生経路に関与しているＣＤ４^＋前駆細胞の発生、Ｔ_Ｈ−ＧＭ表現型の維持、発生下での生存もしくは増殖もしくはエフェクターＴ_Ｈ−ＧＭ細胞、および／またはエフェクターＴ_Ｈ−ＧＭ細胞の活性を調節する（例えば、ＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−３などの分泌因子の機能を調節する）ことによって、調節することができる。例えば、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能における調節としては、以下に限定されないが、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の数、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の生存、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の増殖、および／またはＴ_Ｈ−ＧＭ細胞の活性での調節が挙げられる。本明細書のＴ_Ｈ−ＧＭ細胞の活性は、本明細書で記載されるようなサイトカイン、ケモカイン、成長因子、酵素、およびＴ_Ｈ−ＧＭ細胞により分泌される他の因子によって誘導される活性、およびＴ_Ｈ−ＧＭ細胞との直接的な接触によって誘導される活性を含む。

本明細書に使用されるとき、Ｔヘルパーサブセット細胞である「Ｔ_Ｈ−ＧＭ」とは、Ｔ_Ｈ１およびＴ_Ｈ１７細胞と同様に、前駆ＣＤ４＋前駆細胞から分化する細胞を指すが、この細胞は、本明細書に記載されるように、Ｔ_Ｈ１またはＴ_Ｈ１７細胞サブタイプを関与および発生させる公知の因子のサブセットとは別個かつ独特の因子（Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介因子）のサブセットによって媒介される経路を通じて、関与および発生する。実施形態によっては、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、別個かつ独特の一揃いの遺伝子（例えば表１を参照）を産生し、Ｔ_Ｈ１またはＴ_Ｈ１７細胞サブタイプの病原性を媒介する公知の因子とは異なる機構および経路を通じて病原性をもたらす。例えば、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は、ＩＬ−７／ＳＴＡＴ５機能（そのレギュレーター）によって、関与および発生し、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３（そのエフェクター）によって病原性をもたらす。

態様によっては、本開示は、それを必要とする患者のＴ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害を治療する方法を提供し、この方法は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の機能を調節する有効量の調節剤を前記患者に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるように
、患者は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の炎症性障害であるものとして以前に診断されている。

態様によっては、本開示はまた、ＴＮＦ−α療法に対し限定的な応答を示す患者の関節リウマチを治療する方法を提供し、この方法は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する有効量の調節剤を前記患者に投与することを含む。

本明細書に使用されるとき、「限定的な応答」とは、臨床基準によって決定されるように、応答がないか、または患者がその療法によって治療されないほどに些少な応答を指す。

「治療」または「治療すること」は、療法、防止、および予防を指し、具体的には、予防（防止）のための、または患者が罹患している場合の条件もしくは事象の出現の程度もしくは見込みを減少させるための、患者に対する医薬品の投与または医療処置の実施を指す。それはまた、疾患または状態に関連のある１つまたは複数の症状の重症度を減少させることを指す。本願ではそれは、以下の、すなわち、炎症状態または自己免疫疾患に関連のある痛み、腫脹、発赤、または炎症のうち、１つまたは複数を寛解させることを指す場合がある。本明細書に使用されるとき、ならびに当技術分野でよく理解されているように、「治療」は、臨床結果を含めて、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。この開示のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、以下に限定されないが、１つまたは複数の症状の軽減もしくは寛解、疾患の程度の漸減、疾患の様子の安定化（例えば悪化しない）、疾患の進行の遅延もしくは減速、および／または疾患の様子の寛解または一時的緩和が挙げられる。「治療」はまた、治療を受けなかった場合に予想される生存と比較した際の生存の延長をも意味し得る。

薬剤の「有効量」は、臨床結果を含めて、有益なまたは所望の結果をもたらすのに充分な量である。「有効量」は、それが適用されている文脈に依存する。自己免疫応答を調節する組成物を投与するという文脈では、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能のモジュレーターである薬剤の有効量は、投与された薬剤がない場合に得られる応答と比較した際にそのような調節を達成するのに充分な量である。有効量は、本明細書で定義されるように、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の抑制および／または阻害など、疾患の修正について即時の短期または長期の利益をもたらすことができる。有効量は、１回または複数の投与で投与することができる。本明細書に使用されるときの「有効量」は、患者の１つまたは複数の臨床的に意義のある症状で、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％減少させるのに充分な量、または改善を引き起こすのに充分な量を意味することを意図される。

実施形態によっては、調節剤は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を阻害して、例えば炎症を減少させる。調節剤（阻害剤）によってもたらされる阻害は、生物学的作用の特定の機構を含意しない。実際に、用語「拮抗剤」または「阻害剤」は、本明細書に使用されるとき、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を媒介する因子（例えばＩＬ−７、ＩＬ−７受容体、ＳＴＡＴ５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体、ＰＥＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＪＡＫ１／３、またはＴ_Ｈ−ＧＭ細胞で示差的に発現される遺伝子、例えば表１および表２の遺伝子のうちのいずれか）との全ての可能な薬理学的、生理学的、および生化学的な相互作用を、直接的または間接的にかかわらず含み、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能をタンパク質および／または核酸のレベルで、または別の機構を介して媒介する因子（またはその活性断片）との相互作用を含む。

ある特定の実施形態では、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を阻害する調節剤としては、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を媒介する因子の機能（例えば発現および／または活性）を防止する抗体、ポリペプチド（例えば、ＩＬ−７などを結合および阻害する可溶型受容体）、低分子、核酸（例えばアンチセンス、低分子干渉ＲＮＡ分子、短ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、もしくはタンパク質（例えばサイトカイン）、またはそれらの組合せが挙げられる。そのような阻害
剤を設計、生産、および使用する方法は、当技術分野で公知かつ利用可能である。

本明細書に使用されるとき、「結合する」は、「特異的に結合する」と互換的に使用される。「特異的に結合する」とは、本開示のポリペプチドを認識および結合するが、試料中の、例えば本開示のポリペプチドを天然に含む生体試料中の他の分子を認識および結合することが実質的にない、ポリペプチド（例えば可溶型受容体）または抗体を意味する。一例では、抗体は、活性化ＳＴＡＴ５ポリペプチドに特異的に結合し、非ＳＴＡＴ５ポリペプチドには結合しない。

本明細書に使用されるとき、「抗体」は、無傷の抗体または抗体の抗原結合断片を指し、そのようなものとしては、改変もしく遺伝子工学的に改良されているか、またはヒト抗体である、無傷の抗体または抗原結合断片が挙げられる。

具体的な実施形態では、抗体は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を媒介するいずれか１つまたは複数の因子に結合し、その機能を阻害する。例えば、抗体は、ＩＬ−７、ＩＬ−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、ＳＴＡＴ５、もしくはヤヌスキナーゼ１／３（ＪＡＫ１／３）、またはそれらの組合せに結合し、その機能を阻害する。他の例では、抗体は、ＧＭ−ＣＳＦの機能（もしくはその受容体）、ＩＬ−３、ＰＥＮＫ、もしくはＲＡＮＫＬ、またはそれらの組合せに結合し阻害する。実施形態によっては、抗体は、表１に挙げられた遺伝子に結合し、その機能を阻害する。実施形態によっては、抗体は、タンパク質またはその任意の機能的断片に結合し、その機能を阻害する。適した抗体を設計、生産、および使用する方法は、当業者に公知かつ利用可能である。本開示での使用に適した抗体の例としては、例えばダクリズマブ、バシリキシマブ、マブリリムマブ、ＭＯＲ１０３、ＫＢ００３、ナミルマブ、およびＭＯＲＡｂ−０２２が挙げられる。

用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、互換的に使用され、全長ポリペプチドもしくはその機能的な断片（例えば分解産物、ポリペプチドの選択的スプライシングアイソフォーム、ポリペプチドの酵素切断産物）、基質もしくはリガンドに結合しているポリペプチド、またはポリペプチドの遊離（非結合）形状を含めることができる。用語「機能的断片」は、全長ポリペプチドの活性（例えば、同種のリガンドまたは受容体に結合する能力などの生物活性）の一部または全てを保持する全長タンパク質の一部分を指す。

実施形態によっては、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を阻害する調節剤は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を媒介する因子のうち１つまたは複数を直接的または間接的に阻害する、具体的な生体タンパク質（例えばサイトカイン）とすることができる。そのようなサイトカインとしては、例えばＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ，ＴＧＦ−β、およびＩＬ−６が挙げられる。

実施形態によっては、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を阻害する調節剤は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を媒介する因子のうち１つまたは複数を直接的または間接的に阻害する、低分子とすることができる。本明細書に使用されるとき、「低分子」は、有機化合物、または生物活性を有しかつポリマーではなく、無機化合物と錯体を形成するような化合物（例えば金属）である。低分子は、一般に、約３キロダルトン未満の分子量を有する。公知の低分子の例としては、ＣＡＳ２８５９８６−３１−４（カルビオケム社）、ピモジド、およびトファシチニブが挙げられる。

他の実施形態では、調節剤は、例えばウイルス感染、真菌感染、および細菌感染、がんならびに／またはそれに関連がある状態などの障害において、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を亢進する。一実施形態では、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を亢進する調節剤としては、例えばＣＤ２８アクティベーター、ナイーブ（前駆体）ＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＩＬ−７および／またはＩＬ−２、ＳＴＡＴ５のアクティベーター、またはＴ_Ｈ−ＧＭ細胞のエフェクター（例えばＧＭ−ＣＳ
Ｆ，ＩＬ−３）が挙げられる。

本明細書に使用されるとき、「ＳＴＡＴ５媒介性」の炎症性障害は、臨床基準によって決定されるように、異常なＳＴＡＴ５機能（異常に亢進または阻害されている）によって引き起こされ、かつＳＴＡＴ５機能の調節に対し応答性である、炎症性障害を指す。実施形態によっては、ＳＴＡＴ５は、活性化ＳＴＡＴ５（例えばホスホＳＴＡＴ５であるＴｙｒ６９４）である。

実施形態によっては、炎症性障害は、自己免疫性障害である。ある特定の実施形態では、炎症性障害は、ＳＴＡＴ５（例えば活性化ＳＴＡＴ５）によって媒介される任意の炎症性障害である可能性があり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、関節リウマチ、多発性硬化症、強直性脊椎炎、クローン病、糖尿病、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、紅斑性狼瘡、リウマチ性多発筋痛症、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群／現象、反応性関節炎（ライター症候群）、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、または血管炎が挙げられる。

実施形態によっては、用語「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトを指すが、また、獣医治療を必要とする動物、例えばコンパニオン動物（例えばイヌ、ネコなど）、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験動物（例えばラット、マウス、モルモットなど）を挙げることができる。

実施形態によっては、本薬剤は、ＳＴＡＴ５の機能（例えば発現および／または活性）を阻害する。ＳＴＡＴ５（例えば活性化ＳＴＡＴ５であるＴｙｒ６９４）を阻害する薬剤の例は、本明細書に記載されている。

ある特定の実施形態では、本開示の方法は、患者にＴＮＦ−α療法を投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＴＮＦ−α療法は、非Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性である炎症性条件を有することが決定された患者において投与される。本明細書に記載されるように、ある特定の実施形態では、ＴＮＦ−α療法は、定量されたＴＮＦ−αレベルが例えば参照レベルと比べて少なくとも４０％増加した場合に、投与される。

ＴＮＦ−α療法の例としては、ＴＮＦ−α阻害剤に基づくもの、および非ＴＮＦ−α阻害剤に基づくものが挙げられる。具体的には、ＴＮＦ−α阻害剤に基づく療法としては、エタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、およびセルトリズマブペゴルが挙げられる。非ＴＮＦ−α阻害剤に基づく療法の例としては、コルチコステロイド医薬（例えばプレドニゾン）、非ステロイド性の抗炎症薬（例えばメトトレキサート）、およびＪＡＫ阻害剤（例えばトファシチニブ）が挙げられる。非ＴＮＦ−α阻害剤に基づく療法の他の例としては、アナキンラ、アバタセプト、リツキシマブおよびトシリズマブが挙げられる。

