JP2018528974A - ヒトおよびネコにおけるワクチンのためのhiv、sivおよびfivの交差反応性t細胞エピトープ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、図表、核酸配列、アミノ酸配列または図面をはじめとする、その全内容が本明細書に組み込まれる2016年2月2日出願の米国仮特許出願第62/290,297号および2015年9月25日出願の米国仮特許出願第62/233,07号の優先権を主張する。
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所による認可番号R01-AI65276およびR01−AI30904で政府支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
(1)Fabは、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む抗体の断片である。Fab断片は、抗体全体を酵素パパインで消化することにより生成して、無傷の軽鎖および1つの重鎖の一部を得ることができる。
(2)Fab'は、抗体分子の断片であり、ペプシンにより全長抗体を処理して、無傷の軽鎖および1つの重鎖の一部を得ることができる。2つのFab'は断片は、抗体分子毎に得られる。Fab'は、1つ以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端に、抗体ヒンジ領域から、いくつかの残基を付加することで、Fab断面とは異なっている。
(3)(Fab')2は、後の還元なしで、酵素ペプシンにより全抗体を処理することにより得られる抗体の断片である。F(ab')2は、2つジスルフィド結合により保持される2つのFab'のダイマーである。
(4)Fvは、完全抗体認識結合部位を含む最低抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合関係の1つの重鎖と1つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる(VH−VLダイマー)。この構成において、各可変ドメインの3つのCDRは、相互作用して、VH−VLダイマーの表面で抗原結合部位を画定する。集合的に、6つのCDRが、抗原結合特異性を抗体に与える。しかしながら、単一変数ドメイン(または抗体に特異的な3つCDRしか含まないFvの半分)でも、全結合部位よりも低めの親和性であるものの、抗体を認識し結合する能力を有している。
(5)一本鎖抗体(「SCA」)、遺伝子的に溶融した一本鎖分子として、好適なポリペプチドリンカーにより結合した軽鎖の可変領域(VL)、重鎖の可単一変領域(VH)を含む遺伝子工学分離として定義される。かかる一本鎖抗体はまた、「一本鎖Fv」または「sFV」抗体断片とも呼ばれる。概して、Fvポリペプチドは、VHとVLドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、sFvが、抗原結合のために所望の構造を形成できるようになっている。sFv断片についての考察は、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal 抗体, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, N.Y., pp. 269 315(1994)にある。
HIV/AIDSに対するワクチン予防における最近の開発によって、防御免疫に関する知識が向上したが[1-3]、世界中に広めるための安全性および有効なワクチンの導入は差し迫っていない。ワクチン開発における調査は数多くなされているものの、これまで、僅か3つの候補しか、大規模フェーズIII臨床試験に達していない(IAVI臨床試験データベース、www.iavireport.org/Trials-Database/Pages/default.aspx, 2015年2月29日に評価)。最も成功したフェーズIII試験、RV144は、ハイリスクグループにおいて、最小防御3.7%で、HIV感染のリスクを全体の31.2%減少した。HIV陰性だったワクチン接種被験者は、V1V2ループでHIV−1エンベロープタンパク質(Env)に対して高レベルのIgG抗体を有していたが、Envに対するIgA抗体、またはHIV−1中和抗体は有していなった[5]。エンベロープのV2領域に対する多官能性CD4+T細胞およびCD4+細胞傷害性T細胞(CTL)様活性もワクチンにおいて検出された[6]。
動物 15匹のSPFネコを、フロリダ大学アニマルケアサービスと連携して比較免疫学およびレトロウイルス学研究所で飼育した。雌雄の同年齢のネコを4つのグループに分けた(表5)。IACUC認可の方針およびプロトコルに従って、動物実験を行った。
試作デュアルサブタイプFIVをプライミング用量として1回投与した。市販のデュアルサブタイプFIVワクチン(Fel-O-Vax(r)FIV)[13]を模した試作ワクチンは、4μgの組換えネコIL12(rFeIL12)(R&D Systems, Minneapolis, MN)を入れた1.20mLのFD-1(水中油型)アジュバント中に処方された、それぞれ300μgの不活性ホールウイルス(IWV)FIVペタルーマおよびIWV FIV静岡(計600μgのIWV)からなる。MAPは、LifeTein LLC(Hillsborough, NJ)により生成された。MAPは、アミノ末端の第1のリシン骨格にFIV p24(Fp)またはRT(FRT)ペプチドのいずれかの4つの同一分岐のある、リシン骨格に処方され、カルボキシル末端にパルミチン酸(CH3(CH2)14COOH)の第3のリシンを含んでいる(図10A)。MAP1は、フーリン官能性リンカー(トランスゴルジネットワークの開裂に感受性)と結合したp24ペプチドFp4-3およびFp14-1の分岐鎖からなっていた[29,30]。MAP1bは、4つの複製ペプチドFp14-1を含み、MAP2は、フーリンリンカーのない4つの複製ペプチドFRT3-3およびFRT3-4のオーバーラッピング配列を含んでいた。個々のMAPまたはMAPの組み合わせを、4μgのrFeIL12を入れた1mLの最終容積のFD-1アジュバントに処方した。
8匹のSPFネコに、試作デュアルサブタイプFIVワクチン(IWV)[13]により1回プライミングし、MAP1(ペプチドFp4-3/Fp14-1)、MAP1b(ペプチドFp14-1)および/またはMAP2(ペプチドFRT3-3/FRT3-4)の組み合わせでブーストした(グループ1および2、表5)。免疫付与は、皮下(SC, 500 μg IWV)および皮内(ID, 100 μg IWV)経路を用いたプライミング1回の後、4〜6週間後に、3〜12週間の間隔で、MAP(MAP SC毎に150μgプラスMAP ID毎に50μg)を4〜6回行った。SC免疫付与容積は、プライミング用の1mL(500μg)のIWV、ブースト用の0.75mL MAP(150μg単一MAPまたは300μg MAP1+2)からなり、ID免疫付与は、2つの部位で免疫付与された0.1mL/部位(50μg/部位IWV)または0.125mL/部位(25μg/部位単一MAPまたは50μg MAP1+2)からなる。ネコは、最後のブーストから6週間、in vivo由来サブタイプ-B 病原体FIVFC1の15×50%のネコ感染用量(15 CID50)で静脈内チャレンジを受けた[13]。3匹のIWV-プライミングネコ(グループ3)および4匹のPBS-免疫付与ネコ(グループ4)は対照として用いた(表5)。
IFNγおよびIL2 ELISpot分析を、記載されているとおり、ネコIFNγ ELISpotおよびネコIL2 ELISpotキット(R&D Systems, Cat# SEL764およびSEL1890)を用いて行った[31]。閾値は、MVS ELISpotリーダー(MVS Pacific, LLC)で計数したとき、1x106 PBMCあたり、?50のスポット形成単位(SFU)として定義する。各結果は、媒体対照の平均値の除算後の複製試料の平均である。
