KR20170062453A - 심혈관 위험 사건 예측 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

1 내지 5 년 기간에 걸쳐 심혈관 (CV) 사건의 발생 위험의 예측에 대하여 개체를 평가하기 위해 사용된 바이오마커, 방법, 장치, 시약, 시스템, 및 키트가 제공된다. 상기 방법은 FSTL3와 조합된, MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민 또는 GDF11로부터 선택된 적어도 2개의 바이오마커를 이용한다. 상기 방법은 특히, 관상동맥 심장 질환 (CHD)을 앓는 환자 내 CV 사건을 예측하는데 유용하다.

Description

심혈관 위험 사건 예측 및 이의 용도 {CARDIOVASCULAR RISK EVENT PREDICTION AND USES THEREOF}
발명의 분야
본 출원은 일반적으로 개체에서 바이오마커의 검출 및 추가 심혈관 사건의 위험 평가 및, 더욱 구체적으로, 1 내지 5 년 기간에 걸쳐 심혈관 (CV) 사건의 발생 위험의 예측에 대하여 개체를 평가하기 위해 사용된 하나 이상의 바이오마커, 방법, 장치, 시약, 시스템, 및 키트에 관한 것이다. 상기 사건은 비제한적으로 심근경색증, 뇌졸중, 울혈성 심부전 또는 사망을 포함한다.
배경
하기 설명은 본 출원에 관련된 정보의 요약을 제공하고 본원에서 제공된 임의의 정보 또는 참조된 공보는 본 출원에 대해 선행기술로 인정되지 않는다.
심혈관 질환은 미국에서 사망의 주된 원인이다. 임상 실무 및 치료적 시도에서 널리 사용되는 1차 사건 (D'Agostino, R et al., "General Cardiovascular Risk Profile for Use in Primary Care: The Framingham Heart Study" Circulation 117:743-53 (2008); and Ridker, P. et al., "Development and Validation of Improved Algorithms for the Assessment of Global Cardiovascular Risk in Women" JAMA 297(6):611-619 (2007)) 및 2차 사건 (Shlipak, M. et al. "Biomarkers to Predict Recurrent Cardiovascular Disease: The Heart & Soul Study" Am. J. Med. 121:50-57 (2008)) 위험의 수많은 현존하는 및 중요한 예측변수가 있다. 불행하게도, 리시버-작동 특징적인 곡선, 위험 비율, 및 일치는 현존하는 위험 요소 및 바이오마커의 성능이 보통임을 보여준다 (~0.75의 AUCs는 이들 요소가 동전던지기와 완벽 사이의 단지 중간쯤임을 의미한다). 개선된 진단 성능에 대한 필요성에 더하여, 유익한 (및 파괴적) 개입 및 생활방식 변화에 대해 개체 내에서 모든 단기적 및 개인적 반응성인 위험 제품이 필요하다. 통상적으로 이용된 프라밍햄 방정식은 3가지 주요 문제를 갖는다. 첫째, 너무 장기간이다: 인간 할인 추가 위험을 제외한 10-년 위험 계산을 제공하고 이들에 기반하여 행동 및 생활방식을 변형시키기를 꺼린다. 둘째, 개입에 대단한 반응성은 아니다: 감소할 수 없는 생활 연령; 및 변할 수 없는 성별에 지나치게 의존적이다. 셋째, 본원에서 구상된 높은 위험 집단 내에서, 프라밍햄 요소는 높은 및 낮은 위험 사이에서 양호하게 식별하는데 실패한다: 높은 및 낮은 4분위수 사이에서 위험 비율은 단지 2이고, 대상체를 더 미세한 층들 (예를 들어 10분위수)로 계층화함으로써 위험을 개인화하기 위해 프라밍햄 스코어 사용을 시도하는 경우 관측된 사건율은 많은 십분위수로 유사하다.
심혈관 질환에 대한 위험 요소는 의료적 치료의 세기 및 성질을 제공하기 위해 널리 사용되고, 이의 용도는 과거 2십여 년에 걸쳐 관측된 심혈관 이환율 및 사망률에서 감소에 의심할 여지없이 기여하였다. 이들 요소는 일상적으로 알고리즘에 조합되지만 그러나 불행하게도 이들은 모든 위험을 포착하지 않는다 (심장 질환에 대한 가장 흔한 초기 제시는 여전히 사망이다). 사실상 이들은 아마 위험의 절반을 단지 포착한다. ~0.76의 ROC 곡선하 영역은 1차 예방에서 상기 위험 요소에 전형적이고, 2차 예방에서 성능을 훨씬 악화시키고 (0.62가 전형적이다), 0.5에서 동전던지기와 1.0에서 완벽 사이에서 성능의 단지 약 4분의 1 내지 2분의 1 수치를 악화시킨다.
임상 위험 스코어에 새로운 바이오마커의 부가는 실망시키고 있다. 예를 들어, 3209 명의 프라밍햄 연구 (Wang et al., "Multiple Biomarkers for the Prediction of First Major Cardiovascular Events and Death" N. Eng. J. Med. 355:2631-2637 (2006))에서, 10 바이오마커 (CRP, BNP, NT-proBNP, 알도스테론, 레닌, 피브리노겐, D-이량체, 플라스미노겐-활성제 저해제 1형, 호모시스테인 및 비뇨기 알부민 대 크레아티닌 비)의 부가는 현존하는 위험 요소에 부가된 경우 AUC를 유의미하게 개선하지 않았다: 사건 0-5 년 동안 AUC는 연령, 성별 및 종래 위험 요소를 이용하여 0.76이었고 혼합물에 부가된 바이오마커의 최상 조합을 이용하여 0.77이었고, 2차 예방으로 상황은 악화된다.
1-5 년 윈도우 내에서 심혈관 사건의 더 높은 위험을 가진 환자의 초기 확인이 중요한 것은 상승된 위험을 갖는 개체의 더욱 적극적인 치료가 결과를 개선할 수 있기 때문이다. 따라서, 최적의 관리는 더 높은 위험을 갖는 것으로 고려되는 상기 환자에서 심혈관 사건의 위험을 감소시키기 위해 적극적인 처치를 필요로 하고, 반면에 심혈관 사건의 더 낮은 위험을 갖는 환자는 비싼 및 잠재적으로 침습성 치료가 절약될 수 있으나, 이는 환자에 유익한 효과를 가질 것 같지 않다.
