CN101368173B - 抗人cd44的工程抗体、载体、试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人CD44的工程抗体、载体、试剂盒及其用途，能够在体内外特异性结合人类CD44抗原，通过多种机制单独或协调作用，有目的清除正常免疫细胞活杀伤白血病细胞。本发明涉及抗人CD44单克隆抗体HI313重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述的基因和多肽在制备用于白血病的诊断和治疗药物中的应用。重链和轻链可变区基因来自抗人CD44单克隆抗体。本发明采用基因工程技术成功制备单链抗人CD44基因工程抗体，为白血病和免疫系统疾病的诊断和治疗提供了一种新的有效药物。

Description

抗人CD44的工程抗体、载体、试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及一种可以特异性识别人CD44分子，用于白血病的诊断、预后判断，或治疗白血病的抗人CD44单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、工程抗体、载体、试剂盒及其用途。 

背景技术

白血病是威胁人类生命健康的主要几种疾病之一，在我国发病率大约为2.76/100000人。其中急性淋巴细胞白血病多见于儿童，急性髓系白血病多见于成年人，而慢性白血病多发于40岁以上人群。它是一类起源于造血(或淋巴)干细胞的恶性疾病。由于干细胞受损，白血病细胞失去进一步分化成熟的能力，或者增殖与分化能力不平衡，而停滞在细胞发育的不同阶段，具体表现为细胞在体内无限增殖，而其分化成熟和凋亡受阻。白血病与其它癌症一样，一直因为没有特应性的标志导致无法用常规药物准确杀伤白血病细胞。白血病细胞与正常细胞的区别目前认为主要在于某些生物分子的表达量不同，利用这些特征，特别是与造血干/祖细胞的区别可以在一定程度上杀伤白血病细胞而不影响造血的重建。特异性识别某种细胞膜表面分子的抗体正是实现这一目的的最好工具，目前利用抗体治疗白血病主要是通过以下三种途径：抗体结合白血病细胞后通过补体依赖的细胞毒和抗体依赖细胞介导的细胞毒直接杀伤白血病细胞；抗体结合白血病细胞表面分子，通过所引发的下游信号诱导白血病细胞分化或凋亡；通过抗体的靶向作用将杀伤性药物或效应物带入白血病细胞内达到局部杀伤的目的等。 

目前白血病治疗主要采用控制增殖、诱导凋亡的化疗药物，包括烷化剂、抗代谢药物等。这些药物在杀死白血病细胞的同时，对正常造血细胞也有严重损伤，故对机体存在严重的毒副作用。此外，白血病细胞常会对化疗药物产生耐药，同时化疗后复发率较高，严重影响临床化疗药物治疗的有效性。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可特异性识别正常细胞和白血病细胞表达的人CD44分子，并可用于白血病的诊断、预后判断，杀伤白血病细胞或抑制其生长的抗人CD44单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、工程抗体、载体、试剂盒及其用途，提供的单克隆抗可以在体外抑制多种白血病细胞系的增殖并诱导其凋亡；提供的抗人CD44单克隆抗体轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物，两者重组后表达产生的抗CD44ScFv片段，能够特异性结合人CD44分子并能够降低鼠源性抗人CD44抗体的免疫源性。 

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抗人CD44单克隆抗体杂交瘤细胞系，所述细胞系的保藏号为CGMCC NO.2176。 

一种抗人CD44单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.2176杂交瘤分泌。 

所述的抗体是鼠源性单克隆抗体，属于IgG1亚型。 

抗人CD44的工程抗体，由保藏号为CGMCC NO.2176杂交瘤细胞系经反转录-聚合酶链式合成反应制备产生。 

所述的抗人CD44的工程抗体，由SEQ ID NO.2重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO.4轻链可变区氨基酸序列组成。 

所述的抗人CD44的工程抗体，编码所述SEQ ID NO.2重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述SEQ ID NO.4轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 

含有所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，分别含有SEQ ID NO.1所述的重链可变区VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO.3所述的轻链可变区VL基因核苷酸序列的cDNA的Simple-T载体。 

含有所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，含有SEQ ID NO.1所述的重链可变区VH基因核苷酸序列、SEQ ID NO.3所述的轻链可变区VL基因核苷酸序列和接头序列的cDNA的PET22b(+)载体。 