カルボキシフルオセインジアセテートスクリンイミドエステル(CFSE)増殖を、メーカーのプロトコル(Invitrogen, Grand Island, NY)に従って行い、前述の修正を用いて処理した[11,12]。修正は、培養媒体(RPMI媒体25g/mLゲンタマイシンおよび10%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS))中4μg/mLペプチドにより、2.5x105 CFSE標識ネコPBMCを5日間刺激した(37°C, 5% CO2)。ペプチドプールは、それぞれ4μg/mLの3-5オーバーラッピングペプチドからなっていた。フローサイトメトリーベースの増殖分析は、二次ヤギ抗マウスIgG3- APC/CY7 M Ab(SouthernBiotech, Birmingham, AL; Cat# 1100-19)と組み合わせたマウス抗ネコ(Fe)CD3モノクローナル抗体(Drs. Yorihiro NishimuraおよびTakayuki Miyazawa の好意により提供されたMabクローン[32])、マウス抗FeCD4-PE MAb(SouthernBiotech, Cat# 8130-09)および二次ヤギ抗マウスIgG2a-PE/CY7(Southern Biotech, Cat# 1080-17)と組み合わせたマウス抗FeCD8 MAb(Dr. Nazareth Gengozianの好意により提供されたMAbクローン[33])からなっていた。ネコB細胞(SouthernBiotech, Cat#1665-11)を検出するためのマウス抗B220-APC Mabおよび前述のCFSE のためのMAbsを、FACSフェノタイプのために用いた。FACSフェのタイプとCFSE-増殖分析は両方共、BD LSRIIおよびFACSDivaTM ソフトウェア(BD Biosciences, San Jose, CA)を用いて行った。各試料の最終値は、>1 CFSElowの正の閾値を用いて、媒体対照の平均値の減算後誘導した。
FIV感染を、実験中および実験終了後に集めたPBMCからウイルス分離することにより判断した。骨髄(BM)およびリンパ節(LN)を、実験終了時に集めた。連続モニタリングのために防御済みネコ(SBA)についてBM吸引物およびLN生検を集めた。4週間にわたって、1週間毎に2回採取した培養液のRT分析および培養組織(PBMC、BMおよびLN)のenv特異プロウイルスPCRにより、FIV感染を検出した[13,34]。PBMCウイルス負荷を、チャレンジ後(wpc)14週間からモニターし、2-4 時点から判断した。ウイルス負荷分析は、合計1mLの培養媒体(37°C, 5% CO2)において、未感染SPFネコから2.5x105フィーダーPBMCにより4倍で共生培養した各チャレンジネコからの101、102、103、104、105および106 PBMCからなっていた。PBMCを、3-4日毎に2週間にわたって新たな培養媒体に再懸濁し、集めた流体のFIV力価をRT分析により評価した。4匹のネコ(OCA, OCF, 5HS, DVC)は、9-14 wpcで終了して、早期感染中およびウイルスセットポイントを判断するには早すぎる時点で、病原体FIVFC1-誘導病理学について組織を評価した。
チャレンジ後MAP1/MAP2ブースト後61wpcまたは14週のネコSBAからのPBMCおよびSPFネコからのPBMCを7〜8時間(37°C, 5% CO2)、各ペプチドまたはMAPの存在下、RT-PCRの採取前に培養した。試験したペプチドおよびMAPは、次のものからなっていた。5% FBSおよび2.5x106PBMC/mLの培養媒体中、ペプチド/MAP組み合わせ1(P1: 5 μg/mLそれぞれFp4-3プラスMAP1c)、ペプチド/MAP組み合わせ2(P2: 5 μg/mLそれぞれFp14-1, FRT3-3, FRT3-4, MAP1bプラスMAP2)およびT細胞マイトジェンブドウ球菌エンテロトキシンA(SEA, 0.2 μg/mL)。前述したとおり、ネコIFNγ、IL2、パーフォリン、グランザイムA(GrzA)およびGrzBのmRNAレベルをRT-PCRにより求めた[16]。ネコサイトカインおよび細胞毒についてのプライマーセットの配列を表6に示す。各アクセッション番号は、誘導された完全または部分配列のものである。複数のアクセッション番号は、プライマー対配列および増殖生成物のサイズで観察された100%保存を表している。増殖配列は、Eruofins MWG Operon LLC(Louiville, KY)により配列決定し、対応のサイトカインまたは細胞毒について正しい配列と判断された。
FIVウイルス増加または減少を、IFNαのIFNγおよびFIV抑制作用のFIV増加活性について記載した方法の48ウェル修正版を用いて求めた[37]。簡単に述べると、非感染のSPFドナーからの0.25-0.5x106非刺激PBMCを、7μg/mLのMAP1、MAP2、MAP1c、MAP1b、MAP1+MAP2(合計14μg/mL)またはペプチドFp4-3、Fp14-1、FRT3-3、FRT3-4または負の対照ペプチドHp15-1により、最終容積1mL/ウェルで培養した。MAP1cは、ペプチドFp4-3の4つの分岐鎖を含んでいた。4μg/mLのT細胞マイトジェンコンカナバリンA(ConA)を、感染増加対照として用いた。ペプチド、MAPまたはConA培養6時間後、異なる希釈度のFIVFC1をウェルに添加した。72時間後、同量の対応のペプチド、MAP、ConAまたは媒体を用いて、ConA-刺激自家PBMC(0.25-0.5x106)による新たな培養媒体中で細胞を再培養した。培養7、10および13日に、0.5mLの媒体液体を集め、0.5mLの新たな媒体を添加して、一定の容積に維持した。採取した培養試料を、前述のRT分析を用いてFIV力価について分析した[13,34]。結果を、異なるSPFドナーからのPBMCを用いた2つの実験からの終点希釈力価として示す。
ペプチドまたはMAP培養試料と、ウイルス制御試料または特定のMAP培養試料の終点希釈力価間の統計的有意差を、両側分布による対スチューデントt検定を用いて計算した(SigmaPlotバージョン11.0)。ワクチン接種前後の統計的比較を同時に行った。比較は、p<0.05のとき統計的に有意と考えられた。
MAPブーストの液性免疫原性
IWVプライミングの3週間後、p24に対する抗体応答を検出したが、RTでは検出されなかった(図10B、レーン2)。最後のMAPブースト後かつチャレンジ前5週間で、試験した全5匹のIWV/MAP-ワクチン接種ネコの血清は、p24に対する抗体レベルを維持または減少させた(図10B、レーン3)。1X IWVプライムは、SUまたはTM抗体を含んでいなかった。個々のペプチド特異ELISA分析を行って、IWVにより誘導された抗体を、MAP中の個々のペプチドにより誘導された抗体と区別した。ワクチン接種全体にわたって、ペプチドFp4-3、Fp14-1、FRT3-3およびFRT3-4に対する特定の抗体は検出されなかった(データ示さず)。予測どおり(プライミング後、SUまたはTMに対する抗体がないため)、チャレンジ前のワクチン接種ネコにおいて、FIVウイルスNAbは検出されなかった(データ示さず)。
中程度のIL2生成(図10D)以外に、FIV p24、RTペプチドおよびペプチドプールに対する強固なT細胞増殖(図10C、図10D)およびIFNγ生成(図10C)が、最後のブーストと後4週間かつチャレンジ前にグループ1および2のMAPワクチン接種ネコのT細胞およびPBMCで観察された。ペプチドプールFp4、Fp14およびFRT3は、それぞれ、Fp4-3、Fp14-1およびFRT3-3/FRT3-4ペプチドと、前述したとおり、2-3オーバーラッピングおよび/または近接ペプチドとを含んでいた[11,12]。特に、ワクチン接種ネコのCD3+CD4+T細胞は、CD3+CD8+T細胞も高レベルおよび頻度で、ペプチドプールFp4およびペプチドFp4-3に応答した(図10C、図10D)。しかしながら、CD3+CD8+T細胞は、CD3+CD4+T細胞よりも高い頻度および大きな規模で、ペプチドプールFRT3およびペプチドFRT3-3、FRT3-4に応答した。プールFp14およびペプチドFp14-1に対するT細胞応答は、FRT3プールおよびFRT3-3/FRT3-4ペプチドに対するCD8+T細胞や、Fp4プールおよびFp4-3ペプチドに対するCD4+T細胞応答よりも低く、頻度が低かった。概して、ペプチドプールによる刺激は、個々のペプチドよりもやや高い頻度および大きな規模であった(図10C〜図10F)。4匹のワクチン接種しなかったSPFネコおよび8匹のワクチン接種前のSPFネコは、これらのペプチドプールおよびペプチドに対する応答が、最小(すなわち、2 CFSElow〜FRT3-3のネコDVC、3 CFSElow〜FRT3-4のネコOLI)〜応答なし、であった(データは示さず)。ペプチドプールは、ペプチドと、近接するオーバーラッピングペプチドの関連セグメントの添加の影響を判断するために含められた(表7)。ターゲットペプチドと同一の8つ以上のオーバーラッピングaaのプールのペプチドは(すなわち、MAPワクチン接種に用いられるもの)は、MHCのポケット結合能に基づいて、T細胞を刺激する能力を有している。従って、これは、ペプチドプールの応答が大きな規模および高い頻度となっている。個々のペプチドに比べて、これら配列のプール内の全体量が多いからである。
