WO2023167250A1 - 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する細胞性免疫応答活性の測定方法 - Google Patents

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する細胞性免疫応答活性の測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023167250A1
WO2023167250A1 PCT/JP2023/007658 JP2023007658W WO2023167250A1 WO 2023167250 A1 WO2023167250 A1 WO 2023167250A1 JP 2023007658 W JP2023007658 W JP 2023007658W WO 2023167250 A1 WO2023167250 A1 WO 2023167250A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cov
sars
peptides
cell
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/007658
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
哲也 中面
クズィネ アーノ
卓 村上
太郎 齊藤
有基 片山
Original Assignee
国立研究開発法人国立がん研究センター
株式会社レゾナック
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人国立がん研究センター, 株式会社レゾナック filed Critical 国立研究開発法人国立がん研究センター
Publication of WO2023167250A1 publication Critical patent/WO2023167250A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • cell-mediated immunity In addition to humoral immunity in which antibodies play a central role, cell-mediated immunity is the body's defense function against SARS-CoV-2.
  • Cell-mediated immunity recognizes foreign substances such as pathogens that have invaded the body, and activates CD4 + T cells and/or CD8 + T cells via antigen-presenting cells to eliminate foreign substances (or cells containing foreign substances, such as infected cells). cells), the immune response system.
  • Different individuals may have different cellular immune response capacities depending, for example, on their infection or vaccination history with the pathogen of interest or with pathogens structurally related thereto.
  • the SARS-CoV-2 spike protein has sequence identity with the amino acid sequence of the Wuhan-Hu-1 strain SARS-CoV-2 spike protein (NCBI Reference Sequence: QHD43416.1, YP_009724390.1) 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% ⁇ 99.3%, ⁇ 99.4%, ⁇ 99.5%, ⁇ 99.6%, ⁇ 99.7%, ⁇ 99.8%, ⁇ 99.9%, or 100% spike protein can be
  • the SARS-CoV-2 spike protein has 0, 1, 2, 3 mutated amino acids based on the amino acid sequence of the Wuhan-Hu-1 strain SARS-CoV-2 spike protein.
  • the expression level of mRNA can be evaluated based on the cycle threshold (Ct value) obtained by the real-time RT-PCR method.
  • Ct value cycle threshold
  • the expression level of the marker can be easily compared between samples. .

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

簡便性、迅速性、及び／又はコスト効率性に優れ且つ高感度に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する被験者の細胞性免疫応答活性を測定できる実用的な新規アッセイを確立する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する被験者の細胞性免疫応答活性を測定する方法が提供され、この方法は、（１）被験者から採取された、白血球を含む検体を準備する工程；（２）検体に複数のペプチドを添加し、水性媒体中で、検体と複数のペプチドとをインキュベートする工程；並びに（３）工程（２）の後、白血球におけるＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含み、該複数のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしている。

Description

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する細胞性免疫応答活性の測定方法
　本開示はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関する。より具体的には本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性免疫応答活性を測定する方法に関する。
　重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ　Ａｃｕｔｅ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ　Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　２）は、４つの主要な構造タンパク質、具体的にはスパイク（Ｓ）タンパク質と、エンベロープ（Ｅ）タンパク質と、膜（Ｍ）タンパク質と、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質とを有するコロナウイルスである。スパイクタンパク質は、Ｓ１及びＳ２と呼ばれる２つの領域からなる大きなＩ型膜貫通型タンパク質であり、Ｓ１には主に、細胞表面の受容体を認識する受容体結合ドメインが、Ｓ２には膜融合に必要な要素が含まれている（非特許文献１）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、パンデミックとなって世界中の人々を苦しめており、肺炎症状の他、発熱、咳、息切れ、呼吸困難、悪寒、悪寒を伴う震え、筋肉痛、頭痛、咽頭痛、味覚障害、又は嗅覚障害などの、幅広い症状を引き起こすことが知られている。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する生体の防御機能として、抗体が中心的役割を果たす液性免疫のほか、細胞性免疫がある。細胞性免疫は、体内に侵入した病原体等の異物を認識し、抗原提示細胞を介してＣＤ４＋　Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋　Ｔ細胞を活性化することで異物（あるいは異物を含む細胞、例えば感染細胞）の排除をもたらす、免疫応答系である。異なる個体は、例えば目的の病原体若しくはそれに構造的に関連する病原体についての感染履歴又はワクチン接種歴に応じて、異なる細胞性免疫応答能力を有し得る。
　細胞性免疫応答活性の測定は、被験者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む試料に、病原体等由来の抗原を添加することでＰＢＭＣに含まれるＴ細胞等の白血球を刺激した後、刺激された白血球によって産生されるサイトカイン（例えばインターフェロンγ）などのエフェクター分子を検出するか、又は、エフェクター分子を発現している白血球を検出することで行うことができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する被験者の細胞性免疫応答の活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳｐｏｔ技術を用いる方法（非特許文献２）、ＥＬＩＳＡ法を用いる方法（非特許文献３）、フローサイトメトリー技術を用いる方法（非特許文献４）が報告されている。これらはいずれも、特異的抗体を用いてタンパク質産物としてのエフェクター分子を検出するものである。
　ＥＬＩＳｐｏｔ技術を用いて細胞性免疫応答活性を測定する方法は、抗原刺激前に、全血からＰＢＭＣを分離する必要があり、ＰＢＭＣ分離に時間と労力がかかる。また、当該方法は、細胞刺激後の上清中にタンパク質として発現するエフェクター分子を検出する方法であるため、抗原刺激を開始してから、検出に十分な量のタンパク質が発現し分泌されるまでの時間が長く、抗原刺激に通常１６時間以上の時間を要する。
　ＥＬＩＳＡ法を用いて細胞性免疫応答活性を測定する方法は、抗原刺激前にＰＢＭＣ分離の工程を必要とせず、被験者から採取した血液を全血のまま用いて抗原刺激することができるが、ＥＬＩＳｐｏｔ技術を用いる方法と同様に、細胞刺激後の上清中にタンパク質として発現するエフェクター分子を検出する方法であるため、抗原刺激を開始してから、検出に十分な量のタンパク質が発現し分泌されるまでの時間が長く、抗原刺激に通常２０時間以上の時間を要する。また、分泌されたタンパク質が溶液中に希釈された状態で測定が行われるため、測定感度が低くなる。
　フローサイトメトリー技術を用いて細胞性免疫応答活性を測定する方法は、抗原刺激前にＰＢＭＣ分離の工程を必要とせず、被験者から採取した血液を全血のまま用いて抗原刺激することができ、かつ、抗原刺激の時間が５～８時間で済む。しかしながら、抗原刺激の際に、分泌性のエフェクター分子を細胞内にとどめるためにＢｒｅｆｅｌｄｉｎ－Ａを共存させなければならず、また高価な専用機器を要しその機器の操作のために熟練した技術も要するため、手間とコストがかかる。また、フローサイトメトリー技術を用いる方法は、Ｔ細胞の活性化を促進するために、抗原刺激の際に抗ＣＤ２８抗体を共存させる必要があり、そのことによりバックグラウンドが上昇する可能性がある。
Cell, Vol. 181, pp 914-921, 2020 International Journal of Infectious Diseases, Vol 113. pp 155-162, 2021 International Journal of Infectious Diseases, Vol 106. pp 338-347, 2021 medRxiv 2020 Nov 3;2020.10.30.20223099. doi: 10.1101/2020.10.30.20223099.