한정된 기간 내에서 특이적 질환 상태 또는 병태의 위험 예측용 바이오마커 선택은 특이적인 의료적 적용을 위하여 사건의 확률 및/또는 타이밍과 측정가능한 및 통계적으로 유의미한 관계를 갖는 마커의 확인을 먼저 포함한다. 바이오마커는 해당 병태에 대한 인과관계 경로인, 또는 질환 또는 병태 발달 또는 진행에 다운스트림 또는 평행한, 또는 모두인 분비된 또는 흘린 분자를 포함할 수 있다. 이들은 심혈관 사건에 미리조치된 생물학적 방법에 대한 반응에서 심혈관 조직으로부터 또는 다른 기관 및 주위의 조직 및 순환 세포로부터 혈액 스트림에 방출되거나 또는 이들은 병리생리학의 다운스트림 효과 예컨대 신장 기능의 쇠퇴가 반영될 수 있다. 바이오마커는 작은 분자, 펩티드, 단백질, 및 핵산을 포함할 수 있다. 바이오마커의 확인에 영향을 미치는 주요 사안의 일부는 이용가능한 데이터의 과적합 및 데이터에서의 바이어스를 포함한다.
바이오마커를 확인하기 위한 및 질환 또는 병태의 보유 위험을 진단 또는 예측하기 위한 시도로 다양한 방법이 이용되고 있다. 단백질-기반 마커에 대하여, 이들은 2-차원 전기영동, 질량 분광분석법, 및 면역검정 방법을 포함한다. 핵산 마커에 대하여, 이들은 mRNA 발현 프로파일, microRNA 프로파일, FISH, 유전자 발현 (SAGE)의 시리즈 분석, 대규모 유전자 발현 배열, 유전자 시컨싱 및 유전형분석 (SNP 또는 작은 변이체 분석)을 포함한다.
2-차원 전기영동의 유용성은 낮은 검출 민감성; 단백질 용해도, 전하, 및 소수성을 갖는 사안; 겔 재현성; 및 다중 단백질을 나타내는 단일 스팟의 가능성에 의해 제한된다. 질량 분광분석법에 대하여, 사용된 포멧에 의존하여, 제한은 샘플 가공 및 분리 주변에서 민감성 내지 낮은 존재도 단백질, 신호 내지 소음 고려사항들, 및 무능 내지 검출된 단백질 즉시 확인을 순환한다. 바이오마커 발견에 대한 면역검정 접근법에서 제한은 다수의 분석물을 측정하기 위해 항체-기반 멀티플렉스 검정의 무능에 집중된다. 간단히 고-품질 항체의 배열을 인쇄할 수 있고, 샌드위치 없이, 상기 항체에 결합된 분석물을 측정할 수 있다. (이는 유기체 또는 세포에서 모든 DNA 또는 RNA 서열의 하이브리드화에 의해 평가하기 위한 핵산 서열의 전체의 게놈 이용의 형식적 등가물일 것이다. 하이브리드화가 동일성에 대하여 엄격한 시험일 수 있기 때문에 하이브리드화 실험이 작동한다.) 그러나, 상기 매트릭스에서 단백질 앙상블이, 좋지 못한 신호 대 잡음비를 초래할 수 있는, 널리 다양한 존재도를 갖기 때문에 심지어 매우 양호한 항체는 혈액 또는 심지어 세포 추출물의 맥락에서 작동하기 위해 이의 결합 파트너 선택에서 전형적으로 충분히 엄격하지 않다. 따라서, 바이오마커 발견에 대한 면역검정-기반 접근법과 상이한 접근법을 사용해야 한다 - 분석물이 사실상 바이오마커인 것을 측정하기 위해 동시에 많은 분석물을 평가하기 위해 충분한 엄격성을 얻도록 다중화된 ELISA 검정 (즉, 샌드위치)을 사용할 필요가 있을 것이다. 샌드위치 면역검정은 고 함량까지 이르지 않고, 따라서 엄격한 샌드위치 면역검정을 이용한 바이오마커 발견은 표준 배열 포맷 이용이 가능하지 않다. 마지막으로, 항체 시약은 실질적인 로트 가변성 및 시약 불안정되기 쉽다. 단백질 바이오마커 발견에 대한 즉석 플랫폼은 이 문제를 극복한다.
많은 이들 방법은 분석에 앞서 일부 유형의 샘플 분획화에 의존하거나 또는 이를 필요로 한다. 따라서 일련의 명확한 샘플 집단에서 통계적으로 관련된 바이오마커를 확인 및 발견하기 위해 설계된 충분히 동력화된 연구를 운영하도록 요구된 샘플 제조는 극도로 어렵고, 고비용이며, 시간이 걸린다. 분획화 동안, 광범위한 가변성은 다양한 샘플 속으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 잠재적 마커는 방법에 불안정할 수 있고, 마커의 농도는 변화될 수 있고, 부적절한 응집 또는 분해가 발생할 수 있고, 우연한 샘플 오염이 발생할 수 있고 따라서 초기 질환에서 기대된 미묘한 변화가 불분명할 수 있다.
이들 기술을 이용한 바이오마커 발견 및 검출 방법이 진단적 또는 예측적 바이오마커의 확인에 대하여 심각한 제한을 갖는다는 것이 널리 허용된다. 이들 제한은 낮은-존재도 바이오마커를 검출하는데 무능, 단백체의 전체 동적 범위를 일관되게 커버하는데 무능, 샘플 가공 및 분획화에서 재현불가능성, 및 방법의 전체 재현불가능성 및 강건성의 부족을 포함한다. 추가로, 이들 연구는 데이터에 바이아스를 도입하였고, 표적 질환 집단 내에서 바이오마커를 확인 및 유효화하도록 요구된 분포 및 무작위화에 관하여, 적절한 대조군을 포함하여, 샘플 집단의 복합성을 적절하게 다루지 못하였다.