チャレンジの際、MAPワクチン接種グループ1の4匹のネコ(SBA)のうち1匹は、ウイルス分離およびプロウイルスPCRによりFIV陰性であり、ウイルス特異FIV抗体について陰性であった(表5、図10A、レーン4、図11A)。このネコは、実験全体にわたって通常のCD4+T細胞数を示した。グループ1の他の2匹のネコ(OCA, OCF)は、部分的な防御を示し、1匹のネコは、CD4+T細胞喪失における大幅な遅延を示した(表5)。部分的防御は、感染ウイルス検出の遅延、CD4+T細胞における遅延および/またはウイルスコントロールに比べて低いウイルスセットポイントと定義された(グループ4)。また、1回のMAP1ブーストのみのグループ2の4匹のネコ(DVB)のうち1匹も部分的防御を示した(表5)。また、ネコDVBは、抗TM抗体に対する閾値(0.2 O.D.)がかなり低い(図11A)。完全防御されたネコ(SBA)以外全てのネコは、実験終了時、全ての試験組織(PBMC, BM, LN)において、ウイルス分離およびプロウイルスPCRにより陽性であった(表5)。
理想的には、全てのネコにFIVチャレンジの前にCTL関連細胞毒mRNA分析を行っておき、感染の遅延および低いワクチン接種ネコのウイルス負荷は、期待される成果であったが、完全な防御ネコを与えられることは予想していなかった。従って、ペプチド特異T細胞増殖およびサイトカイン(IFNγおよびIL2)生成分析を実施した後、これらのネコは感染についてチャレンジおよび評価を受け、組織について終了した。1匹の防御されたネコSBAだけが終了せず、1年にわたって感染およびチャレンジ後ブースト免疫について続けてモニターした。他のペプチドの防御潜在性を減少させるFp4-3ペプチドの可能性を試験するために、MAP1プラスMAP2により47 wpcでブーストさせた。チャレンジブースト後14週で、Fp4-3とMAP1cの組み合わせ、およびFp14-1/FRT3-3/FRT3-4ペプチドと、MAP1bと、MAP2との組み合わせに対して、サイトカイン(IFNγおよびIL2)ならびに細胞毒(パーフォリン、GrzA、GrzB)のmRNA生成についてPBMCを分析した。Fp4-3刺激は、PBMCにおいて、SEA刺激に匹敵する、Fp4-3に対する高IFNγ mRNAレベルならびに低IL2およびGrzA mRNAレベルであるが、検出可能でないレベルのFp4-3特異パーフォリンまたはGrzBを誘導した(図11B、11C)。
防御ネコの応答結果およびグループ3における感染の潜在的な増加は、FIV感染に対するp24およびRTペプチドのウイルスの増加と減少の影響の評価を促すものである。ペプチドFp4-3およびMAP1は、FIV感染を大幅に増加するが、Fp14-1およびMAP1bは影響されない(図11D)。ペプチドFRT3-4およびMAP2は、FIV感染を大幅に減少した(p<0.05)が、ペプチドFRT3-3では大幅な増加が観察された(p<0.001)。恐らく、MAP2におけるFRT3-3とFRT3-4の自然なオーバーラップにより、FRT3-3ペプチドよりFRT3-4の方が細胞処理または細胞認識がなされ、感染の大幅な抑制となった。
これまで、HIV−1に対する最良の臨床ワクチン実験(RV144)は、カナリア痘等ウイルス(ALVAC)ベクタードHIV−1 gag/pr/env 免疫付与2回に続いて、組換えEnv−B/E(AIDSVAX)と組み合わせたALVAC−HIV免疫付与2回からなるプライムブーストアプローチを用いてきた[4]。FIV/ネコモデルの同様のプライムブーストアプローチを用いて、ALVACサブタイプ−A FIVVille-Franche gag/pr/envによるプライミング2回に続いて、サブタイプ−A FIVPet感染細胞ワクチン(ICV)によるブースト1回により、相同のチャレンジに対する100%の防御および非相同チャレンジに対する100%の一部〜100%の防御を与えた[42]。本実験において、ネコは、試作IWVによりプライミングされ、レンチウイルス内に保存された3つのT細胞エピトープペプチドおよびFIVサブタイプ内にのみ保存された他のT細胞ペプチド(Fp4-3)を含有するMAPワクチン処方の組み合わせによりブーストされた。試作デュアルサブタイプFIVワクチン(IWV)は、T細胞免疫をさらに誘導し、市販のFIVワクチンよりもtier-2およびtier-3ウイルスに対する防御を与えると報告されている[13,15,16]。この予備実験は、プライムブーストモデルを用いた抗FIVT細胞免疫を生成しかつ評価し、Pam-MAPの安全性を評価するために設計されたものであり、大きな防御を与えるとは考えられなかった。しかしながら、設計されたワクチンは、限られたペプチドレパートリーにおいて有効性が証明されており、MAPワクチングループ1において75%の一部または全ての防御を与えた(表5)。
a 略称: 試作 デュアルサブタイプ不活性ホールウイルスワクチン(IWV)、MAP1プラスMAP2(MAP1+2)、ウイルス分離(VI)、プロウイルスPCR(PCR)、ウイルスセットポイント(VS)、実施せず(n)、陰性(-)、骨髄(BM)、リンパ節(LN)、チャレンジ後週(wpc)、抗膜貫通Ab(TM Ab)
b 14-47wpc未満、最後のレーンは、14 wpc で開始したPBMCからの複数の時点でのウイルスセットポイントの平均である。
c 60%のCD4+T細胞喪失が検出されたときの、チャレンジ後週数。SBAネコのCD4+T細胞数およびCD4+/CD8+T細胞比は 61 wpcでなお標準であった。
d 検出可能なTM Ab 力価による第1の時点(図12Aの0.2 O.D.の閾値)。
e 部分的防御は、VIにおける遅延、CD4+T細胞喪失における遅延および/または対照グループに比べて低いウイルスセットポイントを表している。
f 5HSネコ、OLKネコおよび2匹以上のネコ(OCA, DVC)を、それぞれ、10 wpc、12 wpcおよび14 wpcで安楽死させた。全組織を、終末時にFIV試験したが、ウイルスセットポイントは、早い時点であるため、OLKネコについてのみ判断した。
MAPワクチン研究1に関する情報は全て、FIVペプチドエピトープの選択についての特定の情報を除き、手書き原稿である。ペプチド選択は、下記の表9および10の要約データに記載してある。
HIV−1およびFIVワクチンのためのエピトープの選択は、FIVとHIV−1の間で保存されたウイルスエピトープを認識するために、HIV−1陽性(HIV+)のヒト被験者とFIVワクチン接種ネコの両方からのT細胞の能力に基づいていた。なお、ペプチドエピトープは、エフェクター活性を発揮するT細胞を刺激することのできる最小アミノ酸(aa)配列である。本実験において、CD3+CD4+T細胞およびCD3+CD8+T細胞のペプチド特異免疫学的活性を評価して、CD4+Tヘルパー(TH)、CD4+細胞傷害性T細胞(CTL)、多官能性CD4+T細胞、多官能性CD8+T細胞およびCD8+CTLエフェクター活性を確認した。このように、強固な抗HIVおよび抗FIVエフェクター活性を誘導するペプチドエピトープが、ワクチン免疫原として選択される。
MAPワクチン実験1
試作MAPワクチン実験1は、主に、手書き原稿(実施例1)およびヒト細胞を用いて同様のデータによる2つの文献(Sanouら2013; Roffら2015)におけるFIVワクチン接種ネコのPBMCおよびT細胞の予備免疫分析からのデータに基づいていた。これらの文献は、HIV+被験者からのPBMCおよびT細胞が選択したFIVペプチドと交差反応性であることを示している。
ワクチンペプチドの選択はまた、ペプチドFp4-3が、ワクチン免疫原として有益でなく、実際は、FIV感染を増加し、オーバーラッピングFRT3-3/FRT3-4ペプチドの防御有効性が失われることが分かったMAPワクチン実験1(実施例1参照)からの結果にも基づいていた。E/S分析はまた、Fp4-3のFIV増加活性も示した(図11D)。ペプチドFp14-1を有するMAPは、MAPワクチン実験1において有効性が最小であったため、MAPワクチン実験2には含めなかった。ペプチドFRT3-3はin vitroFIV増加活性を有するという事実から、MAP2は、オーバーラッピングFRT3-3/FRT3-4ペプチドからなっていた。オーバーラップの形態において、このペプチドは、むしろ、in vitroでFIV減少活性を有しており(図11D)、これを用いた(図12)。