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が社会全体に与えてきた、そして現に与えている、甚大な影響に鑑みると、簡便性、迅速性、及び／又はコスト効率性に優れ且つ高感度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する被験者の細胞性免疫応答活性を測定できる系が求められる。しかしながら、例えば迅速性又はコスト効率性のような一側面の改善を追求すると他方で感度が失われるなどして、実用的なアッセイを具体的に確立することは必ずしも容易ではなかった。
　本開示の実施形態は、上記の課題を解決する新規方法を提供するものである。本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
　（１）被験者から採取された、白血球を含む検体を準備する工程；
　（２）前記検体に複数のペプチドを添加し、水性媒体中で、前記検体と前記複数のペプチドとをインキュベートする工程；並びに
　（３）工程（２）の後、前記白血球における、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）及びＣＸＣモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）から成る群より選択される１つ以上のＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程
を含み、
　前記複数のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドであり、かつ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしている、
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する被験者の細胞性免疫応答活性を測定する方法。
［２］
　前記複数のペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列の１５～２０アミノ酸長の断片に相当する複数のペプチドである、［１］に記載の方法。
［３］
　前記複数のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列に沿って隣接するペプチドが互いに１０～１４アミノ酸オーバーラップしている、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
　前記検体は全血である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
　前記工程（２）におけるインキュベートは２～４時間行われる、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］
　さらに以下の工程を含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法：
　（２ａ）前記工程（２）後の検体を凍結する工程；及び
　（２ｂ）前記工程（２ａ）で凍結された検体を融解する工程。
［７］
　前記工程（３）において、Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する方法が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｍＲＮＡワクチンを接種した２０人（１０名はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２既感染者、１０名はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染者）の検体について、ＥＬＩＳｐｏｔ法で細胞性免疫応答活性を評価した結果を示す。ペプチド刺激していない検体は「ブランク」と記載し、ペプチドで刺激した検体は「ペプチド刺激」と記載した。Ｔ細胞機能関連マーカーとしてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）タンパク質の発現を測定した。それぞれの枠の左下の数字は、ＥＬＩＳｐｏｔ法で確認されたスポットの数を示す。「ＮＤ」はスポット数が１０００個以上となり正確な計測ができなかったことを意味する。 図２は、ペプチドで検体を刺激する時間と、ｑＲＴ－ＰＣＲ（定量的ＲＴ－ＰＣＲ）で検出された細胞性免疫応答活性との関係を示す図である。横軸はペプチドで検体を刺激する時間（時間）、縦軸はｌｏｇ２Ｆｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ（Ｆ．Ｉ．）を示す。●（黒丸）は、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｐｒｏｔ＿Ｓ１で刺激したときのｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．を示し、○（白丸）は、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ　ＣＭＶで刺激したときのｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．を示し、×はペプチドで刺激していないときのｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．を示す。 図３は、ペプチドプールによるスパイクタンパク質のカバー率とｑＲＴ－ＰＣＲに基づく細胞性免疫応答検査の感度との関係を示す図である。横軸（ｘ軸）はペプチドプールによるスパイクタンパク質のカバー率（％）、縦軸（ｙ軸）は感度を示す。図中の式は、ペプチドプールによるスパイクタンパク質のカバー率（ｘ）と感度（ｙ）との関係を最小二乗法で算出した式である。 図４は、既存法（ＥＬＩＳｐｏｔ法）で測定したスポット数（ｘ軸）と、実施例１の方法で測定したｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．（ｙ軸）との相関図を示す。相関係数は０．７２１である。 図５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（デルタ株）に対する細胞性免疫応答活性の相関図を示す。ｘ軸はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）のペプチドプールを用いたときのｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．値、ｙ軸はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（デルタ株）のペプチドプールを用いたときのｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．値を示す。相関係数は０．８６５である。
　本開示の実施形態による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する被験者の細胞性免疫応答活性を測定する方法は、
（１）被験者から採取された、白血球を含む検体を準備する工程と、
（２）該検体に複数のペプチドを添加し、水性媒体中で、該検体と上記複数のペプチドとをインキュベートする工程と、
（３）工程（２）の後、上記白血球における、ＩＦＮγ（インターフェロンγ）及びＣＸＣＬ１０（ＣＸＣモチーフケモカインリガンド１０）から成る群より選択される１つ以上のＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、を含む。すなわち本方法は、被験者に由来する検体を使用してｅｘ　ｖｉｖｏで実施されるものである。本開示における被験者は哺乳類動物であり、好ましくは霊長目であり、特に好ましくはヒトである。本開示における被験者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある者、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染者、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの接種者であり得る。上記マーカーはヒトにおける名称で表示しているが、動物種によっては、又は文脈によっては、同じマーカーが別の名称で呼ばれることもあり得る。細胞性免疫応答活性の文脈で使用される「測定する」という用語は、細胞性免疫応答活性を定量化することだけでなく、その定量化結果に基づいて（例えば陰性対照及び／又は陽性対照と比較して）有意な細胞性免疫応答活性の有無を判定又は検査することも含み得る。
　白血球を含む検体は、例えば血液から分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、あるいはさらに精製された白血球そのものであってもよいが、本実施形態では有利なことに、ＰＢＭＣを分離する手間と時間を排除して、全血を検体として利用することができる。当業者に理解されるように、全血である検体は、ヘパリン等の抗凝固剤を含み得る。「被験者から採取された」検体とは、被験者に由来する検体を意味し、例えば抗凝固処理やＰＢＭＣ分離等を経た後のものも「被験者から採取された」検体である。被験者から採取された全血等の検体は、一般に、採血管に保存される。採血管としては、例えばＥＤＴＡ採血管、及びヘパリンナトリウム採血管が挙げられる。ＥＤＴＡはリンパ球の細胞活性に影響を及ぼす可能性があるため、ヘパリンナトリウム採血管がより好ましい。
　工程（１）の「検体を準備する工程」とは、工程（２）以降の実施のために使用可能な検体を取得又は調製する段階を表す。被験者の身体から検体を直接採取（例えば採血）したのが当該方法の実施者であったか否かは問わない。
　本開示において、白血球としては、例えばリンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、及び単球が挙げられる。単球はマクロファージ又は樹状細胞へ分化するため、マクロファージ及び樹状細胞は白血球に属する。リンパ球としては、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞が挙げられる。また、本開示の白血球を含む検体、例えば全血、ＰＢＭＣ等は、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等の抗原提示細胞を含み得る。また、検体中のＴ細胞には、ＣＤ４＋　Ｔ細胞及びＣＤ８＋　Ｔ細胞が含まれ得る。
　本開示において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、野生型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の他、変異型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質であり得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型としては、例えばＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１株が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異型としては、例えばアルファ株、ベータ株、ガンマ株、デルタ株、イプシロン株、ゼータ株、イータ株、シータ株、イオタ株、カッパ株、ラムダ株、ミュー株、及びオミクロン株が挙げられ、それぞれの株の亜種も含まれる。本開示において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＱＨＤ４３４１６．１，ＹＰ＿００９７２４３９０．１）との配列同一性が、９０％以上、９１％以上、９２％以、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％のスパイクタンパク質であり得る。本開示において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のアミノ酸配列を基準として、変異したアミノ酸の数が０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個又は１００個のスパイクタンパク質であり得る。