비록 신규 및 유효한 바이오마커의 발견을 겨냥한 노력이 수십 년 동안 해왔어도, 노력은 크게 비성공적이었다. 다양한 질환용 바이오마커는, 일부 질환 방법에 관하여 기초 연구를 하여도 보통 우연한 발견을 통해, 전형적으로 학교 실험실에서 확인되어 왔다. 발견에 기반하여 및 임상 데이터의 소량으로, 신규 바이오마커의 확인을 제안한 논문이 공개되었다. 대부분의 이들 제안된 바이오마커가, 그러나, 현실적 또는 유용한 바이오마커로서 확인되지 않은 것은, 주로 시험된 소수의 임상 샘플이 유효한 바이오마커가 사실상 발견된 유일한 취약한 통계적인 증거를 제공하기 때문이다. 즉, 초기 확인은 통계의 기초 요소에 관해 엄격하지 않았다. 1994년 내지 2003년의 각각에서, 과학적 문헌의 조사는 바이오마커에 관한 수 천의 참조문헌이 공개되었음을 보여준다. 동일한 시간 프레임 동안, 그러나, FDA는 1년에 많아야, 3개 신규 단백질 바이오마커를 진단 용도로 승인하였고, 수 년 동안 신규 단백질 바이오마커는 승인되지 않았다.
실패한 바이오마커 발견 노력의 이력에 기반하여, 질환 및 병태의 발생의 진단, 예측 또는 위험 예측용 바이오마커가 찾기 드물고 어렵다는 일반적인 이해를 추가로 촉진하는 이론이 제안되어 왔다. 2D 겔 또는 질량 분광분석법에 기반한 바이오마커 연구는 이들 개념을 지지한다. 아주 적은 유용한 바이오마커는 이들 접근법을 통해 확인되었다. 그러나, 2D 겔 및 질량 분광분석법이 대략 1 nM 농도 이상으로 혈액에서 존재하는 단백질을 측정하는 것, 및 단백질의 상기 앙상블이 질환 또는 특정한 병태의 발생으로 양호하게 가장 덜 변화할 것 같을 수 있음이 보통 간과된다. 즉석 바이오마커 발견 플랫폼 이외에, 훨씬 더 낮은 농도로 단백질 발현 수준을 정확하게 측정할 수 있는 단백체 바이오마커 발견 플랫폼은 존재하지 않는다.
복합 인간 생물학을 위하여 생화학적 경로에 대하여 많이 공지된다. 많은 생화학적 경로는 병리학 내에서 국소로 작용하는 분비된 단백질에 의해 개시되거나 또는 종결되고; 예를 들어, 성장 요소는 병리학에서 다른 세포의 복제를 자극하기 위해 분비되고, 다른 요소는 면역 시스템, 등등을 피하기 위해 분비된다. 많은 이들 분비된 단백질이 주변분비 방식으로 작용하여도, 일부는 몸체에서 말단에 작용한다. 생화학적 경로의 기초 이해를 갖는 당해 분야의 숙련가는 많은 병리학-특이적 단백질이 2D 겔 및 질량 분광분석법의 검출 한계 미만 (한층 더 미만)의 농도에서 혈액에 존재해야 하는지를 이해할 것이다. 질환 바이오마커의 상기 상대적으로 풍부한 수의 확인에 선행해야 하는 것은 2D 겔 또는 질량 분광분석법에 의해 검출가능한 것 미만의 농도에서 단백질을 분석할 수 있는 단백체 플랫폼이다.
상기 논의된 바와 같이, 심혈관 사건은 상기 사건에 대한 경향이 정확하게 측정되면 적극적인 치료에 의해, 및 이들을 가장 많이 필요로 하는 사람 및/또는 이들을 가장 적게 필요로 하는 사람에서 상기 개입 표적화에 의해 예방될 수 있고, 의료 자원화 효율은 개선될 수 있고 비용은 동시에 낮아질 수 있다. 추가로, 환자가 심혈관 사건의 그 개인적인 가능성에 대해 정확한 및 단기 정보의 지식을 갖는 경우, 이는 장기간 집단-기반 정보 보다 덜 부정적일 수 있고 이점에 부가될 약물로 개선된 순응도 및 개선된 생활방식 선택을 초래할 것이다. 현존하는 다중-마커 시험은 개체로부터 다중 샘플의 수집을 필요로 하거나 또는 샘플이 다중 검정 사이에서 분할되는 것을 필요로 한다. 최적으로, 개선된 시험은 단지 단일 혈액, 소변 또는 다른 샘플, 및 단일 검정을 필요로 할 것이다. 따라서, 5 년 기간 내에서 심혈관 사건의 예측을 가능하게 하는 바이오마커, 방법, 장치, 시약, 시스템, 및 키트에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 출원은 1 년 기간, 2 년 기간, 3 년 기간, 또는 4 년 기간 이내에 심혈관 (CV) 사건의 위험 예측용 바이오마커, 방법, 시약, 장치, 시스템, 및 키트를 포함한다. 본 출원의 바이오마커는 본원에서 상세히 기재되는 다중화 느린 오프 레이트 앱타머 (소마머)-기반 검정을 이용하여 확인되었다. 본원에서 기재된 소마머(SOMAmer)-기반 바이오마커 확인 방법을 이용함으로써, 본원은 1 년, 2 년, 3 년, 또는 4 년 이내에 CV 사건의 기능도 예측에 유용한 바이오마커의 세트를 기재한다.