予備実験で、3つのFIVペプチドを、FD-1アジュバント(Fort Dodge Animal Health)(水中油型)に混合した3つのMAP処方へと処方し(Colemanら2014)、混合MAPワクチンとして用いた。1つのMAPは、単一のペプチドエピトープ(Fp14-1)を含んでいた。残りの2つのペプチドまたはMAPは、2つの明確に定義されたT細胞エピトープ(FRT3-3/FRT3-4, Fp4-3/Fp14-1)を含んでいた。in vitro分析において、ペプチドFp4-3は、最小のIL2生成で、有意のCD4+T細胞増殖および中程度のIFNγ生成を誘導した(表9)。同様に、ペプチドFp14-1は、CD8+T細胞増殖(25%)よりもCD4+T細胞増殖(37.5%)において、僅かに多いレスポンダー頻度を有していた。このペプチドは、高レスポンダー頻度のIL2生成(62.5%)および僅かな頻度のIFNγタンパク質(12.5%)を有していた。対照的に、MAP2におけるオーバーラッピングFRT3-3/FRT3-4ペプチドおよび個々のペプチドは、CD8+T細胞増殖(44.4%)においては相当のレスポンダー頻度であったが、CD4+T細胞増殖(0%-33.3%)においては、ゼロ〜中程度の頻度を誘導した(表9)。MAP2は、高IL2生成を誘導し、これは、IFNγ生成より僅かに高かった。FRT3-3とFRT3-4は両方共、中程度の頻度のIL2を誘導したが、FRT3-4だけはFRT3-3による最小の頻度で、中程度の頻度のIFNγを誘導した。
MAPワクチン実験2において、有意のCD8+T細胞誘導活性を備えたFIVエピトープを、FIV構造/酵素タンパク質のペプチドエピトープと組み合わせた。各MAPを、予備MAP実験で実施したように、ネコIL12(FeIL12)を補ったアジュバントと別箇に混合し、免疫付与の一回ワクチンとして混合する前に10〜20時間冷蔵した。17匹の同年齢の特異病原体フリーのネコを3つのグループに分けた。グループ1(n=5)は、試作FIVワクチンでプライミングし、混合MAPワクチンで3回ブーストした。グループ2(n=6)は、プライミングなしで、混合MAPワクチンで3回ワクチン接種した。グループ3(n=6)は、半分に分け、PBSまたはFeIL12を補ったアジュバント中PBSにより免疫付与した。ワクチン接種期間のインターバルは4〜5週間の間で変え、最後のワクチン接種とFIVチャレンジのインターバルは、グループ1については5週間、グループ2および3については6週間であった。予備MAPワクチン実験と同じく、ネコに、SCおよびID免疫付与した。しかしながら、MAPの総量は、前回の実験と異なっていた。グループ1および2の各ワクチン接種の用量を図12に示す。継続実験は、2回および3回目のワクチン接種でMAPの総量が多く、MAP免疫原は、IDワクチン接種の方がSCワクチン接種よりも多かった。後者の理由は、IDワクチン接種は、概して、粘膜部により多くのT細胞免疫を誘導するため、パルミチン酸を含むMAP骨格に対する抗体生成の可能性を減じるからである。予備実験において、MAPにおける個々のFIVペプチドに対するELISA抗体は、検出されず、MAP1に対する抗体は、2〜3回目のブーストと同じ位早く検出され、MAP2に対する抗体は4回目のブースト後に有意に検出された。継続実験において、ネコは、抗MAP抗体生成の可能性を減じるために、3回のMAPワクチン接種のみを受けた。さらに、3回のワクチン接種は、4回のワクチン接種より、獣医にとっても楽である。
表10は、交差反応性FIVペプチドエピトープのHIV−1の対応ペプチドも、HIV+被験者のPBMCおよびT細胞において実質的なHIV特異免疫応答を刺激することを示している。この観察は、交差反応性FIVエピトープおよびその対応HIVエピトープは比較的保存されていることを示唆している。これはまた、かかる配列の変化は、HIV−1とFIVの両方のウイルス適合性に悪影響を及ぼすから、エピトープ配列のアミノ酸(aa)が、実質的に変化しないことも示している。HLA/FLA別基準標本に結合するaa残基のHIV/FIV対応エピトープは、比較的保存またはより類似のaa変化である。実験では、HIV/FIV構造および酵素タンパク質にあえてT細胞エピトープを選択した。これらのタンパク質は、補助タンパク質(Vpr, Vpu, Nef)よりウイルス適合性に影響しそうなためである。さらに、FIVウイルスは、Vpr、VpuまたはNefを有さず、これらの補助遺伝子のない市販のFIVワクチンの開発は成功していた(Sidneyら、2008)。このように、ウイルス構造/酵素タンパク質のHIV対応エピトープペプチドは、T細胞ベースのHIV−1ワクチンのための免疫原として有用である。
HIV−1ペプチドの選択は、FIVペプチドを評価するのと同様である。目標は、ヒト用のHIVワクチンを開発することであるため、表9に示した交差反応性FIVペプチドのHIVペプチド(表10)対応物を、HIV+被験者のPBMCおよびT細胞で試験した。分析された免疫機能は、ELISpotによるヒトIFNγ生成、ICSによる細胞溶解素/細胞毒生成、およびHIV+被験者のCD3+CD4+およびCD3+CD8+T細胞のCFSEベースの増殖であった(表10、第1のセットの結果)。また、ロスアラモス国立研究所(LANL)データベースを用いて、保存対応HIVペプチドの配列内に存在し得るCTL活性を有するHIVエピトープ配列のHLAアレルを同定した(表9、LANL CTL)。太字HLAクラス-Iサブタイプおよび太字2桁アレルは、「最良のCD8+CTLエピトープ」のものであり、太字でないものは、潜在的なCTLエピトープのアレルである。HLA-AおよびHLA-Bのみが、HLA別基準標本のポケットに結合するペプチドにおける類似性に基づいてスーパータイプと呼ばれるグループに分類された(Sidneyら2008)。HLA-DRB1のようなHLAクラスIIは、スーパータイプにはまだ完全には分類されていないため、HLA-DRB1アレルについての4桁の命名で示されている。
表10のHIV−1ペプチドの大半が、多くのHIV−1サブタイプ(サブタイプA, B, CおよびD)(表11および12)で保存されているため、HIV−1サブタイプA, B, CおよびDによるHIV−1常在国におけるワクチン免疫原として有用なペプチドとなるはずである。さらに重要なのは、HIV−1サブタイプCは、世界的に蔓延しているサブタイプであり、これにサブタイプBおよびAが続く(Taylorら2008)。
a B太字イタリックペプチドは、MAPワクチン実験で用いた。
b レスポンダーの頻度: 0%-1.4%(-), 1.5%-12.4%(±), 12.5%-25%(+), 25.1%-40%(++), 40.1%-54%(+++), >54%(++++)。
c 略称: CD4+T細胞(CD4+T)およびCD8+T細胞(CD8+T)増殖、細胞溶解素/細胞毒(cyto)生成、HIV感染のエンハンサー/サプレッサー(E/S)
d ネコのHLAアレルと同様の太字HLAスーパータイプ[5]または太字2-または4-桁アレル
e HLAクラスI(Net MHC)、クラスII(NetMHCII)および細胞障害性T細胞(NetCTL)のHLAスーパータイプについてのMHCベースのネットワーク
f 太字HLAスーパータイプまたは2桁アレルは、飼いネコのネコ白血球抗原(FLA)のペプチド結合ポケットに似たHLAタンパク質(すなわち、別基準標本)を発現する。
黄色のハイライトは、ブルーのハイライトの前に最初に終了することを表している。
a B太字イタリックペプチドは、MAPワクチン実験で用いたFIVペプチドのHIV-1対応物。
b レスポンダーの頻度: 0%-1.4%(-), 1.5%-12.4%(±), 12.5%-25%(+), 25.1%-40%(++), 40.1%-54%(+++), >54%(++++)。
c 略称: CD4+T細胞(CD4+ T)およびCD8+T細胞(CD8+T)増殖、CD4+(CyCD4)およびCD8+(CyCD8)T細胞の細胞溶解素および細胞毒生成、HIV感染のエンハンサー/サプレッサー(E/S)
d LANL CTLの太字スーパータイプまたは2桁アレルは、LANLの最良CTLリストからであり、アンダーライン/イタリックは、NetMHCおよび/またはNetCTLにより求められるのと共通している。