所述的抗人CD44的单克隆抗体、工程抗体或载体在制备白血病诊断试剂、免疫抑制类药物或治疗白血病的药物中的应用。 

一种免疫检测试剂盒，包含上述的单克隆抗体或工程抗体或载体。 

所述的免疫检测试剂盒在诊断恶性肿瘤或自身免疫性疾病；或评价恶 性肿瘤或自身免疫性疾病的发展和预后；或指导恶性肿瘤或自身免疫性疾病的治疗中的用途。 

抗人CD44的工程抗体由保藏号为CGMCC NO.2176(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO.2176，保藏日：2007-9-18)杂交瘤经反转录-聚合酶链式合成反应制备产生，属于IgG1亚型，该抗体能特异性结合人CD44分子，在体外对于多种白血病细胞系具有一定的生长抑制和促分化作用。CD44分子在很多急性白血病亚型的白血病原始细胞表面均有表达，参与正常髓系分化，具有信号分子功能，是一个诱导急性白血病原始细胞分化的可能靶点。因此抗人CD44单克隆抗体是一种具有巨大潜力药用抗体。人体对鼠源性抗体的免疫反应(HAMA反应)是鼠源性抗体应用于临床治疗的主要障碍，而基因工程抗体较好的解决了这个问题，它既保留了鼠源单抗的特异亲和力，又大大降低了鼠单抗的异源性，因而具有广阔的应用前景。 

我们应用RT-PCR技术，成功的从杂交瘤细胞中克隆到抗人CD44抗体的轻重链可变区基因，并将抗CD44抗体的轻重链可变区基因克隆到原核表达载体，构建抗人CD44抗体的单链抗体，降低鼠源性抗人CD44抗体的免疫原性，并在大肠杆菌中进行高效分泌性表达，从而提高其产量，降低生产成本。单链抗体的优势在于：较全抗分子量小，穿透能力强，构建周期短，抗原性低，易于基因工程操作，为进一步研究其它工程抗体奠定基础。可在大肠杆菌中表达，易于大量生产，生产成本低。 

附图说明

图1是抗人CD44单克隆抗体HI313结合CD44阳性白血病细胞系的实验。 

图2是根据两种CD44阳性细胞系来检测HI313对CD44抗原的亲和力。 

图3是HI313对白血病急性髓系白血病细胞系的生长抑制实验。 

图4是CD44抗体处理后NB4细胞周期的测量。 

图5是HI313对NB4细胞S期和G1期的影响。 

图6是HI313诱导急性髓系白血病原始细胞的分化情况 

图7是PCR扩增VL，VH基因片段电泳图。 

图8是重叠延伸拼接法构建HI313-ScFv电泳图。 

图9是重建载体Pet22b(+)ScFv的结构示意图。 

图10是ScFv表达产物的SDS-PAGE(10％)结果。 

图11是HI313-ScFv与CD44阳性细胞系的结合检测。 

具体实施方式

制备抗人CD44的工程抗体的杂交瘤保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO.2176，保藏日期：2007-9-18，分类命名为：小鼠抗人CD44杂交瘤细胞系。 

下面结合附图和具体实施方式对本发明的可特异性识别正常细胞和白血病细胞表达的人CD44分子，并可用于清除正常免疫细胞或杀伤白血病细胞的抗人CD44工程抗体、载体、试剂盒及其用途作进一步的详细说明： 

一种抗人CD44单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.2176杂交瘤分泌。 

所述的抗体是鼠源性单克隆抗体，属于IgG1亚型。 

抗人CD44的工程抗体，由保藏号为CGMCC NO.2176杂交瘤细胞系经反转录-聚合酶链式合成反应制备产生。 

所述的抗人CD44的工程抗体，由SEQ ID NO.2重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO.4轻链可变区氨基酸序列组成。 

所述的抗人CD44的工程抗体，编码所述SEQ ID NO.2重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述SEQ ID NO.4轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 

含有所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，分别含有SEQ ID NO.1所述的重链可变区VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO.3所述的轻链可变区VL基因核苷酸序列的cDNA的Simple-T载体。 

含有所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，含有SEQ ID NO.1所述的重链可变区VH基因核苷酸序列、SEQ ID NO.3所述的轻链可变区VL基因核苷酸序列和接头序列的cDNA的PET22b(+)载体。 