　本開示において、「複数のペプチド」とは、互いにアミノ酸配列が異なるという意味において複数種類のペプチドが含まれている、８～３０アミノ酸長のペプチドの集団を表す。例えば２つのペプチドが同じ配列を部分的に共有していても、第一のペプチドにはない１つ以上のアミノ酸残基が第二のペプチドの末端に追加されていたら、これら２つのペプチドは「互いにアミノ酸配列が異なる」と言える。本実施形態で使用される複数のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドである。すなわち、当該複数のペプチドに含まれるペプチドのそれぞれが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを構成するスパイクタンパク質のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドである。これらのペプチドがスパイクタンパク質から断片化処理して得られる断片であることは要せず、実際、本実施形態のペプチドは典型的には化学合成されたペプチドであり得る。
　重要なことに、本実施形態で使用される複数のペプチドは、ペプチドの集団として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーするものである。このことが、後述するｍＲＮＡ発現レベル測定を通じた細胞性免疫応答判定の実用性のために重要であることが見出された。複数のペプチドが「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーする」とは、当該複数のペプチド中の全ペプチドをスパイクタンパク質の全長アミノ酸配列上の対応位置に宛てがって並べていった場合に、全長アミノ酸配列中にあるアミノ酸残基位置（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株では全部で１２７３残基）の４０％以上が覆われることを意味する。本開示では、複数のペプチドに含まれる全ペプチドを、対応する目的タンパク質（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）の全長アミノ酸配列の対応位置に宛てがって並べたときに、その全長アミノ酸配列の全アミノ酸残基のうちのどれだけがペプチドによってカバーされるかを表す百分率を「カバー率」と呼ぶ。従来、アミノ酸配列全長の４０％に満たないカバー率のペプチド（例えば既知のＭＨＣクラスＩ又はＩＩ拘束性ペプチドのセットや、ペプチドベースのワクチン又はワクチン候補等）を用いてリンパ球を刺激してＴ細胞活性化を測定することも行われてきたが、ｍＲＮＡレベルに基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的細胞性免疫応答の判定の系においては、カバー率が例えば２０％未満であると判定の信頼性が著しく低下し得ることが見出された。このカバー率は４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上又は８０％以上であってもよく、９０％以上とすると極めて信頼性の高い細胞免疫性検査が得られる。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーする複数のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列の１５～２０アミノ酸長の断片に相当する複数のペプチドであることが好ましい。換言すると、本実施形態における「複数のペプチド」中のペプチドは１５～２０アミノ酸長であることが好ましく、より好ましくは１５～１８アミノ酸長、さらに好ましくは１５アミノ酸長である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしており上記アミノ酸長範囲内である複数のペプチドが、検体に添加され又は検体とインキュベートされる際に、上記アミノ酸長の範囲外の長さの追加的ペプチドが共存していてもよい。
　抗原提示細胞表面に発現しているＭＨＣ分子は非常に多様性に富んでおり、結合できるペプチドの配列及び長さは個体間での差が非常に大きい。そのため、細胞性免疫検査として幅広く適用できるようにするため、ＭＨＣ分子上に直接結合できるＣｌａｓｓ Ｉ又はＣｌａｓｓ ＩＩペプチドを含む１４アミノ酸以下のペプチド鎖を使用するよりも、１５アミノ酸以上のペプチド鎖を使用することが好ましい。１５アミノ酸以上のペプチド鎖を、検体中に含まれる抗原掲示細胞と混ぜることにより、抗原提示細胞に取り込まれ、細胞内でＣｌａｓｓ Ｉ又はＣｌａｓｓ ＩＩペプチドまで分解され、抗原として細胞表面に提示され、同じ検体内に含まれる抗原特異的なＴ細胞にて認識可能な状態になると考えられる。
　好ましくは、当該複数のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列上のそれぞれの対応位置に並べられた場合に、スパイクタンパク質のアミノ酸配列に沿って隣接するペプチドが互いに１０～１４アミノ酸オーバーラップする。これはすなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列上で、ｎ番目のペプチドのＮ末端残基が、隣接するｎ＋１番目のペプチドのＮ末端残基よりも上流に位置するが、ｎ＋１番目のペプチドのＮ末端残基以降の１０～１４残基の配列は両ペプチドに共通することを意味する。このオーバーラップは例えば１０～１１アミノ酸であってもよく、１１アミノ酸のオーバーラップは特に好適な一例である。あるペプチドを基準として、それに「隣接するペプチド」とは、その基準となるペプチドのＣ末端側と配列上重なるＮ末端側を有するペプチドのうち直近のもの（すなわち最短のＮ末端－Ｎ末端距離を与えるもの）、又は、その基準となるペプチドのＮ末端側と配列上重なるＣ末端側を有するペプチドのうち直近のもの（すなわち最短のＣ末端－Ｃ末端距離を与えるもの）を意味する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしており上記オーバーラップ条件を満たす複数のペプチドが、検体に添加され又は検体とインキュベートされる際に、上記オーバーラップ条件を満たさない追加的ペプチドが共存していてもよい。
　「検体に複数のペプチドを添加する」とは、検体とその複数のペプチドとを組み合わせることを意味し、「複数のペプチドに検体を添加する」と同義である。検体とインキュベートされたこれらのペプチドは、検体中の抗原提示細胞に取り込まれ、場合によってはさらに短く分解され、抗原としてＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子と共に細胞表面に提示され、それがＴ細胞によって認識され得る。このように、当該複数のペプチドは、ＣＤ４＋リンパ球によって認識されるアミノ酸配列を含むペプチド、及びＣＤ８＋リンパ球によって認識されるアミノ酸配列を含むペプチドを含み得る。ＣＤ４＋リンパ球によって認識されるアミノ酸配列を含むペプチド又はＣＤ８＋リンパ球によって認識されるアミノ酸配列を含むペプチドを同定する方法は当業者に知られており、例えば細胞内サイトカイン染色法（ＩＣＳ：intracellular cytokine staining）によって容易に達成され得る。例えば、刺激されたＴ細胞によって発現されるサイトカインタンパク質は公知であるから、上述したようにＢｒｅｆｅｌｄｉｎ－Ａの存在下でペプチドと検体のインキュベーションを行って、フローサイトメトリーによりＣＤ４又はＣＤ８とそのサイトカインとについて共染色されるリンパ球の存在を確認すれば、ペプチドにＣＤ４＋又はＣＤ８＋リンパ球によって認識されるアミノ酸配列が含まれていたことが確認される。
　このように、生細胞によるペプチドの取り込み、抗原提示、及び抗原認識をｉｎ　ｖｉｔｒｏあるいはｅｘ　ｖｉｖｏの水性媒体中で行えること自体は本技術分野で確立されており、当業者はその目的に適した水性媒体を通常の知識に基づいて選択又は調製することができる。水性媒体は例えば細胞培養用の液体培地であり得る。全血は典型的に水性媒体中に維持されるが、その水性媒体を本実施形態の方法における水性媒体として使用してもよい。
　本実施形態の方法の工程（２）では、水性媒体中に添加された、上記条件を満たす複数のペプチドと検体とがインキュベートされる。インキュベーションは、３０℃～４０℃の範囲の温度で実施され得、好ましくは３７℃±０．５℃で実施され得る。インキュベートする時間は、１時間から８時間までで様々であってよい。インキュベーションは、１時間～２時間、２時間～３時間、３時間～４時間、４時間～５時間、５時間～６時間、６時間～７時間、６時間～８時間、１時間～４時間又は２時間～４時間であってもよく、好ましくは２～４時間である。インキュベーションの際の、検体と複数のペプチドとを含む混合物において、当該複数のペプチド全体としての濃度は、例えば０．１～２０μｇ／ｍＬ、０．２～１０μｇ／ｍＬ、又は０．５～５μｇ／ｍＬであり得る。このインキュベーションのあいだに、生細胞によるペプチドの取り込み、抗原提示、及び抗原認識が起こることが理解され、さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的細胞性免疫を有する被験者を、有しない被験者から区別できる有意なｍＲＮＡレベル差が起こることが見出された。Ｔ細胞エフェクター分子の発現上昇には転写後調節も寄与し得るため（Immunology. 2021;164:57-72）、ｍＲＮＡレベルで信頼性の高い細胞性免疫活性の判定を行えることは必ずしも自明なことではなく、また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に関しそのような有意なｍＲＮＡレベル差を迅速に起こさせるために特定のペプチド条件を要することも知られていなかった。
　本実施形態の方法は、上述した工程（２）の後、かつ工程（３）の前に、検体を凍結する工程（２ａ）、及び工程（２ａ）で凍結された検体を融解する工程（２ｂ）をさらに含み得る。これらの工程は、ペプチド刺激後の検体の安定化、長期保管、輸送等のために有利となる。
　ＩＦＮγ及びＣＸＣＬ１０は、公知のＴ細胞機能関連マーカーである。これらのマーカーは細胞性免疫の一部として刺激された白血球において発現が誘導される。これらのマーカーのｍＲＮＡレベルを測定できる技術の非限定的な例としては、ノザンブロットやマイクロアレイ等のハイブリダイゼーションに基づく方法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（配列決定）法等が挙げられるが、迅速性、簡便性、信頼性等の観点から逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法が好ましく、特にリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法は優れた定量性を有するため好ましい。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法としては、例えばＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ法、及びＴａｑＭａｎ（登録商標）法が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の蔓延に伴って、感染検査のためにＰＣＲ装置の普及が一層進んでいるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する被験者の細胞性免疫応答活性をＲＴ－ＰＣＲで簡便にかつ高い信頼性で測定できる実用的方法を確立したことは意義が大きい。同様に、臨床現場などで簡便かつ迅速に使用できる、定温核酸増幅法のＬｏｏｐ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　（ＬＡＭＰ）　法、Ｈｅｌｉｃａｓｅ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｉｒｃｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｉｎｖａｄｅｒ　ａｓｓａｙ法、なども好ましい。さらに、より定量性の高い、Ｄｉｇｉｔａｌ　ｄｒｏｐｌｅｔ　ＰＣＲ法やＤｉｇｉｔａｌ　ｄｒｏｐｌｅｔ　ＬＡＭＰ法なども好ましい。
　工程（３）の一つの実施形態では、必要に応じて、赤血球、及び白血球以外の血液成分が、全血サンプルから除去されてよい。他の実施形態では、全血は、特定のいずれの細胞型の除去又は単離をも行わずに用いられる。いくつかの実施形態では、全血は一般的な市販の磁気ビーズ、遠心カラムなどを利用したＴｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出法にてＲＮＡ抽出されマーカー測定されてよい。好ましい実施形態では、ｍＲＮＡの単離及び増幅のためのデバイスの使用を通じて白血球が単離される。このデバイスの実施形態は、各々その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４５，１８０号、同第７，９６８，２８８号、同第７，９３９，３００号、同第７，９８１，６０８号、及び同第８，０７６，１０５号により詳細に記載されている。
