KR20120128492A

KR20120128492A - 골 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20120128492A
Application number: KR1020110046487A
Authority: KR
Inventors: 이진우; 정호선; 황지숙
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2011-05-17
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2012-11-27

Abstract

본 발명은 (a) STAT5A(Signal transducer and activator of transcription 5A)-인코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 STAT5B-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 STAT5A 또는 STAT5B의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 골 분화 촉진제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 STAT5A의 발현을 억제시키거나 또는 STAT5B의 발현을 촉진시키면 골 분화 촉진제로 판단된다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 STAT5A의 전사활성이 PPARγ와 RXRα에 의해 조절되며 STAT5B의 전사 활성이 C/EBPα와 C/EBPβ에 의해 조절된다. 또한, 본 발명의 STAT5A 및/또는 STAT5B의 억제는 지방세포 분화 억제를 초래하고, STAT5A의 억제는 골아세포의 분화를 촉진시키고 STAT5B의 억제는 골아세포의 분화를 일부분 억제시킨다. 따라서, 본 발명의 골 분화 촉진제을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 골 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로 이용될 수 있을 뿐 아니라, STAT5A(Signal transducer and activator of transcription 5A) 또는 STAT5B 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 지방세포 분화 억제용 조성물로 이용될 수 있다.

Description

골 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Bone Disorders}

본 발명은 지방세포 분화과정 및 골아세포 분화과정에서 STAT5A 및/또는 STAT5B의 기능, 그리고 이의 용도에 관한 것이다.

줄기세포(stem cells)는 인간의 신체 내 골, 뇌, 근육, 피부, 연골 등 모든 신체 기관으로 분화할 수 있는 세포로서, 분화 능력에 따라 배아줄기세포(embryonic stem cells)와 성체줄기세포(adult stem cells)로 나누어진다. 최근에 줄기세포를 이용한 세포치료법의 가능성을 토대로, 질병 치료의 새로운 패러다임이 제시되었다. 배아줄기세포는 성체줄기세포에 비해 다분화능을 보이지만 테라토마를 형성한다는 점과 윤리적인 문제로 인하여 성체줄기세포를 이용한 연구들이 많이 수행되고 있다. 성체줄기세포의 하나인 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)는 골수, 탯줄 등에서 분리하여 배양할 수 있으며 다양한 결체 조직으로 분화가 가능하여 골아세포, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포 등으로 분화 유도가 용이하고, 특히 중간엽 줄기세포는 골아세포, 지방세포, 연골세포들끼리 서로 교차분화가 가능하다. 골수에서 얻어진 중간엽 줄기세포는 지방세포와 골아세포 연골세포로 분화가 왕성하나 아직까지 분자 수준에서 분화 작용기전에 대한 연구는 부족하여 더 많은 연구가 필요한 실정이다.

골다공증(Osteoporosis)은 골수강의 골아세포가 감소하는 결과를 초래하는데 한번 감소된 골아세포는 다시 생성되지 않으며, 골아세포가 빠져나간 자리에 지방세포가 채워져 골밀도 감소를 유발하는 문제점을 가지고 있으며, 골아세포의 감소와 지방세포의 증가의 상호관계는 골수강에서 중간엽 줄기세포에 의한 골아세포 생산과 지방세포 생산의 균형이 깨어짐으로써 발생한다. 이후, 생쥐와 인간 골수기질세포를 이용하여 지방세포 분화 및 골아세포 분화 기작을 밝히기 위한 연구들이 활발히 진행되고 있다. 골아세포 표지 유전자인 Runx2, DLX5, OSTERIX, MSX2, OSTEOPONTIN, OSTEOCALCIN 등의 전사조절 레벨에서의 연구가 주를 이루고 있다. 시험관 밖에서 중간엽 줄기세포의 선택적인 분화는 화학물질, 성장인자, 사이토카인의 조합을 통하여 이루어지는 것으로 알려져 있다.

골화 유도 성장인자로 형질전환 성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β)와 인슐린-유사 성장인자(insuline-like growth factors, IGFs), 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factors, bFGFs)를 대표적으로 들 수 있으며, TGF-β는 정상세포와 종양-유발 상피세포에서 세포증식을 강력히 억제하고 지방세포 형성과정(adipogenesis), 근육형성과정(myogenesis), 혈구형성과정(hematopoiesis) 등을 억제하는 것으로 알려져 있지만, 골에서는 분화를 자극하는 촉진 인자로 알려져 있다.

bFGF는 인 비보 및 인 비트로에서 골 세포의 발생에서 중요한 역할을 수행하며, 재조합된 인간 bFGF는 골아전구 세포의 증식을 촉진하고, 쥐에서 골절 치유를 촉진하고 농도에 의존적으로 골의 양과 미네럴 양을 증가시키는 것으로 알려져 있으며, 골아세포의 증식에 관여하여 TGF-β와 같이 복합적인 골 재생 및 골 형성에 관여하는 것으로도 알려져 있으며, 여러 가지 전사인자 조절에 의해 골아세포 분화가 유도되는 것으로 알려져 있다. 그 중 Cbfa1(core-binding factor-1; AML-3, PEBP2αA)은 골 표현형(osteo-phenotype)을 유지하는데 주요 역할을 하며, 이 유전자는 골아세포 특이적인 전사인자로 처음 알려지게 되었으며, osteoprogenitor 세포에서 주요 역할을 하는 기본적인 HLH(helix-loop-helix) 전사인자로 TWIST가 있다. 인간 골육종 세포주인 SaOS2 세포주에서 이 전사인자의 과발현은 더 높은 osteoprogenitor 세포 표현형을 보이며, 이 전사인자를 억제시키면 alkaline phosphatase 활성과 제 1형 교원질(type I collagen) 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다. Msx2는 osteoprogenitor 세포의 기능에 크게 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이 유전자의 결손은 mice에서 skull의 bone ossification을 늦추고, Cbfa1 전사인자의 상위 조절 인자로 밝혀져 있다. 이처럼 골의 발생 및 형성에 관한 많은 연구들이 이루어지고 있지만, 골아세포 혹은 osteoprogenitor 세포에서 영향을 받는 단백 및 유전자에 관한 연구는 거의 이루어지지 않고 있다. 또한, 골다공증은 골아세포와 지방세포의 불균형으로 초래되는 것으로 알려져 있으므로 골다공증을 해결하기 위해 골아세포와 지방세포의 balancing을 이해하는 것이 가장 중요하다. 그러나, 현재까지 골아세포와 지방세포의 balancing에 관여하는 유전자는 거의 알려져 있지 않은 상태이며, 연구도 미비한 상태이다. 지방세포 분화과정은 전구세포(precursor cells)의 증식과 지방세포 리니지로의 분화 그리고 완전 분화(terminal differentiation) 등의 복잡한 과정을 거친다(MacDougald and Lane, 1995, Annu. Rev. Biochem. 345-373). 이러한 지방세포 분화과정에는 다양한 전사 유전자들의 cascade와 signal pathway등이 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, 지방세포에 중요한 조절유전자로는 peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ), CCAAT/enhancer-binding protein(C/EBP) family, wnt family, ADD/SREBP1, IGF and leptin among others(Chinetti et al., 2000, Inflamm. Res. 49,497-505.; Cowherd et al., 1999, Semin. Cell Dev. Biol. 10,3-10; Rangwala and Lazar, 2000, Annu. Rev. Nutr. 20,535-559.; Rosen and Spiegelman, 2000, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16,145-171.; Rosen et al., 2000Genes Dev. 14,1293-1307). 특히, C/EBPα, C/EBPβ and PPARγ 전사조절인자는 지방세포 분화과정동안 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 지방세포 분화과정 동안 몇 가지 단계를 거쳐 지방세포 분화과정이 일어난다. 지방세포 분화 촉진에 의해 C/EBPβ and δ가 유도되어 이틀동안 발현이 유지되며 그 이후에 C/EBPα and PPARγ를 조절하여 발현을 유도시킨다. 발현된 C/EBPα and PPARγ는 서로의 발현을 조절하고 C/EBPβ and δ의 발현이 줄어들게 되며 C/EBPα and PPARγ는 FABP4, leptin, adiponectin 등과 같은 지방세포 표지 유전자들의 발현을 조절한다(MacDougald and Lane, 1995; Rangwala and Lazar, 2000; Rosen et al., 2000). 그러나, 아직까지 C/EBPα 및 PPARγ, 그리고 FABP4, 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin) 등의 매개체 유전자(terminal marker genes)에 대해서는 아직까지 정확히 알려져 있지 않다. 몇몇의 연구에서는 지방세포 분화기간동안 STAT의 유전자 발현이 증가된다고 보고되었다. 마우스 3T3-L1 지방전구세포(preadipocyte)의 지방세포 분화기간 동안 STAT1과 STAT5의 발현이 증가하였으며, 반면에 인간 지방세포 분화기간 동안에는 STAT3과 STAT5의 발현이 성장 호르몬-매개된 시그널링에 의해 증가되는 것을 보고되었다(Floyd and Stephens, 2003; Harp et al., 2001; Matthews et al., 2007; Shang and Waters, 2003; Stephens et al., 1999).