심혈관 사건은 상기 사건에 대한 경향이 정확하게 측정될 수 있으면 적극적인 치료에 의해 회피될 수 있다. 선행기술 다중-마커 시험은 개체로부터 다중 샘플의 수집을 필요로 하거나, 또는 샘플이 다중 검정 사이에서 분할되는 것을 필요로 한다. 분석물의 상이한 분석물 유형 (지질, 단백질, 대사물) 또는 패널용 다중 샘플 보다, 단일 검정에서 측정된, 단지 단일 생물학적 샘플을 필요로 하는 예후 검정을 제공하는 것이 바람직할 것이다. 단일 샘플 시험의 중심적 이점이 사용현장에서 단순함인 것은, (예컨대 정보 예컨대 인구통계, 심장초음파검사, 영상화, 소변 시험, 혈액 압력 또는 혈관 순응도의 하나 이상의 무상 공급원과 혈액 결과를 통합한) 기술의 다중 유형 및/또는 다중 샘플 수집을 이용한 시험이 투여하기에 더욱 복잡하고 이것이 채택에 장벽을 형성하기 때문이다. 추가의 이점은 다중 단백질용 단일 검정에서 그 단일 샘플 운전으로부터 구동한다. 단일 검정은 함께 다중 검정 결과 또는 기술 포맷의 계산 때문에 원치않는 변화를 완화시켜야 한다. 본원에서 기초과 되는 시험은 그와 같은 "단일 샘플, 단일 검정" 시험이다. 단일 샘플 및 단일 검정의 상기 조합은 다중 독립적인 분석적 절차용 다중 분액에 샘플 분할에 관여된 생물학적 위험 및 문제 그리고 다중 측정 양식의 이용 및 다중 샘플 수집의 기호논리적 복합성을 설명하는 상기 심혈관 사건 위험 시험의 새로운 특징이다.
심혈관 질환은 다중 생물학적 과정 및 조직에 관여하는 것으로 공지된다. 심혈관 질환에 관련된 생물학적 시스템 및 방법의 잘 알려진 예는 염증, 혈전증, 질환-관련된 혈관신생, 혈소판 활성화, 대식세포 활성화, 간 급성 반응, 세포외 매트릭스 리모델링, 및 신장 기능이다. 이들 방법은 성별, 폐경 상태, 및 연령의 기능으로서, 및 응고의 상태 및 혈관 기능에 따라 관측될 수 있다. 이들 시스템이 부분적으로 단백질 기반 신호전달 시스템을 통해 통신하기 때문에, 그리고 다중 단백질이 단일 혈액 샘플에서 측정될 수 있기 때문에, 본 발명은 심혈관 질환에 관여된 특이적 생물학적 시스템 및 방법으로부터 단백질에 집중적인 단일 샘플, 단일 검정 다중 단백질 기반 시험을 제공한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 심혈관 사건용 위험 측정의 중심 기능 중 하나는 치료에 대한 반응 및 행동 변화 예컨대 다이어트 및 운동에서 진전의 평가를 가능하게 하는 것이다. 현행 위험 예측 방법 예컨대 프라밍햄 방정식은 명확히 비반응성 임상 공변량 정보를 포함하고, 주요 요소는 대상체의 연령 및 성별이다. 비록 집단에 대하여 정확할 수 있어도, 이는 개체의 위험에서 변화를 모니터링 하는데 프라밍햄 방정식을 덜 유용하게 만든다. 상기 CV 사건 위험 시험의 새로운 특징은 예후 모델의 일부로서 연령을 필요로 하지 않는 것이다. 주 발명은, 노화의 생물학 내에서, 위험에 더욱 직접적으로 관련되는, 그러나 개체 사이에서 가변적이고 따라서 생활 연령 보다 위험을 평가하는데 더 양호하게 사용되는 기저 생물학적 요소가 있다는 전제에 기반한다. 본 발명은 연령 자체가 질환에서 인과관계 요소가 아니고, 연령이 기저 생물학에 대하여 대리 또는 대용으로서 작용한다는 신념에 전제된다. 연령이 CV 사건의 사실상 예후이면, 개체 개선을 평가하기 위해 사용될 수 없고, 짐작컨대 연령의 효과는 생물학적 기능을 통해 매개된다. 상기 효과는 관련된 생물학의 측정을 통해 더 양호하게 측정될 수 있다. 본 발명에서, 표적화된 단백질은 질환의 생물학에 관여된다. 따라서, 본 발명은 연령과 CV 사건의 위험 사이에 상관관계에서 반영된 생물학적 정보를 포착한다.
심혈관 질환에 관여된 다중 방법으로부터 단백질을 확인하기 위한 전략은 다양한 사건 또는 증상으로 존재한 CV 질환 환자의 광범위/다양성을 제공한 파라미터 선택을 필요로 하였다. 심혈관 질환으로 인한 사건은, 미공지된 원인의 갑작스러운 사망을 포함하여, 이종성이고, 공지된 사건의 2개의 주요 클래스이다: 혈전성 (뇌졸중, 일시적 허혈 발작, 심근경색증) 및 CHF 관련된 사건. 일부 존재한 사건은 특이적 진단 정보 (예를 들면, 집에서 사망)가 부족할 수 있다. CV 질환의 이들 특징의 면에서, 본 발명의 시험은 광범위의 사건로부터 혈액 샘플에 관하여, CV 질환과 관련된 생물학적 방법으로부터 관여된 단백질을 평가함으로써 개발되었다. 상기 전략은 질환에 관여된 다중 방법으로부터 정보 (예를 들면, 혈관신생, 혈소판 활성화, 대식세포 활성화, 간 급성 반응, 다른 림프구 염증, 세포외 매트릭스 리모델링, 및 신장 기능)의 포함을 초래하였다. CV 질환용 다중 단백질 기반 예후 단일 샘플 시험을 개발하기 위해, 선택된 연구 집단은 명백하게 안정한 관상동맥 심장 질환을 갖는 대상체의 고위험 그룹의 집단 연구이었다: "Heart & Soul" 연구. CV 사건의 높은 비율을 갖는 대상체의 상기 세트를 선택함으로써, (사건이 더 드문) 일반적인 집단에서 가능하였던 것 보다 더욱 정확하게 단백질 측정에 관련된 위험을 측정하는 것이 가능하였다. 상기 고위험 그룹에 관한 대상체 시험의 개발은 공통의 생물학 때문에 일반화될 수 있는 단백질 바이오마커 조합의 확인을 허용하였다. 그 결과, 주 본 발명의 시험 및 바이오마커는 "Heart & Soul" 연구의 진입 기준을 일치하는 상기 개체 보다 더 큰 집단에서 사건 예측 이상으로 유효할 것 같다.