　簡潔に述べると、上記デバイスの特定の実施形態は、複数のサンプル導入ウェルと、白血球捕捉フィルターと、サンプル導出ノズルとを有したフィルタープレート、及び、該フィルタープレートの下に配置できる、オリゴ（ｄＴ）を固定化したウェルであるｍＲＮＡ捕捉ゾーンを有するマルチウェルプレートを含む。フィルタープレートのサンプル導入ウェルと、白血球捕捉フィルター及びサンプル導出ノズルと、マルチウェルプレートのｍＲＮＡ捕捉ゾーンのウェルとは、揃えて位置付けられ、従ってサンプル導入ウェルに入れられた液体が白血球捕捉フィルターを通って、さらにサンプル導出ノズルを通って、ｍＲＮＡ捕捉ゾーンのウェルに至ることができるようになっている。いくつかの実施形態では、サンプル導入ウェルに入れられた血液サンプルを、遠心力をかけて白血球捕捉フィルターに通す手段が用いられる。例えば、フィルタープレート全体を遠心分離機で回転させることにより、サンプル導入ウェルから白血球捕捉フィルターへと向かう方向に遠心力をかけて、血液サンプルを白血球捕捉フィルターに通すことができる。いくつかの実施形態では、血液サンプルを白血球捕捉フィルターに通す際には、サンプル導出ノズルの下に導出するサンプルを回収する、回収容器をサンプル導出ノズルの下に配置し得る。デバイスの好ましい実施形態では、白血球は、積層された複数の不織布からなる白血球捕捉フィルター上に捕捉される。血液サンプルのうち白血球捕捉フィルター上に捕捉されずに白血球捕捉フィルターを通過した部分は、回収容器に回収され得る。その後、回収容器は取り外され得る。いくつかの実施形態では、捕捉された白血球は、次に、細胞溶解バッファーで溶解され、それによって、捕捉された白血球からｍＲＮＡが放出される。次にこのｍＲＮＡを含む細胞溶解液は、上記マルチウェルプレートに移される。回収容器が取り外された状態のフィルタープレートの下に、上記マルチウェルプレートが配置され得る。フィルタープレートとマルチウェルプレートのウェルを揃え、遠心力をかけることで、簡便に、かつ、サンプル汚染を防ぎつつ、細胞溶解液をフィルタープレートからマルチウェルプレートに移すことができる。細胞溶解液中のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ捕捉ゾーンに固定化されたオリゴ（ｄＴ）にハイブリダイズされる。いくつかの実施形態で用いられてよい細胞溶解バッファーの組成に関するさらなる詳細は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１０１，３４４号に見出すことができる。いくつかの実施形態では、オリゴ（ｄＴ）に捕捉されていたｍＲＮＡからｃＤＮＡが合成される。好ましい実施形態では、ｃＤＮＡは、次に、Ｔ細胞機能関連マーカーの増幅用に特に設計されたプライマーによるリアルタイムＰＣＲを用いて増幅される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを定量するその他の方法が用いられ、その例としては前述の方法が挙げられるがこれらに限定されない。本段落では、複数のサンプル導入ウェルを有するフィルタープレートと複数のｍＲＮＡ捕捉ゾーンを有するマルチウェルプレートとを含むマルチウェル型のデバイスを説明し、そのようなデバイスは複数の試料を並行して処理するために便利であるが、原理的に同じ処理を単一ウェルのデバイスで行うこともできる。
　工程（３）の一実施形態は、以下の（ａ）～（ｄ）を含むＲＴ－ＰＣＲ法であり得る。
（ａ）フィルターメンブレンを通す濾過により全血から赤血球と非白血球血液成分とを除去して、フィルターメンブレン上に白血球を得ること；
（ｂ）白血球を細胞溶解して、ｍＲＮＡを含有する溶解物を生成させること；
（ｃ）溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化基材（例えばオリゴ（ｄＴ）固定化プレート）に移して、オリゴ（ｄＴ）上にｍＲＮＡを捕捉すること；及び
（ｄ）ｍＲＮＡレベルを測定すること。
　工程（ａ）の一実施形態は、工程（２）で得られたインキュベート後の検体を含むサンプルを、フィルタープレートのサンプル導入ウェルに添加し、インキュベーションし、遠心力を利用してフィルタレーションする工程である。その結果、フィルターメンブレン上に白血球を捕捉することができる。白血球捕捉フィルターであるフィルターメンブレンの好適な一例は、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）繊維膜である。インキュベーションは、２０℃～４０℃の範囲の温度で実施され得る。インキュベートの時間は、１秒間から１時間までで様々であってよい。インキュベーションは、１秒間～１分間、１分間～１時間、１分間～２０分間、２分間～２０分間、５分間～１５分間又は７分間～１２分間であってよい。
　工程（ｂ）は、細胞溶解バッファーを用いて細胞を溶解する工程である。細胞を溶解して細胞内ＲＮＡを放出させることができる細胞溶解バッファーは当業者に知られており、例えば前述の細胞溶解バッファーが挙げられる。
　工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られた溶解物を、オリゴ（ｄＴ）固定化基材に移して、例えば１時間、１時間～３時間、１時間～２４時間、又は１６時間～２４時間インキュベートし、オリゴ（ｄＴ）上にｍＲＮＡを捕捉する工程である。
　工程（ｄ）は、
（ｉ）（ｃ）でオリゴ（ｄＴ）上の捕捉を介して単離されたｍＲＮＡに、プライマー及び逆転写酵素を添加して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作り出すこと；並びに
（ｉｉ）ｃＤＮＡを、ＩＦＮγ及びＣＸＣＬ１０から成る群より選択される１つ以上のＴ細胞機能関連マーカーの核酸配列に特異的であるセンス及びアンチセンスプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとに接触させて、増幅されたＤＮＡを作り出すこと、
を含む方法によって実施され得る。これらの文脈において「プライマー」という用語はオリゴヌクレオチドプライマーを表す。これらの工程によって、Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定することができる。
　ＰＣＲ反応の完了後、又はＰＣＲ反応の進行中に、１つ以上のＴ細胞機能関連マーカーに対する種々のｍＲＮＡ（ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡの検出量で表される）が定量される。特定の実施形態では、定量は、１つ以上のマーカーをコードするｍＲＮＡの量を参照値と比較することによって算出される。いくつかの実施形態では、参照値は、ハウスキーピング遺伝子を例とする、刺激剤（例えば抗原ペプチド）によって発現が誘導も抑制もされない遺伝子の発現レベルである。特定のそのような実施形態では、β－アクチンの発現レベルが参照値として用いられる。本技術分野にて公知である数多くのその他のハウスキーピング遺伝子のいずれかも、参照値として用いられてよい。一つの実施形態として、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で得られるサイクル閾値（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｃｔ値）に基づいて、ｍＲＮＡの発現レベルを評価することができる。当業者に一般的に知られているように、関心対象のマーカーのＣｔ値をハウスキーピング遺伝子のＣｔ値にてノーマライズすることで、検体間でのマーカーの発現量を容易に比較することができる。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法では、１つ以上のＴ細胞機能関連マーカー遺伝子とハウスキーピング遺伝子との検出量を測定し、ハウスキーピング遺伝子のＣｔ値を用いて、Ｔ細胞機能関連マーカー遺伝子（例えばＩＦＮγ、又はＣＸＣＬ１０）をノーマライズし、ノーマライズされたＣｔ値を遺伝子発現量（ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ）へ換算することで、刺激により発現変化（例えば増加）したｍＲＮＡ量を概算することができる。例えば、
Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　=２（－Ｃｔ　ｖａｌｕｅ［ｍａｒｋｅｒ］＋Ｃｔ　ｖａｌｕｅ［ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ　ｇｅｎｅ］）、
ｌｏｇ２（Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ）＝－Ｃｔ　ｖａｌｕｅ［ｍａｒｋｅｒ］＋Ｃｔ　ｖａｌｕｅ［ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ　ｇｅｎｅ］
などの式を用いることができる。
　本開示の方法の実施形態において、１つ以上のＴ細胞機能関連マーカーの、刺激剤にて誘導された発現レベルを、非誘導（溶媒コントロール）サンプルからの同じマーカーの発現レベルと比較することで、刺激によるマーカーの発現レベル変化を評価することができる。ひとつの実施形態として、当業者には理解されるように、誘導されたマーカーの遺伝子発現量を非誘導されたマーカーの遺伝子発現量と比較したＦｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ（Ｆ．Ｉ．）値又はそれから派生した値にて誘導の度合いを概算することができる。例えば、
ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．＝Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ［ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｓａｍｐｌｅ］÷Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ［ｓｏｌｖｅｎｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ］）、
ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．＝－Ｃｔ［ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｓａｍｐｌｅ］）＋Ｃｔ［ｓｏｌｖｅｎｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ］）
などの式を用いることができる。つまり、概算したｍＲＮＡ発現量を、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量と比較することで、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．を算出することができる。ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．は、刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量が、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量の何倍であるかを評価する指標であり、例えば、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が０のときは、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量と刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量とが同じであることを意味し、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が１のときは、刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量が、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量の２倍であることを意味する。すなわち、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が大きいほど、ペプチド刺激で誘導されたｍＲＮＡ発現量が増加したことを意味する。
