TWI741914B - 檢測心血管疾病的檢驗套組及心血管疾病相關生物標記的濃度檢測方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種檢測心血管疾病的檢驗套組，其包含第三適體，其與心血管疾病生物標記具有結合專一性，可有效地應用於檢測心血管疾病。

Description

檢測心血管疾病的檢驗套組及心血管疾病相關生物標記的濃度檢測方法

本發明係關於一種檢驗套組及應用其的檢測方法，特別是一種檢測心血管疾病的檢驗套組及應用其的濃度檢測方法，所述檢測心血管疾病的檢驗套組包含可與心血管疾病生物標記專一性結合的適體。

依據世界衛生組織(WHO)於2016年公佈的統計數據顯示，心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)為全球排名第一的疾病死亡原因，每年約有1800萬人死於心血管疾病，佔所有死亡率的31%。大量的數據顯示，心血管疾病一但發病，因著不良的預後而使得復發事件、發病率以及死亡率的風險很高，而許多人其實已有潛在性的危險而不知。據此可知，要有效降低心血管疾病的致死率與其所造成的損失，應該從預防心血管疾病的角度著手。然而，談到預防心血管疾病，就應該先要能有效的預測心血管疾病發生的風險與適時的監控。

目前對於心血管疾病的直接觀察，可由進行心電圖、心臟超音波、核磁造影或血管造影檢測達成。然而前述儀器設置於特定機構中，因醫療資源有限不太可能對全民做定期性的檢查監控。較可行的心血管疾病檢測方法為傳統血液的檢查，然而像是用低密度膽固醇、三酸甘油脂，或是以身體質量指數(BMI)、腰圍、血壓、以及是否有糖尿病或腎功能異常等傳統的指標判斷風險，雖有其功能但卻還是不夠有效。因此若能利用更有效、更便利、更有經濟效應的指標，尤其是利用血液中的生物指標來評估心血管疾病發生的風險，搭配微小化的快速檢測系統，只需要很少量的血液且便宜的裝置即能完成檢測，將有助達到真正便利、有效又經濟的心血管疾病風險評估，實現定點照護的目標，進而能夠有效降低心血管疾病的發生與致死率。

一般要偵測血液中生物標記，為了要達到有足夠的親和力和專一性，目前不管檢驗試劑或生物感測器，均是利用抗體當作抓取標的分子的試劑。然而抗體的生產成本高且穩定性低，對於儲存和運送的溫度條件嚴格的條件限制，且在許多情況下對他們能夠靶定的表位有所限制。以單股DNA當作適體具有許多使其適用於治療應用的優點，諸如分子量較低而更容易穿透過組織、化學合成成本低、修飾方法已建立以及高穩定性。因此，開發出可針對心血管疾病的生物標記具有高親和力的適合適體，可有效幫助早期檢測心血管疾病而增加患者預後存活率。

有鑒於此，本發明之一目的為提供一種檢測心血管疾病的檢驗套組以及應用其濃度檢測方法，所述檢測心血管疾病的檢驗套組包含與心血管疾病相關的生物標記，例如纖維蛋白原，具有結合專一性的適體，其可客觀且準確的檢測待測樣本中纖維蛋白原的濃度，進而判斷受試者是否具有心血管疾病，並可綜合不同心血管疾病相關的生物標記的濃度，更準確地評估受試者罹患心血管疾病的風險。

本發明之一態樣是在於提供一種檢測心血管疾病的檢驗套組，包含一第三適體。其中第三適體對纖維蛋白原(fibrinogen)具有結合專一性，且包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列。

依據前述之檢測心血管疾病的檢驗套組，可更包含一第三標記物與所述第三適體結合，其中所述第三標記物係選自由同位素、酵素、螢光物質、發光物質及磁性物質所組成之群組。

依據前述之檢測心血管疾病的檢驗套組，其中核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示之第三適體的解離常數(Kd)可為4.4 nM。

本發明之另一態樣是在於提供一種濃度檢測方法，用以檢測待測樣本中心血管疾病相關生物標記之待測濃度，所述濃度檢測方法包含提供待測樣本、進行結合步驟、進行偵測步驟以及進行計算步驟。結合步驟係將待測樣本與前段所述之檢測心血管疾病的檢驗套組接觸並進行結合反應。偵測步驟係偵測待測樣本與檢測心血管疾病的檢驗套組之結合值。計算步驟係將結合值帶入預先建立之回歸方程式以得到心血管疾病相關生物標記之待測濃度。