일부 구현예에서, 심혈관 사건 (CV) 사건의 위험에 대하여 대상체의 스크리닝 방법은 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 N 바이오마커 (여기에서 N은 2 내지 9의 정수이다)를 포함한 바이오마커 패널을 형성하는 단계; 및
(b) 대상체 유래의 샘플 내 패널의 N 바이오마커의 각각의 수준을 검출하는 단계.
일부 구현예에서, 대상체가 CV 사건을 가질 가능성의 예측 방법은 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 N 바이오마커 (여기에서 N은 2 내지 9의 정수이다)를 포함한 바이오마커 패널을 형성하는 단계; 및
(b) 대상체 유래의 샘플 내 패널의 N 바이오마커의 각각의 수준을 검출하는 단계.
일부 구현예에서, 대상체 유래의 샘플 내 MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 9개 모두의 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함한, 심혈관 사건 (CV) 사건의 위험에 대하여 대상체의 스크리닝 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 대상체 유래의 샘플 내 MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 9개 모두의 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함한, 대상체가 CV 사건을 가질 가능성의 예측 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, MMP12, 안지오포에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC 및 알파1-항키모트립신 복합체의 수준으로부터 선택된 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 7개 모두의 바이오마커의 수준이 각 단백질의 대조군 수준 보다 높으면, 및 GDF11 및 알파2-항플라스민으로부터 선택된 적어도 하나의 바이오마커 또는 모든 바이오마커의 수준이 각 단백질의 대조군 수준 수준 보다 낮으면 4 년 이내에 CV 사건을 갖는 대상체의 가능성은 높다.
일부 구현예에서, 대상체 유래의 샘플 내 GDF11 및 FSTL3의 수준을 검출하는 단계를 포함한, 심혈관 사건 (CV) 사건의 위험에 대하여 대상체의 스크리닝 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 대상체 유래의 샘플 내 GDF11 및 FSTL3의 수준을 검출하는 단계를 포함한, 대상체가 CV 사건을 가질 가능성의 예측 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 대상체 유래의 샘플 내 GDF11 및 FSTL3의 수준을 검출하는 단계를 포함한, 대상체가 혈전성 사건을 가질 가능성의 예측 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 혈전성은 심지어 심근경색증, 뇌졸중, 및 일시적 허혈 발작으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, GDF11의 수준이 GDF11의 대조군 수준 보다 낮으면 및/또는 FSTL3의 수준이 FSTL3의 대조군 수준 보다 높으면 4 년 이내에 CV 사건 (예컨대 혈전성 사건)를 갖는 대상체의 가능성은 높다.
일부 구현예에서, 방법은 MMP12의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 안지오포이에틴-2의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 보체 C7의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 심장 트로포닌 I의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 안지오포이에틴-관련 단백질 4의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 CCL18/PARC의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 알파-1-항키모트립신 복합체의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 GDF11의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 및 알파-2-항플라스민의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민의 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 관상동맥 질환을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 CV 사건의 이력을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 높은 심장병 학회 (ACC) 위험 스코어를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 중간체 ACC 위험 스코어를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 낮은 ACC 위험 스코어를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 적어도 하나의 CV 사건을 가졌다. 일부 구현예에서, CV 사건은 심근경색증, 뇌졸중, 울혈성 심부전, 형질전환 허혈 발작, 및 사망으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 및 소변 샘플로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 구현예에서, 방법은 시험관내 수행된다.
일부 구현예에서, 각각의 바이오마커는 단백질 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 방법은 바이오마커 포착 시약의 세트와 대상체 유래의 샘플의 바이오마커를 접촉하는 단계를 포함하고, 여기에서 바이오마커 포착 시약 세트의 각각의 바이오마커 포착 시약은 검출되는 상이한 바이오마커에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 각각의 바이오마커 포착 시약은 항체 또는 앱타머이다. 일부 구현예에서, 각각의 바이오마커 포착 시약은 앱타머이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 앱타머는 느린 오프-레이트 앱타머이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 느린 오프-레이트 앱타머는 변형이 있는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 각각의 느린 오프-레이트 앱타머는 ≥ 30 분, ≥ 60 분, ≥ 90 분, ≥ 120 분, ≥ 150 분, ≥ 180 분, ≥ 210 분, 또는 ≥ 240 분의 오프 레이트 (t1/2)를 갖는 이의 표적 단백질에 결합한다.
일부 구현예에서, CV 사건의 가능성은 하기로부터 선택된 추가의 생체의학 정보의 적어도 하나의 항목 및 바이오마커 수준에 기반한다:
a) 이전 심근경색증, 하나 이상의 관상혈관내 50% 초과 협착증의 혈관조영 증거, 드레드밀 또는 핵 시험에 의한 운동-유발 허혈 또는 이전 관상동맥 혈관재생으로 이루어진 군으로부터 선택된 심혈관 위험 요소의 존재에 상응하는 정보,
b) 상기 개체의 물리적 기술어에 상응하는 정보,
c) 상기 개체의 중량에서 변화에 상응하는 정보,
d) 상기 개체의 인종에 상응하는 정보,
e) 상기 개체의 성별에 상응하는 정보,
f) 상기 개체의 흡연 이력에 상응하는 정보,
g) 상기 개체의 알코올 사용 이력에 상응하는 정보,
h) 상기 개체의 직업적 이력에 상응하는 정보,
i) 심혈관 질환 또는 다른 순환 시스템 병태의 상기 개체의 가족력에 상응하는 정보,
j) 상기 개체 또는 상기 개체의 패밀리 구성원에서 심혈관 질환의 더 높은 위험에 상관한 적어도 하나의 유전자 마커의 상기 개체에서 존재 또는 부재에 상응하는 정보,
k) 상기 개체의 임상 증상에 상응하는 정보,
l) 다른 실험실 시험에 상응하는 정보,
m) 상기 개체의 유전자 발현 값에 상응하는 정보, 및
n) 공지된 심혈관 위험 요소 예컨대 고 포화 지방, 고 염, 고 콜레스테롤의 다이어트의 상기 개체의 소비에 상응하는 정보,
o) 심전도, 심장초음파검사, 내막-중막 두께용 경동맥 초음파, 혈류 매개된 팽창, 맥파 속도, 발목-위팔 지수, 스트레스 심장초음파검사, 심근 관류 영상, CT에 의한 관상동맥 칼슘, 고해상도 CT 혈관조영술, MRI 영상화, 및 다른 영상화 양식으로 이루어진 군으로부터 선택된 기술에 의해 수득된 개체의 영상화 결과에 상응하는 정보,
p) 개체의 약물에 관한 정보, 및
q) 개체의 신장 기능에 관한 정보.