所述的抗人CD44的单克隆抗体、工程抗体或载体在制备白血病诊断试剂、免疫抑制类药物或治疗白血病的药物中的应用。 

一种免疫检测试剂盒，上述的单克隆抗体或工程抗体或载体。 

所述的免疫检测试剂盒在诊断恶性肿瘤；或评价恶性肿瘤的发展和预后；或指导恶性肿瘤的治疗中的用途。 

实施例1小鼠抗人CD44单克隆抗体的制备及荧光标记 

以分离的人周血单个核细胞为抗原，常规方法免疫6周龄Balb/c小鼠，首次基础免疫使用福氏完全佐剂，每隔3周进行一次基础免疫，共三次，2×10⁷细胞/只·次，最后一次基础免疫后3周后脾内注射加强免疫，1×10⁷ 细胞/只；3天后取脾，与NS1小鼠骨髓瘤细胞进行融合，按常规杂交瘤制备方法进行。融合12天后，收集单克隆生长的融合孔上清，利用间接免疫荧光法，选择CD44阳性的靶细胞系进行筛选鉴定，选择反应性好，生长状态好的杂交瘤细胞进行亚克隆，得到稳定分泌抗人CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为HI313，液氮冻存。于2000年提交国际白细胞分化抗原会议，被确认为识别人类CD44抗原。制备的抗人CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO：2176，分类命名为：小鼠抗人CD44杂交瘤细胞系。 

采用小鼠腹腔内诱生法，将HI313细胞株接种Balb/c小鼠腹腔，1.5×10⁶/只，1周后采集腹水，经Protein G Sepharose 4FF亲和层析柱层析，制备HI313抗体纯品。 

利用共价连接的方法把荧光素偶联到抗体上，经分离纯化制备出偶联复合物，即荧光标记抗体。 

实施例2抗人CD44单克隆抗体检测白血病细胞系细胞表面的CD44表达情况 

取生长良好的KGla细胞离心收集，用PBS调制1×10⁷/ml，每100μl加入流式管，一管加入FITC标记HI313抗体，一管加入FITC标记的小鼠IgGl同型对照，室温避光反应20分钟。加入约2ml PBS洗一次，1000rpm离心10分钟弃上清，加入300μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。见图1。实施例3检测HI313的亲和力 

HI313抗体采取倍比稀释的方法，起始浓度为初100μg/ml，共15个点，终浓度为0.0075μg/ml，每管加不同浓度的抗体20μl，对照管加入PBS 20μl；加入浓度为5×10⁶的KG1a，THP-1细胞100μl，混匀后共孵育20分钟，加 2ml PBS，1000rpm，离心5分钟，弃上清，加入FITC标记的羊抗鼠二抗100μl，避光孵育20分钟，加2ml PBS洗一次，弃上清，加入200μl PBS重悬细胞，，流式细胞仪检测，Graph Pad Prism5软件分析。结果显示基于KGla检测的结果为1.34nM，基于THP-1检测的结果为1.2nM，结果一致并远远小于10nM，证明HI313具有很高的亲和力。见图2。 

实施例4抗人CD44单克隆抗体可以在体外有效抑制白血病细胞系的生长 

取生长良好的CD44阳性白血病细胞系，用含20％FBS的RPMI1640培养液调至4×10⁴/ml，按每孔200μl加入96孔培养板。将细胞分为4组，均做4个平行孔。对照组1：不添加任何抗体；对照组2：加入50μg/ml小鼠IgG1亚类抗体；实验组1：加入10μg/ml HI313；实验组2：加入20μg/mlHI313；实验组3：加入50μg/ml HI313。置37℃，5％二氧化碳培养箱培养24-144小时。MTS法检测细胞生长。HI186可抑制急性髓系白血病细胞系的增殖。见图3(抑增殖最大达50％)。 

实施例5抗人CD44单克隆抗体可以阻断白血病细胞系的细胞周期 

取生长状态良好的白血病细胞系，离心后，用RPMI1640培养液调至细胞浓度为8×10⁴/ml，种于24孔板，每孔500μl，分为3组。实验组对照组1：加入500μl正常RPMI1640培养基；对照组2：加入浓度为100μg/ml的小鼠IgGl同型对照7D11 500μl；实验组：加入浓度为100μg/ml的HI313抗体500μl。置37℃，5％二氧化碳培养箱培养72-120小时，Becton Dickinson公司的The CycleTESE^TM PLUS DNA Reagent Kit检测细胞周期，方法依说明书进行。结果显示HI313抗体可以阻滞细胞周期于G₀/G₁，实验组中处于G₀/G₁期的细胞较对照组明显增多。见图4，图5，HI313处理后，细胞S期的百分比降低，G1期增加，说明细胞增殖通过Glarrest被抑制。实施例6HI313诱导急性髓系白血病原始细胞的分化 