그러나, 현재까지 골아세포 분화기간 동안 STAT5의 역할에 대해서는 알려져 있지 않다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 지방세포 분화과정(adipogenesis) 및 골아세포 분화과정(osteogenesis)을 효과적으로 조절할 수 있는 인자를 규명하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 STAT5A(Signal transducer and activator of transcription 5A)의 프로모터 부위 및 STAT5B의 프로모터 부위에 각각 PPARγ 및/또는 RXRα-반응성 전사조절서열 및 C/EBPα 및/또는 C/EBPβ-반응성 전사조절서열이 존재하며, 지방세포 분화과정 및 골아세포 분화과정 동안 STAT5A 및/또는 STAT5B의 발현 조절이 지방세포와 골아세포의 밸런스 유지에 중요하다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 골 분화 촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 골 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 지방세포 분화 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 C/EBPα 또는 C/EBPβ-반응성 전사조절서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 PPARγ 또는 RXRα-반응성 전사조절서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) STAT5A(Signal transducer and activator of transcription 5A)-인코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 STAT5B-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 STAT5A 또는 STAT5B의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 골 분화 촉진제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 STAT5A의 발현을 억제시키거나 또는 STAT5B의 발현을 촉진시키면 골 분화 촉진제로 판단된다.

본 발명자들은 지방세포 분화과정 및 골아세포 분화과정을 효과적으로 조절할 수 있는 인자를 규명하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 STAT5A의 프로모터 부위 및 STAT5B의 프로모터 부위에 각각 PPARγ 및/또는 RXRα-반응성 전사조절서열 및 C/EBPα 및/또는 C/EBPβ-반응성 전사조절서열이 존재하며, 지방세포 분화과정 및 골아세포 분화과정 동안 STAT5A 및/또는 STAT5B의 발현 조절이 지방세포와 골아세포의 밸런스 유지에 중요하다는 것을 확인하였다.

STAT(Signal transducer and activator of transcription) 패밀리의 전사인자는 세포 표면 수용체와 사이토카인 수용체들 간의 시그널링 링크를 제공하며 선택적인 유전자들의 프로모터들에 특이적인 반응 엘리먼트에 기능한다. 이제까지, 일곱 개의 포유동물 STAT 유전자들(STAT-1, -2, -3, -4, -5a, -5b 및 -6)이 동정되었으며, 이들 중 STAT5 전사인자는 세포 성장 및 분화, 그리고 유방 상피세포 및 림프조혈계(lymphohematopoietic system) 세포에서 세포 생존에 관여한다(Wakao, H., et al., Embo J., 13(9): 2182-91(1994)). 또한, STAT5는 정상 포유동물 상피세포 발생 및 분화에 필수적이다. STAT5A 및 STAT5B는 95% 이상의 아미노산 서열 상의 상동성을 가진다. 이들은 정상 상태(homeostatic conditions)에서는 세포질에서 휴면 상태로 존재하지만, 특정 자극[예컨대, IL(interleukin)-2, IL-3, IL-7, GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor), 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴, 등]에 따라 세포내 타이로신 키나제에 의해 인산화(STAT5A의 Tyr694 및 이에 상응하는 STAT5B의 Tyr699)에 의해 활성화되어 다이머 쌍(예컨대, 호모다이머 또는 헤테로 다이머)을 이루어 핵으로 이동하여 전사 활성인자(transcription activators)로서 DNA에 결합하여 기능한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 STAT5A 또는 STAT5B 단백질은 골아세포 분화과정 동안 현저하게 증가하였는데(참고: 도 5), 이는 골 분화 촉진제의 개발을 위해 이용될 수 있다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 골 분화 촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) STAT5A(Signal transducer and activator of transcription 5A)-인코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 STAT5B-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 STAT5A 또는 STAT5B의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 골 분화 촉진제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 STAT5A의 발현을 억제시키거나 또는 STAT5B의 발현을 촉진시키면 골 분화 촉진제로 판단된다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명 타겟(예컨대, STAT5A 또는 STAT5B)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 본 발명 타겟의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포는 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 포유동물로부터 유래된 세포이며, 보다 바람직하게는 줄기세포이고, 보다 더 바람직하게는 자가(autologous) 줄기세포 및 비자가(non-autologous) 줄기세포이며, 보다 더욱 더 바람직하게는 자가 중간엽 줄기세포이고, 가장 바람직하게는 골수-유래 중간엽 줄기세포이다. 상기 세포는 바람직하게는 초기배양 세포(primary cultured cells), 구축세포주(established cell line) 또는 종양세포이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포는 인간의 골수-유래 중간엽 줄기세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 포유동물은 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 뼈(bone), 연골(cartilage), 지방(fat), 힘줄(건), 신경 조직(nerve tissue), 섬유아세포(fibroblast) 및 근육 세포(muscle cell) 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 만능 전구세포(pluripotent progenitors)를 말한다. 상기 중간엽 줄기세포는 골수(bone marrow), 말초신경 혈액, 재대혈, 골막(periosteum), 진피(dermis) 및 중배엽 기원의 조직 등으로부터 분리되고 정제될 수 있다. 인간 중간엽 줄기세포는 다수의 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있는데, 고관절 또는 슬 대체술 도중에 퇴행성 관절염 환자로부터 수득된 대퇴골두 해면골편(femoral head cancellous bone pieces) 플러그(plugs), 및 장래 골수 이식술을 위해 수확될 골수를 가진 정상 공여자, 환자로부터 수득된 흡입된 골수 등으로부터 얻어질 수 있다. 중간엽줄기세포는 골수의 공급원에 따라(즉, 골편, 말초혈의 존재 등) 다수의 상이한 기계적 분리 방법에 의해 분리되며 이러한 분리방법들은 공지되어 있다. 중간엽세포의 분리과정에서 가장 결정적인 것은 특정하게 제조된 배지를 사용하는 것이다. 상기 배지는 분화없이 중간엽 줄기세포를 성장 가능케하고 배양 접시의 플라스틱 또는 유리 표면에 중간엽 줄기세포만의 직접 부착을 가능하게 하는 제제를 함유하고 있음을 특징으로 한다. 골수 시료에 극히 소량 존재하는 중간엽 줄기세포의 선택적인 부착을 가능하게 하는 배지를 사용함으로써, 골수에 존재하는 기타 세포(즉, 적혈구 및 백혈구, 기타 분화된 중간엽 세포 등)로 부터의 중간엽 줄기세포를 분리해 내는 것이 가능하다.

본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명의 타겟의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시험물질은 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 및 화학물질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(예컨대, STAT5A 또는 STAT5B mRNA 서열에 상응하는(corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(예컨대, STAT5A 또는 STAT5B mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.