일부 구현예에서, 방법은 의료보험 수가 또는 생명보험 수가 결정의 목적을 위하여 CV 사건의 가능성을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 추가로 의료 보험 또는 생명 보험에 대하여 적용범위 또는 수가를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 추가로 의료 자원의 이용 예측 및/또는 관리를 위한 방법에서 비롯된 정보를 이용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 추가로 의료 실무진, 병원, 또는 회사로 하여금 구매 또는 결정을 하도록 하기 위하여 상기 방법에서 비롯된 정보를 이용하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 심혈관 (CV) 사건의 위험 평가용 컴퓨터-시행된 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에 대하여 컴퓨터 바이오마커 정보를 검색하는 단계로서, 여기에서 바이오마커 정보는 대상체 유래의 샘플 내 MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 9개 모두의 바이오마커의 수준을 포함하는, 단계; 각각의 상기 바이오마커 값의 분류를 컴퓨터로 수행하는 단계; 복수의 분류에 기반한 상기 개체에 대하여 CV 사건에 대한 위험 평가의 결과를 표지하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체에 대하여 CV 사건의 위험 평가의 결과를 표지하는 단계는 컴퓨터 디스플레이에서 결과를 디스플레이하는 단계를 포함한다.
도 1은 각각의 샘플 희석으로 발견 및 검증 세트에서 측정된 단백질용 정규화 규모 요소 분포의 박스 도표를 보여준다. 박스 도표에서 적색선은 중앙 값을 나타내고, 박스의 넓이는 데이터의 50%를 함유한 4분위간 범위를 디스플레이하고 위스커는 박스 밖으로부터 4분위간 범위를 1.5x 확장한다. 극단적인 정규화 규모 요소를 갖는 샘플은 적색 "+" 징후로 마크된다. 정규화는 검증 샘플에서 측정된 단백질 신호에 분명한 체계적인 세기 바이어스에 대해 보상하기 위해 발견 (검증) 세트에서 중앙 신호 수준을 증가한다 (감소한다).
도 2는 RFU (상단부) 또는 외부 RFU 4분위간 (최하부) 사이의 표준 편차 당 일변량 콕스 모델 위험 비율의 화산형 도표를 보여준다. 수평 점선은 본페로니 정정된 p=0.05 유의성 수준을 표지한다. 미국 국립생물공학정보센터 (NCBI) 유전자 명칭은 극단적인 위험 비율을 갖는 단백질에 대하여 간결한 표지로서 사용된다. 적색으로 표지된 단백질은 CVD9 모델에서 포함된다: ANGPT2 = "안지오포이에틴-2"; C7 = "보체 C7"; SERPINF2 = "세린 프로테아제 저해제 F2" 또는 "α2-항플라스민"; CCL18 = "폐 및 활성화-조절된 케모카인 (PARC)"으로서 또한 공지된 "케모카인 (C-C 모티프) 리간드 18"; ANGL4 = "안지오포이에틴-관련 단백질 4"; KLK3.SERPINA3 = "α1- 항키모트립신 복합체"; 및 TNNI3 = "트로포닌-I, 심장".
도 3은 정규화 절차에서 비롯된 잔류 세기 바이어스를 평가하기 위해 사용된 발견 및 검증 세트 및 강력한 선형회귀 모델에서 CVD9 단백질의 평균 신호 수준을 보여준다.
도 4는 콕스 보정 모델로 재-보정 이전 (왼쪽) 및 이후 (오른쪽) 발견 세트에서 프라밍햄 모델에 의해 생성된 예상된 및 실제의 위험의 비교를 보여준다.
도 5는 콕스 보정 모델로 재-보정 이전 (왼쪽) 및 이후 (오른쪽) HUNT3 검증 세트에서 프라밍햄 모델에 의해 생성된 예상된 및 실제의 위험의 비교를 보여준다.
도 6은 발견 (왼쪽, 회색) 및 검증 (오른쪽, 핑크색) 샘플 세트에 적용될 때 샘플 및 통계적인 과정 순서도를 보여준다.
도 7은 발견 세트 (흑색 기호, 라인 각각의 쌍의 최상부 라인)에서 다변량 LASSO 절차에 의해 선택된 16 단백질 및 검증 세트 (적색 기호, 라인 각각의 쌍의 최하부 라인)로부터 동일 단백질의 상보적 그룹에 대하여 일변량 제4 대 제1 4분위수 위험 비율 (95% 신뢰 구간을 갖는)의 비를 보여준다. 별표로 마크된 단백질은 최소 중요한 단백질의 단계적 역방향 제거 이후 최종 매개변수 모델 (CVD9)에서 포함된다. 이들 16 단백질의 관련된 생물학적 특성에 대하여, 참고 실시예. 범례: MMP-7 = 매트릭스 메탈로프로테이나제 7; MMP12 = 매트릭스 메탈로프로테이나제 12; TIM3 = T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-함유 단백질 3; CCL18 = 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 18, PARC = 폐 및 활성화-조절된 케모카인으로서 앞서 공지됨; GDF11 = 성장 분화 요소 11; CDO = 조절된 세포 부착 관련 종양유전자; EGF = 표피 성장 요소.
도 8은 CVD9 (왼쪽) 및 프라밍햄 (오른쪽)에 대하여 HUNT-3 검증 세트에서 예상된 위험의 10분위수에 의한 보정 성능을 보여준다.
도 9는 CVD9 (핑크색) 및 프라밍햄 (회색)에 대하여 예상된 위험 대 CVD9 위험의 백분위수를 보여준다. 응고점은 CVD9 (핑크색) 및 프라밍햄(회색) 모델에 의해 생성된 예상된 위험의 각각의 10분위수에서 환자에 대하여 관측된 사건 빈도를 표지한다. 수평선은 4-년 사건 발생정도를 표지한다.
