JP2009536021A - 関節リウマチの患者の末梢血白血球におけるFC受容体媒介性腫瘍壊死因子スーパーファミリ及びケモカインのmRNA発現の増大 - Google Patents

関節リウマチの患者の末梢血白血球におけるFC受容体媒介性腫瘍壊死因子スーパーファミリ及びケモカインのmRNA発現の増大 Download PDF

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Abstract

TNFSF−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11又はTNFSF−14の発現を変化させることを伴う関節リウマチの治療に対する患者の応答性を予測する方法を開示する。このような治療の有効性をモニタリングする方法も開示する。さらに、関節リウマチの治療に用いる化合物のスクリーニング方法を開示する。関節リウマチ患者の疾患状態を経時的にモニタリングする方法も開示する。

Description

本開示は、腫瘍壊死因子スーパーファミリメンバー又はサイトカインを伴う関節リウマチ治療に対する患者の応答性を予測する方法、このような療法の有効性をモニタリングする方法、及び関節リウマチの治療に用いる化合物をスクリーニングする方法に関する。本開示は、関節リウマチの患者の疾患状態をモニタリングする方法にも関する。
[関連出願の相互参照]
本願は、「関節リウマチ及び膠原病の患者の末梢血白血球におけるFC受容体媒介性TNFSFのmRNA発現の増大(ENHANCED FC RECEPTOR-MEDIATED TNFSF MRNA EXPRESSION IN PERIPHERAL BLOOD LEUKOCYTES IN PATIENTS WITH REHEUMATOID ARTHRITIS AND COLLAGEN DISEASES)と題され、2006年4月7日に提出された米国特許仮出願第60/790,511号(その全体が参照により本明細書中に援用され、本明細書の一部となる)に対する優先権を主張する。
自己免疫疾患は、宿主細胞と反応する抗体、又は自己反応性である免疫エフェクタT細胞のいずれかの生成を特徴とする。自己抗体は、重症筋無力症における抗アセチルコリン受容体抗体及び全身性エリテマトーデスにおける抗DNA抗体のように或る特定の種類の自己免疫疾患で頻繁に同定される。しかし、このような自己抗体は、多くの種類の自己免疫疾患では見られない。さらに、自己抗体は健常な個体では検出されることが多いが、このような抗体は自己免疫疾患を誘導しない。したがって、自己抗体の他に、未だに同定されていないさらなる機構が自己免疫疾患の病因に明らかに関与している。
自己抗体が標的となる宿主細胞と結合すると、補体カスケードが活性化し、標的となる細胞膜上にC5〜9膜攻撃複合体(membrane attack complex)を形成し、これが宿主細胞の破壊に繋がると考えられる(Esser, Toxicology 87, 229(1994)を参照されたい)。副生成物である、C3a、C4a、又はC5a等の走化性因子は、より多くの白血球を病巣へと補充する(Hugli, Crit. Rev. Immunol. 1, 321(1981)を参照されたい)。病巣に補充された白血球又は自然状態で存在する白血球は、Fc受容体(「FcR」)を介した抗体結合細胞(免疫複合体)を認識する。FcRが免疫複合体と架橋すると、白血球は、宿主細胞の表面上に存在する特異的な受容体と結合し、アポトーシス又は細胞損傷を誘導する(Micheau et al., Cell 114, 181(2003)を参照されたい)TNF−αを放出する(Debets et al., J Immunol. 141, 1197(1988)を参照されたい)。活性化FcRによって、走化性サイトカインの放出も始まり、様々なサブセットの白血球を病巣に補充する(Chantry et al., Eur. J. Immunol. 19, 189(1989)を参照されたい)。以上が、FcR関連自己免疫疾患の分子機構の全般的な仮説である。
関節リウマチ(「RA」)は、胃腸管の炎症を伴う免疫疾患である。臨床的には十分に特徴付けられているが、その病因は余り理解されていない。RAは、通常、末梢関節に対称的に分布して生じる慢性的炎症性滑膜炎を特徴とする。このことによって、軟骨破壊、骨侵食及び関節の完全性の変化が引き起こされ得る。RAの病因は未だに知られていないが、滑膜におけるCD4+T細胞の優勢、RA患者の血液及び血清における可溶性IL−2受容体(活性化T細胞によって産生される)の増大、並びにT細胞除去による疾患の顕著な改善のために、CD4+T細胞がこの疾患に関与する疑いが強い。治療は、鎮痛、炎症の低減、関節構造の保護、機能維持及び全身症候の制御に焦点を当てている。選択肢としては、アスピリン及び他の非ステロイド系抗炎症薬、メトトレキサート、金化合物、D
−ペニシラミン、抗マラリア薬、及びスルファサラジン等の抗リウマチ薬、グルココルチコイド、インフリキシマブ及びエタネルセプト等のTNF−α中和剤、並びにアザチオプリン、レフルノミド、シクロスポリン及びシクロホスファミド等の免疫抑制薬が挙げられる。療法の選択肢の選択がRA患者の疾患状態の評価に依存しているので、疾患状態を評価し、疾患の進行をモニタリングする新規の方法を開発することが望まれる。
TNFSF11(TRANCE、CDF254、及びRANKリガンドとしても知られている)は、活性化T細胞によって発現された場合に抗原提示樹状細胞の生存を高め、骨芽細胞によって発現及び分泌された場合に細胞表面受容体TNFRSF11(RANKとしても知られている)を介した破骨細胞の分化及び活性化を促進する、最近記載された腫瘍壊死因子スーパーファミリのメンバーである。破骨細胞は活性化すると骨吸収に関与し、何人かのRA患者で観察された骨侵食に一部関与し得る。
一実施の形態において、関節リウマチのヒトが療法に反応する可能性があるか否かを判定する方法であって、ヒト由来の白血球を含む第1のサンプルにおいてin vitroで白血球を刺激すること、刺激後、第1のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ(「TNFSF」)−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11、及びTNFSF−14から成る群から選択されるmRNAの量を測定すること、ヒト由来の白血球を含む第2のサンプルにおいてin vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、第2のサンプルにおいてmRNAの量を測定すること、並びに第1のサンプルにおけるmRNAの量と、第2のサンプルにおけるmRNAの量との比を求めることを含み、この比が約1.5:1以上である場合にこのヒトが療法に反応する可能性があると判定する方法が提供される。