ＴＮＦ−α療法は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する有効量の薬剤の投与の前に、同時に、または後に、投与することができる。したがって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する薬剤およびＴＮＦ−α療法は、単一用量で共に投与することができるか、または別々の用量で、例えば、同時もしくは連続的のどちらか、またはその両方で投与することができる。Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する薬剤の投与とＴＮＦ−α療法の投与との間の期間は、治療剤（複数可）の
性質に依存することになる。さらに、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する薬剤およびＴＮＦ−α療法は、同様の投薬スケジュールで投与されても投与されなくてもよい。例えば、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する薬剤が、ＴＮＦ−α療法よりも高い頻度で、またはその逆で投与されるように、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節する薬剤およびＴＮＦ−α療法は、異なる半減期および／または作用を、異なる時間スケールで有していてもよい。治療剤の投与間の日数は、各薬物の安全性および薬力学に従って、当業者が適切に決定することができる。

Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞を特定すること、ならびにＴ_Ｈ１またはＴ_Ｈ１７と比べてＴ_Ｈ−ＧＭ細胞によって示差的に産生される遺伝子を特定することによって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を調節するための新規の治療法を特定するようにＴ_Ｈ−ＧＭ細胞を使用することが可能になり、それによって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性の障害（例えば炎症性障害）を治療するための新しい治療法が可能になる。そのため、さらに別の態様では、本開示は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の機能のモジュレーターを特定するためにスクリーニングする方法であって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の単離された集団、またはＣＤ４＋前駆細胞の単離された集団を候補薬剤に接触すること、および候補薬剤の存在下または不在下でＴ_Ｈ−ＧＭ機能の読出しを測定することを含み、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の読出しの変化が、候補薬剤がＴ_Ｈ−ＧＭ機能のモジュレーターであることを指し示すものである、方法を提供する。

本明細書に使用されるとき、候補薬剤とは、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を媒介する因子の機能（例えば発現および／または活性）を調節することによってＴ_Ｈ−ＧＭ機能を調節しうる薬剤を指す。そのような候補薬剤としては、例えば抗体、ペプチド、低分子、核酸（例えばアンチセンス、低分子干渉ＲＮＡ分子）、もしくはタンパク質（例えばサイトカイン）、またはそれらの組合せが挙げられる。候補薬剤は、本明細書に記載されるように、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能を媒介する因子のいずれかを（タンパク質および／または核酸のレベルで）標的とするように設計することができ、そのような因子としては、表１に挙げられた遺伝子（例えば、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞中で優先的に上方制御される遺伝子、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の表面で優先的に過剰発現／過小発現される遺伝子）が挙げられる。

本明細書に使用されるとき、「読出し」は、測定または定量することのできるＴ_Ｈ−ＧＭ機能の任意の変化（または変化の欠如）を指す。例えば、本明細書に記載されるように、候補薬剤は、その例えばＴ_Ｈ−ＧＭ細胞によるＧＭ−ＣＳＦの分泌に及ぼす効果、またはそのＴ_Ｈ−ＧＭ細胞の存在量に及ぼす効果（Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の関与／発生／増殖に及ぼす効果を通じた）について、評価することができる。そのような読出しを決定するためのアッセイは、当技術分野で公知かつ利用可能であり、本明細書に例示されている。

実施形態によっては、候補薬剤の存在下での変化は、読出しの測定における減少であり、その減少は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の阻害（例えばＧＭ−ＣＳＦもしくはＩＬ−３の産生の低下、またはＴ_Ｈ−ＧＭ細胞の存在量の低下）を指し示し、それによって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の阻害剤としての候補薬剤を特定する。

ある特定の実施形態では、候補薬剤の存在下での変化は、読出しの測定における増加であり、その増加は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の亢進（例えばＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３の産生の増加、またはＴ_Ｈ−ＧＭ細胞の存在量の増加）を指し示し、それによって、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の亢進剤としての候補薬剤を特定する。

実施形態によっては、読出しは、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞で優先的に上方制御または下方制御される、表１および表２に挙げられた遺伝子のうちいずれか１つまたは複数とすることができる。そのため、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞で優先的に上方制御される遺伝子を下方制御する候補薬剤は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の阻害剤である。同様に、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞で優先的に下方制御される遺伝子を上方制御する候補薬剤は、Ｔ_Ｈ−ＧＭ機能の亢進剤である。

ある特定の態様では、前駆ＣＤ４＋細胞を用いて実施される場合のスクリーニングの方法は、本明細書に記載されるように、Ｔ_Ｈ−ＧＭの極性化条件下で実施される。例えば、本方法は、ＩＬ−７／ＳＴＡＴ５、ＴＣＲ活性化、ＣＤ２８共刺激の存在下で、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−４の遮断と組み合わせて、実施することができる。

別段の指示がない限り、本明細書に記載の用語の定義は、本開示の全ての態様および実施形態に適用される。

本開示の実践は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版（Sambrookら、１９８９年）およびMolecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版（SambrookおよびRussel、２００１年）、本明細書では共同でおよび個別に「Sambrook」として参照される）；Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait編、１９８４年）；Animal Cell Culture（R. I. Freshney編、１９８７年）；Handbook of Experimental Immunology（D. M.
WeirおよびC. C. Blackwell編）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（J. M.
MillerおよびM. P. Calos編、１９８７年）；Current Protocols in Molecular Biology（F. M. Ausubelら編、１９８７年、２００１年を通じた補遺を含む）；PCR: The Polymerase Chain Reaction（Mullisら編、１９９４年）；Current Protocols in Immunology（J. E. Coliganら編、１９９１年）；The Immunoassay Handbook（D. Wild編、Stockton Press NY、１９９４年）；Bioconjugate Techniques（Greg T. Hermanson編、Academic Press、１９９６年）；Methods of Immunological Analysis（R. Masseyeff, W. H. AlbertおよびN. A. Staines編、Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH、１９９３年）、HarlowおよびLane（１９８８年）Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications、ニューヨーク、ならびにHarlow and Lane （１９９９年）Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、本明細書では共同でおよび個別に「HarlowおよびLane」として参照される）、Beaucageら編、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry（John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨーク、２０００年）；ならびにAgrawal編、Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties（Humana Press Inc.、ニュージャージー州、１９９３年）に記載されているような、組換えＤＮＡ、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学など、分子生物学の従来手法の使用を含む。

実例

方法

マウス

Ｓｔａｔ５^ｆ／ｆマウスは、L. Hennighausen（国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所）によって提供された。Ｓｔａｔ３^ｆ／ｆマウスは、記載（参照文献２）のように生成した。Ｃｄ４−Ｃｒｅトランスジェニックマウスは、タコニックファーム社から購入した。Ｒａｇ２^−／−マウスは、Ｊｅａｎ−ＰｉｅｒｒｅＡｂａｓｔａｄｏ（シンガポール免疫学ネットワーク）から入手した。全てのマウスがＣ５７ＢＬ／６の遺伝的背景にあり、シンガポール国立大学で特異的病原体不在の条件下で収容した。全ての実験は、６〜８週齢のマウスを用いて実施し、ＮＵＳの施設内動物管理使用員会によって認可された。

患者および対照

血液試料（ｎ＝４７）および滑液試料（ｎ＝３）を、南京大学医学部の附属鼓楼医院の
リウマチ学および免疫学部門に入院していたＲＡ患者から採集した。全ての患者は、ＲＡの分類のためのアメリカリウマチ学会の判断基準を満たしていた。年齢および性別が一致した健康な対照（ｎ＝３２）は、附属鼓楼医院の医療試験センターから得た。試験プロトコールは、南京大学医学部の附属鼓楼医院の倫理委員会によって認可された。

ＩｎｖｉｔｒｏのＴ細胞分化

ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、脾臓およびリンパ節からポジティブ選択および磁性分離（ミルテニーバイオテク社）によって取得し、続いて、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞集団（ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ６２Ｌ^ｈｉＣＤ４４^ｌｏ）をＦＡＣＳＡｒｉａで選別して精製した。ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、プレートに結合された抗ＣＤ３（３μｇ／ｍＬ；ＢＤファーミンジェン社）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ；ＢＤファーミンジェン社）を用いて、異なる組合せの中和抗体およびサイトカインの存在下で３〜４日間刺激した。すなわち、中性条件にはサイトカインまたは中和抗体を何も添加せず、Ｔ_Ｈ１条件にはＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）および抗ＩＬ−４（１０μｇ／ｍＬ，ＢＤファーミンジェン社）とし、Ｔ_Ｈ１７条件にはｈＴＧＦ−β（３ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍＬ）、抗ＩＦＮ−γ（１０μｇ／ｍＬ、ｅバイオサイエンス社）、および抗ＩＬ−４（１０μｇ／ｍＬ）とし、代替のＴ_Ｈ１７条件にはＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２３（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、抗ＩＦＮ−γ（１０μｇ／ｍＬ）、および抗ＩＬ−４（１０μｇ／ｍＬ）とした。ＧＭ−ＣＳＦ発現細胞を分化させるために、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、プレートに結合された抗ＣＤ３（２μｇ／ｍＬ）および可溶性抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）を用い、かつＩＬ−７および／または抗ＩＦＮ−γ（１０μｇ／ｍＬ）を指示された通りに添加して刺激した。全てのサイトカインは、Ｒ＆Ｄシステム社から入手した。全ての細胞は、１０％ＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム，０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および５μＭベータ−メルカプトエタノールを補ったＲＰＭＩ１６４０中で培養した。極性化の３〜４日後に、細胞を洗浄して、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシンを用いて、Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇの存在下で４〜５時間再刺激し、続いて、ＢＤファーミンジェン社からのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを用いて、固定および細胞内染色を行った。Ｆｏｘｐ３染色は、ｅバイオサイエンス社からのキットを用いて行った。細胞をＬＳＲＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）で捕捉し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター社）を用いて解析した。

ＥＡＥ誘導

ＥＡＥ誘導の手順を、以前の報告（参照文献３）から改変した。能動的なＥＡＥ誘導のために、５ｍｇ／ｍＬ加熱殺菌済みＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株Ｈ３７Ｒａ（ディフコ社）を含有するＣＦＡ１００μＬ中のＭＯＧ_{３５−５５} ３００μｇを用いて、０日目および７日目に、マウスを、後方側腹部上の２箇所で免疫した。百日咳毒素［リストバイオラブ社（List Bio Lab）］を、１日目および８日目に、マウス１頭当たり５００ｎｇの投薬量で腹腔内投与した。単回のＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡ免疫には、同様の手順を０日目および１日目にのみ実施した。代替の能動的なＥＡＥ誘導では、ＬＰＳ（ＩＦＡ中６００μｇ／ｍＬ、ＳｉｇｍａからのＯ１１１：Ｂ４）をアジュバントとして使用した。Ｒａｇ２^−／−マウスでの能動的なＥＡＥ誘導のために、Ｓｔａｔ５^ｆ／ｆマウスまたはＣｄ４−Ｃｒｅ；Ｓｔａｔ５^ｆ／ｆマウス由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞を移入し、続いて、上に記載されたようなＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡ免疫を行った。臨床症状を以下のようにスコア付けした。すなわち、０は臨床徴候なし、１は尾の緊張の喪失、２は足取りのぐらつき、３は後肢の麻痺、４は後肢および前肢の麻痺、５は死亡である。ＩＬ−７Ｒα中和抗体（ＳＢ／１４、ＢＤファーミンジェン社）およびアイソタイプ対照を、マウス１頭当たり２００μｇで、１日おきに腹腔内注射した。ＣＮＳ浸潤細胞の解析のために、灌流させ
たマウスから脊髄と脳の両方を採集して細かく刻み、Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア社）を用いた勾配遠心分離によって単核細胞を単離した。