依據前述之濃度檢測方法，其中心血管疾病相關生物標記可為纖維蛋白原 (fibrinogen)。

依據前述之濃度檢測方法，其中當心血管疾病相關生物標記為纖維蛋白原時，所述偵測步驟係偵測待測樣本與第三適體之第三結合值，且所述計算步驟係將第三結合值帶入預先建立之第三回歸方程式以得到纖維蛋白原之待測濃度。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本說明書揭露內容提出一種新穎的檢測心血管疾病的檢驗套組。本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組包含對於心血管疾病的生物標記具有高度結合專一性的適體。進一步對所述適體進行親和力分析，以及以體外試驗證明其與心血管疾病的生物標記具有結合專一性，驗證本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組對於心血管疾病的生物標記的高度專一性，因此可利用本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組早期檢測心血管疾病。

說明書中所述之「適體 (aptamer)」為與特定目標分子結合的寡聚核酸或肽鏈。適體通常從大量的隨機序列被篩選出來，可應用於大分子藥物的開發以及臨床診斷的研究中。於本說明書中所述之「適體」係指適體核酸，是一種核酸經由多次的體外選殖，或是經由系統性配分子指數演繹程序 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)來與多種的目標分子，例如小分子化合物、蛋白質、核酸，細胞、組織與器官等結合，以篩選出與目標分子具有結合專一性的核酸。

說明書中所述之「核苷酸」係指任何長度的核苷酸的聚合物形式，其包含去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及/或其類似物或衍生物。本說明書所示之核苷酸序列係以5’至3’方向排列。

說明書中所述之「N端腦鈉肽前體 (N-terminal pro-brain natriuretic peptide, NT-proBNP)」是一種神經荷爾蒙。研究發現，心室的心肌細胞會分泌一個由134個胺基酸組成的前荷爾蒙，然後分裂成由108個胺基酸所組成的前腦利鈉肽荷爾蒙。進入循環時，又再分裂成由76個胺基酸組成的NT-proBNP，和由32個胺基酸組成的腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)。當左心室功能不良時，NT-proBNP會被分泌出來，其目的在於補償心室壁的擴張，減少心室的負荷。NT-ProBNP於血液中的濃度和美國紐約心臟學會(NYHA)的心臟衰竭分級呈一定比例增加，可藉由檢測血液中NT-ProBNP的濃度判定病人心臟衰竭的嚴重程度。因此NT-proBNP為心臟衰竭的重要生化指標。

說明書中所述之「心肌鈣蛋白I (cardiac Troponin I, cTnI)」為肌鈣蛋白複合物的一個亞基，肌鈣蛋白複合物是與細肌絲相結合的異源蛋白。肌鈣蛋白複合物在骨骼肌和心肌收縮過程中起重要的調節作用。該複合物包括三個亞基：肌鈣蛋白T (TnT)、肌鈣蛋白I (TnI)和肌鈣蛋白C (TnC)。其中在人體內，TnI具有三種亞型，人骨骼肌組織中存在兩種亞型的TnI (skTnI)，一種在慢骨骼肌組織中表達，另一種在快骨骼肌組織中表達。TnI的第三種亞型(cTnI)為心肌型，cTnI僅存在於心臟組織中。當心肌細胞發生損傷或死亡時，細胞內的cTnI會流失到細胞外因此可在血液中被檢測出來。當cTnI於血液中的濃度大於0.04 ng/mL時，就必須在臨床上確認或排除急性心肌梗塞。此外，cTnI的表現在心肌梗塞後可能持續上升達10天之久，可以做為近期心肌梗塞或再梗塞的判斷依據，也可以用來預測梗塞範圍以及預後。因此cTnI可作為判斷心肌梗塞的重要生物標記。

說明書中所述之「纖維蛋白原 (fibrinogen)」屬於第一凝固因子，合成於肝臟，在血液凝固過程中被凝血酶 (thrombin)切割形成纖維蛋白 (fibrin)，和血小板結合以促成血塊凝集。當發炎反應發生24小時後，人體會開始分泌纖維蛋白原，促使紅血球的凝集。此外，動脈硬化的病人體內的纖維蛋白原表現是上升的。因此纖維蛋白原可作為評估發炎和心臟血管危險率的指標。