さらなる態様において、第1のサンプルにおいて白血球を刺激することは、熱凝集ヒトIgGを第1のサンプルと混合することを含む。
さらなる態様において、第1のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィトへムアグルチニン(PHA)、コムギ胚芽凝集素(WGA)、コンカナバリン−A(ConA)、リポ多糖(LPS)、ジャカリン、フコイダン、熱凝集IgE、熱凝集IgA、及び熱凝集IgMから成る群から選択される作用物質を第1のサンプルと混合することを含む。
さらなる態様において、第1のサンプル及び第2のサンプルの少なくとも1つは全血を含む。
別の態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
さらなる態様において、療法はシクロスポリンA及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む。
一実施の形態において、関節リウマチ療法の有効性を評価する方法であって、ヒト由来の白血球を含む第1のサンプルにおいてin vitroで白血球を刺激すること、ヒト由来の白血球を含む第2のサンプルにおいてin vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第1のサンプル及び第2のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ(「TNFSF」)−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11、及びTNFSF−14から成る群から選択されるmRNAの量を測定すること、第1のサンプルにおけるmRNAの量と、第2のサンプルにおけるmRNAの量との第1の比
を算出すること、療法をヒトで行うこと、療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第3のサンプルにおいてin vitroで白血球を刺激すること、療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第4のサンプルにおいてin vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第3のサンプル及び第4のサンプルにおいて、mRNAのレベルを測定すること、第3のサンプルにおけるmRNAの量と、第4のサンプルにおけるmRNAの量との第2の比を算出すること、並びに第1の比と第2の比とを比較することを含み、これらの比の有意な差が効果的な療法の指標となる、関節リウマチ療法の有効性を評価する方法が提供される。
さらなる態様において、第1のサンプル及び第3のサンプルにおいて白血球を刺激することは、熱凝集ヒトIgGをサンプルと混合させることを包含する。
さらなる態様において、第1のサンプル及び第3のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィトへムアグルチニン(PHA)、コムギ胚芽凝集素(WGA)、コンカナバリン−A(ConA)、リポ多糖(LPS)、ジャカリン、フコイダン、熱凝集IgE、熱凝集IgA、及び熱凝集IgMから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合させることを包含する。
さらなる態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
さらなる態様において、第1のサンプル、第2のサンプル、第3のサンプル、及び第4のサンプルの少なくとも1つが全血からなる。
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第1の比が第2の比よりも大きいことである。
さらなる態様において、療法がシクロスポリンA及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む。
一実施の形態において、関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法であって、熱凝集ヒトIgGに曝される場合、白血球が、腫瘍壊死因子サブファミリ(「TNFSF」)−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11、及びTNFSF−14から成る群から選択されるmRNAの転写において少なくとも1.5の倍数増加を示すヒト由来の白血球を含む第1のサンプル、第2のサンプル、第3のサンプル、及び第4のサンプルを得ること、第1のサンプルにおいてin vitroで白血球を刺激すること、第2のサンプルにおいてin vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第1のサンプル及び第2のサンプルにおいて、mRNAの量を測定すること、第1のサンプルにおけるmRNAの量と、第2のサンプルにおけるmRNAの量との第1の比を算出すること、第3のサンプル及び第4のサンプルを作用物質に曝すこと、曝露後、第3のサンプルにおいて、in vitroで白血球を刺激すること、曝露後、第4のサンプルにおいて、in vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第3のサンプル及び第4のサンプルにおいて、mRNAのレベルを測定すること、第3のサンプルにおけるmRNAの量と、第4のサンプルにおけるmRNAの量との第2の比を算出すること、並びに第1の比と第2の比とを比較することを含み、これらの比の有意な差が推定の作用物質の指標となる、関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法が提供される。
さらなる態様において、第1のサンプル及び第3のサンプルにおいて白血球を刺激することは、熱凝集ヒトIgGをサンプルと混合させることを包含する。