Ｓｔａｔ５^＋／＋またはＳｔａｔ５^−／−のＣＤ４^＋Ｔ細胞を用いた能動的なＥＡＥ誘導のために、脾細胞およびＬＮを免疫後１０〜１４日目に回収し、７０μｍの細胞ストレーナー（ＢＤファルコン社）を通した。細胞をｉｎｖｉｔｒｏで、ＩＬ−２３（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１β（２ｎｇ／ｍＬ）存在下、ＭＯＧ_{３５−５５}（２０μｇ／ｍＬ）と共に、３日間培養した。回収後、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ポジティブ選択によって純度＞９０％に精製した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞（滅菌ＰＢＳ中２００万個）をＲａｇ２^−／−マウスへ腹腔内注射し、続いて、翌日に百日咳毒素を投与した。マウスを、上に記載されたように、ＥＡＥの徴候について毎日観察した。様々なＴ_Ｈサブセットを移入することによってＥＡＥ誘導を行うために、上に記載されたように同様の手順を実施した。条件を偏らせた異なるサブセットは以下の通りである。すなわち、偏りなしは、ＭＯＧ_{３５−５５}のみであり、Ｔ_Ｈ１は、ＭＯＧ_{３５−５５}にＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）および抗ＩＬ−４（５μｇ／ｍＬ）を追加し、Ｔ_Ｈ１７は、ＭＯＧ_{３５−５５}にＴＧＦ−β（３ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）、抗ＩＦＮ−γ（５μｇ／ｍＬ）および抗ＩＬ−４（５μｇ／ｍＬ）を追加し、ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈは、ＭＯＧ_{３５−５５}にＩＬ−７（２ｎｇ／ｍＬ）および抗ＩＦＮ−γ（５μｇ／ｍＬ）を追加した。レシピエントマウス当たり６×１０^５個のＣＤ４^＋Ｔ細胞を移入した。

抗原で誘導された関節炎（ＡＩＡ）

簡単に述べれば、５ｍｇ／ｍＬ加熱殺菌済みＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株Ｈ３７Ｒａ（ディフコ社）を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）１００μＬ中のメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）１００μｇを用いて、０日目に、マウスを、後方側腹部上の２箇所で皮下免疫した。百日咳毒素［リストバイオラブ社（List
Bio Lab）］を、１日目に、マウス１頭当たり２５０ｎｇの投薬量で腹腔内投与した。免疫後７日目に、１００μｇのｍＢＳＡ（１０μＬの生理食塩水中）を後右膝関節内に関節内注射することによって、関節炎を誘導した。同じ体積の生理食塩水を対照として用いて、後左膝関節を注射した。関節炎の誘導後７日間にわたって、カリパスを用いて右と左の膝関節の直径の差を測定することによって、関節腫脹を記録した。ＧＭ−ＣＳＦ投与の効果を評価するために、ｍＢＳＡのみを右膝関節に、または１００ｎｇのＧＭ−ＣＳＦ［イムノツールズ社（ImmunoTools）］を補ったｍＢＳＡを左膝関節に関節内注射することによって、ＡＩＡを誘導した。ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＴＮＦ−αの遮断の効果を評価するために、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な（ＭＰ１−２２Ｅ９、ＢＤファーミンジェン社）および／またはＴＮＦ−αに特異的な（ＭＰ６−ＸＴ３、ＢＤファーミンジェン社）中和抗体（マウス当たり各抗体１００μｇ）を用いて、指示された時間に、マウスを腹腔内投与した。

養子移入によってＡＩＡの誘導を行うために、脾細胞および鼠径部ＬＮ細胞を、ｍＢＳＡ／ＣＦＡで免疫したマウスから７日目に単離し、ｉｎｖｉｔｒｏでＩＬ−７（２ｎｇ／ｍＬ）存在下、ｍＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）と共に３日間培養した。回収後、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ポジティブ選択（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）によって純度＞９０％に精製した。次いで、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（滅菌ＰＢＳ中に１００万個）をＷＴナイーブマウス内に移入し、続いて、次の日にｍＢＳＡを関節内注射した。

コラーゲンで誘導された関節炎（ＣＩＡ）

上に記載されたようにＡＩＡと同様の手順で、ニワトリコラーゲンＩＩ／ＣＦＡエマルジョン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃから購入）を用いてマウスを免疫し、続いて百日咳毒
素を注射することによって、ＣＩＡを誘導した。マウスをモニターし、関節炎についてスコア化した。すなわち、０は正常、１は足首もしくは手首の軽度の腫脹または個々の指に限局した明らかな腫脹、２は、脚全体の中等度の腫脹、３は関節強直を伴う脚全体の重度の腫脹である。各マウスについて四肢のスコアを合計した。

組織学的分析

パラフィン包埋組織用には、脊髄を４％ＰＦＡ中で固定した。膝関節または脚を取り出して、１０％ホルマリン中で固定し、５％ギ酸中で脱灰した後、脱水および包埋を行った。切片（５μｍ）は、免疫細胞の浸潤および炎症を評価するためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて、また、軟骨の枯渇を評価するためにサフラニン−Ｏ／ＦａｓｔＧｒｅｅｎを用いて、染色した。凍結組織用には、脊髄をＯＣＴ（組織−Ｔｅｋ）中に包埋し、ドライアイス上で急速凍結した。切片（１０μｍ）を氷冷アセトン中で固定し、一次の抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ＣＤ１１ｂ（ｅバイオサイエンス社）を用いて染色し、続いて、蛍光コンジュゲート二次抗体（インビトロジェン社）と共にインキュベーションした。ＡＩＡ実験用には、膝関節を１０％ホルマリン中で５日間固定し、続いて、５％ギ酸中で５日間脱灰した。切片（１０μｍ）は、免疫細胞の浸潤および炎症を評価するためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色するか、または、軟骨の欠乏を評価するためにサフラニン−Ｏ／ｆａｓｔｇｒｅｅｎを用いて染色した。

細胞の選別およびメイグリュンワルド―ギムザ染色

脾臓または滑膜の単一細胞懸濁液から、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて、ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋でゲートをかけた単球／マクロファージ（Ｌｙ６Ｃ^ｈｉＬｙ６Ｇ⁻）および好中球（Ｌｙ６Ｃ^ｌｏＬｙ６Ｇ^ｈｉ）を選別した。選別した細胞を、ガラススライド上にサイトスピンで貼り付け、その後、標準的な手順に準じて、メイグリュンワルドおよびギムザ染料を用いて染色した。

リアルタイムＰＣＲ

ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って、総ＲＮＡを細胞から抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（インビトロジェン社）を用いて、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。ＳＹＢＲｑＰＣＲキット（ＫＡＰＡ社）と共に７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社）によって、遺伝子発現を測定した。アクチンｂ、Ｇａｐｄｈ、またはＲｎ１８Ｓを内部対照として使用した。プライマー配列は、要望に応じて入手可能である。

ＥＬＩＳＡ

ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−２のレベルを、Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−ＧｏＥＬＩＳＡキット（ｅバイオサイエンス社）によってアッセイし、ＩＬ−１７のレベルを、ＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社）によって製造業者の取扱説明書に従って測定した。

クロマチン免疫沈降アッセイ

Ｓｔａｔ５^ｆ／ｆマウスまたはＣｄ４−Ｃｒｅ；Ｓｔａｔ５^ｆ／ｆマウスから単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞を、プレートに結合された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて３日間活性化させた。細胞を、ＩＬ−７（２０ｎｇ／ｍＬ）またはＩＬ−２（２５ｎｇ／ｍＬ）を用いて４５分間刺激した。ホルムアルデヒドを終濃度１％となるように１０分間添加するこ
とによって、架橋を実施し、続いて、グリシンを用いてクエンチした。細胞溶解物を、超音波処理によって断片化し、タンパク質ＧのＤｙｎａｂｅａｄｓを用いて事前に清澄にし、その後、抗ＳＴＡＴ５抗体（サンタクルズ社）または正常ウサギＩｇＧ（サンタクルズ社）を用いて４℃で一晩、沈降させた。洗浄および溶出の後、６５℃で８時間インキュベートすることによって、架橋逆転を行った。溶出ＤＮＡを精製し、以前に記載されたような（参考文献５）Ｃｓｆ２プロモーターに特異的なプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。

統計

統計的有意差は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６．０１を使用して、スチューデントのｔ検定によって決定した。ｐ値＜０．０５は、有意とみなした。臨床的スコアのｐ値は、多重比較のために二要因多元配置分析（two-way multiple-range analysis of variance：ＡＮＯＶＡ）によって決定した。別段の指定がない限り、平均および標準誤差（the standard error of the mean）（平均±ＳＥＭ）としてデータを示した。

実施例１．Ｓｔａｔ５コンディショナルノックアウトマウスはＥＡＥに抵抗性である

ＳＴＡＴ５は、ＩＬ−１７産生を抑えることによって、Ｔ_Ｈ１７分化を負に制御する（Laurenceら、２００７年；Yangら、２０１１年）。しかし、Ｔ_Ｈ１７媒介性の病態形成におけるＳＴＡＴ５の機能は、よく理解されていない。この疑問を追究するために、Ｓｔａｔ５がＴ細胞区画で特異的に欠失していたＣｄ４−Ｃｒｅ；Ｓｔａｔ５^ｆ／ｆ（Ｓｔａｔ５^−／−）マウス、および同腹の対照に、ＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡを用いて０日目および７日目にマウスを免疫することによって、ＥＡＥを誘導した。麻痺の発生を、臨床スコアへの帰属を毎日行うことによって評価した。驚くべきことに、Ｓｔａｔ５^−／−マウスで臨床疾患の出現および重症度の漸減が観察され（図１Ａおよび図１Ｂ）、Ｔ_Ｈ１７生成におけるＳＴＡＴ５についての拮抗的な役割に基づいた予想とは反対の結果であった。同様の結果は、単回のＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡ免疫を実施した際に、またはＥＡＥを誘導するためのアジュバントとしてＣＦＡをＬＰＳに置き換えた際に観察された（図１Ｃおよび図１Ｄ）。Ｓｔａｔ５^−／−マウスにおけるＥＡＥ疾患の減少に一致して、Ｓｔａｔ５^−／−マウスの脊髄では免疫細胞の浸潤の著しい減少が観察された（図２Ａ）。さらに、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋細胞、Ｂ２２０^＋細胞、およびＣＤ１１ｂ^＋細胞を含めた様々な免疫細胞集団の浸潤が、Ｓｔａｔ５^−／−マウスでは減少した（図２Ｂ〜図２Ｄおよびデータ示さず）。しかし、ＣＮＳのＣＤ４^＋Ｔ細胞の中でのＩＬ−１７^＋細胞およびＩＦＮ−γ^＋細胞の頻度は、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウスとＳｔａｔ５^−／−マウスとの間では同等であり（図３Ａ）、このことは、Ｓｔａｔ５^−／−マウスにおけるＥＡＥへの抵抗性が、Ｔ_Ｈ１細胞およびＴ_Ｈ１７細胞の発生とは無関係であることを示唆している。しかし、Ｓｔａｔ５^−／−マウスのＣＮＳ中でのＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇ集団の低下が検出され（図３Ｂ）、このことは、Ｓｔａｔ５^−／−マウスにおけるＥＡＥに対する抵抗性が、おそらくはＴ_ｒｅｇ細胞の変化に起因しなかったことを指し示す。

実施例２．Ｓｔａｔ５変異マウスでのＥＡＥへの抵抗性は、Ｔ_Ｈ１およびＴ_Ｈ１７の生成とは無関係である抗原特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞の内因的な欠陥に起因する。