e HLAスーパータイプ[5]または2-または4-桁アレル
f HLAクラスI(Net MHC)、クラスII(NetMHCII)および細胞障害性T細胞(NetCTL)のHLAスーパータイプについてのMHCベースのネットワーク。
g 太字のHLAスーパータイプまたは2-桁アレルは、LANL CTLの太字と共通、下線/イタリックは、LANL CTLの下線/イタリックと共通
黄色のハイライトは、ブルーのハイライトの前に最初に終了することを表している。
a 2014年の特定の国の合計人口数(Pop. No.)
b CIA World Factbook using http://www.indexmundi.com/g/からの2013年度(HIVPR)の成人のHIV/AIDSの死亡または生存人口および%HIV有病率。
c 世界人口データベース(www. allelefrequencies.net/hla6006a.asp)におけるアレル頻度: USA NMDPヨーロッパ白色人種、USA NMDPアフリカ系アメリカ人、ナイジェリア(258)、ケニヤルオ族(265)、南アフリカ黒色人種(204)、南アフリカ白色人種(102)、フランスリヨン(4815)、ポーランドpop 3(2907)、中国雲南省(101)およびタイpop 4(16807)、骨髄(BM)レジストリ、幹細胞(SC)レジストリまたは人類学(Anthro)スタディ。
d [5]および生物医学糖尿病リサーチ学会に基づくスーパータイプ: www.socbdr.org/rds/authors/unit_tables_conversions_and_genetic_dictionaries/genotype_ serotype_and_supertype_classification/
e 太字スーパータイプ: 遺伝子座の>20%。
f 各HLA遺伝子座での共優性発現に基づく100%までのHLA-AまたはHLA-B。
g AIDSの進行の遅さ(*)または速さ(**)に関連する多重アレルのスーパータイプ。
h HLA-A29、B*4415、B48およびB*8201は、スーパータイプ状態が未知のため除いた。
i 2013年に報告された多数の突然死についての理由は不明。前年までの少ない人数の補正と思われる。
CD8+T細胞細胞毒(パーフォリン、GrzAおよびB)(Cyto);CD4+T細胞細胞毒 も高い(*);MAP(Fp4-3/Fp14-1)(**);ウイルス増加または減少(E/S);Tat-MAP(tMAP);パルミトイル化Pam-MAP(pMAP; ロスアラモス国立研究所データベース(LANL;進行中(Prog);実施せず(N);9月30日(Sept)または8月31日(Aug)に終了;レスポンダー頻度:0%-1.4%(-),1.5%-12%(±),12.5%-25%(+),26%-40%(++),41%-54%(+++),>54%(++++)。合計スコア = MHCスコアプラス3回生物学的スコア。太字HLAアレルは、FLAアレルと同様のペプチド結合領域またはポケット結合パターンを有する。EpiVax IncによるFLA/HLA混合複合分析に基づくFLA予想: FLA/HLA-*A3(75%) > B27(53%) > B44(33%)=A24(33%)=B7(33%) > A2(17%)=A1(13%) > B62(7%)=B8(7%) > A26/B39/B58(0%); FLA/HLA-DRB1*0101(40%) >0301(29%) >0401/0404/0405(20%) >1501(13%) >0801(7%) >1101(4%)。
動物および免疫付与
生後8週間の特定病原体除去(SPF)ネコをリバティ研究所から購入またはフロリダ大学で繁殖した。SPFネコを図6Bに示すようにグループに分け、第1回の免疫付与の前に3週間順化させた。全てのネコに、MAPワクチン(アジュバントまたはアジュバント/IL12入り)、FD-1アジュバント、FD-1アジュバント/IL12またはPBSのいずれかにより、6週間の間隔で、皮下または皮内経路により、合計3回免疫付与した。
カルボキシフルオセインジアセテートスクリンイミドエステル(CFSE)増殖分析は、メーカーのプロトコル(Invitrogen, Grand Island, NY)に従って行い、前述のとおり、次の修正を用いて処理した(Roffら(2015))。修正は、APC共役抗マウスIgG3(Southern Biotech, Birmingham, AL)と組み合わせた、T. Miyazawa(日本、東京大学)の好意により提供された抗ネコCD3抗体((クローンNZM1)、)、PE共役抗ネコCD4抗体(Southern Biotech)およびPE/Cy7-共役抗マウスIgG2b(Southern Biotech)と組み合わせた抗ネコCD8抗体(テネシー大学のN. Gengozianの好意により提供(Gengozianら(1997))):これにより、ネコCD3+CD4+T細胞およびネコCD3+CD4+T細胞の増殖を検出した。図(図7A−1、7B−1、7A−2、7B−2、7A−3、7B−3)に示した結果は全て、全対照ネコからの各結果の平均値を除算した後のものである。CFSE増殖の閾値は?0.5 CFSElowである。
FIV MAPおよびペプチドに対するPBMCのネコIFNγおよびIL2 ELISpot分析を、前述のとおり(Abbottら(2012))、ネコIFNγモジュラーキット(R&D Systems, Minneapolis, MN)およびネコIL2モジュラーキット(R&D Systems)を用いて行った。図(図8A−1、8B−1、8A−2、8B−2、8A−3、8B−3)に示した結果は全て、全対照ネコからの各結果の平均値を除算した後のものである。IFNγおよびIL2応答は、1x106 PBMCあたり、?50スポット形成単位(SFU)である。
サイトカイン(IFNγ, IL2, TNFα)、細胞溶解素(パーフォリン)および細胞毒(グランザイムAおよび B)mRNA分析を、前述したとおり、全ネコからのPBMCを用いて行った(Aranyosら(2016); Omoriら(2004))。全サイトカインmRNAおよびパーフォリンmRNAについてはPCR増幅サイクルを35とし、グランザイムAおよびB mRNAについては45とする修正を行った。図9Aおよび9Bに示した結果は全て、全対照ネコからの各結果の平均値を除算した後のものである。閾値は?2%相対密度値である。
序論
多重抗原ペプチド(MAP)実験の目的は、1)前のMAP実験1で最良の免疫原性を与えた4つのMAPを用いてMAPワクチンの免疫原性および2)個々のMAPを構成するペプチドの最良の免疫原性を誘導するワクチン接種経路を判断することであった。全ての特定病原体除去(SPF)ネコに、100μgの各MAPから構成されたMAPワクチンをワクチン接種し、ワクチン用量あたり合計400μgとした。この量は、前のMAP実験1での合計量より半分近く少なかった。
前のMAP実験1に基づいて、本実験2は、ワクチン接種2回目6週間後(図7A−1、7B−1、8A−1、8B−1)、ワクチン接種3回目3週間後(図7A−2、7B−2、7A−3、7B−3)およびワクチン接種3回目6週間後(図7A−3、7B−3)の免疫原性を評価した。実験1と同様の免疫パラメータを、実験2で評価した。評価した第1のパラメータは、個々のMAPおよび各MAPを構成するFIVペプチドに対するCD4+T細胞(図7A−1、7A−2、7A−3)およびCD8+T細胞(図7B−1、7B−2、7B−3)の増殖応答であった。分析は、CD3+CD4+T細胞(またはCD4+T細胞)およびCD3+CD8+T細胞(またはCD8+T細胞)を同定するために、ネコCD4, CD8およびCD3に対して個々に標識抗体と組み合わせて用いられる、蛍光活性化セルソーター(FACS)ベースのカルボキシフルオセインジアセテートスクリンイミドエステル(CFSE)増殖分析からなっていた(Aranyosら(2016))。CD8+T細胞のFIV特異活性化により、CD8+T細胞の下位個体群を、FIVチャレンジしたワクチン接種ネコにおいてFIV感染細胞を殺すCD8+細胞傷害性T細胞(CTL)へ分化させることができる。同様に、CD4+T細胞のFIV特異活性化により、CD4+T細胞の下位個体群を、FIVチャレンジのワクチン接種ネコにおいてFIV感染細胞を殺すCD4+CTLへ分化させることができる(Abbasら(2015); Brownら(2010))。また、かかるワクチン誘導活性化により、ワクチン接種ネコにおいて、直接的または間接的にFIV特異CD8+CTLおよびCD4+CTL活性を増加するCD4+Tヘルパー(Th)細胞になるCD4+T細胞の下位固体群を誘導することができる(Abbasら(2015); Brownら(2010))。