さらなる態様において、第1のサンプル及び第3のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィトへムアグルチニン(PHA)、コムギ胚芽凝集素(WGA)、コンカナバリン−A(ConA)、リポ多糖(LPS)、ジャカリン、フコイダン、熱凝集IgE、熱凝集IgA、及び熱凝集IgMから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合させることを包含する。
さらなる態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
さらなる態様において、第1のサンプル、第2のサンプル、第3のサンプル、及び第4のサンプルの少なくとも1つが全血を包含する。
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第1の比が第2の比よりも大きいことである。
一実施の形態において、ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法であって、白血球を含み、ヒトから1回目に得られる第1のサンプルにおいて白血球をin vitroで刺激すること、刺激後、第1のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ(「TNFSF」)−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11、及びTNFSF−14から成る群から選択されるmRNAの量を測定すること、1回目にヒトから得られる白血球を含む第2のサンプルにおいて、in vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第2のサンプルにおいてmRNAの量を測定すること、第1のサンプルにおけるmRNAの量と、第2のサンプルにおけるmRNAの量との第1の比を求めること、白血球を含み、1回目に続く2回目でヒトから得られる第3のサンプルにおいて、in vitroで白血球を刺激すること、刺激後、第3のサンプルにおいてmRNAの量を測定すること、2回目でヒトから得られる白血球を含む第4のサンプルにおいて、in vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第4のサンプルにおいてmRNAの量を測定すること、第3のサンプルにおけるmRNAの量と、第4のサンプルにおけるmRNAの量との第2の比を求めること、並びに第1の比と第2の比とを比較することを含み、第1の比と第2の比との有意な差が疾患状態の変化の指標となる、ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法が提供される。
さらなる態様において、第1のサンプル及び第3のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ヒト熱凝集IgGをサンプルと混合させることを包含する。
さらなる態様において、第1のサンプル及び第3のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィトへムアグルチニン(PHA)、コムギ胚芽凝集素(WGA)、コンカナバリン−A(ConA)、リポ多糖(LPS)、ジャカリン、フコイダン、熱凝集IgE、熱凝集IgA、及び熱凝集IgMから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合させることを包含する。
さらなる態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
さらなる態様において、第1のサンプル、第2のサンプル、第3のサンプル、及び第4のサンプルの少なくとも1つが全血から成る。
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第2の比が第1の比よりも大きく、疾患状態の変化が疾患の進行である。
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第1の比が第2の比よりも大きく、疾患状態の変化が疾患の回復である。
本開示は、RA患者が特異的療法に良好な候補者であるか否かを判定する際の特異的な細胞刺激物質に応じた白血球における差次的なmRNA転写パターンの使用に関する。本開示は、RA患者に実施する療法が有効であるか否かを判定する際のこのような差次的な転写パターンの使用にも関する。本開示は、RAの治療に用いる候補物質をスクリーニングする際のこのような差次的な転写パターンの使用にも関する。本開示は、経時的に患者におけるRAの状態を評価し、疾患の進行をモニタリングする際のこのような差次的な転写パターンの使用にも関する。
上記のように、RAの病因は、RA患者の免疫細胞におけるFcRの機能化に関連し得る。疾患におけるFcRの潜在的な役割をさらに評価するために、自己免疫疾患の患者の病的部位へと遊走する前の末梢血の循環白血球におけるFcRの機能が正常であるか、又はこの遊走の前に既に高められているかを判定することが有用である。Fc受容体(FcR)の機能が関節リウマチ(RA)の患者の末梢血の白血球において正常であるか、又は高められたかを分析するために、熱凝集ヒトIgG(HAG)をヘパリン化全血に直接添加し、腫瘍壊死因子スーパーファミリ(TNFSF)の様々なメンバーのmRNAレベルの変化を評価した。IgGに対して複数のFcR(FcγR)、例えばFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、及びFcγRIII(GeneBank UniGeneデータベース)が存在するが、HAGは全てのFcRサブタイプと反応することができる普遍の刺激物質として作用する。HAGを有する刺激物質によって生じる、TNFスーパーファミリ(TNFSF)のmRNA(例えばGeneBank UniGeneデータベースを参照されたい)のメンバーのmRNAレベルの変化を定量化した。