Ficoll液分离急性髓系白血病病人原始细胞，用用含20％FBS的RPMI1640培养液调至1×10⁶/ml，种于24孔板，2ml/孔。分为3组，实验组：加入HI313抗体，终浓度为20μg/ml；对照组1：不加入任何抗体或小鼠同型对照；对照组2：加入终浓度为20μg/ml的小鼠IgG1同型对照7D11。置 37℃，5％二氧化碳培养箱培养，第3、5、7天，流式细胞仪检测细胞表面CD11b、CD14、CD15和CD34的表达情况。见表1，图6。(请将下表的线条划上实线) 

实施例7抗CD52抗体的轻重链可变区基因克隆 

应用RT-PCR方法从抗人CD44抗体杂交瘤细胞(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO.2176，保藏日：2007-9-18)中克隆抗人CD52抗体的轻重链可变区基因： 

(1)RNA提取：采用Trizol一步法，1)取杂交瘤细胞约10⁶，加入1mlTrizol，吹打混匀，室温静置5分钟。2)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置2-3分钟。3)12000rpm，4℃，离心15分钟。4)取上清，加入0.5ml异丙醇室温静置15分钟。5)12000rpm，4℃，离心15分钟。6)弃上清，加入1ml 75％的乙醇洗，7500rpm，4℃，离心5分钟。7)弃上清，沉淀晾干，加入30μLDEPC水溶解。 

(2)逆转录为CDNA(40μl)：取2.5mM dNTP 4μl，5×first strandbuffer 8μl，DTT4μl，0ligodT2μl，水16.6μl，混匀后加入RNA约2μg，65℃水浴5分钟，快速冰浴2-3分钟。加入50U/μl RNasin0.4μl，Superscript II(200u/μl)1μl混匀后37℃水浴＞1小时。取出后70℃水浴10分钟。-20℃保存。 

(3)PCR扩增抗CD44抗体的轻重链可变区基因 

轻、重链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl)：引物Mouse Ig primers购自Novagen公司。以cDNA为模板，高保真Pyrobest DNA聚合酶扩增。PCR循环程序为94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。 

(4)测序载体的构建：Simple-T载体购自大连宝生物公司。将轻重链可变区基因PCR产物回收，与Simple-T载体连接后，按常规方法氯化钙转化，以100μg/ml氨苄浓度筛选阳性克隆，送测序，该基因完全符合蛋白数据库中抗体所具有的若干保守的框架氨基酸的特点，该序列为抗体基因序列。分别命名为T-VH及T-VL，见图7。 

实施例8单链抗体基因表达载体PET22b(+)ScFv的构建 

根据轻、重链可变区的酶切图谱及构建载体PET22b(+)的酶切位点，设计并合成了用于VH，VL基因扩增和拼接的引物。 

VH上游引物 

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VH下游引物 

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VL上游引物 

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VL下游引物 

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引入克隆用的Nco I/Xho I限制性酶切位点及单链抗体的linker序列(采用最广泛的(GGGGS)₃为linker)。从所构建的T-VH及T-VL载体中PCR扩增VH，VL片段，回收后，经重叠延伸拼接法(SOE)通过PCR直接合成ScFv基因，见图8、图9。将PET22b(+)载体及回收的ScFv基因分别用Nco I/XhoI双酶切，回收后按常规方法进行连接和转化构建抗人CD52 ScFv表达载体PET22b(+)ScFv。阳性克隆用Nco I/Xho I双酶切鉴定后测序确定。正确的克隆用于表达。测序结果表明正确，按氨基酸序列推测738bp，ScFv约为26.8KD的蛋白，见图10。 

实施例9抗人CD44ScFv抗体片段的表达、纯化 

(1)抗人CD44单链抗体(ScFv)在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE分析：在3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中接种一阳性单菌落，37℃震荡培养过夜后，全部接种于1L含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养 基中，37℃震荡培养约4小时后，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，16℃继续诱导培养12-20小时后6000g收获菌液，加入细菌渗透性释放液(Tris-HCl 30mM，EDTA 1mM，PMSF 0.1mM，蔗糖(20％，w/v)，NaCl 200mM)100ml，室温轻摇10分钟。12000g收集菌体，加入100ml 5mM预冷的MgSO₄，4℃轻摇10分钟。12000g再次离心，分别收集上清和菌体。各取适量，加入20μl 2XSDS上样buffer，100℃煮沸5min。取5μl上样，10％SDS-PAGE检测表达蛋白，考马斯亮蓝染色。实验证明实现了重组质粒pET22b(+)ScFv在大肠杆菌中的表达，738bp片段表达出约28Kd的带(His)₆的蛋白，见图10。 