본 명세서에서 siRNA를 언급하면서 사용되는 용어 “상보적”은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 siRNA가 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하는 것으로 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있으며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.

siRNA 말단 구조는 STAT5A 또는 STAT5B 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 명세서의 용어 “miRNA(microRNA)”는 21-25 뉴클레오타이드의 단일 가닥 RNA 분자로써, 타겟 mRNA의 파쇄 또는 해독단계에서의 억제를 통하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 조절물질이다. 이러한 miRNA는 두 단계의 프로세싱으로 이루어진다. 최초의 miRNA 전사체(primary miRNA)가 핵 안에서 Drosha라는 RNaseⅢ type 효소에 의해 70-90 염기 정도의 스템-루프 구조, 즉 pre-miRNA로 만들어지고, 이후 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)라는 효소에 의해 절단되어 21-25 염기의 성숙한 miRNA로 만들어진다. 이렇게 생성된 miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로써 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도한다. miRNAs는 다양한 생리학적 현상 및 질환에 관여한다.

본 발명에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 예컨대, 본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 STAT5A 또는 STAT5B에 상보적이고 STAT5A 또는 STAT5B mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, STAT5A 또는 STAT5B mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 STAT5A 발현의 하향-조절은 골아세포의 분화를 촉진시켰으며, STAT5B 발현의 하향-조절은 골아세포의 분화를 억제하였다(참고: 도 7).

이어, 시험물질이 처리된 세포에서 본 발명의 타겟의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 하기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 시험물질이 본 발명의 STAT5A의 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제시키거나 또는 STAT5B의 발현을 촉진시키면 골 분화 촉진제로 판정될 수 있다.

본 발명의 STAT5A 또는 STAT5B 유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시험물질을 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, STAT5A 또는 STAT5B 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. STAT5A 및 STAT5B 유전자-특이적 프라이머 세트는 서열목록 제1서열 및 제2서열에 예시된 뉴클레오타이드 서열에 포함된 서열이다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 STAT5A 또는 STAT5B 유전자의 발현량 변화를 측정한다.

또한, STAT5A 또는 STAT5B 단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, STAT5A 또는 STAT5B 단백질의 양의 변화는 면역염색, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 웨스턴 블롯팅, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 STAT5A 및 STAT5B의 아미노산 서열은 각각 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열에 기재되어 있다.

상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명은 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 타겟에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 추가적으로 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 타겟에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 과립형성 인자 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 타겟의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 STAT5A(Signal transducer and activator of transcription 5A) 유전자의 발현을 억제하거나, 또는 STAT5B 유전자의 발현을 촉진시키는 골 분화 촉진제를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 STAT5A(Signal transducer and activator of transcription 5A) 또는 STAT5B 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 물질을 포함하는 지방세포 분화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로써 상술한 본 발명의 STAT5A 또는 STAT5B를 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 골 분화 촉진제는 STAT5A의 발현을 억제하거나 또는 STAT5B의 발현을 증가시킴으로써, 골아세포의 분화과정을 촉진시키고(참고: 도 5 및 도 7), STAT5A 또는 STAT5B 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 물질은 지방세포 분화를 억제하였다(참고: 도 4).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 골 질환은 골다공증, 청소년 골다공증, 불완전 골형성증(osteogenesis imperfecta), 과골화증, 고칼슘혈증, 부갑상선 기능항진증, 골연화증, 용해성 골질환, 골괴사증, 뼈의 파젯병, 골 발생 질환, 골 골절, 류마티스 관절염에 의한 골 손실, 염증성 류마티스 관절염, 골수염, 전이성 골질환, 치주성 골 소실, 구루병, 암에 의한 골 손실 및 골의 노인성 손실을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 (a) 상술한 골 분화 촉진제의 약제학적 유효량, 또는 STAT5A 또는 STAT5B 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 물질의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 골 분화 촉진제의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양, 또는 STAT5A 또는 STAT5B 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 물질의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 피하 주입, 근육 주입, 경피 투여, 관절강내 주사, 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제5서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터로 이루어진 PPARγ 또는 RXRα-반응성 전사조절서열을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제6서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터로 이루어진 C/EBPα 또는 C/EBPβ-반응성 전사조절서열을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “프로모터”는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 재조합 발현벡터에서 리포터 유전자-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 PPARγ, RXRα, C/EBPα 또는 C/EBPβ 단백질이 결합하는 전사조절서열은 그의 다운스트림 방향에 리포터 유전자를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 PPARγ, RXRα, C/EBPα 또는 C/EBPβ 단백질이 결합하는 전사조절서열은 프로모터의 활성을 조사하기 위한 것으로서, 상기한 서열을 필수 구성요소로 한다. 필수 서열 중 리포터 유전자는 분석하고자 하는 프로모터의 전사활성에 따라 그 발현의 정도가 차이가 있게 되고, 이에 의해 발현이 되는 단백질의 활성 또는 양을 조사함으로써 프로모터의 전사활성을 용이하게 판단할 수 있게 해준다. 리포터 유전자로서 바람직하게는, 루시퍼라제의 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제의 유전자, β-갈락토시다제의 유전자, 사람의 성장 호르몬의 유전자, 녹색 형광단백질(green fluorescent protein) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 루시퍼라제 유전자이다.

리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 양은 루시퍼라제의 경우에는 de Wet J. et al, Mol. Cell Biol., 7:725-737(1987)에 개시된 방법, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제의 경우에는 Gorman C. et al, Mol. Cell Biol., 2:1044-1051(1982)에 개시된 방법, β-갈락토시다제의 경우에는 Hall C.V. et al, J. Mol. Appl. Genet., 2:101-109(1983)에 개시된 방법, 사람의 성장 호르몬의 경우에는 Selden R. et al., Mol. Cell Biol., 6:3173-3179(1986)에 개시된 방법, 녹색 형광단백질의 경우에는 Chalfie M. et al, Science, 263:802-805(1994)에 개시된 방법에 따라 측정될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 지방세포 분화과정 및 골아세포 분화과정에서 STAT5A 및/또는 STAT5B의 발현 패턴 및 기능, 그리고 이의 용도에 관한 것이다.

(b) 본 발명에 따르면, 본 발명의 STAT5A의 전사활성이 PPARγ와 RXRα에 의해 조절되며 STAT5B의 전사 활성이 C/EBPα와 C/EBPβ에 의해 조절된다.

(c) 본 발명의 STAT5A 및/또는 STAT5B의 억제는 지방세포 분화 억제를 초래한다.

(d) 또한, STAT5A의 억제는 골아세포의 분화를 촉진시키고 STAT5B의 억제는 골아세포의 분화를 억제시킨다.

(e) 따라서, 본 발명의 골 분화 촉진제을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 골 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로 이용될 수 있을 뿐 아니라, STAT5A(Signal transducer and activator of transcription 5A) 또는 STAT5B 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 지방세포 분화 억제용 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 중간엽 줄기세포의 지방세포 분화기간 동안 STATs 단백질과 인산화된 STATs 단백질의 발현을 조사한 결과이다. 도 1A는 지방세포 분화기간동안 STATs 단백질의 변화를 웨스턴 방법을 이용하여 관찰한 결과이다. 도 1B는 인산화된 STATs 단백질의 발현을 웨스턴 방법을 이용하여 관찰한 결과이다. 도 1C는 중간엽 줄기세포의 지방세포 분화기간 동안 C/EBPα가 STAT5B의 프로모터에 3일째와 4일째에 결합하는 것을 보여주는 ChIP 실험 결과이다.
도 2는 루시퍼라제 어세이를 이용하여 STAT5A와 STAT5B의 전사활성을 조절하는 인자를 조사한 결과이다. 도 2A는 C/EBPα와 C/EBPβ에 의해 STAT5A와 STAT5B의 전사활성이 조절되는 지를 나타내는 결과이며, 도 2B는 PPARγ와 RXRα에 의해 STAT5A와 STAT5B의 전사활성이 조절되는 지를 조사한 결과이다.
도 3은 STAT5A와 STAT5B의 전사활성 위치를 조사한 결과로, 각각의 프로모터 부위에 대한 다양한 크기의 프로모터 컨스트럭트를 이용하여 루시퍼라제 어세이를 실시하였다.
도 4는 중간엽 줄기세포의 지방세포 분화기간 동안 STATs 단백질의 발현 패턴을 조사한 결과이다. 도 4A는 지방세포 분화기간 동안 C/EBPβ와 PPARγ를 억제시킨 후 지방세포로의 분화능을 오일 레드 o 염색을 이용하여 관찰하였다. 도 4B는 도 4A와 동일한 군에서 단백질을 추출하여 다양한 지방세포 표지 유전자들의 발현을 웨스턴 블랏팅으로 조사한 결과이다. 도 4C는 지방세포 분화기간 동안 STAT5A와 STAT5B를 각각 과다발현시킨 후 지방세포로의 분화능을 관찰하기 위해 오일 레드 o 염색을 실시한 결과이다. 도 4D는 지방세포 분화기간 동안 STAT5A와 STAT5B의 발현을 억제시킨 후 지방세포로의 분화능을 관찰하기 위해 오일 레드 o 염색을 실시한 결과이다. 도 4E는 중간엽 줄기세포의 지방세포 분화기간 동안 STAT5A와 STAT5B의 발현을 억제시킨 후 지방세포로의 분화능을 관찰하기 위해 오일 레드 o 염색을 실시한 결과이다. 도 4F는 도 4D와 동일한 군에서 단백질을 추출하여 다양한 지방세포 표지 유전자들의 발현을 웨스턴 블랏팅으로 조사한 결과이다.
도 5는 골아세포 분화기간 동안 STATs 단백질의 발현을 조사한 결과이다. 아래쪽 패널은 골아세포로의 분화가 유도되었는 지를 알아보기 위해, 골아세포로 14일 동안 분화를 유도 후 본 코사 염색을 실시하였다.
도 6은 다양한 골아세포 표지 유전자들의 전사활성을 조사한 결과로, 루시퍼라제 어세이를 이용하여 조사하였다.
도 7은 골아세포 분화기간 동안 STAT5A와 STAT5B의 작용을 조사한 결과이다. STAT5A 및 STAT5B에 대한 RNAi를 각각 50 μM로 처리한 후 14일 동안 골아세포로 분화를 유도하였다. 이후 골아세포 분화를 확인하기 위해, 알리자린 레드 S 염색 및 본 코사 염색을 실시하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