利用した方法は以下のようなものであった。様々なTNFSF遺伝子のヌクレオチド配列は、GenBankのUniGeneデータベースから検索した。それぞれの遺伝子のPCRプライマーは、Primer Express(Applied Biosystem, Foster City, CA)及びHYBsimulator(RNAture, Irvine, CA)によって設計された(Mitsuhashi et al., Nature 367:759(1994)、及びHyndman et al., BioTechniques, 20:1090(1996)を参照されたい)。この配列は以下の表1で要約される。オリゴヌクレオチドはIDT(Coralville, IA)で合成された。
Figure 2009536021
Figure 2009536021
熱凝集IgG(HAG)は、PBS中で63℃で15分間、20mg/mLのヒトIgG(Sigma, St. Louis)を加熱することによって調製した(Ostreiko et al., Immunol Lett. 15, 311(1987)を参照されたい)。8ウェルストリップマイクロチューブに、1.2μlのHAG又は対照(リン酸緩衝生理食塩水)(BioLegend, San Diego)を添加し、使用まで−20℃で保存した。新鮮ヘパリン化全血60μlをそれぞれのウェルに三重で添加し、蓋をして37℃で2〜8時間インキュベートした。それぞれの処理後、以下に記載されるように全血50μlをフィルタプレートに移した。それぞれの血液サンプルを使用まで−80℃で凍結保存した。
mRNA及びcDNAは、Mitsuhashi et al., Clin. Chem. 52:4(doi: 10.1373/clinchem.2005.048983で公開された)に記載された方法に従って全血から調製した。米国特許出願第10/796,298号(参照より本明細書中に援用される)で開示された方法を利用してもよい。要するに、96ウェルフィルタプレートを回収プレート上に置き、5mMのトリス(pH7.4)150μlを加えた。4℃で1分間、120×gで遠心分離した後、血液サンプル50μlをそれぞれのウェルに加え、すぐに4℃で2分間、120×gで遠心分離した後、4℃で5分間、2000×gで遠心分離しながらPBS 300μlで1回、それぞれのウェルを洗浄した。それから、1%の2−メルカプトエタノール(Bio Rad, Hercules, CA, USA)、0.5mg/mlのプロテイナーゼK(Pierce, Rockford, IL, USA)、0.1mg/mlのサケ精子DNA(5 Prime Eppendorf/Brinkmann, Westbury, NY, USA)、0.1mg/mlの大腸菌tRNA(Sigma)、それぞれ10mMの特異的なリバースプライマーと、標準的なRNA34オリゴヌクレオチドとのカクテルを添加した、ストック溶解緩衝液60μlをフィルタプレートに加えた後、37℃で10分間インキュベートした。それから、フィルタプレートをオリゴ(dT)固定化マイクロプレート(GenePlate、RNAture)上に置き(Mitsuhashi et al., Nature 357:519(1992)、及びHamaguchi et al., Clin. Chem. 44, 2256(1998)(両方とも参照により本明細書中に援用される)を参照されたい)、4℃で5分間、2000×gで遠心分離した。4℃で一晩保存した後、4℃でマイクロプレートをプレーン溶解緩衝液100μlで3回、その後洗浄緩衝液(0.5MのNaCl、10mMのトリス(pH7.4)、1mMのEDTA)150μlで3回洗浄した。1×RT緩衝液、それぞれ1.25mMのdNTP、4単位のrRNasin、及び80単位のMMLV逆転写酵素(Promega)(プライマーなし)を含有する緩衝液30μlを添加し、37℃で2時間、インキュベートすることによって、それぞれのウェルでcDNAを直接合成した。特異的なプライマーでプライミングした(primer-primed)cDNAが溶液中に存在し、オリゴ(dT)でプライミングしたcDNAはマイクロプレートに固定されたままであった(Hugli, Crit. Rev. Immunol. 1, 321(1981)を参照されたい)。SYBRグリーンPCR(Morrison et al., Biotechniques 24, 954(1998)(参照により本明細書中に援用される))のために、cDNAを水で4倍に希釈し、cDNA溶液4μlを384ウェルPCRプレートに直接移し、これにiTaq SYBRマスターミックス(BioRad, Hercules, CA)5μl及びオリゴヌクレオチドカクテル(それぞれ15μMのフォワードプライマー及びリバースプライマー)1μlを加え、95℃で10分間を1サイクル、その後95℃で30秒間及び60℃で1分間を45サイクルのPCRをPRISM 7900HT(ABI)において行った。TaqMan PCRも利用することができ、このような場合、cDNA溶液を384ウェルPCRプレートに直接移し、これにTaqMan汎用マスターミックス(ABI)5μl及びオリゴヌクレオチドカクテル(それぞれ15μMのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに3〜6μMのTaqManプローブ)1μlを加え、95℃で10分間を1サイクル、その後95℃で30秒間、55℃で30秒間、及び60〜65℃で1分間を45サイクルのPCRをPRISM 7900HT(ABI)において行った。
1×RT緩衝液を陰性対照として用い、プライマーダイマーがSYBRグリーンPCR条件下で生成しなかったことを確認した。Ctは、解析用ソフトウェア(SDS, ABI)によって求められた。ΔCtは、適切な対照サンプルのCt値を差し引くことによって算出され、倍数増加は、それぞれのPCRサイクルの有効性を100%と仮定することによって、2^(−ΔCt)と算出された。
図1は、末梢全血のヒト白血球におけるTNFSFのmRNAのFcR媒介性の遺伝子発現の分析結果を示す。RA患者で示される結果は、HAG刺激に応じて1.5倍を超える倍数増加を示す被験者と定義された、「応答」被験者の割合として表される。
RA患者及び健常な対照被験者に対する個々の結果は、対照値を超える倍数増加として図2で表される。各データ(健常な成人では○、及びRA患者では●)は、三重の一定分量の全血の平均であった。図1で示される統計的有意性(*:p<0.05、**:p<0.01)は、上記のように応答者及び非応答者の集団を用いたχ2検定によって算出された。HAGで刺激し、サイクル閾値(Ct)(以下を参照されたい)に対して発現された健常個体の全血を用いて得られたさらなるデータは図11に示される。
