CN103193886A

CN103193886A - 鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a荧光标记单抗的用途

Info

Publication number: CN103193886A
Application number: CN2013101305271A
Authority: CN
Inventors: 汤永民; 徐晓军
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-04-14
Filing date: 2013-04-14
Publication date: 2013-07-10

Abstract

本发明提供一种鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a荧光标记单抗在制备人活化T细胞检测试剂中的应用。所述抗体是一种用异硫氰酸荧光素直接标记的鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体的荧光抗体（2B8a-FITC）。以该抗体为基础制备的异硫氰酸荧光素标记的荧光抗体对于抗原的结合具有高度的敏感性和特异性，同时活性良好，能识别经植物血凝素刺激的活化T细胞和再生障碍性贫血等免疫相关性疾病病人外周血中的活化T细胞。可应用于人活化T细胞活化状态的检测，可制备成检测试剂。

Description

鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a荧光标记单抗的用途

技术领域

本发明属生物技术，主要涉及鼠免疫球蛋白，尤其涉及活化T细胞检测试剂的开发，即用异硫氰酸荧光素（FITC）直接标记鼠抗人活化T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体（单抗）制备荧光抗体（2B8a-FITC），在制备人活化T细胞检测试剂中的应用。

背景技术

T细胞的活化状态对免疫系统的稳定至关重要，正向和负向调控失衡都将引起疾病的发生。如T细胞在再次免疫应答过程中反应过强可以出现超敏反应引起组织损伤；体内存在针对自身抗原的自身反应性T细胞可以导致多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病；抑制性T细胞的功能过亢、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肿瘤抗原不能识别或T细胞信号转导的缺陷可以导致肿瘤的发生；T细胞对同种异型抗原的识别是发生移植物抗宿主病（GVHD）的基础^[1]。在肿瘤免疫治疗过程中，T细胞的活化状态与疾病的治疗效果密切相关。

在儿童血液系统疾病中，再生障碍性贫血（AA）、噬血细胞综合征（HLH）等疾病的发生均与T细胞的过度活化、功能过亢有关。在AA，其主要的发病机制是Th1细胞和CD8+Ｔ细胞过度增殖活化分泌细胞因子损伤造血干/祖细胞和间充质干细胞（MSC），同时MSC、调节性Ｔ细胞、NK细胞、NKT细胞及早期造血生长因子水平的下降是机体免疫调节和支持造血的能力下降所致^[2]。因此，抑制和/或杀伤活化T细胞的免疫抑制疗法是治疗AA的策略。而HLH则是由于自身的免疫缺陷病原体难以清除，导致T细胞过度活化和细胞因子风暴而损伤脏器，该病进展迅速、死亡率非常高，基本的治疗手段也是通过激素、环孢素及依托泊苷等药物抑制或杀灭活化T细胞而使疾病缓解^[3]。

因此，活化T细胞的检测对于疾病的诊断、鉴别诊断及疗效评估均有重要意义，同时也是医学科学研究过程中常用的手段。

T细胞活化分子的表达是T细胞活化的重要标志。T细胞活化分子是在静息T细胞表面弱表达或不表达，而在T细胞受丝裂原或抗原刺激后表达于该细胞表面的分子，包括细胞因子、细胞因子受体、粘附分子、协同刺激分子、MHC分子和细胞毒物质等^[1]。由于各分子功能的差异，其在细胞表面的表达时间也有明显差异。如临床上常有的检测指标CD69是一个早期活化的标志，在T细胞活化后12～24h内达到高峰，24h后开始逐渐下降，且其表达并不强；而HLA-DR则是个晚期活化的标志，一般在T细胞活化后72h开始出现^[4]。因此，一个早期稳定的T细胞活化分子对于及时了解T细胞状态具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a荧光标记单抗在制备人活化T细胞检测试剂中的应用。所述抗体是一种用异硫氰酸荧光素（FITC）直接标记的鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体的荧光抗体（2B8a-FITC），所述的鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体的重链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；轻链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供的鼠抗人活化T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体是以分化早期的CD34+白血病细胞系KG1a作为免疫原，采用经典鼠-鼠杂交瘤技术制备而成。该抗体经递交国际人类白细胞分化抗原协作组会议（8^th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, HLDA-8）鉴定后认为该抗体识别的抗原性质不明，属国际上尚未认识的造血细胞膜新的分化抗原或新的CD 分子。该单克隆抗体重、轻链分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。研究表明，2B8a抗原在T细胞活化早期（12小时内）即出现表达，并逐渐增强，在72h～96h达高峰，是一个早期稳定的活化标志。