중간엽 줄기 세포의 일차배양

성인 공여자의 장골로부터 얻은 골수 조직으로부터 퍼콜 농도구배 방법을 이용하여 성인 중간엽 줄기세포들을 수집한 후, 10% 우태아 혈청(Gibco, 미국)과 1% 항생제-항균제 용액(Gibco, 미국)이 첨가된 DMEM-LG(Dulbeccos modified eagles medium-low glucose; Gibco, 미국)에서 일차배양을 하였다. 이후, 상기 줄기세포가 세포 용기(75 cm²)에 90 % 이상의 컨플루언시에 도달할 때까지 계대배양시켰으며, 세포 배양액은 3일에 한 번씩 교체하였다.

중간엽 줄기세포로부터 분리된 clone의 지방세포 및 골아 세포로의 분화 유도

배양된 clone 세포들을 지방세포로의 분화를 유도하기 위해, clone 세포들이 플레이트에 꽉 차고 이틀이 지난 후 지방세포 분화 배양액(10% 우태아 혈청, 1% 항생제-항균제 용액, 0.5 mM 이소뷰틸-메틸크산틴(Sigma, 미국), 1 μM 덱사메타손(Sigma, 미국), 5 ㎍/ml 인슐린(Sigma, 미국), 200 μM 인도메타신(Sigma, 미국)을 첨가한 DMEM-LG)을 첨가한 후 14일 동안 배양하였으며 3일에 한 번씩 신선한 분화 배양액으로 교체하였다. 성인 중간엽 줄기세포에서 중간엽 줄기세포를 골아세포로 분화유도하기 위하여 골아세포 분화 배양액(10% 우태아 혈청, 1% 항생제-항균제 용액, 100 nM 덱사메타손, 10 mM β-글라이세로포스페이트(Sigma, 미국), 50 ㎍/㎖ 아스코르빈산-2-포스페이트(Sigma, 미국)를 첨가한 DMEM-LG)을 첨가하여 14일 동안 배양하였다. 배양 후, 본 코사(Von kossa) 염색을 실시하였다.

중간엽 줄기세포의 지방세포 및 골아세포로의 분화 과정동안 STATs 유전자의 단백질 변화 관찰

중간엽 줄기세포를 지방세포와 골아세포로 분화 유도 후 STATs 유전자의 단백질 발현을 관찰하기 위하여 웨스턴 블랏을 실시하였다. 분화시킨 세포를 용해 완충액(0.5% deoxycholic acid(Sigma, 미국), 150 mM NaCl(Sigma, 미국), 1% NP-40(Sigma, 미국), 0.1% SDS(Sigma, 미국), 50 mM Tris-Cl(Sigma, 미국)을 포함하는 25 mM Tris-HCl(pH 7.4)에 부유시켜 세포 균질액을 만든 뒤, Bradford 방법으로 단백질 정량을 실시하였다. 세포 추출액을 12% 폴리아크릴아마이드 젤(폴리아크릴아마이드:비스-아크릴아마이드(Sigma, 미국) = 29:1)을 사용하여 130 V에서 2시간 동안 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 웨스턴 블랏터(Western blotter; Hoefer, 미국)로 3시간 동안 350 mA의 전류를 흘려 단백질들을 젤로부터 나이크로셀룰로오스 막(Amersham Pharmacia, 미국)으로 옮긴 다음 나이트로셀룰로오스 필터를 5% 탈지유를 함유한 1×TBST 용액(100 mM Tris(pH 7.5), 1.5 M NaCl, 0.5% Tween-20(Sigma, 미국)에서 1시간 동안 블랏킹하였다. 상기 나이크로셀룰로오스 막에 일차항체(Becton Dickson, 미국)를 실온에서 3시간 동안 부착시킨 다음 1× TBST로써 세척한 뒤 이차항체를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 부착시켰다. 이후, ECL 웨스턴 블랏팅 검출 키트(Amersham Pharmacia, 미국)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 막에 용액을 첨가하고 플라스틱 필름으로 덮어준 뒤 X-ray 필름을 사용하여 현상하였다.

STAT5A와 STAT5B의 루시퍼라제 어세이(luciferase assay)를 이용한 전사활성 측정

HELA 세포를 배양한 후 STAT5A와 STAT5B의 전사활성을 촉진시키는 유전자의 발현을 알아보기 위하여 루시퍼라제 어세이(Promega, 미국)를 실시하였다. pGL3B-STAT5A 프로모터(약 1.5 kb)-루시퍼라제 컨스트럭트와 pGL3B-STAT5B 프로모터(약 1.5 kb)-루시퍼라제 컨스트럭트를 각각 DLX5, MSX2, STAT5A 과다발현 벡터와 함께 리포펙타민 2000(Invitrogen, 미국)를 이용하여 세포 안으로 집어넣은 후 이틀 후에 세포로부터 단백질을 추출하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

siRNA를 이용한 STAT5A와 STAT5B의 억제

STAT5A와 STAT5B 유전자의 발현을 억제시키기 위하여 각 유전자에 특이적인 siRNA를 합성한다. 합성된 siRNA를 이용하여 중간엽 줄기세포에 리포좀을 이용하여 세포 안으로 삽입 후 골아세포 분화 배지에 세포를 14일 동안 배양한다.

중간엽 줄기세포의 골아세포 유도 및 분화 확인

배양 24시간 후, 골분화 배지를 첨가하여 14일 동안 배양하였다. 3일 간격으로 분화 배지를 교체하였으며, 아스코르브산은 매일 첨가하였다. 골분화 유도를 확인하기 위하여 다음과 같은 방법(본 코사 염색)으로 염색하였다: 14일 동안 골아세포로 분화 유도된 세포들을 메탄올:아세톤(1:1) 고정 용액(Sigma, 미국)에 30초 동안 고정하였다. 고정된 세포들을 증류수로 세척한 후, 2% 실버 나이트레이트(silver nitrate; Sigma, 미국) 용액을 각 웰에 첨가하여 상온에서 빛을 차단한 채 30분 동안 반응시켰다. 반응시킨 세포를 증류수에 세척한 후, 30분 동안 강한 빛(36 watt light bulb)에 노출시켰다. 약 30분 후, 염색된 세포는 칼슘염이 갈색-검은색으로 염색되었다. 이후, 칼슘 침착량 정도를 현미경하에서 관찰하였다.