　本開示の方法の実施形態において、同一被験者の検体について、２種類以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のスパイクタンパク質のアミノ酸配列に相当するペプチドを用いて細胞性免疫応答活性を測定し、それぞれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対する細胞性免疫応答活性を比較することもできる。２つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対する細胞性免疫応答活性を比較することで、当該被験者が、どの株に対する細胞性免疫応答活性を有するか、又は、どの株に対する細胞性免疫応答活性が高いか、又はどの株に対して交差免疫性を示すか等を評価することができる。一つの実施形態として、第一の複数のペプチドはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株のスパイクタンパク質配列に対応し、第二の複数のペプチドはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生株（又は別の変異株）のスパイクタンパク質配列に対応する。第一と第二の複数のペプチドは前述のようにそれぞれＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の４０％以上をカバーする。第一と第二の複数のペプチドは、対応する株に特異的な配列部分、すなわち両株の配列差異をもたらす変異部分をカバーするペプチドを含むが、それ以外のペプチドは、第一と第二の複数のペプチドに共通し得る。第一の複数のペプチドにて誘導されたｍＲＮＡ発現量が第二の複数のペプチドにて誘導されたｍＲＮＡ発現量を上回った場合、もしくは下回った場合、上記変異株に対する被験者の細胞性免疫活性は、野生株（又は上記別の変異株）に対する細胞性免疫活性に比して、それぞれ高い、もしくは、低いと判定する。前述の「第一の複数のペプチドにて誘導されたｍＲＮＡ発現量が第二の複数のペプチドにて誘導されたｍＲＮＡ発現量を上回った場又は下回った場合」の判断方法としては、特に制限はないが、例えば統計学的有意差をもって判断する方法が挙げられる。一方、第一の複数のペプチドにて誘導されたｍＲＮＡ発現量と第二の複数のペプチドにて誘導されたｍＲＮＡ発現量が、統計的有意差がつかない程度に同一であった場合、上記変異株に対する検体の細胞性免疫活性は野生株（又は上記別の変異株）に対する細胞性免疫活性に比して差がないと判定する。適切な統計学的検定の選定及び適用は当業者の通常の技量の範囲内のことである。本開示の方法の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性免疫活性の有無を調べると同時に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株特異的な細胞性免疫活性の有無を調べることができるため、臨床的に有用である。
　本開示の測定方法に関わり得るＲＮＡとしては、例えばｍＲＮＡ、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ画分、及びＴｏｔａｌ　ＲＮＡが挙げられる。本開示の測定方法におけるｍＲＮＡは、スプライシング等のさまざまなプロセシングを受けて成熟したｍＲＮＡであっても、プロセシングを受けて成熟したｍＲＮＡになる前のＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体）であってもよい。
　本開示の測定方法のいくつかの実施形態は、以下のいずれかの測定キットの実施形態を用いることで行うことができる。
＜測定キット１＞
（１）複数のペプチドを含むペプチドセット；及び
（２）ＩＦＮγ及びＣＸＣＬ１０から成る群より選択される１つ以上のＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定するための測定試薬
を含み、
　前記複数のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドであり、かつ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしている、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する被験者の細胞性免疫応答活性の測定キット。
＜測定キット２＞
（１）第一の複数のペプチドを含む第一のペプチドセット；
（２）第二の複数のペプチドを含む第二のペプチドセット；及び
（３）ＩＦＮγ及びＣＸＣＬ１０から成る群より選択される１つ以上のＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定するための測定試薬
を含み、
　前記第一の複数のペプチドは、変異株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドであり、
　前記第二の複数のペプチドは、野生株又は別の変異株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドであり、
　前記第一の複数のペプチドと第二の複数のペプチドとが、それぞれ対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしている
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する被験者の細胞性免疫応答活性の測定キット。
＜測定キット３＞
（１）複数のペプチドを含むペプチドセット；
（２）白血球を単離するための試薬；
（３）（２）で単離した白血球からＲＮＡを精製するための試薬；
（４）ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための試薬；及び
（５）ＩＦＮγ及びＣＸＣＬ１０から成る群より選択される１つ以上のＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定するための測定試薬
を含み、
　前記複数のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドであり、かつ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしている、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する被験者の細胞性免疫応答活性の測定キット。
　測定キットは、任意で、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｍＲＮＡを単離するための試薬をさらに含んでもよい。
　本開示の上記実施形態のキットにおける「ペプチドセット」とは、本開示の測定方法の実施形態に使用することができる複数のペプチドを含むペプチドの集団であることが理解されるべきである。測定方法の実施形態に関連して提供された説明（例えば複数のペプチド、試薬、細胞及び核酸ならびにそれらの単離、測定等に関すること）は、キットの実施形態にも適用することができる。
　本開示のキットの実施形態に関わり得るＲＮＡとしては、例えばｍＲＮＡ、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ画分、及びＴｏｔａｌ　ＲＮＡが挙げられる。本開示のキットの実施形態の測定対象となるｍＲＮＡは、スプライシング等のさまざまなプロセシングを受けて成熟したｍＲＮＡであっても、プロセシングを受けて成熟したｍＲＮＡになる前のＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体）であってもよい。
　本明細書において、「～」（「…から…まで」の意）を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示し、また、その最小値及び／又は最大値を除外した範囲も包含する。複数の数値範囲が記載されている場合は、或る記載された数値範囲の上限値又は下限値は、別の記載された数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせて別個の数値範囲を規定することができ、そのような別個の数値範囲も本開示に含まれる。「工程」が行われることは、明確に分離して独立した工程が行われる場合だけでなく、他の工程と明確に分離できなくてもその工程の所期の事象が達成される場合も含まれ得る。
　以下、実施例を示して本開示の実施形態をさらに詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は代表的な実験結果の例示に過ぎず、発明の実施形態がこれらの詳細に限定されるわけではないことが理解されるべきである。なお、以下の実施例においては、次のメーカーの試薬類を使用した。
　Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｐｒｏｔ＿Ｓ１（Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ１とも記す）、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｐｒｏｔ＿Ｓ＋（Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ＋とも記す）、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｐｒｏｔ＿Ｓ（Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓとも記す）、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｐｒｏｔ＿Ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓｆｕｌｌとも記す）、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｐｒｏｔ＿Ｓ　Ｂ．１．６１７．２　ＷＴ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｐｏｏｌ（以下、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　ｄｅｌｔａ　ｒｅｆ．とも記す）、　ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ　ＣＭＶ　ｐｐ６５（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ　ＣＭＶとも記す）（以上、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）；ＰｅｐＭｉｘ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓｐｉｋｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（以下、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｉｘとも記す）、ＰｅｐＭｉｘ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓｐｉｋｅ　Ｂ．１．６１７．２／Ｄｅｌｔａ）（以下、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｉｘ　ｄｅｌｔａ　ｖａｒｉａｎｔとも記す）（以上、ＪＰＴ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）；ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ　ＤＭＳＯ（以下、ＤＭＳＯと記す）、ＰＢＳ（－）（以下、ＰＢＳバッファーと記す）、リポポリサッカリド大腸菌Ｏ１１１由来フェノール抽出品（以下、ＬＰＳと記す）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（以下、Ｔｗｅｅｎ２０と記す）（以上、富士フイルム和光純薬社製）；Ｍ－ＭＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｍ－ＭＬＶ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）；ＲＮａｓｉｎ（商標）Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（以下、ＲＮａｓｉｎと記す）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）；ベノインジェクトＩＩ真空採血管ヘパリンナトリウム（以下、ヘパリンＮａ採血管と記す）（テルモ社製）；０．２ｍＬ　Ａｍｐｌｉｆｙｔ　ＰＣＲ　Ｚｉｐｐｅｒ　Ｓｔｒｉｐ　Ｔｕｂｅｓ　＆　Ｃａｐｓ）（以下、ＰＣＲチューブと記す）（Ｔｈｏｍａｓ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）；３８４ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）；　ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）。