当纯化2B8a单抗直接用于流式检测时是采用间接免疫荧光标记法，即需要荧光素标记的羊抗鼠Fc段抗体作为二抗与其结合才能被流式细胞仪检测到，操作步骤比较繁琐，非特异性结合较高。因此，本实验室采用改良Marshall法，用FITC标记纯化的2B8a 单抗，制备FITC直接标记的2B8a荧光抗体2B8a-FITC^[5]。2B8a-FITC 使流式检测步骤简化并且大大减少了非特异性结合，并可以与其他不同荧光素偶合的抗体联合进行多色荧光分析，使不同活化T细胞亚群的分析检测结果更为准确、可靠。

本发明所述的用FITC直接标记的荧光单抗（2B8a-FITC）的制备方法为：将纯化的2B8a单抗，通过改良Marshall法，用FITC进行标记，多余FITC经PBS充分透析除去。通过检测植物血凝素（PHA）活化的T细胞及再生障碍性贫血（AA）及噬血性淋巴组织细胞增生症（HLH）等免疫学紊乱性疾病患者的外周血T细胞表明，2B8a-FITC与活化T细胞具有良好的识别活性，对T细胞免疫功能的基础研究以及免疫性紊乱性疾病的临床诊断具有重要的应用价值。

目前临床上用于检测T细胞活化状态的常用指标是CD69、CD25和HLA-DR。CD69虽然在T细胞活化早期即可出现，但表达时间短，临床检测阳性率低，敏感性差。CD25和HLA-DR虽然持续时间长，但表达较晚，在T细胞活化早期呈阴性。而2B8a的表达规律不同于上述3个抗原（图7），它表达早且持续稳定，表达强度高，在用于T细胞活化状态的检测上具有更大的优势。因此，我们认为，2B8a-FITC荧光抗体用于活化T细胞的检测较CD69、CD25和HLA-DR具有更高的准确性。

ZCH-2B8a（简称2B8a）是鼠抗人造血细胞分化抗原的单克隆杂交瘤细胞系，以分化早期的CD34+白血病细胞KG1a作为免疫原，采用经典鼠鼠杂交瘤技术制备而成。经三次亚克隆培养，建立了能稳定分泌2B8a 抗体的杂交瘤细胞系。该抗体经递交第8届国际人类白细胞分化抗原协作组会议（8^th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigen，HLDA-8）鉴定后认为该抗体识别的抗原性质不明，属国际上尚未认识的造血细胞膜新的分化抗原或新的CD 分子。研究表明，该抗体与正常外周血静止期T 细胞不反应，但与活化的T细胞反应较强，可能识别新的活化分子，可应用于人活化T细胞活化状态的检测，可制备成检测试剂。

附图说明

图1是鼠抗人活化T细胞新抗原ZCH-2B8a单克隆抗体的可变区重链基因（VH2B8a）序列（两个黑色箭头之间的序列）。序列位置：76-435，共360bp。

图2是鼠抗人活化T细胞新抗原ZCH-2B8a单克隆抗体的可变区轻链基因（VL2B8a）序列（两个黑色箭头之间的序列）。序列位置：622-960，共339 bp。

图3是SPA Sepharose亲和层析法纯化2B8a抗体腹水色谱图。

图4是SDS-PAGE鉴定2B8a抗体蛋白亚基的电泳图。左侧泳道为蛋白分子量标准，右侧泳道为经DTT还原后的2B8a抗体的重链和轻链，分子量分别约为52 kDa和29 kDa。

图5是流式细胞术评价2B8a-FITC直标抗体。

图6是2B8a-FITC直标抗体活性滴定分析。

图7是2B8a抗原在PHA刺激的活化T细胞上的表达随时间变化。

图8是CD69在PHA刺激的活化T细胞上的表达随时间变化。

图9是CD25在PHA刺激的活化T细胞上的表达随时间变化。

图10是HLA-DR在PHA刺激的活化T细胞上的表达随时间变化。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例一 2B8a 单克隆抗体重、轻链基因的克隆

本发明2个基因的核苷酸序列及氨基酸序列如下：

（1）2B8a单抗重链可变区基因（VH2B8a）具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，编码SEQ ID NO.3的氨基酸序列。