下述將更詳細討論本發明各實施方式。然而，此實施方式可為各種發明概念的應用，可被具體實行在各種不同的特定範圍內。特定的實施方式是僅以說明為目的，且不受限於揭露的範圍。

一、本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組

本發明之包含選自由一第一適體、一第二適體及一第三適體所組成之群組。其中第一適體對N端腦鈉肽前體具有結合專一性，第二適體對心肌鈣蛋白I具有結合專一性，第三適體對纖維蛋白原具有結合專一性。

本發明之第一適體之一實施例為N20a，其具有SEQ ID NO：1之核苷酸序列。第一適體之另一實施例為N10，其具有SEQ ID NO：4之核苷酸序列。第一適體之又一實施例為N15，其具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列。第一適體之再一實施例為N21a，其具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列。

本發明之第二適體之一實施例為Tn2，其具有SEQ ID NO：2之核苷酸序列。第二適體之另一實施例為cTni3，其具有SEQ ID NO：7之核苷酸序列。第二適體之又一實施例為cTni6，其具有SEQ ID NO：8之核苷酸序列。

本發明之第三適體之一實施例為F03s，其具有SEQ ID NO：3之核苷酸序列。第三適體之另一實施例為F17a，其具有SEQ ID NO：9之核苷酸序列。第三適體之又一實施例為F13a，其具有SEQ ID NO：10之核苷酸序列。第三適體之再一實施例為F37a，其具有SEQ ID NO：11之核苷酸序列。

本發明之第一適體、第二適體和第三適體可使用本發明所屬技術領域中已知方法製備。且本發明之第一適體、第二適體和第三適體可呈線性或環狀形式，可以是RNA、DNA(例如單股DNA)、經修飾核酸，或其混合物。第一適體、第二適體和第三適體可以是非天然分子(例如含有不存在於天然基因中的核苷酸序列或含有自然界中不存在的經修飾核苷酸)。或者或另外，第一適體、第二適體和第三適體可不含有編碼功能性肽的核苷酸序列。

此外，本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組可更包含第一標記物、第二標記物及/或第三標記物。第一標記物與第一適體結合，其中第一標記物係選自由同位素、酵素、螢光物質、發光物質及磁性物質所組成之群組。第二標記物與第二適體結合，其中第二標記物係選自由同位素、酵素、螢光物質、發光物質及磁性物質所組成之群組。第三標記物與第三適體結合，其中第三標記物係選自由同位素、酵素、螢光物質、發光物質及磁性物質所組成之群組。

[試驗例]

1.親和力測試

首先測試本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組中所包含的第一適體、第二適體和第三適體的親和力。親和力測試會運用表面電漿共振儀 (surface Plasmon resonance, SPR)進行結合測量其訊號之變化，計算個別之第一適體、第二適體和第三適體對其目標蛋白之解離常數 (disassociation constant, Kd)。或是結合針對目標蛋白且與冷光酵素結合的抗體，利用冷光的訊號測量與目標蛋白相應之第一適體、第二適體和第三適體的親和力。

請參照第1A圖、第1B圖和第1C圖，為將第一適體、第二適體或第三適體與其相應的目標蛋白結合後，以表面電漿共振儀進行測量，並將相對單位(RU)隨目標蛋白濃度的變化作圖而得的親和力曲線。其中第1A圖為第一適體N20a與NT-proBNP之親和力曲線圖，第1B圖為第二適體Tn2與hcTnI (human cardiac Troponin I)之親和力曲線圖，第1C圖為第三適體F03s與纖維蛋白原之親和力曲線圖。

第1A圖的結果顯示，第一適體N20a與NT-proBNP具有高度的親和力，經計算後推定第一適體N20a的解離常數為2.89 nM。第1B圖的結果顯示，第二適體Tn2與hcTnI具有高度的親和力，經計算後推定第二適體Tn2的解離常數為19.8 nM。第1C圖的結果顯示，第三適體F03s與纖維蛋白原具有高度的親和力，經計算後推定第三適體F03s的解離常數為4.4 nM。