図1及び図2で示されるように、HAGが主にTNFSF−3、4、7、8、11、14、15及び18のmRNAを誘導した。HAG誘導性のTNFSF−3、4、7及び14に対する応答者集団(1.5を超える倍数増加)が、健常な対照よりもRA患者において有意に大きく、HAG誘導性のTNFSF−11に対する応答者集団は対照よりもHAGにおいて大きかったが、この場合では統計的有意性は確立することができなかった。これらのデータによって、TNFSF−3、4、7、11及び14に対して白血球の機能亢進が付随した末梢血白血球におけるHcR機能の障害が示唆されている。このシステムは、下記のように、RAにおける免疫細胞の細胞傷害機能の分析に有用である。
用量応答及び動力学的研究が図3で示される。図3は、末梢血白血球におけるTNFSFのmRNA発現に対する熱凝集IgG(HAG)の効果を示す。図3Aは反応速度を示す。三重の一定分量のヘパリン化全血60μlをそれぞれPBS(○、△)、又は200μg/mLのHAG(●、▲)と混合し、37℃で0〜12時間インキュベートした。それから、TNFSF−15(○、●)及びIL−8(△、▲)のmRNAを上記のように定量した。対照として時間が0での値を用いて倍数増加を算出した。図3Bは用量応答を示す。三重の一定分量のヘパリン化全血60μlをそれぞれ様々な濃度のHAGと混合し、37℃で2時間インキュベートした。それから、TNFSF−2(●)、TNFSF−15(▲)、IL−8(○)、IL−1B(◇)、及びCXCL−2(△)のmRNAを上記のように定量した。対照として溶媒(PBS)に対する値を用いて倍数増加を算出した。それぞれのデータ点は、三重の一定分量の全血の平均±標準偏差(A)又は平均(B)であった。外部対照RNA34は全ての場合で変化せず、このことによってアッセイが適切に行われたことが示唆された。
上記のHAGの他に、他の刺激物質、例えばホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィトへムアグルチニン(PHA)、コムギ胚芽凝集素(WGA)、コンカナバリン−A(Con−A)、リポ多糖(LPS)、ジャカリン、フコイダン、熱凝集IgA、熱凝集IgE、及び熱凝集IgMも、図4〜図10及び図12〜図14で示されるように、健常な個体から採取された全血において様々なサブタイプのTNFSF及びケモカインを誘導する。これらのアッセイで進められたプロトコルは、それぞれの場合で利用された刺激物質が異なることを除いて上記で与えられたものと同じであった。図4〜図14では、データは、或る特定量のPCR産物を生成するのに必要とされるPCRのサイクル数であるサイクル閾値(Ct)に関して表される。刺激したサンプルのCt値から刺激していないサンプルのCt値を差し引くことによって、ΔCt値を得た。Ctは対数スケールで
あるので、1ΔCt単位は、量が2倍変化することを示す。発現レベルが高くなると、標準量の産物を生成するのに必要とされるPCRのサイクル数が減少するので、負のΔCt値は発現の増大を示す。
これらの刺激物質の幾つかがHAGのものと同様の刺激パターンを示す。特に、図4及び図5で示されるように、PMA及びPHAは、RA患者においてHAGによっても刺激されるTNFSF−14を刺激する。これらの刺激物質は、RA患者に対する療法の選択肢を評価し、RAを治療する新規の薬剤をスクリーニングするのにも有用である。
免疫系の活性によって生じる実際の細胞死(RAで起こると考えられるようなもの)を研究するのに、細胞傷害アッセイが一般的に用いられている。一般的に、51Cr充填した標的細胞をエフェクタ細胞と様々な比でインキュベートし、死細胞又は損傷細胞から放出された51Cr放射活性の量を定量することによって、細胞傷害アッセイが行われる(Dunkley et al., J Immunol Methods 6, 39(1974)を参照されたい)。幾つかの場合、放射性物質を非放射性物質、例えば蛍光物質に置き換えているが(Kruger-Krasagakes et al., J Immunol Methods 156, 1(1992)を参照されたい)、基本原理は変わらない。このように、細胞傷害アッセイの結果は実際の細胞死を反映する。
しかし、非生理的な実験条件下で細胞傷害アッセイを行い、複雑な細胞間相互作用及び細胞−血漿間相互作用をこのような研究の中で評価するのは難しい。さらに、細胞傷害アッセイは、どのTNFSFメンバーが細胞死に関与するかを示していない。エフェクタ細胞が標的細胞を認識すると、単一のエフェクタ細胞では多くの標的細胞を破壊するのに十分ではないので、エフェクタ細胞は標的細胞を破壊するだけでなく、他のエフェクタ細胞を補充するようにも機能する。この補充機能は、走化性因子の放出によって表されると考えられる。エフェクタ細胞によって放出されるこのような走化性因子の同一性は、従来の細胞傷害アッセイでは示されない。しかし、本開示に記載のアッセイシステムによって、エフェクタ細胞において多くの種類の遺伝子発現を同時に同定することができる。
関与するTNFSFサブタイプの同定は、これらの分子が標的細胞又は白血球上の特異的な受容体と反応するので非常に重要である。例えば、UniGeneの発現配列タグ(EST)プロファイルデータベースによれば、TNFSF−11に対する受容体(TNFRSF11、RANKとしても知られる)は破骨細胞に存在し、この経路の刺激によって骨吸収が引き起こされる。したがって、RA患者におけるTNFSF−11活性の増大(図1、図2)はRAの主な影響である骨侵食に関連し得る。
全血の使用が培養培地において単離白血球を使用することよりも好ましく、これは前者が後者よりも生理学的であり、白血球の全集団をスクリーニングすることができるためである。全血のより長期的なインキュベートによって、さらなる人工産物を生成することができる。したがって、理想的な方法は、in vitroからex vivoに切り替えることによって、短期間のインキュベート中に全血における初期の致死シグナル及び補充シグナルを同定することである。mRNAの転写は、タンパク質合成又は最終的な生物学的転帰のいずれよりも早い事象である。したがって、mRNAは標的にふさわしい。