중간엽 줄기세포의 지방세포 유도 및 분화 확인

배양 24시간 후, 지방세포 분화배지를 첨가하여 14일 동안 배양하였다. 분화배지는 3일 간격으로 교체하였다. 14일 동안 지방세포로 분화 유도된 세포들을 10% 포르말린-중성액(formalin-neutral buffer; Sigma, 미국)에 30분 동안 고정시킨 후 증류수로 세척하였다. 그 다음, 60% 이소프로판올로 5분 동안 방치한 후, 0.18%의 오일 레드 O(Sigma, 미국) 용액으로 5-30분 동안 염색하였다. 증류수로 다시 세척한 후, 지방세포로 분화 유도된 세포들을 현미경 하에서 관찰하였다.

실험결과

중간엽 줄기세포를 지방세포로 분화 유도후 지방세포 분화기간(adipogenesis)동안 STAT 유전자들의 발현을 관찰하였다. STAT5의 단백질과 인산화된 STAT5 단백질 발현이 증가하는 것을 관찰하였다. 이를 통해, 지방세포 분화기간동안 STAT5가 중요한 역할을 할 것으로 예상하였다(도 1).

지방세포 분화기간동안 STAT5A와 STAT5B의 발현을 조절하는 인자를 찾기 위해, 루시퍼라제 어세이를 통해 C/EBPα, C/EBPβ 및 PPARγ에 의한 전사조절을 알아보았다. 그 결과, C/EBPβ와 C/EBPα는 STAT5B의 전사 발현을 조절하며, PPARγ는 STAT5A의 전사발현을 조절하는 것을 관찰하였다. 또한, CHIP 어세이를 수행하여 루시퍼라제 결과와 동일하게, C/EBPβ와 C/EBPα 단백질이 STAT5B 프로모터에 결합하며, PPARγ 단백질이 STAT5A 프로모터에 결합하는 것을 관찰하였다(도 2).

STAT5A 프로모터에 PPRE 결합 사이트를 알아보기 위하여, STAT5A의 5’-결실 컨스트럭트(deletion construct)를 만든 후 루스퍼라제 활성을 측정한 결과, -108 결실 컨스트럭트에서 전사 활성이 감소하는 것을 관찰하였으며, -403에서 -108 사이에 PPRE 결합 사이트가 있는 것을 확인할 수 있었다. STAT5B 프로모터에 C/EBP결합 사이트를 알아보기 위하여 STAT5B의 5’-결실 컨스트럭트를 만든 후 루스퍼라제 활성을 측정한 결과, -118 결실 컨스트럭트에서 전사 활성이 감소하는 것을 관찰하였으며, -190에서 -118사이에 C/EBP결합 사이트가 있는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

STAT5A와 STAT5B의 지방세포 기간동안 기능을 알아보기 위하여 STAT5A와 STAT5B의 발현을 siRNA를 이용하여 억제 후 지방세포로의 분화를 유도하였다. STAT5A가 억제되었을 때 지방세포 분화가 완벽히 억제되었으며, STAT5B는 부분적으로 지방세포 분화를 억제하였다(도 4).

골아세포 분화과정 동안 STATs의 발현양상을 보기 위해, 14일 동안 분화를 시킨 후 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 분화기간 동안 STAT1, STAT2, STAT3, STAT4에서는 발현정도가 변화를 보이지 않았지만, STAT5A와 STAT5B는 대조군에 비해 발현정도가 증가되는 것을 보여주었다. 이 결과, STAT5A와 STAT5B가 골 분화과정 동안 중요한 역할을 할 것이라는 가설을 세울 수 있었다(도 5).

골 분화와 관련된 전사인자가 STAT5A의 전사활성에 어떤 영향을 주는지 알아보기 위해, 루시퍼라제 어세이 실험을 하였다. 리포터 벡터인 STAT5A에 과다발현 벡터인 STAT5A와 DLX5, MSX2를 삽입하였다. MSX2와 STAT5A는 STAT5A 의 전사활성에 아무런 변화를 주지 못하였다. DLX5는 STAT5A 프로모터에 결합하여 전사활성을 약 8배 가량 활성화시켰다. DLX5-과다발현 벡터는 STAT5A 리포터 벡터 뿐 아니라, 다른 골 분화와 관련된 유전자인 MSX2, Osterix의 전사활성을 증가시켜주었는데(도 6), 이는 DLX5가 STAT5A의 전사활성에 직접적으로 조절한다는 것을 의미한다.

골 분화기간동안 STAT5A와 STAT5B의 역할을 알아보기 위해 RNAi 실험을 수행하였다. 웨스턴 블랏팅을 통해 STAT5A와 STAT5B가 각각 억제되는 것을 확인하였고, RNAi 처리 후 14일간 분화시키고 본 코사 염색 및 알리자린 레드 S(Alizarin red S) 염색(Sigma, 미국)을 통해 분화 정도를 조사하였다. STAT5A의 발현을 억제시켰을 경우 대조군과 비교하여 골 분화가 촉진되었고, STAT5B의 발현을 억제시켰을 경우에는 골아세포 분화가 조금 억제되었으나 거의 변화가 없는것을 관찰 하였다(도 7).

추가논의사항

본 연구에서는 STAT5A와 STAT5B의 단백질 발현이 지방세포기간동안 증가한다는 것을 관찰하였으며, C/EBPα와 C/EBPβ에 의해 STAT5B의 전사 활성이 조절되며 PPARγ와 RXRα에 의해 STAT5A의 전사활성이 조절된다는 것을 관찰하였다. 지방세포 분화기간동안 STAT5A의 발현이 억제되면 지방세포의 분화가 완전히 억제되며 STAT5B의 발현이 억제되면 지방세포 분화가 일부 억제된다는 것을 관찰하였다. 이것으로 보아 지방세포 분화기간동안 STAT5A는 지방세포기간동안 중요한 역할을 하면 STAT5B는 보조적인 역할을 할 것으로 예상된다. 또한 지방세포 분화기간동안 STAT5A의 역할과는 반대로 골아세포 분화기간동안 STAT5A의 발현이 억제되면 골아세포 분화가 더욱 촉진된다는 것을 관찰하였다. 이것은 골아세포와 지방세포의 분화사이에서는 STAT5A가 밸런싱을 조절하는 중요한 인자로 작용할 수 있다는 것을 명시한다.

기존의 지방세포 분화기간동안에는 C/EBPβ의 발현이 촉진되면 하위 조절유전자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현이 촉진되면 하위 유전자들의 발현이 조절되는 것으로 알려져 있다. 본 결과에서는 지방세포 분화기간동안 STAT5A는 PPARγ와 RXRα에 의해 전사 활성이 촉진되며 STAT5B는 C/EBPα와 C/EBPβ에 의해 전사활성이 촉진되었다. 그러나 STAT5B의 발현을 억제시키면 지방세포 분화가 일부분만 억제되는 것으로 보아 기존의 지방세포 분화기간동안 유전자 조절 과정에서 C/EBPβ에 의해 지방세포 분화 신호가 시작되면 PPARγ와 C/EBPα의 발현이 촉진되면 STAT5A의 발현이 촉진되면서 지방세포 분화가 유도된다는 것을 알수 있었다. 그러나 STAT5A를 억제하면 PPARγ의 발현이 줄어드는 것으로 보아 STAT5A와 PPARγ는 서로 전사활성을 조절할 것으로 예상된다. 실제로 한 연구에서 STAT5A가 PPARγ의 전사활성을 촉진시킨다는 결과로 보아 STAT5A와 PPARγ는 상호보완적으로 서로의 전사활성을 조절할 수 있을 것이다.