請再參照第2A圖、第2B圖、第3A圖、第3B圖、第4A圖、第4B圖和第4C圖，為將第一適體、第二適體或第三適體與針對其相應的目標蛋白且與冷光酵素結合的抗體結合後，利用冷光的訊號測量，將冷光強度隨目標蛋白濃度的變化作圖而得的親和力曲線。其中第2A圖為第一適體N10與NT-proBNP之親和力曲線圖，第2B圖為第一適體N15與NT-proBNP之親和力曲線圖，第3A圖為第二適體cTni3與hcTnI之親和力曲線圖，第3B圖為第二適體cTni6與hcTnI之親和力曲線圖，第4A圖為第三適體F17a與纖維蛋白原之親和力曲線圖，第4B圖為第三適體F13a與纖維蛋白原之親和力曲線圖，第4C圖為第三適體F37a與纖維蛋白原之親和力曲線圖。此外，將第一適體N21a與NT-proBNP結合後，以表面電漿共振儀進行測量，並將相對單位(RU)隨目標蛋白濃度的變化作圖而得的親和力曲線。請參照第2C圖，為第一適體N21a與NT-proBNP之親和力曲線圖。

第2A圖的結果顯示，第一適體N10與NT-proBNP具有高度的親和力，經計算後推定第一適體N10的解離常數為19.8 nM。第2B圖的結果顯示，第一適體N15與NT-proBNP具有高度的親和力，經計算後推定第一適體N15的解離常數為59.6 nM。第2C圖的結果顯示，第一適體N21a與NT-proBNP具有高度的親和力，經計算後推定第一適體N21a的解離常數為62.84 nM。第3A圖的結果顯示，第二適體cTni3與hcTnI具有高度的親和力，經計算後推定第二適體cTni3的解離常數為2.3 nM。第3B圖的結果顯示，第二適體cTni6與hcTnI具有高度的親和力，經計算後推定第二適體cTni6的解離常數為49.4 nM。第4A圖的結果顯示，第三適體F17a與纖維蛋白原具有高度的親和力，經計算後推定第三適體F17a的解離常數為59.0 nM。第4B圖的結果顯示，第三適體F13a與纖維蛋白原具有高度的親和力，經計算後推定第三適體F13a的解離常數為300.8 nM。第4C圖的結果顯示，第三適體F37a與纖維蛋白原具有高度的親和力，經計算後推定第三適體F37a的解離常數為95.0 nM。

上述結果顯示，本發明之第一適體、第二適體和第三適體具有數或數十納莫耳每升(nM)解離常數的親和力程度，已經屬於一般抗體的親和力範圍。

2.專一性測試

進行專一性測試時，先分別合成第一適體、第二適體和第三適體的單股DNA，並利用表面覆蓋目標蛋白或非目標蛋白的磁珠與第一適體、第二適體和第三適體混合，再利用磁力留住磁珠並沖洗掉未能附著於磁珠上的適體。接著再加熱破壞磁珠上的蛋白以將吸附的適體釋放於上清液中，並利用上清液進行定量PCR來分析殘留的適體數量，互相比較以測驗第一適體、第二適體和第三適體的專一性。理論上，有專一性的適體應該只會和其對應的目標的蛋白相結合，而不會和非對應蛋白結合。於本試驗例中測試的適體為第一適體N20a、第二適體Tn2和第三適體F03s。

請參照第5A圖、第5B圖、第5C圖和第5D圖，為本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組之專一性測試結果圖。第5A圖為定量PCR後各測試組的膠體電泳分析圖，其中大寫字母N、T、F分別代表磁珠上覆有NT-proBNP、hcTnI及纖維蛋白原。縮小標示N、T、F則分別代表第一適體N20a、第二適體Tn2及第三適體F03s，兩者並寫表示該蛋白覆蓋磁珠與所示適體混合的試驗組別。第5B圖為第一適體N20a的專一性和非專一性建結的定量PCR分析結果圖。第5C圖為第二適體Tn2的專一性和非專一性建結的定量PCR分析結果圖。第5D圖為第三適體F03s的專一性和非專一性建結的定量PCR分析結果圖。