Ｓｔａｔ５欠失（Ｃｄ４−ｃｒｅ；Ｓｔａｔ５^ｆ／−）マウスは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方の減少を伴う末梢リンパ球減少症を発病することが報告された（Yaoら、２００６年）。しかし、別の研究では、Ｓｔａｔ５欠失（Ｃｄ４−ｃｒｅ；Ｓｔａｔ５^ｆ／ｆ）が、末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合に影響を及ぼさなかったことが示された（Burchillら、２００７年）。実験の状況では、末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞の絶対数の変化は、ＥＡＥ発生の間はＳｔａｔ５の欠失によって検出されず（図４Ａおよび図４Ｂ）、このことは、
Ｓｔａｔ５^−／−マウスにおけるＥＡＥに対する抵抗性が、末梢リンパ球減少症によって引き起こされなかったことを示唆している。さらに、ＩＬ−１７^＋細胞およびＩＦＮ−γ^＋細胞の頻度の増加が、Ｓｔａｔ５^−／−マウスの脾臓中のＣＤ４^＋Ｔ細胞の中で検出され（図４Ｃ）、このことは、Ｓｔａｔ５^−／−マウスにおけるＥＡＥに対する抵抗性が、おそらくはＴ_Ｈ１およびＴ_Ｈ１７の生成と無関係であるという考えをさらに支持する。Ｔ_Ｈ１およびＴ_Ｈ１７の生成におけるＳＴＡＴ５の機能を検証するために、Ｔ_Ｈ１およびＴ_Ｈ１７の極性化条件下でナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化することによって、ｉｎｖｉｔｒｏ分化を実施した。以前の報告に符合して、ＳＴＡＴ５は、Ｔ_Ｈ１７分化に及ぼすＩＬ−２の抑制効果を媒介した（データ示さず）。興味深いことに、ＩＬ−７は、やはりＳＴＡＴ５を通じてシグナルを送るが、Ｔ_Ｈ１７の分化への明らかな効果があることが観察されなかった（データ示さず）。しかし、ＳＴＡＴ５が欠失していた際にＴ_Ｈ１極性化条件下でＩＦＮ−γ^＋細胞の僅かな低下が観察された（データ示さず）。

Ｓｔａｔ５^−／−マウスでのＥＡＥの抵抗性がＣＤ４^＋Ｔ細胞によって媒介されるか否かを確定するために、Ｓｔａｔ５^＋／＋またはＳｔａｔ５^−／−のＣＤ４^＋Ｔ細胞を用いてＲａｇ２^−／−マウスを再構築し、続いて、ＥＡＥ誘導を行った。我々は、Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞を受けたＲａｇ２^−／−マウスが、野生型細胞を受けたマウスに比較して、疾患に抵抗性であることを見出し（データ示さず）、このことは、Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、ＥＡＥ発生を促進する能力を損なっていたことを実証している。

次に、脳炎惹起性の欠如が、ＣＮＳへのＳｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞の遊走の欠陥によって引き起こされたものか否かを検討した。ケモカイン受容体ＣＣＲ６は、Ｔ_Ｈ１７細胞の脈絡叢を通じたＣＮＳへの進入に不可欠であることが示されている（Reboldiら、２００９）。そのため、Ｓｔａｔ５^−／−とＳｔａｔ５^＋／＋の両方のＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＣＣＲ６の発現を検討した。Ｓｔａｔ５^＋／＋対照に比較して、Ｓｔａｔ５^−／−マウスの脾臓でのＣＤ４^＋ＣＣＲ６^＋細胞の増加（図５Ａ）が観察された。ＣＸＣＲ３およびＣＤ６９の発現も検討し、ＳＴＡＴ５の不在下で、ＣＤ４^＋Ｔ細胞中で両分子の発現が増加することが示された（図５Ａ）。これらの結果は、Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞がＣＮＳを浸潤することができることを指し示している。さらに、ＥＡＥ誘導の間に、同等の数のＣＤ４^＋Ｔ細胞がＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウスのＣＮＳに存在することが観察された（７日目および９日目）（図５Ｂ）。しかし、Ｓｔａｔ５^−／−マウスのＣＮＳ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞は、疾患の発症の間に劇的に落ち込みがあった（２１日目）（図５Ｃおよび図５Ｄ）。合わせると、これらの結果は、Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、ＣＮＳを浸潤することができるが、ＥＡＥにおいて実効性のある炎症をＣＮＳに誘導できないことを実証している。

Ｓｔａｔ５欠損マウスのＥＡＥに対する抵抗性が、ＣＮＳ中の自己反応性ＣＤ４^＋Ｔの生存の際の何らかの潜在的な欠陥によって引き起こされる可能性をさらに排除するために、野生型細胞よりも数を増加させたＳｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｒａｇ２^−／−マウスにそれぞれ移入して、同等の数の自己反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞がＥＡＥ発生の間、ＣＮＳに存在していたことを確認した。図６Ａおよび図６Ｂに示すように、２群のマウスの間でＣＮＳ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞が同様の数であったにもかかわらず、しかし、疾患の重症度の減少が、Ｓｔａｔ５欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞を受けたマウスで観察された。さらに、ある数のＳｔａｔ５欠損マウスが、ＥＡＥ疾患のピークで、野生型マウスと同様の数のＣＤ４^＋Ｔ細胞をＣＮＳ中に含有することが観察されたが、それにもかかわらず、それらは、上記の野生型マウスに比較して、ＥＡＥに比較的抵抗性であり（図６Ｃ）、このことは、Ｓｔａｔ５欠損マウスにおけるＥＡＥ疾患に対する抵抗性が、おそらくはＣＮＳ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞の生存が損なわれたことに起因していなかったことをさらに示唆している。

これらの観察と、Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞で内因的に損なわれていることとの
間の因果関係をさらに展開するために、ＭＯＧ_{３５−５５}特異的なＳｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のＣＤ４^＋Ｔ細胞を、さらに免疫を行わずにＲａｇ２^−／−マウスに別々に移入して、これらの細胞がＥＡＥ発生を媒介することができるか否かを試験した。図７Ａおよび図７Ｂに示すように、Ｓｔａｔ５^＋／＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞を受けたマウスは、移入後の１週目に、自然発生的にＥＡＥ疾患を発病した。それに対して、Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞を受けたマウスは、疾患の重症度および発生率が大幅に減少していた。Ｒａｇ２^−／−マウスのＣＮＳ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞の中でのＩＬ−１７^＋細胞およびＩＦＮ−γ^＋細胞の頻度は、２群間で同等であり（図７Ｃ）、このことは、Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞の脳炎惹起性の内因的な欠陥は、Ｔ_Ｈ１およびＴ_Ｈ１７とは無関係であることをさらに示唆している。Ｓｔａｔ５^−／−マウスに観察されたＥＡＥに対する抵抗性におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞のあり得る役割を排除するため、ＭＯＧ_{３５−５５}特異的なＳｔａｔ５^＋／＋またはＳｔａｔ５^−／−のＣＤ４^＋Ｔ細胞を、等しい数のＳｔａｔ５^＋／＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に用いて、Ｒａｇ２^−／−マウスを再構築した。Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞をＳｔａｔ５^＋／＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に移送しても、やはりＥＡＥを誘導できなかった（データ示さず）。合わせると、これらのデータは、Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞が脳炎惹起性の内因的な欠陥を有することを提示している。本明細書に引用された全ての特許、公開された出願、および参照文献の関連の教示は、参照によりその全体を組み入れられる。

実施例３．Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦの発現の漸減

ＧＭ−ＣＳＦ産生がＳｔａｔ５の欠失によって損なわれたか否かを試験するために、ＭＯＧ_{３５−５５}特異的なＳｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のＣＤ４^＋Ｔ細胞でその発現を検討した。ＭＯＧ_{３５−５５}／ＣＦＡを免疫したＳｔａｔ５^＋／＋マウスおよびＳｔａｔ５^−／−マウス由来の脾細胞を、様々な濃度のＭＯＧ_{３５−５５}を用いて２４時間負荷を与えて、ＧＭ−ＣＳＦの分泌を検討した。Ｓｔａｔ５^＋／＋細胞で、ＧＭ−ＣＳＦ産生は、ＭＯＧ_{３５−５５}用量依存的な様式で増加することが観察された（図８Ａ）。それに対して、Ｓｔａｔ５^−／−細胞では、ＧＭ−ＣＳＦ産生は、全ての条件で激しく漸減した。このことをさらに検証するために、マウス由来の脾細胞を、ＥＡＥ発生の間、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１７の細胞内染色のためのＧｏｌｇｉＰｌｕｇの存在下で、ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて刺激した。ＩＬ−１７の発現がＳｔａｔ５^−／−細胞で亢進されたにもかかわらず、ＳＴＡＴ５の不在下で、ＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉ細胞のうちＧＭ−ＣＳＦ^＋ＩＬ−１７⁻細胞およびＧＭ−ＣＳＦ^＋ＩＬ−１７^＋細胞の割合の大幅な減少が観察された（図８Ｂ）。さらに、ＭＯＧ_{３５−５５}特異的なＧＭ−ＣＳＦ^＋Ｔ細胞の頻度も、Ｓｔａｔ５^−／−マウスの脾臓で大幅に減少した（図８Ｃ）。合わせると、これらの結果は、ＳＴＡＴ５が自己反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞でのＧＭ−ＣＳＦの発現に必要であることを指し示している。しかし、Ｔ_Ｈ１７の分化の重要な転写因子であるＳＴＡＴ３は、ＧＭ−ＣＳＦの発現に必要であった（図８Ｄ）。

次に、ＥＡＥ発生の間のＣＮＳにおけるＧＭ−ＣＳＦの誘導を検討した。ＣＮＳ浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの産生がＳｔａｔ５の欠損によって損なわれていなかったにもかかわらず、Ｓｔａｔ５^−／−マウスのＣＮＳで、対照マウスに比較して、ＣＤ４^＋ＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞の頻度の漸減が検出された（図９Ａ）。さらに、解析では、ＣＤ４^＋ＩＬ−１７^＋細胞の中およびＣＤ４^＋ＩＦＮ−γ^＋細胞の中での、ＧＭ−ＣＳＦ^＋のパーセンテージの減少が示された（図９Ａ）。同様に、ＭＯＧ_{３５−５５}特異的なＳｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞を移入されたＲａｇ２^−／−マウスも、対照マウスに比較して、ＣＮＳ中のＣＤ４^＋ＧＭ−ＣＳＦ^＋Ｔ細胞の頻度の減少を示した（図９Ｂ）。Ｓｔａｔ５^−／−マウスのＣＮＳにおけるＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ発現は、ＥＡＥ誘導後８日目に、すなわち同等のＣＤ４^＋Ｔ細胞の浸潤がＳｔａｔ５^−／−マウスおよびＳｔａｔ５^＋／＋マウスに検出された時に（図５Ｃおよび図５Ｄ）、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウ
スよりも著しく低かった（図９Ｃ）。一方、Ｓｔａｔ５^−／−マウスとＳｔａｔ５^＋／＋マウスとの間で、ＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの発現の有意な差は検出されなかった（図９Ｃ）。Ｓｔａｔ５^−／−マウスのＣＮＳにおけるサイトカイン誘導（ＩＬ−１７およびＩＦＮ−γ）が後期の段階で損なわれた（１４日目、図９Ｃ）のは、Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔが神経炎症に耐えられないということによって説明しうる（図５Ｃおよび図５Ｄ）。興味深いことに、ＣＮＳにおけるＧＭ−ＣＳＦの誘導は、ＩＬ−２３の誘導に先立って起こり（図９Ｃ）、このことは、ＩＬ−２３が、ＥＡＥの誘導相でのＧＭ−ＣＳＦ発現に必要ではない可能性があることを示唆している。要約すれば、この結果は、自己反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞中のＧＭ−ＣＳＦ発現がＳＴＡＴ５によって制御され、ＳＴＡＴ５の不在下でＧＭ−ＣＳＦ産生を損なっていることはＥＡＥに対するマウスの抵抗性をもたらすということを示唆している。

実施例４．ＩＬ−７−ＳＴＡＴ５シグナリングは、自己反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞でＧＭ−ＣＳＦの発現を誘導し、神経炎症の一因となる