［実施例１］
細胞性免疫応答活性の測定方法
（１）刺激用のペプチドプール
　野生型Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成するスパイクタンパク質のアミノ酸配列を元に作製されたオーバーラップペプチドプール製品である、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ１、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ＋、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓｆｕｌｌ及びＰｅｐｔｉｖａｔｏｒ　ｄｅｌｔａ　ｒｅｆ．を準備した。これらのペプチドプールはそれぞれ、スパイクタンパク質のアミノ酸配列の１５アミノ酸長断片に相当する複数のペプチドから構成され、隣接するペプチドが互いに１１アミノ酸オーバーラップしている。それぞれのペプチドプールについて、カバーするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の配列領域（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ；アミノ酸残基番号で示されている）、及び、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のカバー率（Ｃｏｖｅｒ；全１２７３残基のうちペプチドによってカバーされている残基の数、及びその百分率が示されている）を表１に示した。
　なお、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　ｄｅｌｔａ　ｒｅｆ．には、１９番目のスレオニン（Ｔ）、１４２番目のグリシン（Ｇ）、１５６番目のグルタミン酸（Ｅ）、４５２番目のロイシン（Ｌ）、４７８番目のスレオニン（Ｔ）、６１４番目のアスパラギン酸（Ｄ）、６８１番目のプロリン（Ｐ）、及び９５０番目のアスパラギン酸（Ｄ）を含む、１５アミノ酸長のペプチドを含むため、上記アミノ酸残基を含む、８種類の１５アミノ酸長のペプチドが含まれていることがわかる。この情報から、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　ｄｅｌｔａ　ｒｅｆ．は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の全アミノ酸（１２７３アミノ酸）のうち、１２０アミノ酸長に相当するペプチドを含んでいることとなる。
（２）ペプチドストリップの準備及び保管
　カバー率４０％以上のペプチドプールであるＰｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ１、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ、及びＰｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓｆｕｌｌを、抗原希釈液（２０％のＤＭＳＯを含むＰＢＳバッファー）を用いて２０μｇ／ｍＬとなるように溶解した。また、比較例として、カバー率２０％未満のペプチドプールであるＰｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ＋及びＰｅｐｔｉｖａｔｏｒ　ｄｅｌｔａ　ｒｅｆ．を、前記抗原希釈液を用いて２０μｇ／ｍＬとなるように溶解した。各ペプチドプール溶液を６μＬずつ、ＰＣＲチューブに分注した。また、前記各ペプチドプール溶液の他、陰性コントロールとして前記抗原希釈液を、免疫細胞の刺激の有無を確認するための陽性コントロールとして２０μｇ／ｍＬのＬＰＳを含む抗原希釈液を調製し、それぞれ６μＬずつＰＣＲチューブに分注した。それぞれの溶液が分注されたＰＣＲストリップチューブ（以下、ペプチドストリップと記す）を、－８０℃のフリーザーで凍結し保管した。
（３）全血のペプチド刺激
　凍結保管していたペプチドストリップを２５℃で保持し、ペプチドプール溶液を融解した。ヘパリンＮａ採血管に採血された全血を、ペプチドストリップの各チューブに１２０μＬずつ添加し、攪拌し混合した。攪拌の後、３７℃で４時間インキュベートし、全血に含まれる白血球の刺激を行った。インキュベート後、全血サンプルを－８０℃で凍結し保管した。
（４）全血に含まれる白血球の捕捉
　（３）で凍結した、上記ペプチドストリップを３７℃で１５分間保持し、全血サンプルを融解した。マルチウェルフィルタープレートのウェルに、フィルター洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファー）を１５０μＬずつ添加し、２５００ｇ、４℃で１分間遠心分離した。その後、上記全血サンプルをウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１０分間静置した後、２５００ｇ、４℃で２分間遠心分離を行い、フィルター上に白血球を捕捉した。なお、この実施例の文脈では、「遠心分離」とは、遠心分離機でプレートを回転させてプレートの底方向に遠心力を掛けることを意味する。
（５）ｍＲＮＡの溶出及び捕捉
　細胞溶解バッファーを、上記フィルタープレートの各ウェルのフィルター上に６０μＬずつ添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、フィルター上の白血球を溶解した。オリゴ（ｄＴ）が各ウェルに固定化されている別のマルチウェルプレート（以下、ｍＲＮＡ捕捉用プレートという）を、上記フィルタープレートの下に配置して両プレートのウェルを上下に重ならせ、２５００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。フィルタープレートを取り外し、細胞溶解液をウェル中に受け入れたｍＲＮＡ捕捉用プレートを４℃で１～２４時間インキュベートした。インキュベート後、洗浄バッファーを用いて各ウェルを洗浄し、細胞溶解液中に含まれていたオリゴ（ｄＴ）非結合性物質を取り除いた。
（６）ｃＤＮＡの合成
　逆転写酵素を含む逆転写バッファーを、ｍＲＮＡ捕捉用プレートの各ウェルに３０μＬずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。前記操作により、ｍＲＮＡ捕捉用プレートに捕捉されていたポリＡテール化ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。
（７）ｑＰＣＲ
　ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘに、各遺伝子（アクチンベータ：ＡＣＴＢ、インターフェロンガンマ：ＩＦＮＧ、　シーエックスシーエル１０：ＣＸＣＬ１０）用のプライマー対（表２に配列を示す）を混合し、３８４ウェルＰＣＲプレートのウェルに３μＬずつ分注した。上記（６）で得られたｃＤＮＡ溶液を２μＬずつウェルに添加し、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、当該システムの取扱説明書に従い、下記のサイクルでリアルタイムＰＣＲを行った。
　Ｓｔａｇｅ１：９５℃　１０：００，　
　Ｓｔａｇｅ２：４０ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　９５℃　００：３０　ａｎｄ　６５℃　１：００，　
　Ｓｔａｇｅ３：Ｍｅｌｔｉｎｇ　ｃｕｒｖｅ
　ここで、ACTBのセンスプライマー配列は配列番号１、ACTBのアンチセンスプライマー配列は配列番号２、IFNGのセンスプライマー配列は配列番号３、IFNGのアンチセンスプライマー配列は配列番号４、CXCL10のセンスプライマー配列は配列番号５、CXCL10のアンチセンスプライマー配列は配列番号６である。
（８）測定結果の解析方法
　リアルタイムＰＣＲにより得られた各遺伝子の測定値は、反応の閾値を満たすサイクル数であるＣｔ値で表すこととした。また、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ遺伝子のＣｔ値を用いて、検出対象遺伝子（ＩＦＮＧ，ＣＸＣＬ１０）のＣｔ値をノーマライズし、ノーマライズされたＣｔ値を遺伝子発現量へ換算することで、刺激により発現増加したｍＲＮＡ量を概算した。すなわち、概算したｍＲＮＡ発現量を、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量と比較することで、ペプチド刺激特異的なｍＲＮＡ発現量を決定し、結果はｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．で表現した。例えば、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が０の時は、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量と刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量とが同じであることを意味し、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が１の時は、刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量が、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量の２倍であることを意味する。従って、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が大きいほど、ペプチド刺激で誘導されたｍＲＮＡ発現量が増加したことを意味する。
［実施例２］
（１）既存法による陽性検体の選択
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｍＲＮＡワクチンを２回接種した２０人（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の既感染者１０名、未感染者１０名）からの血液を、細胞性免疫応答活性の測定方法として広く用いられるＥＬＩＳｐｏｔ法で試験し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性免疫を有する陽性検体を選択した（図１）。ペプチドプールとしてはＰｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ　ｆｕｌｌを使用し、ペプチド刺激方法及びＩＦＮγタンパク質の検出方法は、市販キットであるＢＤ（商標）ＥＬＩＳｐｏｔ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の取扱説明書に従い実施した。なお、陰性コントロールとして、ペプチドで刺激しないウェルを準備した。ＥＬＩＳｐｏｔ法において細胞性免疫応答活性を陽性と判断する基準（カットオフ値）は、１ウェルあたりのスポット数が２５個以上とし、陽性又は陰性を判断した。すなわち、陰性コントロールにおけるスポット数を、ペプチド刺激した場合のスポット数から差し引いた数が２５以上である場合に陽性と判定した。図１に示すとおり、被検体「未感染者５」以外の１９検体が陽性検体であることが判明した。
（２）ｑＲＴ－ＰＣＲによる細胞性免疫活性の測定へのペプチド刺激時間の影響
　最初に、潜在感染による免疫状態の維持が期待されるサイトメガロウイルスのペプチドプールを用いて、ペプチド刺激時間と、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって検出され得る細胞性免疫活性との関係を評価した。上記（１）で選択された陽性検体であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染者１の血液を、サイトメガロウイルスのアミノ酸配列由来のペプチドプールであるＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ　ＣＭＶで０～２４時間刺激した際に、ｑＰＣＲによって検出されるＩＦＮＧ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の変化を評価した。図２に示すとおり、ＩＦＮＧ遺伝子のｍＲＮＡ検出量は刺激開始後４時間まで上昇し、４時間以降は一定で有意な変化をしなくなった。