FIV特異CD4+T細胞増殖応答は、さらなるワクチン接種により、頻度(MAPおよびペプチドバーの総数)および規模(各MAPまたはペプチドバーの高さ)が増加した(図7A−1対7A−3)。T細胞応答は、ペプチドと相互作用する主要組織適合遺伝子複合体(MHC)に基づくため(Abbasら(2015))、不活性化ホールFIVウイルス(IWV)を、陰性または最小応答対照刺激剤として用い、T細胞マイトジェンコンカナバリンA(ConA)を陽性対照として用いた。実験2における3回目のワクチン接種後3週間と、3回目のワクチン接種後6週間のFIV特異応答の頻度の比較をしたところ、略同じであった(図7A−2対7A−3)。さらに、SQ MAPワクチン接種ネコからのCD4+T細胞は、MAPワクチン接種ネコからのものよりも、FIV特異CD4+T細胞増殖応答が多かった(灰色バーの数が、青色バーの数より多い、図7A−1、7A−2、7A−3)。FIV特異CD4+T細胞増殖応答は前の実験1よりも頻度も大きかった(実験1のデータは示していないが、前回提出してある)。
FIV MAPおよびペプチドに対する最も高いIL2応答頻度が、3回目のワクチン接種後6週間よりも、2回目のワクチン接種後3週間のワクチン接種ネコからのPBMCで観察された(図8A−1対8A−3)。IL2応答の最も高い頻度は、2回目のワクチン接種後6週間で、ペプチドFRT3-3、Fp14-4およびFRT7-2で観察されたが、IL2応答の最も高い頻度は、ペプチドFRT3-4でしか観察されたなかった(図8A−1対8A−3)。この観察結果は、エピトープ応答の変化が、経時で生じたことを示していた。概して、IL2生成応答の頻度は、SQ MAPワクチン接種ネコからのPBMCとID MAPワクチン接種ネコからのPBMC間と同様であった(図8A−1、8A−2、8A−3)。
予備のサイトカイン/パーフォリン/グランザイムmRNA分析によれば、ペプチドFRT3-3、FRT3-4およびオーバーラップFRT3-3/4の組み合わせは、1匹のSQ MAPワクチン接種ネコからのPBMCにおいて、IFNγ、IL2、TNFαおよびGrzAの大部分のmRNA発現かつ非常に低レベルのパーフォリンを誘導することが示された(図9A)。次の最も頻度の多いmRNA発現は、Fp14-3、Fp14-4およびオーバーラップFp14-3/4からなるペプチドプールの同じネコからのPBMCの刺激の際のIL2、TNFαおよびGrzAについてであった。しかしながら、Fp9-3刺激ではmRNA発現は観察されず、FRT7-1、FRT7-2およびオーバーラップFRT7-1/2ペプチドプールで刺激したときにTNFαおよびIL2 mRNA発現のみが検出された。ID MAPワクチン接種ネコのPBMCにおいて、Fp14-3、Fp14-4およびオーバーラップFp14-3/4のペプチドプールおよびFRT3-3、FRT3-4およびFRT3-3/4のペプチドプールの刺激により、IL2発現は全て除き、IFNγ、IL2、TNFα、GrzAおよびGrzB mRNA発現が明らかに検出された(図9B)。これらの予備の結果によれば、サイトカイン/perf/Grz mRNA発現は、MAPワクチン接種ネコからのPBMCにおいてFIVペプチドにより誘導できることを証明している。mRNA発現のペプチド特異誘導はまた、CTL活性が、MAPワクチン接種ネコからのPBMCいにおいても存在していることが示される。
抗レンチウイルス免疫原性、ネコ白血球抗原(FLA)相互作用およびレンチウイルスaa配列保存に基づく、FIVにおけるT細胞エピトープ選択
CD8+T細胞細胞溶解素/細胞毒(パーフォリン, GrzAおよびB)(Cyto); CD4+T細胞細胞毒も高い(*);なお、p24またはRTからのペプチドは全て、有意のHIV+患者を用いてARTで分析したため、応答は非常に低い; ウイルス増加または減少(E/S);レスポンダーの頻度: 0%-1.4%(-), 1.5%-12.4%(±), 12.5%-25%(+), 25.1%-40%(++), 40.1%-54%(+++), >54%(++++)。太字HLAアレルは、FLAアレルと同様のペプチド結合ポケットを有する。
FIVペプチドの対応HIV−1ペプチドも、HIV+被験者からのPBMCおよびT細胞を用いて免疫原性について試験した。これらHIV−1ペプチドは全て、対応FIV配列による実質的に高いaa配列変換を有していた。p24またはRTからではないこれらのHIV−1ペプチドは、抗レトロウイルス療法(ART)のHIV+被験者からの結果であるため、非常に低い応答を有している。ARTのHIV+被験者は、概して、以前から報告があり(Mcllroy, 2013; Shanら2012)、本表に示すとおり、低いHIV特異免疫応答を有している。HRT7-1およびHRT7-2のまた、ARTのHIV+被験者からの細胞で試験した。陽性IFNγ ELISpot応答の閾値は、106 PBMCあたり、?75スポット形成単位(SFU)である。CFSEベースCD4+(CD4+T)およびCD8+(CD8+T)T細胞増殖の閾値は、?2% CD4+T細胞CFSElowまたはCD8+T細胞CFSElowである。CD4+T細胞(CyCD4)およびCD8+T細胞(CyCD8)におけるFACSベース細胞溶解素(パーフォリン)および細胞毒(グランザイムAおよびB)の細胞内サイトカイン染色(ICS)の閾値は、?0.2%である。レスポンダーの頻度を、試験した合計についての閾値レベル以上のレスポンダー数のパーセントで示す。0%-1.4%(-), 1.5%-12.4%(±), 12.5%-25%(+), 25.1%-40%(++), 40.1%-54%(+++), >54%(++++)。黒色の9つのHIV−1ペプチドは、本MAPワクチン実験で用いた対応FIVペプチドであるが、青色の13のペプチドは用いなかった。
CD4+およびCD8+T細胞細胞溶解素/細胞毒(パーフォリン, GrzAおよびB)(CyCD4およびCyCD8)。なお、HRT7-1およびHRT7-2を除いて、p24またはRTからではないペプチドは全て、ARTの有意のHIV+患者を使って分析したため、応答は非常に低い。レスポンダーの頻度: 0%-1.4%(-), 1.5%-12.4%(±), 12.5%-25%(+), 25.1%-40%(++), 40.1%-54%(+++), >54%(++++)。太字のLANL HLAアレルは、太字のin silico HLAアレルと共通。
チャレンジ後12 wk(wpc)までで、対照グループ3で防御が観察されなかったとき、グループ1および2は、それぞれ、60%および50%の防御率である。前の予備MAPワクチン実験における同じチャレンジ用量(15 CID50)で、最後の対照ネコは、12 wpcで感染し、これは、本MAPワクチン実験1と同時である。自然FIV感染用量は、2 CID50であるため(Yamamoto, 2009)、前および本チャレンジ用量は、12.5x自然感染用量である。より重要なのは、チャレンジFIVFC1ウイルスは、市販のデュアルサブタイプFIVワクチンにより誘導されるウイルス中和抗体に対して抵抗性がある病原体株であることであるウイルス中和抗体(Colemanら2014)。
合計CD8+T細胞増殖応答、合計CD4+T細胞増殖および全てのワクチンペプチドに対する累積CD8+T細胞/CD4+T細胞応答比を追加し示した(上3行)。合計で11のペプチドを分析したとき、CD8+T細胞増殖およびCD4+T細胞増殖のペプチドのパーセンテージ(%)、続いて、CD4+T細胞増殖によるペプチドの%に対するCD8+T細胞増殖によるペプチドの%を示す(中3行)。全てのワクチンペプチドに対するSFU/106 PBMCでの合計IFNγ応答および合計IL2応答を、各ワクチン接種ネコについて示す(最後2行)。赤色のグループ1(DV4, OLM)およびグループ2(DU5, DX1, OLL)は感染し、赤色の値は、これらのネコの防御が欠けている潜在的な理由を示唆するものである。6 wpc感染したグループ1の2匹のネコは、DVAとOLMである。これらのネコについては、IFNγおよびIL2生成は最も高かったが、CD8 T-Cell/CD4T細胞応答比は最も低かった。9 wpc 感染したグループ2のネコは、DU5とDX1であり、1匹のネコOLLは、12 wpc感染であった。これらのネコについては、3匹とも、IFNγおよびIL2生成は最も高かったが、2匹については、CD8T細胞/CD4T細胞応答比は最も低かった。代わりに、ネコDX1は、2番目に高いCD8/CD4T細胞応答比であったが、最高数(45%)のワクチンペプチド誘導CD4+T細胞増殖でもあった。DX1におけるCD4/CD8T細胞応答比は除き、12 wpcでの本結果は、高CD8/CD4T細胞応答比および低レベルのIFNγおよびIL2生成のワクチン接種ネコで防御が観察されることを示している。グループ1(DU1, DY2, EA4)およびグループ2(BFA, DU4, DX5)の防御ネコをさらに6週間モニターしたところ、完全防御か防御遅延のいずれかを示した。完全防御を確認するために、ネコは全て、PBMCばかりでなく、胸腺、骨髄、リンパ節細胞についてもFIV感染陰性でなければならず、感染誘導FIV抗体について陰性でなければならない。