次に、ＳＴＡＴ５がＧＭ−ＣＳＦの発現を制御する機構を調べた。本開示が指し示すように、ＩＬ−２３もＩＬ−１βも強力なＳＴＡＴ５スティミュレ―タ―でないように思われる（図１０Ａ）。さらに、ＩＬ−１Ｒ１の発現は変わらず、一方、ＩＬ−２３Ｒαの発現がＳｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞で増加した（図１０Ｂ）。これらのデータは、ＳＴＡＴ５の持つＧＭ−ＣＳＦの発現を誘導する能力が、おそらくはＩＬ−２３およびＩＬ−１βのシグナリングに無関係であることを示唆している。これに対して、ＩＬ−２およびＩＬ−７はどちらも、チロシンリン酸化を誘導することによって、ＳＴＡＴ５を強力に活性化した（図１０Ａ）。そこで、これら２つのサイトカインが自己反応性Ｔ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦの誘導に及ぼす効果をさらに検討した。ＭＯＧ_{３５−５５}を免疫した野生型マウス由来の脾細胞を、ＭＯＧ_{３５−５５}のみまたはＩＬ−２を追加で用いて、負荷を与えた。ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１７の産生を、細胞内サイトカイン染色によって分析した。図１０Ｃに示されるように、ＩＬ−２は、ＧＭ−ＣＳＦ^＋Ｔ細胞の頻度へ中等度の効果を示した。これに対して、ＩＬ−７は、ＩＬ−１７⁻ＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉＴ細胞とＩＬ−１７^＋ＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉＴ細胞の両方で、ＧＭ−ＣＳＦの発現を大幅に促進した（図１１Ａ）。さらに、細胞内サイトカイン染色およびＥＬＩＳＡによって評価されたように（図１１Ａ、下部パネル、および図１１Ｂ）、ＩＬ−７は、ＳＴＡＴ５依存的な様式で、すなわちＳｔａｔ５欠失がＧＭ−ＣＳＦの発現への効果を阻止するものとして、この機能を実行した。

ＩＬ−７Ｒαは、ＣＤ６２Ｌ^ｈｉＣＤ４４^ｌｏＴ細胞およびＣＤ６２Ｌ^ｌｏＣＤ４４^ｈｉＴ細胞の両方で発現し、このことは、ＩＬ−７が直接的にＣＤ４^＋Ｔ細胞に作用して、ＧＭ−ＣＳＦの発現を制御する可能性があることを示唆している。そのため、ＣＤ６２Ｌ^ｈｉＣＤ４４^ｌｏＴ細胞およびＣＤ６２Ｌ^ｌｏＣＤ４４^ｈｉＴ細胞を、ＥＡＥ発生の間、Ｓｔａｔ５^−／−マウスおよび同腹の対照から選別して、次いで、ＩＬ−７の存在下または不在下で、細胞を活性化した。図１１Ｃに示されるように、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏＣＤ４４^ｈｉＴ細胞は、ＧＭ−ＣＳＦを強力に発現し、一方でＣＤ６２Ｌ^ｈｉＣＤ４４^ｌｏＴ細胞は、３０倍低いＧＭ−ＣＳＦ量を発現した。ＳＴＡＴ５の欠失の結果、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏＣＤ４４^ｈｉＴ細胞での基礎的なＧＭ−ＣＳＦ産生が減少した。予想した通り、ＩＬ−７は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の両サブセットにおけるＧＭ−ＣＳＦの発現を、ＳＴＡＴ５依存的な様式で促進した（図１１Ｃ）。

自己反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞における、ＩＬ−７で誘導されたＧＭ−ＣＳＦの発現がＥＡＥの発生へ及ぼす寄与を検討するため、ＥＡＥ発生の間、ＩＬ−７Ｒα特異的な抗体（クローンＳＢ／１４）を用いてマウスを処理した。処理の結果、疾患の重症度の有意な減少がもたらされ、ＣＮＳの炎症の減少を伴っていた（図１２Ａおよび１２Ｂ）。以前の報告
（Leeら、２０１２年）に符合して、この中和抗体は、Ｔ細胞を枯渇させる活性を持たなかった（図１２Ｃ）。注目すべきことに、ＩＬ−７シグナリングの遮断の結果、ＣＮＳ浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞でＧＭ−ＣＳＦ発現の低下が生じた（図１２Ｄ〜図１２Ｆ）。要約すると、本願の知見は、ＩＬ−７が、自己反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞にＳＴＡＴ５依存的なＧＭ−ＣＳＦの発現を誘導し、その発現が、神経炎症の発生に寄与することを指し示している。

実施例５．ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈ細胞は、Ｔ_Ｈ１７およびＴ_Ｈ１とは別個である

Ｔ_Ｈ１７とＴ_Ｈ１はどちらもＧＭ−ＣＳＦを産生することができるため、ＩＬ−７で刺激された表現型がこれらのサブセットのどちらに関わるかを判定した。ＧＭ−ＣＳＦ発現ＣＤ４^＋細胞の特徴をさらに理解するため、Ｔ_Ｈ１またはＴ_Ｈ１７を極性化する条件で、プレートに結合された抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８を用いて、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を刺激した。抗ＣＤ３が抗ＣＤ２８と共にＧＭ−ＣＳＦの発現を誘導することが観察された（図１４Ａ）。しかし、予想通りに、Ｔ_Ｈ１分化の条件がＩＦＮ−γの発現を促進し、Ｔ_Ｈ１７の条件がＩＬ−１７の発現を促進する一方で、Ｔ_Ｈ１とＴ_Ｈ１７のどちらの分化の条件も、ＧＭ−ＣＳＦの産生を大きく抑制した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。逆に、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの中和によって、ＧＭ−ＣＳＦ発現細胞の生成が促進し（図１３Ａ）、このことは、以前の報告に一致した（Codarriら、２０１１年）。ＩＬ−２３およびＩＬ−１βは、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＧＭ−ＣＳＦ発現細胞の分化を増加させず（図１３Ａ）、これは、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞がその受容体を発現しなかったという知見に一致した。ＴＧＦ−βは、ＧＭ−ＣＳＦの発現を阻害する（El-Behiら、２０１１年）。Ｔ_Ｈ１７の分化のために不可欠なサイトカインであるＩＬ−６は、ＧＭ−ＣＳＦ発現へ深い阻害効果を及ぼし（図１４Ｂ）、このことは、ＳＴＡＴ３が負のレギュレーターである可能性があることを指し示す。これに取り組むために、Ｓｔａｔ３^−／−マウスから、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を細胞分化用に精製した。衝撃的なことに、ＳＴＡＴ３の不在下では、Ｔ_Ｈ１７条件下で極性化された細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現した（図１４Ｃ）。興味深いことに、外因的なＩＬ−６がないときでさえ、ＳＴＡＴ３は、ＧＭ−ＣＳＦ発現細胞の分化に及ぼす中等度の抑制効果を依然として有する（図１４Ｃ）。さらに、ＲＯＲγｔおよびＴ−ｂｅｔは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞でのＧＭ−ＣＳＦ発現に必要ではないことが報告されている（El-Behiら、２０１１年）．そのため、本願のデータは、ＧＭ−ＣＳＦ発現ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、Ｔ_Ｈ１７およびＴ_Ｈ１とは別個の系譜を介して発生するというモデルを支持する。

実施例６．ＩＬ−７−ＳＴＡＴ５は、ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈ細胞の分化をプログラムする

本明細書に開示される本願の知見（例えば、ｉｎｖｉｖｏのＳｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞中のＧＭ−ＣＳＦ発現の漸減、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞でのＧＭ−ＣＳＦ発現のＩＬ−７／ＳＴＡＴ５媒介性誘導、ならびにＴ_Ｈ１細胞およびＴ_Ｈ１７細胞に対するＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈ細胞の別個の特色を含む）は、ＩＬ−７−ＳＴＡＴ５シグナリングによって制御される別個のＴ_Ｈ細胞サブセットを指し示している。異なる濃度のＩＬ−７の存在下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いてナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化することによって、ｉｎｖｉｔｒｏのＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈ細胞の分化を検討することにより、この知見をさらに追究した。図１５Ａおよび図１５Ｂに示されるように、ＩＬ−７は、ＧＭ−ＣＳＦ発現細胞の生成およびＧＭ−ＣＳＦの分泌を強く促進した。さらに、ＩＬ−７によるＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈの生成は、ＳＴＡＴ５によって媒介された。ＳＴＡＴ５がない場合、ＩＬ−７は、ＧＭ−ＣＳＦ発現細胞の生成を促進することができなかった（図１５Ｃおよび１５Ｄ）。さらに、精査では、ＩＬ−７で誘導されたＳＴＡＴ５の活性化が、Ｃｓｆ２遺伝子のプロモーター領域に直接的に結合することが示された（図１５Ｅおよび１５Ｆ）。

少数の割合のＩＦＮ−γ発現細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈの分化の間に生成した（図１５Ａ）。そのため、ＩＦＮ−γの遮断がＧＭ−ＣＳＦ発現細胞の生成に及ぼす効果を試験したところ、ＩＬ−７とＩＦＮ−γの中和との組合せが、最も高頻度のＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞を誘導したことが示され、ＩＬ−１７^＋細胞またはＩＦＮ−γ^＋細胞が殆ど検出されなかった（図１６Ａ）。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈの転写因子を規定するサブセットの発現を検討すると、ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_ＨでのＲＯＲγｔまたはＴ−ｂｅｔの発現は、それぞれＴ_Ｈ１７細胞またはＴ_Ｈ１細胞よりも大幅に低いことが観察され（図１６Ｂ）、このことは、ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈ細胞がＴ_Ｈ１細胞およびＴ_Ｈ１７細胞とは別個のものであることを裏付ける。合わせると、これらのデータは、ＩＬ−７−ＳＴＡＴ５シグナリングが、Ｔ_Ｈ−ＧＭと呼ばれる新規のＧＭ−ＣＳＦ発現ヘルパーＴ細胞サブセットの分化を方向付けることを示唆している。

次に、ＩＬ−２シグナリングがナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＴ_Ｈ−ＧＭ分化に影響を与える可能性があるか否かを決定した。ＩＬ−２またはＩＬ−２に対する抗体の添加は、ＧＭ−ＣＳＦ^＋細胞の頻度に僅かな効果を及ぼしたに過ぎず（図１４Ｄ）、このことは、ＩＬ−２がＴ_Ｈ−ＧＭの分化に最小限の効果を及ぼすこと指し示している。ＩＬ−７Ｒαとは異なり、ＩＬ−２高親和性受容体であるＩＬ−２Ｒαは、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞では発現されていなかったが、その発現は、ＴＣＲの活性化によって徐々に誘導された（図１７Ａ〜図１７Ｃ）。ゆえに、ＩＬ−２の最小限の効果は、少なくとも一部は、ＩＬ−２刺激に対するナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞の不応性に起因する。この観点を支持するものとして、ＩＬ−７は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞で、ＳＴＡＴ５の活性化を誘導し、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ発現を上方制御したが、ＩＬ−２はしなかった（図１７Ｄおよび１７Ｅ）。この考えをさらに裏付けるために、ＩＬ−２またはＩＬ−７を用いて活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞を刺激すると、どちらのサイトカインもＳＴＡＴ５の活性化、Ｃｓｆ２プロモーターの結合、およびＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの上方制御を誘導することが示された（図１８Ａ〜図１８Ｃ）。注目すべきことに、ＩＬ−２は、ＩＬ−７に比較して、ＳＴＡＴ５の活性化の延長を誘導した（図１８Ａ）。

実施例７．Ｔ_Ｈ−ＧＭの別個の遺伝子発現プロファイル

Ｔ_Ｈ−ＧＭを公知のＴ細胞サブセット（例えばＴ_Ｈ１およびＴ_Ｈ１７）とは別個であるものとして実証するため、全トランスクリプトーム解析をマイクロアレイにより実施して、特異性を公知のＴ細胞サブセット、特にＴ_Ｈ１７細胞と比較して検証した。ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ１７、およびＴ_Ｈ−ＧＭに分化させた。マイクロアレイ解析を実施して、それらの遺伝子発現プロファイルを検討した。全トランスクリプトームのクラスタリングは、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞が、Ｔ_Ｈ１細胞またはＴ_Ｈ１７細胞とは別個の新規のサブセットを代表するものとして指し示した。Ｔ細胞系譜特異的な遺伝子発現を表１に示す。ナイーブ細胞、Ｔ_Ｈ１７細胞、またはＴ_Ｈ−ＧＭ細胞に比較して、Ｔ_Ｈ１細胞で優先的に発現する２０２遺伝子のリストを特定すると（倍変化＞１．７）、その中では、ＩＦＮ−γおよびＴ−ｂｅｔはリストの最上位であった（表１）。同様に、Ｔ_Ｈ１７の特色遺伝子、例えばＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｆ、ＲＯＲγｔ、およびＲＯＲαを、Ｔ_Ｈ１７細胞に特異的な４１１遺伝子を含むリストに特定した（表１）。Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞特異的な遺伝子リスト（「Ｔ_Ｈ−ＧＭで優先的に上方制御される遺伝子」-Ｔ_Ｈ−ＧＭシグネチャー遺伝子）は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子をリスト中に最上位の遺伝子として含む２１０遺伝子を含有する（表１）。他のサブセットに比較して、Ｔ_Ｈ−ＧＭサブセットにおいて高レベルで選択的に発現する一連の表面分子、およびＴ_Ｈ−ＧＭサブセットにおいて低レベルで選択的に発現する別の一連の表面分子を特定した（図１９および表１）。これらの分子（Ｔ_Ｈ−ＧＭシグネチャー遺伝子でもある）は、表面マーカーによるさらに別の特性解析のために使用して、Ｔ細胞のＴ_Ｈ−ＧＭサブセットを特定することができる。サイ
トカインおよび転写因子、具体的にはＩＬ−３をコードする遺伝子を含めて、他のいくつかの目的遺伝子も特定した。様々なヘルパーＴ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで分化させ、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞がＴ_Ｈ１細胞およびＴ_Ｈ１７細胞に比較して強力なＩＬ−３産生体であることを確認した（図２０Ａ、図２０Ｃ、および図２０Ｄ）。さらに、ＥＢＩ−３、ＰＥＮＬ、およびＲＡＮＫＬを含めて、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞で優先的に発現する他のいくつかのサイトカインを見出したが（図２０Ｂ）、このことは、Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞の多様な生物学的機能を指し示している。