於第5A圖中，若於72 bp的位置有偵測到增幅的DNA片段，表示混合的樣品經清洗過後仍有單股DNA殘留，表示兩者之間有較強的親和力。請參照第5A圖和第5B圖，於第5A圖中適體為第一適體N20a的組別，僅見以覆有NT-proBNP的磁珠進行混合，後續可偵測到增幅的DNA片段。而第5B圖的結果亦顯示僅有覆有NT-proBNP的磁珠才能吸附第一適體N20a。顯示第一適體N20a僅與NT-proBNP具有強親和力，而與hcTnI和纖維蛋白原不具有強親和力。請參照第5A圖和第5C圖，於第5A圖中適體為第二適體Tn2的組別，僅見以覆有hcTnI的磁珠進行混合，後續可偵測到增幅的DNA片段。而第5C圖的結果亦顯示僅有覆有hcTnI的磁珠才能吸附第二適體Tn2。顯示第二適體Tn2僅與hcTnI具有強親和力，而與NT-proBNP和纖維蛋白原不具有強親和力。請參照第5A圖和第5D圖，於第5A圖中適體為第三適體F03s的組別，僅見以覆有纖維蛋白原的磁珠進行混合，後續可偵測到增幅的DNA片段。而第5D圖的結果亦顯示僅有覆有纖維蛋白原的磁珠才能吸附第三適體F03s。顯示第三適體F03s僅與纖維蛋白原具有強親和力，而與NT-proBNP和hcTnI不具有強親和力。

上述結果顯示，本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組所包含的第一適體、第二適體和第三適體均對目標蛋白具有良好的專一性，而針對BSA或其他心血管疾病生物標記中的非目標蛋白則不具有專一結合性。

二、本發明之濃度檢測方法

本發明之濃度檢測方法係用於活體外檢測待測樣本中心血管疾病相關生物標記之待測濃度，可使用上述之檢測心血管疾病的檢驗套組，將本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組與待測樣本結合後，偵測待測樣本與檢測心血管疾病的檢驗套組之結合值，並將結合值帶入預先建立之回歸方程式以得到心血管疾病相關生物標記之待測濃度。

請參照第6A圖，為本發明之濃度檢測方法100的步驟流程圖。在第6A圖中，濃度檢測方法100包含步驟110、步驟120、步驟130和步驟140。所述濃度檢測方法100係用以檢測待測樣本中心血管疾病相關生物標記之待測濃度，而心血管疾病相關生物標記可為N端腦鈉肽前體 (N-terminal pro-brain natriuretic peptide, NT-proBNP)、心肌鈣蛋白I (cardiac Troponin I, cTnI)及/和纖維蛋白原 (fibrinogen)。

步驟110是提供一待測樣本，係自受試者取得檢體樣本，其中檢體樣本可以為血液、血漿和血清等。

步驟120是進行一結合步驟，係將待測樣本與前段所述之檢測心血管疾病的檢驗套組接觸並進行結合反應。其中檢測心血管疾病的檢驗套組包含選自由一第一適體、一第二適體及一第三適體所組成之群組。此外，第一適體可與第一標記物結合，而第一標記物可選自由同位素、酵素、螢光物質、發光物質及磁性物質所組成之群組。第二適體可與第二標記物結合，而第二標記物可選自由同位素、酵素、螢光物質、發光物質及磁性物質所組成之群組。第三適體可與第三標記物結合，而第三標記物可選自由同位素、酵素、螢光物質、發光物質及磁性物質所組成之群組。

步驟130是進行一偵測步驟，係偵測待測樣本與檢測心血管疾病的檢驗套組之一結合值。詳細地說，當心血管疾病相關生物標記為N端腦鈉肽前體時，所述偵測步驟係偵測待測樣本與第一適體之第一結合值。當心血管疾病相關生物標記為心肌鈣蛋白I時，所述偵測步驟係偵測待測樣本與第二適體之第二結合值。當心血管疾病相關生物標記為纖維蛋白原時，所述偵測步驟係偵測待測樣本與第三適體之第三結合值。

步驟140是進行一計算步驟，係將結合值帶入預先建立之回歸方程式以得到心血管疾病相關生物標記之待測濃度。詳細地說，將第一結合值帶入預先建立之第一回歸方程式可得到N端腦鈉肽前體之待測濃度。將第二結合值帶入預先建立之第二回歸方程式可得到心肌鈣蛋白I之待測濃度。將第三結合值帶入預先建立之第三回歸方程式可得到纖維蛋白原之待測濃度。