　次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のペプチドプールを用いて、ペプチド刺激時間と、ｑＲＴ－ＰＣＲによって検出され得る細胞性免疫活性との関係を評価した。上記サイトメガロウイルスの試験と同様に、（１）のＥＬＩＳｐоｔ実験で同定された陽性検体のうちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染者１の血液を、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ　Ｓ１で０～２４時間刺激した際に、ｑＲＴ－ＰＣＲによって検出されるＩＦＮγ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の変化を評価した。図２に示すとおり、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ　ＣＭＶ用いた試験の結果と同様に、ＩＦＮＧ遺伝子のｍＲＮＡ発現量は刺激開始後４時間まで上昇し、４時間以降は一定で有意な変化をしなくなった。ここに例示される結果より、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性免疫応答活性の測定において、検出対象マーカーのｍＲＮＡ発現量を測定することで、短い細胞刺激時間で、細胞性免疫応答活性の検出が可能となることが判明した。
［実施例３］
臨床検体を用いた被験者の細胞性免疫応答活性
（１）臨床検体を用いた細胞性免疫応答活性の測定
　実施例２（１）で選択した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性免疫の陽性検体である１９人の血液を臨床検体として用い、実施例１（１）～（８）の方法に従いＩＦＮγのｍＲＮＡ発現量に基づいて細胞性免疫応答活性を測定し、ペプチドプール毎のｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．を算出した。その結果を表３に示した。なお、本実施例において細胞性免疫応答活性を陽性と判断する基準（カットオフ値）はｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．≧１．７５とし、陽性と判断されたアッセイを表３において灰色で示した。
（２）感度試験
　臨床検査において、陽性検体を検査した場合に当該陽性検体が陽性と判断される割合を感度といい、感度が高いほど、陽性者を陽性として正しく判定する可能性が高い検査法であるということができる。臨床検査において、一般的に、感度が７０％以上となることが要求される。
　表３の結果に基づいて、本試験における感度を以下の式により算出した。
　感度（％）＝（細胞性免疫応答活性を陽性と判断した検体数）÷（陽性１９検体）×１００
　本試験におけるそれぞれのペプチドプールについて、陽性と判断された検体数、及び感度を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４の結果より、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ１（カバー率５４．４％）、Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ（カバー率４５．０％）、及びＰｅｐｔｉｖａｔｏｒ　Ｓ　ｆｕｌｌ（カバー率９９．６％）で刺激した際の感度は、それぞれ８４．２％、７８．９％、及び９４．７％であった。ここで例示される結果により、カバー率４０％以上、具体的には例えば４５．０％～９９．６％のペプチドプールを用いてペプチド刺激をすることで、正確な検査ができることが判明した。図示していないが、ＣＸＣＬ１０の検出においても同様の結果が観察され得る。
（３）スパイクタンパク質のカバー率と感度との相関
　表４の結果に基づき、スパイクタンパク質のカバー率（ｘ軸）と、実施例４の試験における感度（ｙ軸）との関係のグラフを図３に示し、さらに、最小二乗法により関係式（２次式）を求めた。図３に示したとおり、スパイクタンパク質のカバー率と感度との間には相関性があることが見出された。例えば５４．４％のカバー率のペプチドプールと４５．０％のカバー率のペプチドプールとは、スパイクタンパク質アミノ酸配列のうち共通の部分をカバーしている割合は僅かだが、このようにどの領域をカバーしているかの違いに関わらず「カバー率」と検査感度とが著しく相関することが見出された。
　図３に示される相関式より、感度７０％となるスパイクタンパク質のカバー率を算出したところ、３５．３％であった。８０％以上のカバー率では、カットオフ値を低くしても極めてロバストで信頼性の高い検査が得られた。
［実施例４］
既存法（ＥＬＩＳｐｏｔ法）との比較
　実施例１の測定方法及びＥＬＩＳｐｏｔ法で細胞性免疫応答の判定を行った際の結果の比較を表５に示した。表５において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性免疫が陽性であると判断された検体を○、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性免疫が陰性であると判断された検体を×で示した。
　表５より、実施例１の測定方法の結果は、１つの検体（未感染１）を除いて、既存法（ＥＬＩＳｐｏｔ法）の結果と一致した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは細胞性免疫検査のゴールドスタンダードとも言えるものだが、採血から判定結果取得まで少なくとも１日以上の長時間を要する。本実施形態のｍＲＮＡレベルに基づく方法は、採血から判定結果取得までの時間をはるかに短縮できるが、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイに匹敵する高い信頼性で細胞性免疫応答の判定を行うことができている。また、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、全血からＰＢＭＣを分離する必要があり、ＰＢＭＣ分離に時間と労力がかかる。一方、本実施形態のｍＲＮＡレベルに基づく方法は、ＰＢＭＣの取得が必要なく、採血液をそのまま用いることができる簡便な方法である。
　また、ＥＬＩＳｐｏｔ法で得られたスポット数（ｘ軸）と、実施例１の測定方法で得られたｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．値（ｙ軸）との相関性を評価し、相関図を図４に示した。図の結果より、当該２つの測定方法の相関関係が示された（相関係数＝０．７２１）。
　以上に例示される結果より、実施例１に記述された測定方法は、短時間、かつ簡便な方法で、既存法と同等の正確な判定ができる方法であることが判明した。
［実施例５］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（デルタ株）に対する細胞性免疫応答活性の比較
（１）陽性検体の準備
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｍＲＮＡワクチンを２回接種し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した経験のない被験者５名（未感染１１～未感染１５）；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｍＲＮＡワクチンを２回接種し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した経験のある被験者７名（既感染１１～既感染１７）；及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｍＲＮＡワクチンを接種しておらず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した経験のある被験者１名（既感染１８）から、ヘパリンＮａ採血管を用いて血液を採取した。実施例２（１）の方法と同様の方法に従い前記１３人の血液を、細胞性免疫応答活性の測定方法として広く用いられるＥＬＩＳｐｏｔ法で試験し、全ての検体が陽性であることを確認した。
（２）細胞性免疫応答活性の測定
　刺激用ペプチドプールとして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｉｘ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質［野生型］）と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｉｘ　ｄｅｌｔａ　ｖａｒｉａｎｔ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質［デルタ株］）を用いた。これらは、それぞれ、野生型（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株）及びデルタ株のスパイクタンパク質全長を１１アミノ酸オーバーラップでカバーする複数の１５ｍｅｒペプチドを含むものである。実施例１（２）の方法に従い、それぞれのペプチドプール（２０μｇ／ｍＬ）を調製した。
　前記陽性検体１３例の血液を臨床検体として用い、実施例１（１）～（８）に記載の方法に従い、それぞれのペプチドプールを用いた際の細胞性免疫応答活性をＩＦＮγのｑＰＣＲに基づいて測定し、ｌｏｇ２　Ｆ．Ｉ．を算出した。その結果を表６に示した。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｉｘで刺激した際のＬｏｇ２　Ｆ．Ｉ．値と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｉｘ　ｄｅｌｔａ　ｖａｒｉａｎｔで刺激した際のＬｏｇ２　Ｆ．Ｉ．値との相関図を図５に示した。
　表６及び図５より、前記１３人の陽性検体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２［野生型］及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２［デルタ株］に対して、同等の細胞性免疫応答活性を有していることが判明した。このように、本開示の実施形態による測定方法により、それぞれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対する細胞性免疫応答活性を比較することもできることが明らかとなった。
関連出願への相互参照
　本願は、２０２２年３月１日に出願された米国仮出願第６３／３１５，１６４号の利益を主張し、該出願は参照によりその全体がここに組み入れられる。

Claims (7)

  1. 　（１）被験者から採取された、白血球を含む検体を準備する工程；
    　（２）前記検体に複数のペプチドを添加し、水性媒体中で、前記検体と前記複数のペプチドとをインキュベートする工程；並びに
    　（３）工程（２）の後、前記白血球における、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）及びＣＸＣモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）から成る群より選択される１つ以上のＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程
    を含み、
    　前記複数のペプチドは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドであり、かつ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしている、
    　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する被験者の細胞性免疫応答活性を測定する方法。
  2. 　前記複数のペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列の１５～２０アミノ酸長の断片に相当する複数のペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記複数のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列に沿って隣接するペプチドが互いに１０～１４アミノ酸オーバーラップしている、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記検体は全血である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記工程（２）におけるインキュベートは２～４時間行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　さらに以下の工程を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法：