비만, 당뇨, 골다공증을 이해하기 위해서는 중간엽 줄기세포에서 지방세포와 골아세포의 분화조절을 이해하는 것이 필요하다. 본 연구에서 골아세포 분화 기간 동안 STAT5A와 STAT5B가 시간이 지나면서 점차 증가하였다. STAT5A를 억제하면 골 분화가 촉진 되었다. 또한 DLX5가 STAT5A 전사활성에 직접적으로 조절하는 것을 보았다. 이 결과, STAT5A와 STAT5B가 골 분화 기간 동안 필요한 전사인자라는 것을 알았고, 더 나아가 STAT5A와 STAT5B가 특정 골아 세포 마커유전자와의 조절 관계를 찾아야 할 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Bone Disorders <130> PN110039 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2379 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atggcgggct ggattcaggc ccagcagctt cagggagatg ccctgcgcca gatgcaagtg 60 ttgtatgggc agcatttccc catcgaggtc cggcactacc tggcccagtg gatcgagagc 120 cagccgtggg atgctattga cttggataat ccccaggacc gaggtcaggc cacccaactc 180 ctggagggcc tggtgcagga gctgcagaag aaggcggagc accaggtggg ggaagatggg 240 tttttgctga agatcaagct ggggcactat gccacacagc tccagaacac gtatgaccgc 300 tgtcccatgg agctggttcg ctgtatccgt cacattctgt acaacgaaca gaggctggtt 360 cgcgaagcca acaattgcag ctcccctgct ggtgtcctgg ttgacgccat gtcccagaag 420 caccttcaga tcaaccaaag gtttgaggag ctgcgcctga tcacacagga cacggagaac 480 gagctgaaga agctgcagca gacccaagag tacttcatca tccagtacca ggagagcctg 540 cggatccaag ctcagtttgc ccagctgggc cagctgaacc cccaggagcg catgagcagg 600 gagacggccc tccagcagaa gcaagtgtcc ctggagacct ggctgcagcg agaggcacag 660 acactgcagc agtaccgagt ggagctggct gagaagcacc agaagaccct gcagctgctg 720 cggaagcagc agaccatcat cctggacgac gagctgatcc agtggaagcg gagacagcag 780 ctggccggga acgggggtcc ccccgagggc agcctggacg tgctgcagtc ctggtgtgag 840 aagctggccg agatcatctg gcagaaccgg cagcagatcc gcagggctga gcacctgtgc 900 cagcagctgc ccatcccagg ccccgtggag gagatgctgg ctgaggtcaa cgccaccatc 960 acggacatca tctcagctct ggtcaccagc acgttcatca tcgagaagca gcctcctcag 1020 gtcctgaaga cccagaccaa gtttgcggcc accgtgcgcc tgctggtggg gggaaagctg 1080 aatgtgcaca tgaacccccc gcaggtgaag gcgaccatca tcagcgagca gcaggccaag 1140 tccctgctca agaatgagaa cacccgcaat gagtgcagcg gcgagatcct gaacaactgt 1200 tgcgtcatgg agtaccacca ggccactggc acgctcagcg cccacttcag aaacatgtca 1260 ctgaaaagaa tcaagcgcgc cgacaggcgt ggtgcagagt cggtgacgga ggagaagttc 1320 acagtcctgt ttgagtctca gttcagcgtt ggcagcaacg agctggtgtt ccaggtgaag 1380 accctgtccc tccctgtggt cgttatcgtc catggcagcc aggaccacaa tgctactgcc 1440 accgtgctgt gggacaatgc ctttgctgag ccgggcaggg tgccatttgc tgtgcctgac 1500 aaggtgctgt ggccgcagct gtgtgaagcg ctcaacatga aattcaaggc tgaagtacag 1560 agcaaccggg gcttgaccaa agagaacctc gtgttcctgg cacagaaact gttcaacatc 1620 agcagcaacc acctcgagga ctacaacagc atgtctgtgt cctggtccca gttcaaccgg 1680 gagaacttgc ccggctggaa ctacaccttc tggcagtggt tcgacggggt gatggaggtg 1740 ctgaagaagc accataagcc ccattggaat gatggggcta tcctgggttt cgtgaacaag 1800 caacaggccc acgacctgct catcaacaag ccggacggga ccttcctgct gcgcttcagt 1860 gactcggaaa tcgggggcat caccattgct tggaagtttg actctccgga ccgaaacctc 1920 tggaatctga agccattcac gacgcgagat ttctccattc ggtccctggc cgaccggctg 1980 ggggacctga actaccttat ctacgtgttc ccagaccgac ccaaggacga ggtctttgcc 2040 aagtattaca ctcctgtact tgcgaaagca gttgacggat acgtgaagcc acagatcaag 2100 caagtggtcc ctgagttcgt caatgcatcc acagatgccg gagccagcgc cacctacatg 2160 gaccaggctc cttccccagt cgtgtgccct caacctcact acaacatgta cccacccaac 2220 cctgaccctg tccttgacca agatggcgag tttgacctgg atgagagcat ggatgttgcc 2280 aggcacgtgg aagaactttt acgccggccc atggacagtc tcgacgcccg cctctcccca 2340 cctgctggtc tcttcacctc cgctagaagc tccctgtcc 2379 <210> 2 <211> 2358 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 atggctatgt ggatacaggc tcagcagctc cagggcgatg cccttcacca gatgcaggcc 60 ttgtacggcc agcatttccc catcgaggtg cgacattatt tatcacagtg gatcgaaagc 120 caagcctggg actcaataga tcttgataat ccacaggaga acattaaggc cacccagctc 180 ctggagggcc tggtgcagga gctgcagaag aaggcggagc accaggtggg ggaagatggg 240 tttttgctga agatcaagct ggggcactat gccacacagc tccagagcac gtacgaccgc 300 tgccccatgg agctggttcg ctgtatccgg cacattctgt acaacgaaca gaggctggtt 360 cgcgaagcca acaacggcag ctctccagct ggaagtcttg ctgacgccat gtcccagaag 420 caccttcaga tcaaccaaac gtttgaggag ctgcgcctga tcacacagga cacggagaac 480 gagctgaaga agctgcagca gacccaagag tacttcatca tccagtacca ggagagcctg 540 cggatccaag ctcagtttgc ccagctggga cagctgaacc cccaggagcg catgagcagg 600 gagacggccc tccagcagaa gcaagtgtcc ctggagacct ggctgcagcg agaggcacag 660 acactgcagc agtaccgagt ggagctggct gagaagcacc agaagaccct gcagctgctg 720 cggaagcagc agaccatcat cctggacgac gagctgatcc agtggaagcg gagacagcag 780 ctggccggga acgggggtcc ccccgagggc agcctggacg tgctgcagtc ctggtgtgag 840 aagctggccg agatcatctg gcagaaccgg cagcagatcc gcagggctga gcacttgtgc 900 cagcagctgc ccatcccagg ccccgtggag gagatgctgg ctgaggtcaa cgccaccatc 960 acggacatca tctcagccct ggtcaccagc acgttcatca tcgagaagca gcctcctcag 1020 gtcctgaaga cccagaccaa gtttgcagcc accgtgcgcc tgctggtggg ggggaagctg 1080 aatgtgcaca tgaacccccc gcaggtgaag gcgaccatca tcagcgagca gcaggccaag 1140 tccctgctca agaatgagaa cacccgcaat gattacagcg gcgagatcct gaacaactgt 1200 tgcgtcatgg agtaccacca ggccactggc acactcagcg cccacttcag aaacatgtcc 1260 ctgaaacgaa tcaagaggtc tgaccgccgt ggggcagagt cagtaacgga agagaagttc 1320 acgatcctgt ttgactcaca gttcagcgtc ggtggaaacg agctggtctt tcaagtcaag 1380 accttgtcgc tcccggtggt ggtgattgtt cacggcagcc aggacaacaa tgccacagcc 1440 actgtcctct gggacaacgc ctttgcagag cctggcaggg tgccatttgc cgtgcctgac 1500 aaggtgctgt ggccgcagct gtgtgaagcg ctcaacatga aattcaaggc tgaagtacag 1560 agcaaccggg gcttgaccaa ggagaacctc gtgttcctgg cacagaaact gttcaacatc 1620 agcagcaacc acctcgagga ctacaacagc atgtccgtgt cctggtccca gttcaaccgg 1680 gagaatttgc caggacggaa ttacactttc tggcagtggt ttgatggcgt gatggaagta 1740 ttgaaaaaac atctcaagcc tcactggaat gatggggcta tcctgggttt cgtgaacaag 1800 caacaggccc acgacctgct catcaacaag ccagacggga ccttcctgct gcgcttcagc 1860 gactcggaaa tcgggggcat caccattgct tggaagtttg actctcagga gagaatgttt 1920 tggaatctga tgccttttac cactagagac ttctctatcc ggtccctcgc tgaccgcctg 1980 ggggacctga attacctcat atatgtgttt cctgatcggc caaaggatga agtatattct 2040 aagtactaca caccggtccc ctgtgagccc gcaactgcga aagcagctga cggatacgtg 2100 aagccacaga tcaagcaggt ggtccccgag tttgcaaatg catccacaga tgctgggagt 2160 ggcgccacct acatggatca ggctccttcc ccagtcgtgt gccctcaggc tcactacaac 2220 atgtacccac ccaacccgga ctccgtcctt gataccgatg gggacttcga tctggaagac 2280 acgatggacg tggcgcggcg cgtggaagag ctcttaggcc ggcccatgga cagtcagtgg 2340 atccctcacg cacagtca 2358 <210> 3 <211> 793 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Ala Gly Trp Ile Gln Ala Gln Gln Leu Gln Gly Asp Ala Leu Arg 1 5 10 15 Gln Met Gln Val Leu Tyr Gly Gln His Phe Pro Ile Glu Val Arg His 20 25 30 Tyr Leu Ala Gln Trp Ile Glu Ser Gln Pro Trp Asp Ala Ile Asp Leu 35 40 45 Asp Asn Pro Gln Asp Arg Gly Gln Ala Thr Gln Leu Leu Glu Gly Leu 50 55 60 Val Gln Glu Leu Gln Lys Lys Ala Glu His Gln Val Gly Glu Asp Gly 65 70 75 80 Phe Leu Leu Lys Ile Lys Leu Gly His Tyr Ala Thr Gln Leu Gln Asn 85 90 95 Thr Tyr Asp Arg Cys Pro Met Glu Leu Val Arg Cys Ile Arg His Ile 100 105 110 Leu Tyr Asn Glu Gln Arg Leu Val Arg Glu Ala Asn Asn Cys Ser Ser 115 120 125 Pro Ala Gly Val Leu Val Asp Ala Met Ser Gln Lys His Leu Gln Ile 130 135 140 Asn Gln Arg Phe Glu Glu Leu Arg Leu Ile Thr Gln Asp Thr Glu Asn 145 150 155 160 Glu Leu Lys Lys Leu Gln Gln Thr Gln Glu Tyr Phe Ile Ile Gln Tyr 165 170 175 Gln Glu Ser Leu Arg Ile Gln Ala Gln Phe Ala Gln Leu Gly Gln Leu 180 185 190 Asn Pro Gln Glu Arg Met Ser Arg Glu Thr Ala Leu Gln Gln Lys Gln 195 200 205 Val Ser Leu Glu Thr Trp Leu Gln Arg Glu Ala Gln Thr Leu Gln Gln 210 215 220 Tyr Arg Val Glu