本開示は、初めて末梢血の循環白血球におけるFcR由来のTNFSF−11誘導性の基礎機能亢進を示唆している。本方法は、腸組織ではなく全血を用いるので、TNFSF不活性化療法に対して見込まれる応答性を評価するため、及び治療反応をモニタリングするためのRAに対する診断試験として用いることができる。具体的には、RAのヒトがT細胞刺激に応じて転写されたmRNAを標的とする療法に対して反応する可能性があるか否かを判定する方法の好ましい実施形態では、RA患者から全血を得て、上記のように、血液サンプルにHAG刺激、及び任意で対照刺激(PBS)を与える。上記のようにサン
プルでTNFSF−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11又はTNFSF−14のmRNAのmRNAレベルの量を測定することができる。HAGで刺激後に1つ又は複数のこれらのmRNAのレベルが有意に上昇したRA患者(例えば、1.5を超える倍数変化によって示されるように)は、これらのmRNAを標的とする療法に良好な候補者である。
さらに、患者においてTNFSF−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11又はTNFSF−14のmRNAの1つ又は複数を標的とするRA治療の有効性を評価する方法の好ましい実施形態において、HAG刺激後の全血におけるmRNAの量と、対照刺激後の量との第1の比を治療の開始前に得る。HAG抗体刺激後の全血におけるmRNAの量と、対照刺激後の量との第2の比を治療の開始後に得る。これらの比の有意差(第1の比が第2の比より大きいような場合)が療法の有効性を示し得る。例えば、このような療法には、シクロスポリンA又はタクロリムスの投与が含まれ得る。
重要なことに、このex vivo方法は、破骨細胞の活性化に関与することが知られている1つ又は複数のTNFSF−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11又はTNFSF−14、及び特にTNFSF−11の抗FcR媒介性のmRNA発現を阻害する化合物のスクリーニングにも用いることができる。これらの新規の薬剤候補が転写レベルで白血球のmRNA生成を阻害するので、このような化合物は興味深い薬剤標的である。このことがRAに対する薬剤開発の新たな戦略を与える。
開示のシステムを用いて薬剤化合物をスクリーニングし、それによってRAを治療すると推定される作用物質を同定する方法の実施形態において、HAG等のT細胞刺激に曝された場合、白血球が、RA関連mRNAレベルにおいて少なくとも1.5の倍数増加を示すという点で応答者であるRA患者から全血を得る。HAG刺激後の被験者の全血におけるmRNAの量と、対照刺激後の量との第1の比を算出する。さらに、被験者からの全血サンプルをin vitroで薬剤化合物に曝した後、上記のように差次的に刺激する。それから、HAG刺激後の全血におけるmRNAの量と、これらの曝露サンプルの対照刺激後の量との第2の比を算出する。2つの比の有意差(第1の比が第2の比より大きいような場合)によって、薬剤化合物がRAに対する潜在的な治療法として、さらなる研究候補であることが示され得る。
さらに、患者から得られた白血球を含むサンプルにおいて、TNFSF−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11又はTNFSF−14の1つ又は複数のmRNAレベルを測定することによってRA患者の疾患状態をモニタリングする方法の好ましい実施形態において、in vitroで熱凝集IgG抗体又は他の刺激物質を用いたT細胞刺激後の全血におけるmRNAの量と、in vitroでの対照刺激後の量との第1の比を1回目に得る。1回目に続く2回目で、in vitroでのT細胞刺激後の全血におけるmRNAの量と、in vitroでの対照刺激後の量との第2の比を得る。これらの比の有意差は疾患状態の変化を示し得る。例えば、第2の比が第1の比より大きい場合、このことが疾患の進行を示し得る一方で、第1の比の方が大きいことが疾患の退行を示し得る。
関節リウマチ患者群及び対照群における、末梢全血中のヒト白血球中の様々なTNFSF mRNAによるFcR媒介性遺伝子発現の定量結果を示す図である。 関節リウマチ患者群及び対照患者群の全血において熱凝集IgG(HAG)刺激によって誘導された様々なTNFSFのmRNAレベルの倍数増加を示す図である。 末梢血の白血球におけるTNFSF及びケモカインのmRNA発現に対するHAGの効果を示す図である。 ホルボールミリステートアセテート(PMA)による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 フィトへムアグルチニン(PHA)による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 コムギ胚芽凝集素(WGA)による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 コンカナバリン−A(ConA)による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 リポ多糖(LPS)による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 ジャカリンによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 フコイダンによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgGによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgGによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgGによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgGによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgAによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgAによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgAによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgMによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgMによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgMによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgEによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgEによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。 熱凝集IgEによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。