（2）2B8a单抗轻链可变区基因（VL2B8a）具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列，编码SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

2B8a重链和轻链基因的核苷酸序列及氨基酸序列的获取步骤如下：

1、ZCH-6-2B8a单抗的研制：基本按Koller&Milstein报告的鼠-鼠杂交瘤经典方法进行^[6]，以急性粒细胞白血病（未分化型）细胞系KG1a细胞作为免疫原，将10⁷白血病细胞给8周龄雌性Balb/C小鼠作腹腔注射，每周一次，共4次，于第4次注射后第3天，脱臼杀死小鼠，无菌取脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞系NS-1细胞（美国ATCC产品）按6:1混合，以50%聚乙二醇(PEG，美国Sigma公司，分子量3350道尔顿)溶液作为融合媒介进行细胞融合，于96孔板(美国Falcon公司)中进行选择性培养。于融合后第9 ~ 20天，隔日用免疫原细胞对培养上清进行间接免疫荧光法 (I I F) 筛选。阳性孔细胞经3次克隆化并连续2 次100%孔达到阳性，即建立了能持续分泌2B8a单抗的杂交瘤细胞系。经8个多月的连续传代培养和反复冻融，其分泌2B8a单抗的能力稳定。以其腹水(荧光法效价1:3200)或培养上清(荧光法效价1:16)作为2B8a单抗的来源进行下一步的实验。

2、2B8a重、轻链基因(VH_2B8a、VL_2B8a)的扩增和克隆

2.1 总RNA的抽提和处理：

收集2B8a杂交瘤细胞8×10⁶，以核糖核酸（RNA）抽提试剂盒（TRIZOL液）按说明书步骤抽提总RNA。最后溶于25μl DEPC（diethyl-pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）水中，并加入RNasin^® （核糖核苷酸酶抑制剂）至终浓度为1 U/ml（单位/微升）。紫外分光光度计测定A260、A280及其比值，1％琼脂糖电泳观察总RNA。进行逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）前，取2μl 2B8a总RNA，按照RQ1（无RNA酶的DNA酶试剂盒）说明的方法，消化总RNA中可能污染的基因组DNA。

2.2 总RNA的抽提：

（1）计数细胞，共8×10⁶个活细胞；

（2）常温下1000转/分钟（rpm）离心15分钟，弃上清；

（3）沉淀中加入无菌生理盐水后在1000rpm条件下离心15分钟，重复洗涤2次；

（4）向沉淀中加入8ml TRIZOL（1ml/10⁶细胞），立即用5ml无菌针筒反复抽打剪切数分钟；

（5）将上述TRIZOL溶液按1ml/管转入1.5ml 带盖小塑料（eppendorf）管中，室温下静置5分钟；

（6）每管加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温下静置10分钟；

（7） 4°C下12000g离心15分钟，将水相转入新的1.5ml 的eppendorf管中，每管加入0.5ml异丙醇，立即摇匀，室温下静置10分钟；

（8）4°C下，12000g离心10分钟；

（9）弃上清，每管加入1.5ml 75%乙醇，混匀，4°C下，7500g离心5分钟，弃上清；

（10）真空干燥机中晾干，每管加入25μl无RNA酶的DEPC水溶解沉淀，-80°C冰箱保存。

2.3 总RNA浓度的测定：

取出2μl新抽提的总RNA，加入98μl DEPC水混匀，紫外分光光度计（GeneQuant II）测定260吸光值（A260）及280吸光值（A280），RNA实际浓度用如下公式计算：

(μg/μl)

A260/24

2.4 总RNA凝胶电泳：

取新抽提的总RNA 3μl加入电泳上样缓冲液5μl，1％琼脂糖凝胶内含溴乙啶(EB)浓度0.5mg/ml，经100V直流电压下电泳5分钟，凝胶成像系统观测结果并摄像保存。

2.5 总RNA的处理：取总RNA 1 ml＋无RNA酶的DNA酶 (RNase-free Dnase) （1 U/ml）10ml＋ RNasin（40 U/ml）1 ml，总量达12ml，经37°C×1小时，90°C × 5 分钟孵浴后立即置冰上待用。

2.6 RT-PCR:

按照说明书，将RQ1无RNA酶的DNA酶处理过的总RNA进行逆转录（25ml体系），并用DNA 纯化试剂盒（QIAquick）纯化mRNA/cDNA杂交双链。取纯化的cDNA 2.5ml进行PCR。