Leu Ala Glu Lys His Gln Lys Thr Leu Gln Leu Leu 225 230 235 240 Arg Lys Gln Gln Thr Ile Ile Leu Asp Asp Glu Leu Ile Gln Trp Lys 245 250 255 Arg Arg Gln Gln Leu Ala Gly Asn Gly Gly Pro Pro Glu Gly Ser Leu 260 265 270 Asp Val Leu Gln Ser Trp Cys Glu Lys Leu Ala Glu Ile Ile Trp Gln 275 280 285 Asn Arg Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu His Leu Cys Gln Gln Leu Pro 290 295 300 Ile Pro Gly Pro Val Glu Glu Met Leu Ala Glu Val Asn Ala Thr Ile 305 310 315 320 Thr Asp Ile Ile Ser Ala Leu Val Thr Ser Thr Phe Ile Ile Glu Lys 325 330 335 Gln Pro Pro Gln Val Leu Lys Thr Gln Thr Lys Phe Ala Ala Thr Val 340 345 350 Arg Leu Leu Val Gly Gly Lys Leu Asn Val His Met Asn Pro Pro Gln 355 360 365 Val Lys Ala Thr Ile Ile Ser Glu Gln Gln Ala Lys Ser Leu Leu Lys 370 375 380 Asn Glu Asn Thr Arg Asn Glu Cys Ser Gly Glu Ile Leu Asn Asn Cys 385 390 395 400 Cys Val Met Glu Tyr His Gln Ala Thr Gly Thr Leu Ser Ala His Phe 405 410 415 Arg Asn Met Ser Leu Lys Arg Ile Lys Arg Ala Asp Arg Arg Gly Ala 420 425 430 Glu Ser Val Thr Glu Glu Lys Phe Thr Val Leu Phe Glu Ser Gln Phe 435 440 445 Ser Val Gly Ser Asn Glu Leu Val Phe Gln Val Lys Thr Leu Ser Leu 450 455 460 Pro Val Val Val Ile Val His Gly Ser Gln Asp His Asn Ala Thr Ala 465 470 475 480 Thr Val Leu Trp Asp Asn Ala Phe Ala Glu Pro Gly Arg Val Pro Phe 485 490 495 Ala Val Pro Asp Lys Val Leu Trp Pro Gln Leu Cys Glu Ala Leu Asn 500 505 510 Met Lys Phe Lys Ala Glu Val Gln Ser Asn Arg Gly Leu Thr Lys Glu 515 520 525 Asn Leu Val Phe Leu Ala Gln Lys Leu Phe Asn Ile Ser Ser Asn His 530 535 540 Leu Glu Asp Tyr Asn Ser Met Ser Val Ser Trp Ser Gln Phe Asn Arg 545 550 555 560 Glu Asn Leu Pro Gly Trp Asn Tyr Thr Phe Trp Gln Trp Phe Asp Gly 565 570 575 Val Met Glu Val Leu Lys Lys His His Lys Pro His Trp Asn Asp Gly 580 585 590 Ala Ile Leu Gly Phe Val Asn Lys Gln Gln Ala His Asp Leu Leu Ile 595 600 605 Asn Lys Pro Asp Gly Thr Phe Leu Leu Arg Phe Ser Asp Ser Glu Ile 610 615 620 Gly Gly Ile Thr Ile Ala Trp Lys Phe Asp Ser Pro Asp Arg Asn Leu 625 630 635 640 Trp Asn Leu Lys Pro Phe Thr Thr Arg Asp Phe Ser Ile Arg Ser Leu 645 650 655 Ala Asp Arg Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Leu Ile Tyr Val Phe Pro Asp 660 665 670 Arg Pro Lys Asp Glu Val Phe Ala Lys Tyr Tyr Thr Pro Val Leu Ala 675 680 685 Lys Ala Val Asp Gly Tyr Val Lys Pro Gln Ile Lys Gln Val Val Pro 690 695 700 Glu Phe Val Asn Ala Ser Thr Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Tyr Met 705 710 715 720 Asp Gln Ala Pro Ser Pro Val Val Cys Pro Gln Pro His Tyr Asn Met 725 730 735 Tyr Pro Pro Asn Pro Asp Pro Val Leu Asp Gln Asp Gly Glu Phe Asp 740 745 750 Leu Asp Glu Ser Met Asp Val Ala Arg His Val Glu Glu Leu Leu Arg 755 760 765 Arg Pro Met Asp Ser Leu Asp Ala Arg Leu Ser Pro Pro Ala Gly Leu 770 775 780 Phe Thr Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ser 785 790 <210> 4 <211> 786 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Ala Met Trp Ile Gln Ala Gln Gln Leu Gln Gly Asp Ala Leu His 1 5 10 15 Gln Met Gln Ala Leu Tyr Gly Gln His Phe Pro Ile Glu Val Arg His 20 25 30 Tyr Leu Ser Gln Trp Ile Glu Ser Gln Ala Trp Asp Ser Ile Asp Leu 35 40 45 Asp Asn Pro Gln Glu Asn Ile Lys Ala Thr Gln Leu Leu Glu Gly Leu 50 55 60 Val Gln Glu Leu Gln Lys Lys Ala Glu His Gln Val Gly Glu Asp Gly 65 70 75 80 Phe Leu Leu Lys Ile Lys Leu Gly His Tyr Ala Thr Gln Leu Gln Ser 85 90 95 Thr Tyr Asp Arg Cys Pro Met Glu Leu Val Arg Cys Ile Arg His Ile 100 105 110 Leu Tyr Asn Glu Gln Arg Leu Val Arg Glu Ala Asn Asn Gly Ser Ser 115 120 125 Pro Ala Gly Ser Leu Ala Asp Ala Met Ser Gln Lys His Leu Gln Ile 130 135 140 Asn Gln Thr Phe Glu Glu Leu Arg Leu Ile Thr Gln Asp Thr Glu Asn 145 150 155 160 Glu Leu Lys Lys Leu Gln Gln Thr Gln Glu Tyr Phe Ile Ile Gln Tyr 165 170 175 Gln Glu Ser Leu Arg Ile Gln Ala Gln Phe Ala Gln Leu Gly Gln Leu 180 185 190 Asn Pro Gln Glu Arg Met Ser Arg Glu Thr Ala Leu Gln Gln Lys Gln 195 200 205 Val Ser Leu Glu Thr Trp Leu Gln Arg Glu Ala Gln Thr Leu Gln Gln 210 215 220 Tyr Arg Val Glu Leu Ala Glu Lys His Gln Lys Thr Leu Gln Leu Leu 225 230 235 240 Arg Lys Gln Gln Thr Ile Ile Leu Asp Asp Glu Leu Ile Gln Trp Lys 245 250 255 Arg Arg Gln Gln Leu Ala Gly Asn Gly Gly Pro Pro Glu Gly Ser Leu 260 265 270 Asp Val Leu Gln Ser Trp Cys Glu Lys Leu Ala Glu Ile Ile Trp Gln 275 280 285 Asn Arg Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu His Leu Cys Gln Gln Leu Pro 290 295 300 Ile Pro Gly Pro Val Glu Glu Met Leu Ala Glu Val Asn Ala Thr Ile 305 310 315 320 Thr Asp Ile Ile Ser Ala Leu Val Thr Ser Thr Phe Ile Ile Glu Lys 325 330 335 Gln Pro Pro Gln Val Leu Lys Thr Gln Thr Lys Phe Ala Ala Thr Val 340 345 350 Arg Leu Leu Val Gly Gly Lys Leu Asn Val His Met Asn Pro Pro Gln 355 360 365 Val Lys Ala Thr Ile Ile Ser Glu Gln Gln Ala Lys Ser Leu Leu Lys 370 375 380 Asn Glu Asn Thr Arg Asn Asp Tyr Ser Gly Glu Ile Leu Asn Asn Cys 385 390 395 400 Cys Val Met Glu Tyr His Gln Ala Thr Gly Thr Leu Ser Ala His Phe 405 410 415 Arg Asn Met Ser Leu Lys Arg Ile Lys Arg Ser Asp Arg Arg Gly Ala 420 425 430 Glu Ser Val Thr Glu Glu Lys Phe Thr Ile Leu Phe Asp Ser Gln Phe 435 440 445 Ser Val Gly Gly Asn Glu Leu Val Phe Gln Val Lys Thr Leu Ser Leu 450 455 460 Pro Val Val Val Ile Val His Gly Ser Gln Asp Asn Asn Ala Thr Ala 465 470 475 480 Thr Val Leu Trp Asp Asn Ala Phe Ala Glu Pro Gly Arg Val Pro Phe 485 490 495 Ala Val Pro Asp Lys Val Leu Trp Pro Gln Leu Cys Glu Ala Leu Asn 500 505 510 Met Lys Phe Lys Ala Glu Val Gln Ser Asn Arg Gly Leu Thr Lys Glu 515 520 525 Asn Leu Val Phe Leu Ala Gln Lys Leu Phe Asn Ile Ser Ser Asn His 530 535 540 Leu Glu Asp Tyr Asn Ser Met Ser Val Ser Trp Ser Gln Phe Asn Arg 545 550 555 560 Glu Asn Leu Pro Gly Arg Asn Tyr Thr Phe Trp Gln Trp Phe Asp Gly 565 570 575 Val Met Glu Val Leu Lys Lys His Leu Lys Pro His Trp Asn Asp Gly 580 585 590 Ala Ile Leu Gly Phe Val Asn Lys Gln Gln Ala His Asp Leu Leu Ile 595 600 605 Asn Lys Pro Asp Gly Thr Phe Leu Leu Arg Phe Ser Asp Ser Glu Ile 610 615 620 Gly Gly Ile Thr Ile Ala Trp Lys Phe Asp Ser Gln Glu Arg Met Phe 625 630 635 640 Trp Asn Leu Met Pro Phe Thr Thr Arg Asp Phe Ser Ile Arg Ser Leu 645 650 655 Ala Asp Arg Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Leu Ile Tyr Val Phe Pro Asp 660 665 670 Arg Pro Lys Asp Glu Val Tyr Ser Lys Tyr Tyr Thr Pro Val Pro Cys 675 680 685 Glu Pro Ala Thr Ala Lys Ala Ala Asp Gly Tyr Val Lys Pro Gln Ile 690 695 700 Lys Gln Val Val Pro Glu Phe Ala Asn Ala Ser Thr Asp Ala Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Thr Tyr Met Asp Gln Ala Pro Ser Pro Val Val Cys Pro Gln 725 730 735 Ala His Tyr Asn Met Tyr Pro Pro Asn Pro Asp Ser Val Leu Asp Thr 740 745 750 Asp Gly Asp Phe Asp Leu Glu Asp Thr Met Asp Val Ala Arg Arg Val 755 760 765 Glu Glu Leu Leu Gly Arg Pro Met Asp Ser Gln Trp Ile Pro His Ala 770 775 780 Gln Ser 785 <210> 5 <211> 260 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 aagtaaagtc actgtgacca cacacagagg gcggggacag cccagacatt tcaacttctg 60 cagaaaaggt tcaggttttc cccacctcta aagttgaaaa aaaaaaaaaa aagagtaaaa 120 gaggaggtcc aaagaccaga aagaaggatc aggaactcgg aatggaaaga aaagatacaa 180 gaagaaatta gtaagagagg aagccaatta aaatgatccc tccaggccac tgggtcttgg 240 cccggatggt attcgagtag 260 <210> 6 <211> 96 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 gtctccattt gcttgttttt cttgggagct ttactggaaa caaaatgtga ttgcgtacta 60 gctgcggagg ggaagttggc tagaactcac agcttt 96