更具體舉例來說，假設待測的心血管疾病相關生物標記為心肌鈣蛋白I，請參照第6B圖和第6C圖，第6B圖繪示實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組之結構示意圖，第6C圖繪示利用實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組進行濃度檢測之步驟流程示意圖。實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組係將與生物素結合的第二適體與抗生物素塗層磁珠進行結合，以形成一第二適體磁珠。再將第二適體磁珠與待測樣本混合後，以緩衝溶液將未結合至第二適體磁珠的蛋白洗去。將與待測樣本混合後的第二適體磁珠以抗心肌鈣蛋白I的一級抗體共同培養一段時間後，以緩衝溶液將未接上第二適體磁珠的抗心肌鈣蛋白I的一級抗體洗去。再將接上抗心肌鈣蛋白I的一級抗體的第二適體磁珠與接有辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP)和鹼性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP)的二級抗體共同培養一段時間後，以緩衝溶液洗去未與一級抗體專一性結合的二級抗體，再加入酵素冷光試劑，利用冷光的訊號測量以測得待測樣本與第二適體的第二結合值。而第二結合值會隨心肌鈣蛋白I濃度的變化而變化，是以在進行未知濃度的待測樣本檢測時，先以已知濃度且經序列稀釋後的心肌鈣蛋白I，與第二適體磁珠以前述步驟建立一第二回歸方程式，後續檢測未知濃度的待測樣本時，即可將測得的第二結合值帶入第二回歸方程式而得到待測樣本中心肌鈣蛋白I的待測濃度。

請參照第7A圖、第7B圖和第7C圖，第7A圖為實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組對純化的心肌鈣蛋白I進行檢測之結果圖，第7B圖為實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組的專一性測試結果圖，第7C圖為實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組對血清樣本進行檢測之結果圖。

試驗上，先將純化的心肌鈣蛋白I稀釋為12 ng/mL、2.4 ng/mL、1.2 ng/mL、0.24 ng/mL、0.06 ng/mL和0.01 ng/mL，再將6個濃度的心肌鈣蛋白I分別與第二適體磁珠混合，以前述的方法偵測第二結合值，再將6個不同濃度所得到的第二結合值利用四參數邏輯回歸方程式(4-parameter logistic regression)，公式為y=(A₁ -A₂ )/(1+(x/x₀ )^p)+A₂ ，其中y代表第二結合值(於實施例1中即為冷光強度)、x代表濃度、A₁ 為起始結合值，A₂ 為最後結合值，x₀ 則代表結合值轉折點濃度，p則為乘冪值。A₁ 、A₂ 、x₀ 及p值為利用軟體進行曲線擬合所求得的值，並以擬合求得的值帶入回歸方程式以建立符合該組標準濃度檢量線的回歸公式。此公式即可用以計算第二結合值和濃度的關係。第7A圖的結果顯示，第二適體磁珠與不同濃度的心肌鈣蛋白I具有良好的回歸曲線關係，是以後續可用以準確地偵測待測樣本中心肌鈣蛋白I的待測濃度。

此外，試驗上另分別將心肌鈣蛋白I、NT-proBNP、纖維蛋白原和BSA分別稀釋為12 ng/mL、2.4 ng/mL、1.2 ng/mL、0.24 ng/mL、0.06 ng/mL和0.01 ng/mL，再將6個濃度的心肌鈣蛋白I、NT-proBNP、纖維蛋白原和BSA分別與第二適體磁珠混合，以前述的方法偵測是否有結合值(即冷光強度)。第7B圖的結果顯示，僅有當待測樣本為心肌鈣蛋白I時可以偵測到冷光強度，當待測樣本為NT-proBNP、纖維蛋白原和BSA時，則不能測得冷光訊號值，顯示實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組具有良好的專一性。

進一步地，將已知心肌鈣蛋白I濃度的血清樣本分別與第二適體磁珠混合，以前述的方法偵測第二結合值。第7C圖的結果顯示，第二適體磁珠與血清樣本中不同濃度的心肌鈣蛋白I亦具有良好的曲線分佈關係，是以本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組可以運用在檢測血清樣本中心肌鈣蛋白I的待測濃度。