2.6.1 RT反应体系：取RQ1处理过的总RNA 13ml＋寡聚脱氧胸苷[Oligo（dT）] 1.5 ml，总量达14.5mL，经65°C 预变性5分钟，立即置冰上，加入以下试剂：DEPC水 2.5 ml＋ 5倍缓冲液 5 ml＋ 25mM dNTP（脱氧核苷混合物） 0.5 ml＋ RNA酶抑制剂 1.5 ml＋逆转录酶（200 U/mL） 1 ml至总体积25 ml，经37°C，30 分钟孵浴以合成互补脱氧核糖核苷酸（cDNA），置95°C 5分钟，然后移至4°C冰浴备用。

2.6.2 PCR体系

(1) 50 ml的PCR反应体系：2.5ml纯化的2B8a 10pmol的轻链或重链可变区上下游引物各1ml，0.5ml 25mM的dNTP，5ml 10×高保真PCR缓冲液，0.2ml高保真Taq聚合酶（Platinum^® Taq High Fidelity）；引物序列如下：

重链可变区5'引物序列（SEQ ID NO.5）： GAG GTC CAG CTG CAA CAA TCT

重链可变区3'引物序列（SEQ ID NO.6）： CCA GGG GCC AGT GGA TAG ACA AGC TTG GGT GTC GTT TT

轻链可变区5'引物序列（SEQ ID NO.7）： GAC ATT CTG ATG ACC CAG TCT

轻链可变区3'引物序列（SEQ ID NO.8）： GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC

（2）反应条件： 94°C预变性2分钟，94°C变性30秒，57°C退火30秒，72°C延伸30秒，共38个循环；

（3）最后一个循环完成后，加入1ml Taq DNA Polymerase（Taq DNA聚合酶） 72°C延伸7分钟；

（4）取5ml PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，同时加标准分子量标志物，鉴定PCR产物片断大小，分别命名为VH2B8a 和VL2B8a基因。结果可观察到360碱基对（bp）左右的VH2B8a条带和340bp左右的VL2B8a条带。将前述阳性条带切胶回收纯化得到VH_2B8a和VL_2B8a基因。

3．VH_2B8a、VL_2B8a基因扩增产物的克隆和鉴定将纯化的VH2B8a和VL2B8a基因片段通过连接酶分别与克隆载体pGEM®-T Easy连接，获得的连接产物pGEM®-T Easy/VH和pGEM®-T Easy/VL，通过转化DH5a感受态细菌，得到数十个白色菌落和数个蓝色菌落，分别挑取3个白色菌落进行质粒扩增，抽提后进行核酸限制性内切酶EcoRI酶切鉴定，1％琼脂糖电泳结果均可见360bp左右的目的片段。

4．VH2B8a、VL2B8a基因序列测定和分析

对阳性重组质粒纯化后进行测序，VH2B8a(图1)和VL2B8a（图2）基因均符合小鼠Ig可变区框架结构。VH2B8a基因全长360bp（见序列SEQ ID NO 1），编码120个氨基酸(见序列SEQ ID NO 3)，在IMGT（the international ImMunoGeneTics information system® http://www.imgt.org）上进行检索比对，发现此重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白重链可变区基因IGHV1-67*01 F的同源性达94.10％，提示该基因归属于小鼠Ig的VH基因。氨基酸序列分析结果显示，重链可变区含有明确的4个框架区（FR）和3个抗原决定簇互补区（CDR），在第22位和第96位为特征性Cys（半胱氨酸）。VH2B8a氨基酸序列结构框架如下：1~25 FR1、26~33 CDR1、34~50 FR2、51~58 CDR2、59~96 FR3、97~108 CDR3、109~120 FR4。

VL2B8a基因全长339bp（见序列SEQ ID NO 2），编码113个氨基酸（见序列SEQ ID NO 4），在NCBI上进行检索，发现此轻链可变区基因与小鼠Igκ链基因IGKV7-3*01 P的同源性81.44％，提示该基因归属于小鼠Ig的Vκ基因。氨基酸序列分析结果显示，轻链可变区含有明确的4个框架区（FR）和3个抗原决定簇互补区（CDR），在第23位和第94位为特征性半胱氨酸（Cys）。VL2B8a氨基酸序列框架如下：1~26 FR1、27~36 CDR1、37~53 FR2、54~56 CDR2、57~92 FR3、93~101 CDR3、102~113 FR4。