Claims

(a) STAT5A(Signal transducer and activator of transcription 5A)-인코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 STAT5B-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 STAT5A 또는 STAT5B의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 골 분화 촉진제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 STAT5A의 발현을 억제시키거나 또는 STAT5B의 발현을 촉진시키면 골 분화 촉진제로 판단된다.
제 1 항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 줄기세포는 자가(autologous) 줄기세포 또는 비자가(non-autologous) 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세포는 포유동물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 또는 고양이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 시험물질은 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질인 것을 특징으로 하는 방법.
STAT5A(Signal transducer and activator of transcription 5A) 유전자의 발현을 억제하거나, 또는 STAT5B 유전자의 발현을 촉진시키는 골 분화 촉진제를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 청소년 골다공증, 불완전 골형성증(osteogenesis imperfecta), 과골화증, 고칼슘혈증, 부갑상선 기능항진증, 골연화증, 용해성 골질환, 골괴사증, 뼈의 파젯병, 골 발생 질환, 골 골절, 류마티스 관절염에 의한 골 손실, 염증성 류마티스 관절염, 골수염, 전이성 골질환, 치주성 골 소실, 구루병, 암에 의한 골 손실 또는 골의 노인성 손실인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
STAT5A(Signal transducer and activator of transcription 5A) 또는 STAT5B 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 물질을 포함하는 지방세포 분화 억제용 조성물.
서열목록 제5서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터로 이루어진 PPARγ 또는 RXRα-반응성 전사조절서열.
서열목록 제6서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터로 이루어진 C/EBPα 또는 C/EBPβ-반응성 전사조절서열.