MAPの各ペプチドの、5つの全てのFIVサブタイプ(A,B,C,D,E)中、アミノ酸(aa)配列保存について分析した。2つのペプチド配列間の符号は次のとおりである。同一aa(*);非常に類似aa(:);中程度に類似aa(.);赤色aa残基は、FIV(A,B,C,D,E)の対応のaa残基と類似していない。FIVサブタイプEのポリメラーゼ配列は、NCBI GenBankで利用不可である。MAP4のp24ペプチドFp9-3は、評価した5つの全てのFIVサブタイプの中で100%配列同一性を有しており、優れたワクチンペプチドである。次に高いaa同一性および類似性のぺプチドは、MAP5のFRT7-1/FRT7-2であり、MAP3のFp14-3/Fp14-4およびMAP2vのFRT3-3/FRT3-4がこれに続く。結論として、上位4つのMAPにおけるFIVペプチドは全て、高いaa同一性および類似性を有しており、これらは高度に保存され、優れたワクチンペプチドとなる。
FIVに対するワクチンについて4つの最良のFIVペプチドもまた、HIV+被験者からのT細胞により認識される。MAPワクチン実験1の2つの最良のワクチンペプチドは、ペプチドFp9-3(表20A)とオーバーラッピングペプチドFRT7-1/FRT7-2である(表20B)。FIVペプチドFp9-3は、対応のHIV-1ペプチド配列より類似性(53%)および同一性(13%)は少ないが(表20A)、このペプチドは、HIV+被験者のCD8+T細胞により一貫して大きな規模で検出される。FIVオーバーラッピングペプチドFRT7-1/FRT7-2は、HIV-1より、次に類似性(65%)および同一性(55%)の少ないものである(表20B)。他の2つのFIVオーバーラッピングペプチドFp14-3/Fp14-4(表20C)およびFRT3-3/FRT3-4(表20D)は、対応HIV-1ペプチド配列に対して、大きなaa配列類似性(表20Cにおいて75%、表20Dにおいて80%)、中程度〜大きなaa配列同一性(表20Cにおいて31−37%、表20Dにおいて70%)である。かかる配列保存はまた、対応のSIVペプチド配列にも存在する。このように、配列保存は、これらのFIVおよび対応のHIV-1ペプチド配列は、突然変異に対して抵抗がある可能性があり、主要突然変異はウイルス適合性に大きく影響し得るため、優れたワクチン免疫原として機能する。
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SEQ ID NOs:1-35および39-101は、本発明の範囲内のエピトープである。
SEQ ID NO:36は、FRT3-3ペプチド(KKKSGKWRLIDFRV)である。
SEQ ID NO:37は、FRT3-4ペプチド(WRLIDFRVLNKL)である。
SEQ ID NO:38は、本発明のペプチド(RVKR)に結合させるのに用いることができるリンカー配列の例である。
Claims (56)
- ヒトまたは動物に免疫不全ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、1つ以上の抗原および/または免疫原をヒトまたは動物に投与することを含み、前記1つ以上の抗原および/または免疫原は、1つ以上の進化的に保存されたエピトープを含み、前記エピトープは、2つ以上の異なる免疫不全ウイルス間で保存されている、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、
前記エピトープは、HIVとFIVとの間で保存されている、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記エピトープは、HIVとSIVとFIVとの間で保存されている、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記エピトープは、T細胞エピトープである、方法。 - 請求項4に記載の方法であって、
前記T細胞エピトープは、1つ以上のT細胞応答を誘導する、方法。 - 請求項5に記載の方法であって、
前記T細胞応答は、細胞毒、細胞溶解素および/またはサイトカインの生成および/または放出である、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 19-23, 26, 29-37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記抗原および/または免疫原は、ペプチドまたはタンパク質であり、前記2つ以上のペプチドまたはタンパク質は、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67の1つ以上のアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなり、前記ヒトまたは動物に投与される、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記抗原および/または免疫原は、ペプチドまたはタンパク質であり、前記ペプチドまたはタンパク質は、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかの2つ以上のアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記誘導された免疫応答は、CTL関連免疫応答および/またはTヘルパー(Th)免疫応答である、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記誘導された免疫応答は、CD4+および/またはCD8+T細胞応答の誘導を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
ヒトは、HIVおよび/またはFIVからの前記1つ以上の抗原および/または免疫原を投与される、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記動物は、ネコであり、FIVおよび/またはHIVからの前記1つ以上の抗原および/または免疫原が投与される、方法。 - 1つ以上の進化的に保存されたエピトープであって、前記エピトープは、2つ以上の異なる免疫不全ウイルス間で保存されている、エピトープ。
- 請求項15に記載のエピトープであって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、エピトープ。 - 請求項15に記載のエピトープであって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうち2つ以上のアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、エピトープ。 - 請求項15〜17のいずれかに記載の1つ以上のペプチドを含む、多重抗原ペプチド(MAP)構造。
- 請求項18に記載のMAPであって、
1つ以上のペプチドは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67の1つ以上のアミノ酸配列あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、MAP。 - 請求項18に記載のMAPであって、
前記MAPは、1つ以上のパルミチン酸部分を含む、MAP。 - 抗体またはその抗原結合断片であって、
i)FIVタンパク質またはエピトープに特異的に結合し、HIVタンパク質またはエピトープには結合しない、または
ii)HIVタンパク質またはエピトープに特異的に結合し、FIVタンパク質またはエピトープには結合しない、、または