实施例二 2B8a 直标抗体 2B8a-FITC 的制备

在清洁级BALB/c小鼠腹腔注射2B8a细胞，制备大量腹水。硫酸铵初步纯化后采用Econo-Pac 蛋白A柱进行亲和层析（图3），SDS-PAGE检测纯化蛋白的纯度（图4）。将获得的纯化2B8a单抗，通过改良Marshall法[5]，用FITC进行标记，多余FITC经PBS充分透析除去，具体步骤如下：

1. 抗体的准备：取适量的2B8a Ab溶液置于三角烧杯中，加入生理盐水或碳酸盐缓冲液，使蛋白终浓度为20 mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。

2．异硫氰酸荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按蛋白与荧光素100：1的质量比称取异硫氰酸荧光素粉末。

3. 结合：边搅拌边将称取的异硫氰酸荧光素渐渐加入2B8a Ab溶液中，加毕后，在4℃冰箱内继续搅拌12～18h。　　

4. 透析：结合完毕后，将溶液离心于2500rpm离心20min，除去其中少量之沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH 8.0缓冲盐水透析（0～4℃）过夜。

5. 过柱：取透析过夜的标记物，过Sephadex G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。

6. F/P比值的测定：用酶标仪测定该标记物的A495和A280的吸光值。根据以下公式F/P＝(2.87×A495) /(A280-0.35×A495)计算F/P值，合适的F/P值为2～4。

7. 保存：将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%，分装。于4℃可以保存半年，-20℃保存可达2年以上。

本实验采用改良Marshall法制备了2B8a FITC直标抗体，该抗体经酶标仪检测其A495和A280的吸光值分别为0.532和0.475，经计算F/P值为2.64，介于2～4之间，符合荧光抗体的特异性染色质量的要求。

本实验采用流式细胞术（FCM）法，通过对比2B8a-FITC和2B8a＋GAM-FITC与Raji细胞及Molt-3细胞的反应性，来鉴定2B8a-FITC直标抗体用于实验检测的敏感性和特异性。结果显示（图5）。图5中a-c为Raji细胞（表达2B8a抗原），d-f为Molt-3（不表达2B8a抗原）细胞，从左至右依次为阴性对照，2B8a + GAM（羊抗鼠免疫球蛋白）-FITC，2B8a-FITC。2B8a-FITC和2B8a＋GAM-FITC与Raji细胞均呈明显的阳性反应，峰型相似，阳性率（98.48% vs. 98.35%）和平均荧光强度（53.61 vs. 54.01）接近。而在Mlot-3细胞上，2B8a-FITC和2B8a＋GAM-FITC基本呈阴性反应（9.35% vs. 10.80%），且2B8a-FITC的非特异性结合弱于2B8a＋GAM-FITC。表明该直标抗体具有良好的敏感性和特异性。

实施例三 2B8a-FITC 活性鉴定：

1. 收获Raji细胞，离心后调节细胞浓度至 1×10⁶/ml；每只流式管取细胞悬液 50μl。

2. 阴性对照管加入鼠 IgG1 5μl；其余每只流式管分别加入 2B8a-FITC 0μg，0.01μg，0.025μg，0.05μg，0.1μg，0.25μg和0.5μg，4℃ 孵育 30 min。

3 孵育结束后以 PBS 洗涤、离心（1000rpm×5min）两次，流式细胞仪检测。

本实验取Raji细胞株为反应细胞，固定细胞量，逐渐增加2B8a-FITC量，流式细胞仪检测不同2B8a-FITC浓度时阳性率变化，结果表明阳性率随2B8a-FITC增多而增加，但是0.1μg的2B8a-FITC即可饱和5×10⁴个Raji细胞, 继续增加2B8a-FITC阳性率增加不明显（图6）。图6中，所滴定的细胞量为5×10⁴个Raji细胞。结果表明在一定的抗体范围内，阳性率随2B8a-FITC量的增加而增加，但是0.1μg的2B8a-FITC即可饱和5×10⁴个Raji细胞, 继续增加2B8a-FITC阳性率增加不明显。表明该直标抗体识别能力强，活性佳。

实施例四 2B8a 单抗与 PHA 活化的外周血 T 淋巴细胞的反应性

1外周血单个核细胞（PBMNC）的分离：

1.1取静脉抗凝血3 ml，用pH 7.4的PBS溶液将抗凝血作1:1稀释。

1.2取分层液3ml置入15ml灭菌离心管内。

1.3用毛细吸管吸取稀释血液，在离分层液上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上。稀释血液与分层液的体积比例为2:1。