Claims (26)

  1. 関節リウマチのヒトが療法に反応する可能性が有るか否かを判定する方法であって、
    ヒト由来の白血球を含む第1のサンプルにおいてin vitroで白血球を刺激すること、
    刺激後、前記第1のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ(「TNFSF」)−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11、及びTNFSF−14から成る群から選択されるmRNAの量を測定すること、
    ヒト由来の白血球を含む第2のサンプルにおいてin vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
    第2のサンプルにおいて前記mRNAの量を測定すること、並びに
    第1のサンプルにおける前記mRNAの量と、第2のサンプルにおける前記mRNAの量との比を求めることを含み、該比が約1.5:1以上である場合にヒトが前記療法に反応する可能性が有ると判定する方法。
  2. 第1のサンプルにおいて白血球を刺激することが、熱凝集ヒトIgGを第1のサンプルと混合することを含む、請求項1に記載の方法。
  3. 第1のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィトへムアグルチニン(PHA)、コムギ胚芽凝集素(WGA)、コンカナバリン−A(ConA)、リポ多糖(LPS)、ジャカリン(jacalin)、フコイダン、熱凝集IgE、熱凝集IgA、及び熱凝集IgMから成る群から選択される作用物質を第1のサンプルと混合することを含む、請求項1に記載の方法。
  4. 第1のサンプル及び第2のサンプルの少なくとも1つが全血を含む、請求項1に記載の方法。
  5. 対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項1に記載の方法。
  6. 前記療法がシクロスポリンA及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む、請求項1に記載の方法。
  7. 関節リウマチ療法の有効性を評価する方法であって、
    ヒト由来の白血球を含む第1のサンプルにおいてin vitroで白血球を刺激すること、
    ヒト由来の白血球を含む第2のサンプルにおいてin vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
    刺激後、第1のサンプル及び第2のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ(「TNFSF」)−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11、及びTNFSF−14から成る群から選択されるmRNAの量を測定すること、
    第1のサンプルにおける前記mRNAの量と、第2のサンプルにおける前記mRNAの量との第1の比を算出すること、
    前記療法をヒトで行うこと、
    療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第3のサンプルにおいてin vitroで白血球を刺激すること、
    療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第4のサンプルにおいてin vitroで前記対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
    刺激後、第3のサンプル及び前記第4のサンプルにおいて、前記mRNAのレベルを測定すること、
    第3のサンプルにおける前記mRNAの量と、前記第4のサンプルにおける前記mRN
    Aの量との第2の比を算出すること、並びに
    第1の比と第2の比とを比較することを含み、該比の有意な差が効果的な療法の指標となる、療法の有効性を評価する方法。
  8. 第1のサンプル及び前記第3のサンプルにおいて白血球を刺激することが、熱凝集ヒトIgGを該サンプルと混合することを含む、請求項7に記載の方法。
  9. 第1のサンプル及び第3のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィトへムアグルチニン(PHA)、コムギ胚芽凝集素(WGA)、コンカナバリン−A(ConA)、リポ多糖(LPS)、ジャカリン、フコイダン、熱凝集IgE、熱凝集IgA、及び熱凝集IgMから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項7に記載の方法。
  10. 対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項7に記載の方法。
  11. 第1のサンプル、第2のサンプル、第3のサンプル、及び第4のサンプルの少なくとも1つが全血を含む、請求項7に記載の方法。
  12. 前記比の有意な差は、前記第1の比が前記第2の比よりも大きいことである、請求項7に記載の方法。
  13. 前記療法がシクロスポリンA及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む、請求項12に記載の方法。
  14. 関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法であって、