実施例８．Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞は主要な病原集団である

ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈサブセット（Ｔ_Ｈ−ＧＭ）が主要な脳炎惹起性のエフェクター細胞であったという仮説を試験するために、ＭＯＧ_{３５−５５}特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞の異なるサブセットの養子移入を、Ｒａｇ２^−／−マウス内へＥＡＥ誘導のため実施した。図２１に示されるように、ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｔ_Ｈ細胞は、Ｔ_Ｈ１７サブセットおよびＴ_Ｈ１サブセットと比較して、ＥＡＥを優先的に誘導することが可能であった。

実施例９．化学阻害剤によるＳＴＡＴ５活性の抑制は、Ｔ_Ｈ−ＧＭによるＧＭ−ＣＳＦ発現を弱め、ＥＡＥを寛解させる

化学阻害剤によってＳＴＡＴ５の活性化を途絶させる効果を検討し、自己免疫性神経炎症を治療する実行可能な方法を追究した。ＳＨ２ドメイン内の鍵となるチロシン残基上のリン酸化は、ＳＴＡＴ５の活性化および機能に決定的に重要である。市販のＳＴＡＴ５阻害剤（ＣＡＳ２８５９８６−３１−４、カルビオケム社）は、チロシンのリン酸化およびＳＴＡＴ５のＤＮＡ結合を選択的に途絶させることが報告されている（Mullerら、２００８年）。まず、ＣＤ４^＋Ｔ細胞でのＩＬ−７刺激時にこの阻害剤がＳＴＡＴ５の活性化に及ぼす阻害効果を試験した。５０μｍの濃度では、阻害剤は約５０％の阻害効果を有し、この効果は、濃度の増加に伴ってさらに亢進された（図２２Ａ）。ＳＴＡＴ５阻害剤は、親和性が低く、それゆえ、ＳＴＡＴ５の活性化を充分に遮断するには高濃度を必要としたが、一方、ＪＡＫ３阻害剤は、低濃度でさえ強力な阻害効果を示した（図２２Ｂ）。次に、ＳＴＡＴ５阻害剤の特異性を、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ１の活性化に及ぼす効果を検討することによって試験した。図２２Ｃおよび図２２Ｄに示されるように、このＳＴＡＴ５阻害剤は、比較的低濃度（５０または１００μｍ）で、ＳＴＡＴ３とＳＴＡＴ１の両方の活性化に最小限の阻害効果を示した。

ＳＴＡＴ５の阻害がＴ_Ｈ−ＧＭ分化に及ぼす効果を検討した。示されるように、ＳＴＡＴ５阻害剤は、Ｔ_Ｈ−ＧＭの分化を投薬量依存的な様式で抑制した（図２２Ｅ）。ＳＴＡＴ５阻害剤処理時のＴ_Ｈ１分化の減少が観察されたが（データ示さず）、Ｔ_Ｈ１７の分化は、ＳＴＡＴ５阻害剤によって抑制されなかった（データ示さず）。

ＥＡＥ疾患におけるＳＴＡＴ５の活性化を標的とすることの治療効果を追究するために、市販のＳＴＡＴ５阻害剤を、疾患の発症後１日おきに野生型マウスに腹腔内投与した。麻痺の発生を、臨床スコアの帰属を毎日行うことによって評価した。ＳＴＡＴ５の阻害によって、ＥＡＥの重症度が寛解し、それは、ＣＮＳ中の免疫細胞の浸潤の減少を伴った（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。それに対して、ＪＡＫ３阻害剤は、ＳＴＡＴ５の活性化を強力に遮断することができなかったにもかかわらず（図２２Ｂ）、ＥＡＥへの有害な効果を示した（図２３Ｂ）。注目すべきことに、ＳＴＡＴ５阻害剤は、結果としてＣＮＳ浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞でＧＭ−ＣＳＦの産生の減少をもたらした（図２３Ｃおよび図２３Ｄ）。この研究は、化学阻害剤によってＳＴＡＴ５を標的とすることが、ＭＳにおける治療介入の際に有用であることを指し示している。

実施例１０．ＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞は、ヒトのＲＡと関連がある

性別／年齢が合致する健康な対照（ＨＣ）と比較して、ＲＡ患者の末梢血中のＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの血漿濃度を検討し、どちらのサイトカインもＲＡで上昇することを見出した（図２４Ａ）。ＲＡおよびＨＣにおけるＩＦＮ−γ産生Ｔ_Ｈ細胞、ＩＬ−１７産生Ｔ_Ｈ細胞またはＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞のｅｘｖｉｖｏでの頻度を定量した。高頻度のＩＦＮ−γ産生Ｔ_Ｈ細胞および／またはＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞が全ての試料で検出されたが、低頻度（＜１％）のＩＬ−１７産生Ｔ_Ｈ細胞（図２４Ｂ）が観察された。ＧＭ−ＣＳＦ単独産生（ＧＭ−ＣＳＦ^＋ＩＦＮ−γ⁻）Ｔ_Ｈ細胞は、ＲＡとＨＣの両方における実質的な集団を表す（図２４Ｂ）。さらに重要なことに、ＲＡの末梢血中のこの集団の頻度は、ＨＣのそれよりも有意に高かった（図２４Ｃ）。これに対して、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮ−γ二重産生Ｔ_Ｈ細胞もＩＦＮ−γ単独産生Ｔ_Ｈ細胞も、ＲＡとＨＣとの間で頻度に有意な差を示さなかった（図２４Ｃ）。したがって、末梢血中のＧＭ−ＣＳＦ単独産生Ｔ_Ｈ細胞の頻度は、ＲＡで選択的に上昇しており、このことは、Ｔ_Ｈ細胞により分泌されるＧＭ−ＣＳＦとＲＡとの機能的な関連を示唆する。さらに、ＲＡにおいて、血漿ＧＭ−ＣＳＦ濃度とＧＭ−ＣＳＦ単独産生Ｔ_Ｈ細胞の頻度との間に有意な相関が観察された（図２４Ｄ）。

ＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞のＲＡとの関連をさらに評価するために、単核細胞をＲＡ患者の滑液から単離し、これらの細胞の存在量を分析した。末梢血に比較して、ＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞の頻度の顕著な上昇が滑液に観察されたが、これらの細胞の大部分は、ＩＦＮ−γを共発現していた（図２４Ｅ）。同様に、Ｔ_Ｈ１およびＴ_Ｈ１７の両方の頻度も滑液で増加し、Ｔ_Ｈ１に比較してＴ_Ｈ１７は依然として少数集団であった（図２４Ｅ）。

実施例１１．ＧＭ−ＣＳＦは、ＴＮＦ−α非依存の様式で実験的関節炎を媒介する

ＨＣに比較してＲＡの血漿中でＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αのレベルが上昇したことは、これら２つのサイトカインを標的とすることによる治療アプローチを示唆する可能性がある。ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの両方を遮断する効能を、抗原誘導性関節炎（ＡＩＡ）モデルでの関節炎マウスの処理において試験した。ＡＩＡは、Ｔ細胞作動性のＲＡモデルであり、疾患を速やかにかつ同調させて発症させることで、Ｃ５７ＢＬ／６系統で手軽に誘導可能であり、ＲＡの病態形成の追究を容易にする。ＧＭ−ＣＳＦまたはＴＮＦ−αのどちらかを個別に遮断することによって、ＡＩＡの発生が弱められた（図２５Ａ）。興味深いことに、ＧＭ−ＣＳＦ特異的中和抗体とＴＮＦ−α特異的中和抗体との組合せは、関節炎の発生の操作において、個別の処理よりも良好な効能を示した（図２５Ａ）。すなわち、ＧＭ−ＣＳＦを標的とすることは、ＴＮＦ−α活性とは無関係な方式で、関節炎の治療において有益な効能を有しうる。関節炎の発生を媒介する際のＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−αとの区別可能な効果をさらに研究するために、コンディショナルＳｔａｔ５欠失を有したマウス系統（短く言えばＣｄ４−Ｃｒｅ；Ｓｔａｔ５^ｆ／ｆ、またはＳｔａｔ５^−／−）を、ＡＩＡ誘導のためのＴ細胞に使用した。これらのコンディショナルＳｔａｔ５−ノックアウトマウスは、血清のＴＮＦ−αならびにＩＦＮ−γのレベルの顕著な増加を示した場合でさえ（図２５Ｅ）、関節腫脹が軽度となり、滑液中の免疫細胞の浸潤が少数となり、関節破壊が減少するなど、関節炎の発生に抵抗性を示した（図２５Ｂ〜２５Ｄ）。これに対し、ＧＭ−ＣＳＦの血清中レベルは、ノックアウトマウスで有意に減少し（図２５Ｅ）、下に記載の結果によってさらに支持されるように、それは、おそらくは関節炎の発生に対する抵抗性の原因因子であった。一致する結果が、コラーゲン−誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルでも観察された（図２６Ａ〜図２６Ｄ）。合わせると、これらの知見は、ＧＭ−ＣＳＦがＲＡにおける重要な病原メディエーターであることを示唆し、また、抗ＴＮＦα剤に不応性のＲＡ患者を治療するための抗ＧＭ−ＣＳＦ剤の開発が有望であることを指し示しており、ＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞をＲＡ診断のための新しいバイオマー
カーとして際立たせるものとしている。

実施例１２．自己反応性Ｔ_Ｈ細胞によるＳＴＡＴ５制御性のＧＭ−ＣＳＦの分泌は、滑膜の炎症を媒介する

ＧＭ−ＣＳＦとＲＡとの関連に基づき、関節炎マウスにおけるＧＭ−ＣＳＦの細胞性産生体と、ＧＭ−ＣＳＦ発現の基礎を成す制御機構とを検討した。野生型ＡＩＡマウスから脾細胞を採集し、細胞を３つの画分、すなわち脾細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が枯渇した脾細胞、およびＣＤ４^＋Ｔ細胞に分離して、各画分を同じ細胞数で様々な条件下で刺激した。脾細胞は、刺激がない場合には、低いものの検出可能なレベルのＧＭ−ＣＳＦを産生し、それは、ＰＭＡ／イオノマイシンまたはｍＢＳＡ抗原による刺激によって顕著に増加した（図２８Ａ）。全ての条件下で、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が枯渇した脾細胞は、ほぼ完全にＧＭ−ＣＳＦの産生を阻止した（図２８Ａ）。これに対して、全ての条件下で、ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、脾細胞に比較して劇的に上昇したＧＭ−ＣＳＦを産生した（図２８Ａ）。これらの結果は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、少なくとも関節炎マウスの脾臓で優勢なＧＭ−ＣＳＦの産生体であることを強く支持し、ＲＡで血漿ＧＭ−ＣＳＦ濃度とＧＭ−ＣＳＦ単産生Ｔ_Ｈ細胞の頻度との相関が観察されたことにいくらか一致する（図２４Ｄ）。そのため、Ｔ_Ｈ細胞により分泌されるＧＭ−ＣＳＦの関節炎発生における機能的な重要性を検討した。Ｔ細胞特異的なＣｓｆ２−ノックアウトマウスは入手可能ではなく、ＳＴＡＴ５がＴ_Ｈ細胞中のＧＭ−ＣＳＦ発現の鍵となるレギュレーターであることを考えて、コンディショナルＳｔａｔ５−ノックアウトマウスを使用したところ、上に記載されたようなＧＭ−ＣＳＦレベルの低下および関節炎の発生に対する抵抗性を示した。