1.4 用水平离心机离心（2000rpm，20min）。绝大部分单个核细胞悬浮于血浆与分层液的界面上，呈白膜状。用毛细吸管轻插至白膜层，沿试管壁周缘吸出界面层细胞，移入另一试管中。

1.5 用5倍以上体积的PBS液离心洗涤2次（1500rpm，5min）。

1.6 将细胞重悬于淋巴细胞培养基中。

2 淋巴细胞转化实验：

2.1用RPMI1640培养基将分离的PBMNC浓度调整至5×10⁵/ml，按1ml/孔将细胞悬液接种于24孔板中。

2.2 对照孔加无菌PBS 10μl，实验孔加除菌的1mg/ml PHA溶液10μl，混匀。

2.3 置37℃培养箱中转化培养。分别在培养0h、12h、24h、48h、72h和96h取细胞进行流式检测。

3 2B8a抗原及其他活化标志的检测：

3.1 收获细胞，分别置于离心管中，1000rpm离心5min后去上清，加入200μl PBS悬浮细胞。

3.2每个样本设3只流式反应管，3管分别加入以下抗体进行4℃孵育15min（FITC、PE、PerCP标记的荧光抗体加5μl/管，APC标记的荧光抗体2.5 μl/管）。第1管（阴性对照管）：鼠抗人IgG1-FITC、鼠抗人IgG1-PE、鼠抗人IgG1-PerCP、鼠抗人IgG1-APC；第2管（测试管）：2B8a-FITC、CD69-PE、CD8-PerCP和CD3-APC; 第3管（测试管）：CD3-FITC、CD25-PE、HLA-DR-PerCP和CD4-APC。

3.3 孵育结束后，每管加入1ml溶血剂，振荡混匀后室温孵育10min。然后加PBS，1000rpm离心5min洗涤2次。

3.4 上机，在流式细胞仪上进行检测。

结果表明， 2B8a抗原在活化早期（12小时内）即出现表达，并逐渐增强，在72h～96h达高峰[96h后阳性率和平均荧光强度指数（MFI）开始缓慢下降，数据未显示]，是一个早期稳定的活化标志。CD69在PHA刺激后即刻出现活化，12～24h内达到高峰，24h后开始逐渐下降，是一个早期活化的标志，且其表达并不强，峰值阳性率在69%左右。CD25在T细胞活化后24～48h开始表达，以较快的速度上升，是一个中期活化的标志。而HLA-DR则在PHA孵育后72h开始表达，是个晚期活化的标志。可见，2B8a抗原在活化T细胞上的表达规律完全不同于CD69、CD25和HLA-DR（图7-图10）。图7-图10中，共检测6例标本，横坐标为PHA孵育时间，纵坐标为阳性率。2B8a 抗原（Ag）在活化早期（12小时内）即出现表达，并逐渐增强，在72h～96h达高峰，是一个早期稳定的活化标志。2B8a Ag在活化T细胞上的表达规律完全不同于CD69、CD25和HLA-DR。

实施例五 2B8a 抗原在各临床疾病中表达情况的检测

1 吸取肝素钠抗凝的外周血30μl置于流式反应管内；

2 每例外周血标本共设3只反应管，3管分别加入以下抗体进行4℃孵育15min（FITC、PE、PerCP标记的荧光抗体加5μl/管，APC标记的荧光抗体2.5 μl/管）。第1管：鼠抗人IgG1 FITC、鼠抗人IgG1 PE、鼠抗人IgG1 PerCP、鼠抗人IgG1 APC；第2管：2B8a-FITC、CD69-PE、CD8-PerCP和CD3-APC; 第3管：CD3-FITC、CD25-PE、HLA-DR-PerCP和CD4-APC。

3 反应结束后每支反应管加入荧光激活细胞分检仪（FACS）溶血剂2ml，振荡后置37°C避光孵育10min。

4 孵育结束后加PBS洗涤（1000rpm离心5min）2次，流式细胞仪上检测。

本研究主要检测了16例免疫相关性疾病，病种包括再生障碍性贫血（AA）11例；免疫性血小板减少症（ITP）2例；噬血细胞综合征（HLH）3例。结果表明，AA中CD4＋T细胞和CD8＋T细胞的2B8a Ag的阳性病例数分别为90.9%和72.7%，而其他病例均阳性。CD4+T细胞和CD8+T细胞2B8a的表达较为一致，其相关系数为0.854（P < 0.001，Spearman法）。而其他活化标志，HLA-DR与2B8a的表达负荷率较高，提示2B8a可以长期表达于活化T细胞表面。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