도 10은, 상기 집단에서 프라밍햄 스코어에 대하여 최대 유효한 시간인, 년 1 및 제4년에서 발견 세트 (흑색, 화살표로 지적됨) 및 독립적인 검증 세트 (적색, 화살표로 지적됨)에 적용된 모델에 대한 ROC 곡선을 보여준다. 발견 (녹색) 및 검증 (청색) 집단에서 프라밍햄 스코어에 대한 ROC 곡선이 또한 포함된다.
도 11은 발견 (왼쪽) 및 검증 (오른쪽) 집단에서 각각의 CVD9-예상된 위험 4분위수에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다. 체크 표지 마크는 개별 대상체에 대한 검열 (최후 관찰)의 시간을 보여주고 그늘진 간격은 95% 신뢰 구간을 표지한다.
도 12는 본원에서 기재된 다양한 컴퓨터-시행된 방법으로 사용을 위한 비제한 예시적 컴퓨터 시스템을 실증한다.
도 13은 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커를 검출하기 위해 사용될 수 있는 비제한 예시적 앱타머 검정을 실증한다.
도 14는 앱타머, 예컨대 느린 오프-레이트 앱타머에 편입될 수 있는 특정 예시적 변형된 피리미딘을 보여준다.
도 15는 GDF11과 FSTL3 사이의 상관관계를 보여준다.
도 16은 각각의 모델에 대하여 각각의 4분위수에 대한 생존 곡선을 보여준다. 1st 내지 4th 4분위수는 흑색 (최상부 라인), 적색 (제2 라인 아래), 녹색 (제3 라인 아래) 및 청색 (최하부 라인)으로 기재된다. 그늘짐은 95% 신뢰 구간을 보여준다. 부호 "+"는 검열받은 샘플을 의미한다.
도 17은 낮은 위험 그룹 및 높은 위험 그룹에 대하여 GDF11과 GDF11.FSTL3 사이의 생존 곡선의 비교를 보여준다. 왼쪽 패널에서, 최상부 라인은 GDF11.FSTL3 모델을 나타내고 최하부 라인은 GDF11 모델을 나타낸다. 오른쪽 패널에서, 최상부 라인은 GDF11 모델을 나타내고 최하부 라인은 GDF11.FSTL3 모델을 나타낸다.
도 18은 GDF11과 GDF11.FSTL3 (왼쪽) 사이 및 FSTL3과 GDF11.FSTL3 (오른쪽) 사이에서 4-년 확률의 비교를 보여준다.
도 19는 3 모델에 대하여 제4년에서 ROC 곡선을 보여준다.
도 20은 GDF11.FSTL3 모델의 각각의 그룹 (모두, CHF-사망, 및 혈전성 사건)의 선형 예측변수의 각각의 4분위수에 대한 생존 곡선을 보여준다. 1st 내지 4th 4분위수는 흑색 (최상부 라인), 적색 (제2 라인 아래), 녹색 (제3 라인 아래) 및 청색 (최하부 라인)으로 기재된다. 그늘짐은 95% 신뢰 구간을 보여준다.
도 21은 모델 GDF11, GDF11.WFIKKN1, GDF11.WFIKKN2, 및 GDF11.WFIKKN1.WFIKKN2용 각각의 4분위수에 대한 생존 곡선을 보여준다.
도 22는 GDF11 모델과 GDF11.WFIKKN1, GDF11.WFIKKN2, 및 GDF11.WFIKKN1.WFIKKN2 모델 사이에서 위험 확률을 보여준다.
도 23은 각각의 모델: GDF11, GDF11.WFIKKN1, GDF11.WFIKKN2, 및 GDF11.WFIKKN1.WFIKKN2에 대하여 ROC 곡선을 보여준다.
상세한 설명
본 발명이 특정 대표적인 구현예와 함께 기재되는 한편, 본 발명이 청구항에 의해 정의되고, 비제한적으로 상기 구현예임이 이해될 것이다.
당해 분야의 숙련가는 본원에서 기재된 것과 유사한 또는 등가인 많은 방법 및 물질이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명은 비제한적으로 기재된 방법 및 물질이다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 비록 본원에서 기재된 것과 유사한 또는 등가인 임의의 방법, 장치, 및 물질이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있어도, 특정 방법, 장치, 및 물질은 본원에서 기재된다.
본원에서 인용된 모든 공보, 공개된 특허 문서, 및 특허 출원은 각각의 개체 공보, 공개된 특허 문서, 또는 특허 출원이 참고로 편입된 바와 같이 특이적으로 및 개별적으로 지적된 것처럼 동일한 정도로 이로써 참고로 편입된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 첨부된 청구항을 포함하여, 단수 형태는, 맥락이 명확히 다르게는 지시하지 않는 한, 복수를 포함하고, "적어도 하나" 및 "하나 이상"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, "앱타머"에 대한 참조는 앱타머의 혼합물을 포함하고, "프로브"에 대한 참조는 프로브의 혼합물 등등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다", "포괄하다", "포괄하는", 함유하다", "함유하는" 및 이의 임의의 변형은 비-배타적 포함을 커버하기 위해 의도되고, 이로써 요소 또는 요소의 목록을 포함하는, 포괄하는, 또는 함유하는 주제의 과정, 방법, 제법 한정 물질, 또는 조성물이 명확히 열거되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다.
본 출원은 한정된 기간, 예컨대 1 년 이내, 2 년 이내, 3 년 이내, 또는 4 년 이내 단기 CV 사건의 위험 예측용 바이오마커, 방법, 장치, 시약, 시스템, 및 키트를 포함한다.
"심혈관 사건"은 순환 시스템의 임의의 부분에서 기능상실 또는 기능이상을 의미한다. 한 구현예에서, "심혈관 사건"은 순환 시스템의 기능이상에 기인하는 뇌졸중, 일시적 허혈 발작 (TIA), 심근경색증 (MI), 갑작스러운 사망, 및/또는 아마도 원인이 심혈관인 집단에서 미공지된 원인의 심부전, 또는 갑작스러운 사망을 의미한다. 또 다른 구현예에서, "심혈관 사건"은 임의의 전술한 기능이상 및/또는 불안정한 협심증, 스텐트 또는 혈관성형술 요법 등등을 의미한다.