iii)FIVタンパク質またはエピトープに結合し、かつ対応のHIVタンパク質またはエピトープにも結合する、または
iv)FIVまたはHIVエピトープを含むペプチドに結合し、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、抗体またはその抗原結合断片。 - 請求項21に記載の抗体であって、
前記抗体が、モノクローナル抗体である、抗体。 - 請求項21に記載の抗体であって、
前記抗体は、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67の1つ以上のアミノ酸配列あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなるエピトープに特異的に結合する、抗体。 - i)異なる免疫不全ウイルス間で進化的に保存された1つ以上のエピトープ、および/または
ii)前記1つ以上の進化的に保存されたエピトープを含む1つ以上のポリヌクレオチド、および/または
iii)2つ以上の免疫不全ウイルスからの配列を含む1つ以上のポリペプチド、および/または
iv)2つ以上の免疫不全ウイルスからの配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド、および/または
v)請求項18〜20のいずれかに記載のMAP構造、を含む組成物。 - 請求項24に記載の組成物であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、組成物。 - 請求項24に記載の組成物であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 19-23, 26, 29-37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、組成物。 - 請求項24に記載の組成物であって、
前記組成物は、2つ以上のペプチドを含み、前記2つ以上のペプチドは、独立して、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、組成物。 - 請求項24に記載の組成物であって、
前記組成物は、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかの2つ以上のアミノ酸配列あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなるペプチドまたはタンパク質を含む、組成物。 - 請求項24に記載の組成物であって、
前記組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、組成物。 - 請求項24〜29のいずれかに記載の組成物を含むワクチン。
- 請求項30に記載のワクチンであって、前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、ワクチン。
- ウイルスに感染したヒトまたは動物において、免疫不全ウイルスの感染を強化および/または潜伏感染を活性化する方法であって、SEQ ID NO:28, 30または36のアミノ酸配列を含む、またはからなるペプチドあるいは前記ペプチドを含む組成物またはMAP構造を前記ヒトまたは動物に投与することを含む、方法。
- 請求項32に記載の方法であって、
前記ウイルスは、FIVまたはHIVである、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:20, 26, 30, 35, 36, 37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、方法。 - 請求項15に記載のペプチドであって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:20, 26, 30, 35, 36, 37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、ペプチド。 - 請求項18に記載のMAPであって、
前記ペプチドは、SEQ ID NOs:20, 26, 30, 35, 36, 37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、MAP。 - 請求項21に記載の抗体であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:20, 26, 30, 35, 36, 37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、抗体。 - 請求項30に記載のワクチンであって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:20, 26, 30, 35, 36, 37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、ワクチン。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記動物は、ネコである、方法。 - 請求項1〜14、34または39のいずれかに記載の方法であって、
前記1つ以上の抗原および/または免疫原は、前記ヒトまたは動物に皮下または経皮投与される、方法。 - 請求項6に記載の方法であって、
前記細胞毒、細胞溶解素および/またはサイトカインは、IL2、IFNγ、腫瘍壊死因子α(TNFα)、パーフォリンまたはグランザイムAまたはBのうち1つ以上である、方法。 - 請求項1〜14、34または39のいずれかに記載の方法であって、
前記免疫応答は、前記免疫不全ウイルスによる感染に対する防御を与える防御免疫応答である、方法。。 - 請求項1〜14、34または39のいずれかに記載の方法であって、
前記免疫不全ウイルスは、FIVである、方法。 - 請求項1〜14、34または39のいずれかに記載の方法であって、
前記免疫不全ウイルスは、HIVである、方法。 - 請求項42に記載の方法であって、
前記免疫不全ウイルスは、FIVである、方法。 - 請求項42に記載の方法であって、
前記免疫不全ウイルスは、HIVである、方法。 - 請求項1〜14または39に記載の方法であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:26, 30, 35または88のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、方法。 - 請求項1〜14、34または39に記載の方法であって、
前記1つ以上の抗原および/または免疫原を前記ヒトまたは動物に皮下または皮内投与することを含む、方法。 - 請求項15に記載のペプチドであって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:26, 30, 35または88のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、ペプチド。 - 請求項49に記載の1つ以上のペプチドを含むMAP構造。
- 請求項24に記載の組成物であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:26, 30, 35または88のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、組成物。 - 請求項51に記載の組成物を含むワクチン。
- 2つ以上の異なる免疫不全ウイルス間で保存される1つ以上の進化的に保存されたエピトープをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項15〜17、35または49のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項53または54に記載のポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドが、DNAから構成される、ポリヌクレオチド。 - 請求項53または54に記載のポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドが、RNAから構成される、ポリヌクレオチド。
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