以前の研究（Burchillら、２００７年）に一致して、ＡＩＡ誘導後７日目に、野生型マウスに比較して、同様のＣＤ４^＋Ｔ細胞の頻度が、ＳＴＡＴ５欠損マウスの末梢リンパ系組織ならびに炎症を生じた滑膜組織に観察され（図２７Ａ〜２７Ｄ）、このことは、ＳＴＡＴ５の喪失が、末梢でのＣＤ４^＋Ｔ細胞の生成と滑膜組織での浸潤とを損なわないようであることを示唆する。ＣＤ４^＋Ｔ細胞の持つ潜在的な関節炎発症能のためのＳＴＡＴ５の要件を決定するために、Ｓｔａｔ５^＋／＋およびＳｔａｔ５^−／−のＡＩＡマウスに由来し、かつｅｘｖｉｖｏで拡大した抗原反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、野生型ナイーブマウス内に別々に移入し、続いて、ｍＢＳＡを関節内注射した。Ｓｔａｔ５^＋／＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞を受けたマウスは、ＡＩＡ誘導後７日目に、滑膜組織に豊富な免疫細胞の浸潤を呈した（図２７Ｅ）。これに対して、Ｓｔａｔ５^−／−ＣＤ４^＋Ｔ細胞を受けたマウスは、滑膜の浸潤が顕著に減少した（図２７Ｅ）。したがって、ＳＴＡＴ５欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、潜在的な関節炎発症能に欠陥がある。

多面的な証拠が、ＲＡにおけるＴ細胞の中心的な役割を支持している。しかし、Ｔ細胞の病原機構は、依然として不十分な理解のままである。Ｔ_Ｈ１は、ヒトのＲＡの滑膜浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞の中で優勢な集団であるにもかかわらず（Bernerら、２０００年；Yamadaら、２００８年）、ＩＦＮ−γシグナリングの欠陥は、関節炎の動物モデルでは、結果として疾患の罹患性を増加させる（Guedezら、２００１年；Irmlerら、２００７年；Manoury-Schwartzら、１９９７年；Vermeireら、１９９７年）。これに対して、Ｔ_Ｈ１７細胞は、関節炎の動物モデルで決定的に重要であることが証明されているが（Pernis、２００９年）、Ｔ_Ｈ１７細胞の優勢は、ヒトのＲＡの末梢血と滑膜区画との両方において限定的である（Yamadaら、２００８年）ならびに（図１Ｂおよび図１Ｅ）。本明細書に提示されるように、ＳＴＡＴ５制御性のＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞は、関節炎の病態形成を増強する。

ＧＭ−ＣＳＦ産生におけるＳＴＡＴ５の制御的な役割を検証するために、ＰＭＡ／イオノマイシンにＧｏｌｇｉｐｌｕｇを追加で用いて、ＡＩＡマウスに由来する脾細胞をｅｘ
ｖｉｖｏで刺激し、続いて、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーを行った。予想通り、ＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉ集団の中でのＧＭ−ＣＳＦ単生産細胞の頻度は、Ｓｔａｔ５^−／−マウスで有意に低下した（図２８３４Ｂ）。注目すべきことに、ＩＬ−１７単産生（Ｔ_Ｈ１７）細胞またはＩＦＮ−γ単産生（Ｔ_Ｈ１）細胞の頻度に、２群間で有意な差は観察されなかった（図２８Ｂ）。ｍＢＳＡによる再刺激と細胞内サイトカイン染色とを組み合わせることによるさらに進んだ研究では、ＧＭ−ＣＳＦ産生エフェクターＴ細胞に特異的なｍＢＳＡの頻度が、Ｓｔａｔ５^−／−マウスの脾臓では、対照よりもはるかに少ないことが示された（図２９Ａ）。さらに、ＡＩＡマウス由来の脾細胞および鼠径部リンパ節（ＬＮ）を、ｍＢＳＡを用いてｅｘｖｉｖｏで再刺激し、培養上清中のサイトカイン濃度を測定したところ、ＧＭ−ＣＳＦはＳＴＡＴ５の欠失がある場合に有意に減少するが、ＩＬ−１７とＩＦＮ−γのどちらも２群間で同等のレベルであることを見出した（図２９Ｂおよび図２９Ｃ）。合わせると、本結果は、実験的関節炎において、ＳＴＡＴ５の喪失によって、ＧＭ−ＣＳＦ産生エフェクターＴｈ細胞が特異的に抑制される場合があるが、Ｔ_Ｈ１７細胞またはＴ_Ｈ１細胞は抑制されないということを指し示している。

滑膜の炎症におけるＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞の関与とＳＴＡＴ５によるその制御とを精査するために、滑膜組織をＡＩＡマウスから切り出し、Ｔ_Ｈ細胞によるサイトカイン産生を検討した。ＧＭ−ＣＳＦの複数の細胞源があるにもかかわらず（Cornishら、２００９年）、ＣＤ４^＋Ｔ_Ｈ細胞が、ＡＩＡマウスの滑膜組織における卓越したＧＭ−ＣＳＦの産生体であり（図２８Ｃ）、脾臓における観察と一致した（図２８Ａ）。さらに、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウスよりも大幅に低いパーセンテージの滑膜のＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞が、Ｓｔａｔ５^−／−マウスに検出された（図２８Ｄ）。一方、Ｔ_Ｈ１細胞とＴ_Ｈ１７細胞の両方が、２群間で同様のパーセンテージを示した（図２８Ｃ）。対照に比較して、Ｓｔａｔ５^−／−マウスの滑膜区画でのＧＭ−ＣＳＦレベルが低下することが予想された。これに取り組むために、炎症を生じた滑膜組織をＲＮＡおよびタンパク質の抽出のためにＡＩＡマウスから回収して、ｑＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによってサイトカインレベルを検討した。実際に、関節炎の誘導後５日目または７日目に、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウスよりも低い滑膜ＧＭ−ＣＳＦがＳｔａｔ５^−／−マウスで検出されたが、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１７では検出されなかった（図２８Ｅおよび図３０Ａ〜図３０Ｃ）。さらに、２つの重要なプロ炎症性サイトカインであるＩＬ−６およびＩＬ−１βもまた、ＳＴＡＴ５欠損マウスで持続的かつ有意な減少が見出されたが（図２８Ｅおよび図３０Ａ〜図３０Ｃ）、このことは、滑膜の炎症が弱められたことを指し示している。注目すべきことに、ＴＮＦ−α産生は、ＳＴＡＴ５欠損マウスでは７日目に減少したが、５日目には減少しなかった（図２８Ｅおよび図３０Ａ〜図３０Ｃ）。合わせると、これらの結果は、関節炎発症性のＴ_Ｈ細胞によるＳＴＡＴ５制御性のＧＭ−ＣＳＦ発現が、滑膜の炎症の誘発に決定的に重要であることを指し示している。

滑膜炎および関節炎の発生を媒介する際の、Ｔ_Ｈ細胞によるＳＴＡＴ５制御性のＧＭ−ＣＳＦ産生の持つ重大な役割を決定するために、ｍＢＳＡ／ＣＦＡを免疫したマウスの左膝関節に、ＧＭ−ＣＳＦをｍＢＳＡとの混合物として関節内注射を介して投与し、一方で、右膝関節に、ｍＢＳＡのみを注射した。ｍＢＳＡを用いた注射のみで、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウスの滑膜区画で豊富な免疫細胞の浸潤を誘導するのに充分であったが、Ｓｔａｔ５^−／−マウスではそのようにすることができなかった（図２８Ｆ）。ＧＭ−ＣＳＦをｍＢＳＡと共に投与することによって、Ｓｔａｔ５^−／−マウスにおいて滑膜の炎症が効率良く回復した（図３４Ｆ）。一貫して、サフラニン−Ｏ／ＦａｓｔＧｒｅｅｎ染色では、Ｓｔａｔ５^−／−マウスにおいて、ＧＭ−ＣＳＦ／ｍＢＳＡを注射すると軟骨の重度な枯渇が生じるが、ｍＢＳＡのみには生じないことが明らかになった（図２８Ｇ）。したがって、これらの結果は、関節炎発症性のＴ_Ｈ細胞によるＳＴＡＴ５制御性のＧＭ−ＣＳＦ産生が、関節炎の病態形成を媒介するために不可欠であるという意見について、支持を提供
する。

実施例１３．Ｔｈ細胞由来のＧＭ−ＣＳＦは、滑膜組織での好中球の蓄積を媒介する

ＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔｈ細胞が滑膜の炎症を誘発して関節炎の発生を駆り立てる機構を検討した。好中球、ＤＣ、およびマクロファージを含む骨髄系由来の細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を発現するため、ＧＭ−ＣＳＦの一般的な標的となっている（Hamilton、２００８年）。重要なことに、それらの細胞は、ＲＡ患者およびマウス関節炎モデルにおいて滑膜区画に侵入し、滑膜炎に寄与する（McInnesおよびSchett、２０１１年）。ＡＩＡマウスの滑膜区画の骨髄系由来細胞の浸潤を検討した。滑膜の浸潤白血球の中で、ＣＤ１１ｂ^＋骨髄系細胞が優勢な集団（〜７０％）を表した（図３１Ｂ）。関節炎の誘導後７日目に検討すると、ＣＤ４^＋Ｔ_Ｈ細胞浸潤がＳＴＡＴ５欠失によって変わらなかったにもかかわらず、滑膜のＣＤ１１ｂ^＋細胞の浸潤は、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウスに比較して、Ｓｔａｔ５^−／−マウスでは有意に減少した（図３１Ｂ）。同様の頻度のＣＤ１１ｂ^＋細胞が２群の脾臓に検出されたため、この減少は、おそらくは造血の欠陥に起因しない（図３１Ａ）。さらに、ＣＤ１１ｂ^＋細胞は、７日間の経時で、野生型マウスの滑膜組織で連続的に増加したが、ＳＴＡＴ５欠損マウスでは増加しなかった（図３１Ｃ）。注目すべきことに、関節炎の誘導の間、ＳＴＡＴ５欠損マウスの滑膜ＣＤ１１ｂ^＋細胞の蓄積の選択的な除去を、ＧＭ−ＣＳＦの局所投与により部分的に回復させることができた（図３１Ｄ）。合わせると、これらの結果は、滑膜区画での骨髄系細胞の蓄積は、Ｔ細胞特異的なＳＴＡＴ５の欠失とその結果として生じるＧＭ−ＣＳＦの不足によって、特異的に鈍る可能性があることを指し示している。

次に、ＤＣ、マクロファージ、および好中球を含む異なるＣＤ１１ｂ^＋細胞の集団を分析した。最近、ＣＤ１１ｃ^ｉｎｔＣＤ１１ｂ^ｈｉＬｙ６Ｃ^＋／ｈｉＭＨＣＩＩ^ｈｉという特徴を有する単球由来の樹状細胞（ＭｏＤＣ）が、ｍＢＳＡ／ＩＬ−１β関節炎モデルに関与することが報告された（Campbellら、２０１１年）。本願の研究のＡＩＡモデルでは、ＭｏＤＣは、脾臓および滑膜組織に、低い存在量で特定された（データ示さず）。さらに、Ｓｔａｔ５^＋／＋マウスとＳｔａｔ５^−／−マウスとの間で同等の頻度のＭｏＤＣが、末梢リンパ系組織と滑膜組織との両方で検出された（データ示さず）。これらの結果は、ＭｏＤＣの分化においてＧＭ−ＣＳＦが重要でない役割を持つことを示す、以前の報告に符合する（Greterら、２０１２年）。