(2)抗人CD44单链抗体(ScFv)纯化：将按上步收集的菌体沉淀重悬于1/10培养体积的冰预冷20mmol/L Tris-HCl(PH 7.2)，超声破碎细胞，13000rpm，4℃离心30min，取上清用于纯化。上步收集的上清直接用于纯化。 

蛋白采用Pharmacia公司的Chelating Sepharose Fast Flow进行纯化，按操作手册平衡镍柱，挂镍，清洗。将粗分离的样品加入镍离子亲合层析柱，使目的蛋白结合到柱子上，洗涤后，用6倍柱床体积的含500mM咪唑的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱液用PBS缓冲液透析48小时。 

实施例10抗人CD44 ScFv抗体与CD44阳性细胞系结合实验测定活性 

取CD44表达阳性细胞系，制成1×10⁶细胞悬液；加入HI313-ScFv，室温避光孵育30分钟，加入约2ml PBS洗一次，1000rpm离心10分钟弃上清；再加入FITC标记的anti-Flag抗体，室温避光孵育30分钟，加入约2ml PBS洗一次，1000rpm离心10分钟弃上清；加入300μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。结果显示HI313-ScFv可与CD44表达阳性的白血病细胞系结合。见图11。 

                      SEQUENCE LISTING 

<110>协和干细胞基因工程有限公司 

<120>抗人CD44单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、工程抗体、载体、试剂盒及其用途 

<130> 

<160>4 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>357 

<212>DNA 

<213>小鼠(Mus musculus) 

<220> 

<221>CDS 

<222>(1)..(357) 

<400>1 

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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 

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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 

        115 

<210>2 

<211>119 

<212>PRT 

<213>小鼠(Mus musculus) 

<400>2 

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                85                  90                  95 

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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 

        115 

<210>3 

<211>339 

<212>DNA 

<213>小鼠(Mus musculus) 

<220> 

<221>CDS 

<222>(1)..(339) 

<400>3 

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1               5                   10                  15 

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Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asn Thr 

            20                  25                  30 

tat ggg acc acc tat ttg tct tgg tac ctc cac aag cct ggc cag tct    144 

Tyr Gly Thr Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser 

        35                  40                  45 

cca cag ctc ctc atc tat ggg att tcc cac aga ttt tct ggg gtg cca    192 

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser His Arg Phe Ser Gly Val Pro 

    50                  55                  60 

gac agg ttc act ggc aat ggt tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc    240 

Asp Arg Phe Thr Gly Asn Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 

65                  70                  75                  80 

agc acc att aag cct gag gac ttg gga atg tat tac tgc tta caa gct    288 

Ser Thr Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 

                85                  90                  95 

aca cat cag cct ccg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa    336 

Thr His Gln Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 

            100                 105                 110 

cgg                                                                339 

Arg 

<210>4 

<211>113 

<212>PRT 

<213>小鼠(Mus musculus) 

<400>4 

Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly 

1               5                   10                  15 

Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asn Thr 

            20                  25                  30 

Tyr Gly Thr Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser 

        35                40                    45 

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser His Arg Phe Ser Gly Val Pro 

    50                  55                  60 

Asp Arg Phe Thr Gly Asn Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 

65                  70                  75                  80 

Ser ThrI le Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 

               85                 90                   95 

Thr His Gln Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 

            100                 105                 110 

Arg 

Claims (6)

1.一种抗人CD44的工程抗体，由保藏号为CGMCC NO.2176杂交瘤细胞系经反转录-聚合酶链式合成反应制备产生，其特征是由接头序列连接的SEQ ID NO.2重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO.4轻链可变区氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的抗人CD44的工程抗体，其特征是编码所述SEQ ID NO.2重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述SEQ ID NO.4轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.含有权利要求1所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，其特征是含有SEQ ID NO.1所述的重链可变区VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO.3所述的轻链可变区VL基因核苷酸序列的cDNA的Simple-T载体。

4.含有权利要求1所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，其特征是含有SEQ ID NO.1所述的重链可变区VH基因核苷酸序列、SEQ ID NO.3所述的轻链可变区VL基因核苷酸序列和接头序列的cDNA的PET22b(+)载体。

5.权利要求1所述的抗人CD44的工程抗体或3、4中任一项所述的载体在制备白血病诊断试剂或治疗白血病的药物中的应用。

6.一种免疫检测试剂盒，其特征是：含有至少一种权利要求1、2工程抗体或权利要求3、4的载体。

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