    　（２ａ）前記工程（２）後の検体を凍結する工程；及び
    　（２ｂ）前記工程（２ａ）で凍結された検体を融解する工程。
  7. 　前記工程（３）において、Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する方法が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
PCT/JP2023/007658 2022-03-01 2023-03-01 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する細胞性免疫応答活性の測定方法 WO2023167250A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202263315164P 2022-03-01 2022-03-01
US63/315,164 2022-03-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023167250A1 true WO2023167250A1 (ja) 2023-09-07

Family

ID=87883828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/007658 WO2023167250A1 (ja) 2022-03-01 2023-03-01 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する細胞性免疫応答活性の測定方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023167250A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015529081A (ja) * 2012-09-06 2015-10-05 日立化成株式会社 ペプチド特異的免疫の評価のための方法
JP2018528974A (ja) * 2015-09-25 2018-10-04 フロリダ大学 リサーチファウンデーション インコーポレイティッド ヒトおよびネコにおけるワクチンのためのｈｉｖ、ｓｉｖおよびｆｉｖの交差反応性ｔ細胞エピトープ
WO2022086444A1 (en) * 2020-10-20 2022-04-28 National University Of Singapore A method to monitor virus- specific t cells in biological samples

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015529081A (ja) * 2012-09-06 2015-10-05 日立化成株式会社 ペプチド特異的免疫の評価のための方法
JP2018528974A (ja) * 2015-09-25 2018-10-04 フロリダ大学 リサーチファウンデーション インコーポレイティッド ヒトおよびネコにおけるワクチンのためのｈｉｖ、ｓｉｖおよびｆｉｖの交差反応性ｔ細胞エピトープ
WO2022086444A1 (en) * 2020-10-20 2022-04-28 National University Of Singapore A method to monitor virus- specific t cells in biological samples

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMARANTE, M.K. DE LUCCA, F.L. CORAL DE OLIVEIRA, C.E. PELEGRINELLI FUNGARO, M.H. VISSOCI REICHE, E.M. MUXEL, S.M. EHAR: "Expression of noncoding mRNA in human blood cells activated with synthetic peptide of HIV", BLOOD CELLS, MOLECULES & DISEASES, LAJOLLA, US, vol. 35, no. 2, 1 September 2005 (2005-09-01), US , pages 286 - 290, XP005074541, ISSN: 1079-9796, DOI: 10.1016/j.bcmd.2005.06.004 *
LE BERT NINA, CLAPHAM HANNAH E., TAN ANTHONY T., CHIA WAN NI, THAM CHRISTINE Y.L., LIM JANE M., KUNASEGARAN KAMINI, TAN LINDA WEI : "Highly functional virus-specific cellular immune response in asymptomatic SARS-CoV-2 infection", JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, US, vol. 218, no. 5, 3 May 2021 (2021-05-03), US , XP055936764, ISSN: 0022-1007, DOI: 10.1084/jem.20202617 *
TAN ANTHONY T., LIM JOEY M.E., LE BERT NINA, KUNASEGARAN KAMINI, CHIA ADELINE, QUI MARTIN D.C., TAN NICOLE, CHIA WAN NI, DE ALWIS : "Rapid measurement of SARS-CoV-2 spike T cells in whole blood from vaccinated and naturally infected individuals", JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. 131, no. 17, 1 September 2021 (2021-09-01), XP055936763, DOI: 10.1172/JCI152379 *
TROJAN, A. RAJESWARAN, R. MONTEMURRO, M. MUTSCH, M. STEFFEN, R.: "Real time PCR for the assessment of CD8+ T cellular immune response after prophylactic vaccinia vaccination", JOURNAL OF CLINICAL VIROLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 40, no. 1, 28 August 2007 (2007-08-28), NL , pages 80 - 83, XP022234009, ISSN: 1386-6532, DOI: 10.1016/j.jcv.2007.04.022 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Oliveira et al. SARS-CoV-2 and the COVID-19 disease: a mini review on diagnostic methods
AU2002314224B2 (en) Prenatal diagnosis method on isolated foetal cell of maternal blood
JP5805368B2 (ja) Ｉｐ−１０に基づく免疫学的モニタリング
EP3152232A1 (en) Determining antigen recognition through barcoding of mhc multimers
EP2084508B1 (en) Preparation method
US10018629B2 (en) Correlation of disease activity with clonal expansions of human papillomavirus 16-specific CD8+ T-cells in patients with severe erosive oral lichen planus
Alvarez-Lafuente et al. Human herpesvirus-6 and multiple sclerosis: relapsing-remitting versus secondary progressive
MXPA01010546A (es) Metodo para el diagnostico de encefalopatias espongiformes transmisibles.
US20230393121A1 (en) A method to monitor virus-specific t cells in biological samples
WO2023167250A1 (ja) 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する細胞性免疫応答活性の測定方法
Zindrou et al. Specific detection of Entamoeba histolytica DNA by hemolysin gene targeted PCR
Saiz et al. No evidence of CNS infection with Chlamydia pneumoniae in patients with multiple sclerosis
RU2656186C2 (ru) Вирус гриппа с и вакцина
US20150309048A1 (en) Methods and kits for detecting antigen-induced memory cd8+ t cells
CN105671188B (zh) 用于诊断结核分枝杆菌感染的分子标志物、引物组及应用
ES2715526T3 (es) Método para la detección de células inmunitarias específicas de antígeno en líquidos extrasanguíneos
WO2008154525A2 (en) Predicting vaccine efficacy
CN111440859A (zh) 一种人呼吸道合胞病毒感染的生物标志物及应用
US20150211063A1 (en) Methods of Screening for Susceptibility to Virus Infection
EP3735985B1 (en) A novel orthobunyavirus in human encephalitis and its diagnostic and therapeutic applications
WO2023018782A1 (en) Methods to determine cd4+ memory t cell responses to sars-cov-2 infection or vaccination
US20240180984A1 (en) Methods for determining tumor immune status
Rodin THE ROLE OF CYTOMEGALOVIRUS IN THE INFLAMMATION ASSOCIATED WITH HIV INFECTION AND AGING
Saito et al. Rapid and high throughput assessment of cellular immunity against SARS-CoV-2 based on the ex vivo activation of genes in leukocyte assay with whole blood
WO2009109604A1 (en) Method for detection of parvovirus b19 in blood or bone marrow

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23763507

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024504731

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A