好中球は、大きな潜在的な細胞毒性を有し、複数の方式でＲＡの始動および進行に寄与する（Wrightら、２０１４年）。ＲＡ疾患の活性および関節の破壊は、関節への好中球の流入に直接的に関連することが示唆されている（Wrightら、２０１４年）。Ｌｙ６ＣおよびＬｙ６Ｇの示差的な発現に基づき、ＣＤ１１ｂ^＋骨髄系細胞は、Ｌｙ６Ｃ^ｌｏＬｙ６Ｇ^ｈｉ集団（好中球）およびＬｙ６Ｃ^ｈｉＬｙ６Ｇ⁻集団（単球／マクロファージ）に分類することができる。本願の研究では、Ｌｙ６Ｃ^ｌｏＬｙ６Ｇ^ｈｉ集団は、７日間の経時で滑膜組織に蓄積し続け、ＡＩＡ誘導後７日目に、野生型マウスにおいて、滑膜ＣＤ１１ｂ^＋細胞の中で優勢な集団を表したが、一方で、この集団は、ＳＴＡＴ５欠損マウスにおいて持続的かつ劇的に漸減したことが示された（図３２Ａ）。ギムザ染色を使用して、滑膜に浸潤したＬｙ６Ｃ^ｌｏＬｙ６Ｇ^ｈｉ集団が好中球であり、それらが環状の核を伴う典型的な多形核の特徴を呈することが立証された（図３２Ｂ）。これに対して、滑膜に浸潤したＬｙ６Ｃ^ｈｉＬｙ６Ｇ⁻集団は、単核の形態を有したことから、おそらくは単球／マクロファージであった（図３２Ｂ）。重要なことに、関節炎の誘導の間のＧＭ−ＣＳＦの関節内投与によって、ＳＴＡＴ５欠損マウスの滑膜区画での好中球の蓄積が効率良く回復したが（図３２Ｃ）、このことは、炎症を生じた関節への好中球の蓄積を媒介する際に、Ｔ_Ｈ細胞由来のＧＭ−ＣＳＦが重大な役割を持つこと示唆している。

好中球は、炎症の間リクルートされるが、そこでは、好中球と血管内皮細胞との間の複雑な相互作用が、好中球の接着と、炎症を生じた組織への循環系からの遊出とを方向付ける（KolaczkowskaおよびKubes、2013）。ｉｎｖｉｔｒｏの遊出アッセイでは、好中球の接着と、内皮細胞の単層を横断する遊走とが、ケモアトラクタントとしてのＧＭ−ＣＳＦによって有意に亢進され（図３３Ａおよび図３３Ｂ）、このことは、ＧＭ−ＣＳＦが、ＡＩＡにおいて、炎症を生じた関節への好中球のリクルートを媒介する可能性があることを示唆している。効果的な好中球のアポトーシスは、炎症の消散に決定的に重要である。しかし、滑膜炎では、好中球のアポトーシスは、生存の延長と炎症の持続という結果を伴い遅延する（Wrightら、２０１４年）。そのため、好中球の生存に及ぼすＧＭ−ＣＳＦの効果を試験したところ、ＧＭ−ＣＳＦが、好中球のアポトーシスの遅延に際し深い効能を有することが見出された（図３３Ｃ）。合わせると、これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦが、好中球のリクルートを媒介し、滑膜区画での好中球の生存を存続させ、滑膜炎の持続に寄与する可能性があることを示唆している。ＡＩＡにおける好中球の重大な役割を決定するために、Ｌｙ６Ｇに特異的な中和抗体（１Ａ８）を使用して、ｉｎｖｉｖｏで好中球を枯渇させた。中和抗体の投与の結果、ＡＩＡで、関節腫脹の有意な改善がもたらされた（図３２Ｄ）。したがって、Ｔ_Ｈ細胞由来のＧＭ−ＣＳＦによって媒介される好中球の蓄積は、ＡＩＡの発生に重要である。

実施例１４．ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄系細胞および滑膜線維芽細胞によるプロ炎症性サイトカインの産生を亢進する

サイトカインは、先天免疫と適応免疫との間のクロストークにおいて重要なメディエーターである。本明細書に示されるように、いくつかのプロ炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびＴＮＦ−α）は、ＲＡの病態形成に関連があり（ChoyおよびPanayi、２００１年）、ＳＴＡＴ５欠損ＡＩＡマウスの滑膜組織で有意に減少した（図２８Ｅおよび図３０Ａ〜図３０Ｃ）。観察されたサイトカインの減少の基礎を成す機構への洞察を高めるために、表面マーカーの示差的な発現に基づき滑膜細胞を異なる集団に分画することによって、それらのプロ炎症性サイトカインの細胞源を検討した（図３４Ａ）。ＣＤ４５^＋ＴＣＲβ^＋集団（Ｔ細胞）、ＣＤ４５^＋ＴＣＲβ⁻ＣＤ１１ｃ⁻ＣＤ１１ｂ^＋集団（殆どが単球／マクロファージ、および好中球）、ならびにＣＤ４５^＋ＴＣＲβ⁻ＣＤ１１ｃ^＋集団（樹状細胞）中のサイトカインのｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＬ−１７と同様に（対照として）、大部分が滑膜のＴ細胞によって産生され（図３４Ｂ）、このことは、ＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ_Ｈ細胞の重要性をさらに補強する。これに対して、ＩＬ−６およびＩＬ−１βは、骨髄系細胞、例えばＣＤ１１ｂ^＋集団およびＣＤ１１ｃ^＋集団によって主に産生された（図３４Ｂ）。ＴＮＦ−αは、３つ全ての集団によって発現され、Ｔ細胞では比較的存在量が低かった（図３４Ｂ）。上記に議論したように、ＣＤ１１ｂ^＋集団におけるＬｙ６ＣおよびＬｙ６Ｇの示差的な発現に基づき、Ｌｙ６Ｃ^ｌｏＬｙ６Ｇ^ｈｉ集団（好中球）およびＬｙ６Ｃ^ｈｉＬｙ６Ｇ⁻集団（単球／マクロファージ）をさらに分析したところ、単球／マクロファージは、おそらくは主なＩＬ−６産生体であったが、一方、好中球は、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのさらに良好な産生体であるものと思われた（図３４Ｃ）。これらの結果は、上記の知見と併せて、（図２８Ｅおよび図３０Ａ〜３０Ｃ）、Ｔ_Ｈ細胞によって分泌されるＧＭ−ＣＳＦが、滑膜炎中の骨髄系細胞から、プロ炎症性サイトカインの発現を引き出すという繋がりを指し示している。

ＩＬ−６およびＩＬ−１βの発現におけるＧＭ−ＣＳＦの制御機能を試験するために、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）および骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を培養し、ＧＭ−ＣＳＦを用いて刺激した。確かに、ＧＭ−ＣＳＦによる刺激は、ＩＬ−６とＩＬ−１βとの両方のｍＲＮＡ発現を、１時間以内に迅速に上方制御した（図３４Ｄおよび図３４Ｅ）。さらに、ＧＭ−ＣＳＦは、ＢＭＤＭからは投薬量依存的な様式で（図３４Ｆ）、お
よびＢＭＤＣからは低投薬量であっても（図３４Ｇ）、ＩＬ−６の分泌を顕著に増加させた。成熟ＩＬ−１βの分泌を誘導するために、ＬＰＳを用いて、ＢＭＤＭを６時間プライミングし、その間、異なる濃度のＧＭ−ＣＳＦを添加し、続いてＡＴＰにより刺激した。ＥＬＩＳＡにより測定すると、ＧＭ−ＣＳＦの添加によって、培養上清へのＩＬ−１βの分泌が有意に亢進した（図３４Ｈ）。滑膜の炎症の活発な役者である滑膜線維芽細胞（Muller-Ladnerら、２００７年）も、ＧＭ−ＣＳＦにより刺激すると、ＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現の増加を示した（図３４Ｉ）。ＧＭ−ＣＳＦのＴＮＦ−α発現に及ぼす誘導効果は、ＢＭＤＭ、ＢＭＤＣ、または滑膜線維芽細胞では観察されなかった（データ示さず）。関節炎の発生におけるＩＬ−６およびＩＬ−１βの機能的な重要性（ChoyおよびPanayi、２００１年）を考えると、Ｔ_Ｈ細胞により分泌されたＧＭ−ＣＳＦは、骨髄系細胞および滑膜線維芽細胞からＩＬ−６およびＩＬ−１βの発現を引き出すことをも介して、滑膜の炎症を媒介する可能性がある。
表１．Ｔ_Ｈ１細胞、Ｔ_Ｈ１７細胞、およびＴ_Ｈ−ＧＭ細胞で示差的に発現している遺伝子の概要

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本発明が、その例示的な実施形態を参照して具体的に示され、記載されている一方で、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更がその中でなされうることが、当業者によって理解されよう。

Claims

シグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）阻害剤を含む、患者の関節リウマチ治療用組成物であって、
前記患者が、ＴＮＦ−α療法に対し限定的な応答を示す、または応答しない患者であって、
前記阻害剤が、ピモジド、ＣＡＳ番号がＣＡＳ２８５９８６−３１−４である化合物、抗ＳＴＡＴ５アンタゴニスト抗体、ＳＴＡＴ５に対するｓｉＲＮＡ又はＳＴＡＴ５に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、組成物。
ＳＴＡＴ５阻害剤を含む、患者の関節リウマチ治療用組成物であって、
ＳＴＡＴ５阻害剤に、前記患者におけるＴ−ヘルパー（Ｔ_Ｈ−ＧＭ）細胞またはＣＤ４^＋前駆細胞を接触させるものであり、
前記患者が、ＴＮＦ−α療法に対し限定的な応答を示す、または応答しない患者であって、
前記阻害剤が、ピモジド、ＣＡＳ番号がＣＡＳ２８５９８６−３１−４である化合物、抗ＳＴＡＴ５アンタゴニスト抗体、ＳＴＡＴ５に対するｓｉＲＮＡ又はＳＴＡＴ５に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、組成物。
前記関節リウマチが、Ｔ_Ｈ−ＧＭ媒介性である、請求項１又は２に記載の組成物。
前記患者は、参照レベルと比べて、ＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−３の発現レベルが増加している患者である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
前記参照レベルが、健康なヒトから得られる発現レベルである、請求項４に記載の組成物。
前記患者におけるＳＴＡＴ５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−３のレベルが、前記参照レベルより、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％増加している、請求項４に記載の組成物。
前記Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞が、ＩＬ−７および活性化ＳＴＡＴ５の存在下でＣＤ４^＋前駆細胞から分化したものである、請求項２に記載の組成物。
前記Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞が、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を発現する、請求項２に記載の組成物。
前記Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞が、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスファミリーのメンバーｅ４０（ＢＨＬＨｅ４０）、プレプロエンケファリン（ＰＥＮＫ）、ＩＬ−２、セリン（またはシステイン）ペプチダーゼインヒビターのクレイドＢメンバー６ｂ（Ｓｅｒｐｉｎｂ６ｂ）、ニューリチン１（Ｎｒｎ１）、ステロイル−コエンザイムＡデサチュラーゼ１（Ｓｃｄ１）、またはホスホトリエステラーゼ関連Ｃ１ｑ様３（Ｐｔｅｒ）のうち１つまたは複数を過剰発現する、請求項２に記載の組成物。
前記Ｔ_Ｈ−ＧＭ細胞が、リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ａ（Ｌｙ６ａ）；ＣＤ２７；またはリンパ球セレクチン（Ｓｅｌｌ）のうち１つまたは複数を過小発現する、請求項２に記載の組成物。
ＳＴＡＴ５阻害剤を含む、ＴＮＦ−α非依存的な様式による患者の関節リウマチ治療用組成物であって、
前記患者が、ＴＮＦ−α療法に対し限定的な応答を示す、または応答しない患者であり、
前記阻害剤が、ピモジド、ＣＡＳ番号がＣＡＳ２８５９８６−３１−４である化合物、抗ＳＴＡＴ５アンタゴニスト抗体、ＳＴＡＴ５に対するｓｉＲＮＡ又はＳＴＡＴ５に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、組成物。