綜上所述，本發明提供一種檢測心血管疾病的檢驗套組以及應用其濃度檢測方法，所述檢測心血管疾病的檢驗套組包含與N端腦鈉肽前體、心肌鈣蛋白I及/或纖維蛋白原等心血管疾病相關的生物標記具有高度親和力和結合專一性的第一適體、第二適體和第三適體，其可客觀且準確的檢測待測樣本中N端腦鈉肽前體、心肌鈣蛋白I及/或纖維蛋白原的濃度，進而判斷受試者是否具有心血管疾病，並可綜合不同心血管疾病相關的生物標記的濃度，更準確地評估受試者罹患心血管疾病的風險。因本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組所包含的第一適體、第二適體和第三適體為單股DNA的適體，和現行被廣泛使用的抗體相較之下，有著生產成本較低、保存溫度條件較寬鬆以及生產批次差異小等優點。且第一適體、第二適體和第三適體可以用於發展新的檢測方法及新的檢測試劑，亦可結合應用於開發半導體式、電化學式或其它型式的生物感應器，可能延伸出微型偵測晶片或檢驗套組。此外，因本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組包含針對三個心血管疾病的生物標記所篩選的單股DNA適體，亦可合併運用於微型的偵測晶片或檢驗套組中，可以綜合不同生物標記的濃度來更準確地評估心血管疾病的風險，開發此類小型檢測儀器或套組能真正幫助實現定點照護的目標。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

100:濃度檢測方法 110,120,130,140:步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下: 第1A圖為本發明之第一適體之一實施例之親和力曲線圖； 第1B圖為本發明之第二適體之一實施例之親和力曲線圖； 第1C圖為本發明之第三適體之一實施例之親和力曲線圖； 第2A圖為本發明之第一適體之另一實施例之親和力曲線圖； 第2B圖為本發明之第一適體之又一實施例之親和力曲線圖； 第2C圖為本發明之第一適體之再一實施例之親和力曲線圖； 第3A圖為本發明之第二適體之另一實施例之親和力曲線圖； 第3B圖為本發明之第二適體之又一實施例之親和力曲線圖； 第4A圖為本發明之第三適體之另一實施例之親和力曲線圖； 第4B圖為本發明之第三適體之又一實施例之親和力曲線圖； 第4C圖為本發明之第三適體之再一實施例之親和力曲線圖； 第5A圖、第5B圖、第5C圖和第5D圖為本發明之檢測心血管疾病的檢驗套組之專一性測試結果圖； 第6A圖繪示本發明之濃度檢測方法的步驟流程圖； 第6B圖繪示實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組之結構示意圖； 第6C圖繪示利用實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組進行濃度檢測之步驟流程示意圖； 第7A圖為實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組對純化的心肌鈣蛋白I進行檢測之結果圖； 第7B圖為實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組的專一性測試結果圖；以及 第7C圖為實施例1之檢測心血管疾病的檢驗套組對血清樣本進行檢測之結果圖。

Claims (6)

1. 一種檢測心血管疾病的檢驗套組，包含一第三適體所組成之群組，該第三適體對纖維蛋白原 (fibrinogen)具有結合專一性，且包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列。
2. 如請求項1所述之檢測心血管疾病的檢驗套組，更包含一第三標記物與該第三適體結合，其中該第三標記物係選自由同位素、酵素、螢光物質、發光物質及磁性物質所組成之群組。
3. 如請求項1所述之檢測心血管疾病的檢驗套組，其中核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示之該第三適體的解離常數(Kd)為4.4 nM。
4. 一種濃度檢測方法，用以檢測一待測樣本中一心血管疾病相關生物標記之一待測濃度，該濃度檢測方法包含： 提供該待測樣本； 進行一結合步驟，係將該待測樣本與如請求項1至請求項3任一項所述之該檢測心血管疾病的檢驗套組接觸並進行結合反應； 進行一偵測步驟，係偵測該待測樣本與該檢測心血管疾病的檢驗套組之一結合值；以及 進行一計算步驟，係將該結合值帶入預先建立之一回歸方程式以得到該心血管疾病相關生物標記之該待測濃度。
5. 如請求項4所述之濃度檢測方法，其中該心血管疾病相關生物標記為纖維蛋白原 (fibrinogen)。
6. 如請求項5所述之濃度檢測方法，該偵測步驟係偵測該待測樣本與該第三適體之一第三結合值，且該計算步驟係將該第三結合值帶入預先建立之一第三回歸方程式以得到該纖維蛋白原之該待測濃度。

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