参考文献

1. 徐晓军. 新的T细胞活化标志ZCH-2B8a抗原的分子特性及功能研究[博士学位论文]. 杭州: 浙江大学. 2009:35-114。

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4. Rea, IM, McNerlan, SE, Alexander, HD. CD69, CD25, and HLA-DR activation antigen expression on CD3+ lymphocytes and relationship to serum TNF-alpha, IFN-gamma, and sIL-2R levels in aging.. Exp Gerontol, 1999,34(1):79。

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<110> 浙江大学

<120> 鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a荧光标记单抗的用途

<160> 8

<170> Patent In Version 2.1

<210> 1

<211> 360

<213> 人工序列

<222>

<223> 93 a 86 c 90 g 91 t

<400> 1

GAGGTCCAGC TGCAACAATC TGGGCCTGAG CTGGTGAGGC CTGGGGTCTC AGTGAAGATT 60

TCCTGCAAGG GTTCCGGCTA CACATTCACT GATTATGCTA TGCACTGGGT GAAGCAGCGT 120

CATGCAAAGA GTCTAGAGTG GATTGGAGTT ATTAGTCCTT ACTCTGGTAA TACAAACTAC 180

AACCAGAAGT TTAAGGGCAA GGCCACAATG ACTGTAGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAT 240

ATGGAACTTG CCGGATTGAC ATCTGAGGAT TCTGCCATCT ATTACTGTGC AAGTACGGCT 300

ACTCTTTACT ATGCTATGGA CTACTGGGGT CAAGGAACCT CAGTCACCGT CTCCTCAGCC 360

<210> 2

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<222>

<223> 88 a 85 c 84 g 82 t

<400>2

GACATTCTGA TGACCCAGTC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGCA GAGGGCCACC 60

ATATCCTGCA GAGCCAGTGA AAGTGTTGAT AATTTTGGCA ATAGTTTAAT GCACTGGTAC 120

CAGCAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC CTCATCTATC GTGCATCCAA CCTAGAATCT 180

GGGATCCCTG CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTAGGACAG ACTTCACCCT CACCATTAAT 240

CCTGTGGAGG CTGATGATGT TGCAACTTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA GGATCCGTGG 300

ACGTTCGGTG GAGGCACCAA ACTGGAAATC AAACGGGCT 339

<210> 3

<211> 120

<212>

<213> 人工序列

<222>

<223> 按照大肠杆菌偏爱的密码子，设计了酶切位点和接头肽的编码hPTH(1-34)的合成基因

<400> 3

EVQLQQPGPE LVRPGVSVKI SCKGSGYTFT DYAMHWVKQR HAKSLEWIGV ISPYSGNTNY 60

NQKFKGKATM TVDKSSSTAY MELAGLTSED SAIYYCASTA TLYYAMDYWG QGTSVTVSSA 120

<210> 4

<211> 127

<212>

<213> 人工序列

<222>

<223>

<400> 4

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD NFGNSLMHWY QQKPGQPPKL LIYRASNLES 60

GIPARFSGSG SRTDFTLTIN PVEADDVATY YCQQSNEDPW TFGGGTKLEI KRA 113

<210> 5

<211> 21

<212>

<213> 人工序列

<222>

<223> 重链可变区5'引物序列

<400> 5

GAG GTC CAG CTG CAA CAA TCT

<210> 6

<211> 38

<212>

<213> 人工序列

<222>

<223> 重链可变区3'引物序列

<400> 6

CCA GGG GCC AGT GGA TAG ACA AGC TTG GGT GTC GTT TT

<210> 7

<211> 21

<212>

<213> 人工序列

<222>

<223> 轻链可变区5'引物序列

<400> 7

GAC ATT CTG ATG ACC CAG TCT

<210> 8

<211> 21

<212>

<213> 人工序列

<222>

<223> 轻链可变区3'引物序列

<400> 8

GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC

Claims

1. 一种用异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体在制备人活化T细胞检测试剂中的应用，所述的鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体的重链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，轻链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体的重链可变区基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，轻链可变区基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。