    熱凝集ヒトIgGに曝される場合、白血球が、腫瘍壊死因子サブファミリ(「TNFSF」)−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11、及びTNFSF−14から成る群から選択されるmRNAの転写において少なくとも1.5の倍数増加を示すヒト由来の白血球を含む第1のサンプル、第2のサンプル、第3のサンプル、及び第4のサンプルを得ること、
    第1のサンプルにおいてin vitroで白血球を刺激すること、
    第2のサンプルにおいてin vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
    刺激後、前記第1のサンプル及び前記第2のサンプルにおいて、前記mRNAの量を測定すること、
    第1のサンプルにおける前記mRNAの量と、第2のサンプルにおける前記mRNAの量との第1の比を算出すること、
    第3のサンプル及び第4のサンプルを前記作用物質に曝すこと、
    曝露後、第3のサンプルにおいて、in vitroで白血球を刺激すること、
    曝露後、第4のサンプルにおいて、in vitroで前記対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
    刺激後、第3のサンプル及び第4のサンプルにおいて、前記mRNAのレベルを測定すること、
    第3のサンプルにおける前記mRNAの量と、第4のサンプルにおける前記mRNAの量との第2の比を算出すること、並びに
    前記第1の比と前記第2の比とを比較することを含み、前記比の有意な差が推定の作用物質の指標となる、関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法。
  15. 第1のサンプル及び第3のサンプルにおいて白血球を刺激することが、熱凝集ヒトIgGを前記サンプルと混合することを含む、請求項14に記載の方法。
  16. 第1のサンプル及び第3のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィトへムアグルチニン(PHA)、コムギ胚芽凝集素(WGA)、コンカナバリン−A(ConA)、リポ多糖(LPS)、ジャカリン、フコイダン、熱凝集IgE、熱凝集IgA、及び熱凝集IgMから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項14に記載の方法。
  17. 対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項14に記載の方法。
  18. 第1のサンプル、第2のサンプル、第3のサンプル、及び第4のサンプルの少なくとも1つが全血を含む、請求項14に記載の方法。
  19. 前記比の有意な差は、前記第1の比が前記第2の比よりも大きいことである、請求項14に記載の方法。
  20. ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法であって、
    白血球を含み、前記ヒトから1回目に得られる第1のサンプルにおいてin vitroで白血球を刺激すること、
    刺激後、前記第1のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ(「TNFSF」)−3、TNFSF−4、TNFSF−7、TNFSF−11、及びTNFSF−14から成る群から選択されるmRNAの量を測定すること、
    前記1回目に前記ヒトから得られる白血球を含む第2のサンプルにおいて、in vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
    刺激後、第2のサンプルにおいて前記mRNAの量を測定すること、
    第1のサンプルにおける前記mRNAの量と、第2のサンプルにおける前記mRNAの量との第1の比を求めること、
    白血球を含み、前記1回目に続く2回目で前記ヒトから得られる第3のサンプルにおいて、in vitroで白血球を刺激すること、
    刺激後、前記第3のサンプルにおいて前記mRNAの量を測定すること、
    前記2回目で前記ヒトから得られる白血球を含む第4のサンプルにおいて、in vitroで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
    刺激後、第4のサンプルにおいて前記mRNAの量を測定すること、
    第3のサンプルにおける前記mRNAの量と、第4のサンプルにおける前記mRNAの量との第2の比を求めること、並びに
    前記第1の比と前記第2の比とを比較することを含み、該第1の比と該第2の比との有意な差は、前記疾患状態の変化の指標となる、ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法。
  21. 第1のサンプル及び第3のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ヒト熱凝集IgGを前記サンプルと混合することを含む、請求項20に記載の方法。
  22. 第1のサンプル及び第3のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィトへムアグルチニン(PHA)、コムギ胚芽凝集素(WGA)、コンカナバリン−A(ConA)、リポ多糖(LPS)、ジャカリン、フコイダン、熱凝集IgE、熱凝集IgA、及び熱凝集IgMから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項20に記載の方法。
  23. 対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項20に記載の方法。
  24. 第1のサンプル、第2のサンプル、第3のサンプル、及び第4のサンプルの少なくとも1つが全血を含む、請求項20に記載の方法。
  25. 前記比の有意な差は、前記第2の比が前記第1の比よりも大きく、疾患状態の前記変化が該疾患の進行である、請求項20に記載の方法。
  26. 前記比の有意な差は、前記第1の比が前記第2の比よりも大きく、疾患状態の前記変化が該疾患の退行である、請求項20に記載の方法。
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