심혈관 사건은 "울혈성 심부전" 또는 "CHF" 및 "혈전성 사건"를 포함한다. 혈전성 사건은 MIs, 일시적 허혈 발작 (TIA), 뇌졸중, 급성 관상동맥 증후군 및 관상동맥 재-혈관형성 요법을 포함한다.
특정 구현예에서, 바이오마커는 심근경색증, 뇌졸중, 사망 및 울혈성 심부전로서 한정된 CV 사건로 4 년 기간 이내 갑작스러운 사망 또는 추가로 CV 사건의 위험을 평가하기 위해 단독으로 또는 다양한 조합으로 사용을 위하여 제공된다. 혈전성 사건은 조합된 심근경색증 및 뇌졸중으로 이루어진다. 아래에 상세히 기재된 바와 같이, 예시적 구현예는 표 3에서 제공된 바이오마커를 포함하고, 이는 일반적으로 실시예에서 기재된 멀티플렉스 소마머-기반 검정을 이용하여 확인되었다.
기재된 CV 사건 바이오마커의 일부가 CV 사건의 위험 평가를 위하여 단독으로 유용할 수 있어도, 방법은 CV 사건 바이오마커의 다중 서브셋의 그룹화를 위하여 또한 본원에서 기재되고, 여기에서 각각의 그룹화 또는 서브셋 선택은, 본원에서 "바이오마커 패널" 및 패널로서 상호교환적으로 참조된, 3 이상 바이오마커의 패널로서 유용하다. 따라서, 본원의 다양한 구현예는 표 3에서 바이오마커의 적어도 5개, 적어도(art least) 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 9개 모두를 포함한 조합을 제공한다.
한 구현예에서, 바이오마커 서브셋 또는 패널에 유용한 바이오마커의 수는 바이오마커 값의 특별한 조합에 대하여 민감성 및 특이성 값에 기반한다. 용어 "민감성" 및 "특이성"은, 4 년 이내 CV 사건을 가질 증가된 위험을 가짐에 따라 또는 동일한 기간 이내 CV 사건을 가질 증가된 위험을 갖지 않음에 따라, 이의 생물학적 샘플에서 검출된 하나 이상의 바이오마커 값에 기반한, 개체를 정확하게 분류하기 위한 능력에 관해 본원에서 사용된다. "민감성"은 CV 사건의 증가된 위험을 갖는 개체의 정확한 분류에 관해 바이오마커(들)의 성능을 나타낸다. "특이성"은 CV 사건의 증가된 위험을 갖지 않는 개체의 정확한 분류에 관해 바이오마커(들)의 성능을 나타낸다. 예를 들어, 사건 음성 샘플 및 사건 양성 샘플의 세트를 시험하기 위해 사용된 마커의 패널에 대하여 85% 특이성 및 90% 민감성은 대조군 샘플의 85%가 패널에 의해 사건 음성 샘플로서 정확하게 분류되었고 사건 양성 샘플의 90%가 패널에 의해 사건 양성 샘플로서 정확하게 분류되었음을 나타낸다.
대안적 방법에서, 스코어는, 한정된 시간 단위 이내 CV 사건의 높은, 중간체 또는 낮은 위험의 역치와 함께, 임상 발견에 기반하여 측정된 역치와 함께, 연속적 범위에서 보고될 수 있고; 동일한 데이터의 대안적 발현은 확률의 역치 (예컨대 50%)를 고정하는 것 및 대상체의 상기 분율이 이의 사건을 가질 시간 (예를 들면, 방사성 붕괴에서 반감기와 비슷, 동위원소의 절반이 붕괴할 시간)을 예측하는 것이다.
바이오마커의 서브셋 또는 패널에서 사용되는 바이오마커의 수에 영향을 미칠 수 있는 요소는 CV 사건의 위험에 대하여 평가되는 개체로부터 생물학적 샘플을 수득하기 위해 사용된 절차이다. 주의하여 제어된 샘플 입수 환경에서, 원하는 민감성 및 특이성 및/또는 역치 값을 충족시키기 위해 필요한 바이오마커의 수는 샘플 수집, 조작 및 보관에서 더욱 변형될 수 있는 상황에서 보다 더 낮아질 것이다. 대안적으로, 더 높은 민감성 및 특이성은 위험 예측 알고리즘으로부터 민감성 마커의 제거 또는 저조하게 수집된 샘플의 거부를 가능하게 하는 샘플 작동 마커와 함께 (예를 들면, 다양한 수집 상황에서 생존하지 않는) 샘플 입수에 덜 강력한 더 많은 마커를 이용함으로써 수득될 수 있다.
"생물학적 샘플", "샘플", 및 "시험 샘플"은 개체로부터 수득된 또는 다르게는 유도된 임의의 물질, 생물학적 유체, 조직, 또는 세포를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이는 (전체의 혈액, 백혈구, 주변 혈액 단핵 세포, 버피 코트, 혈장, 및 혈청을 포함한) 혈액, 가래, 눈물, 점액, 세비액, 비강 흡입물, 소변, 타액, 복막 세척액, 복수, 담낭액, 선상 유체, 림프액, 기관지 흡입물, 활막 유체, 관절 흡입물, 장기 분비, 세포, 세포성 추출물, 및 뇌척수액을 포함한다. 이는 또한 모든 전술한 실험적으로 분리된 분획을 포함한다. 예를 들어, 혈액 샘플은 혈청, 혈장, 또는 혈액 세포, 예컨대 적색 혈액 세포 또는 백색 혈액 세포 (백혈구)의 특정한 유형을 함유한 분획으로 분획화될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈액 샘플은 건조된 혈반이다. 일부 구현예에서, 혈장 샘플은 건조된 혈장 스팟이다. 일부 구현예에서, 샘플은 개체로부터 샘플의 조합, 예컨대 조직 및 유체 샘플의 조합일 수 있다. 용어 "생물학적 샘플"은 또한, 예컨대 대변 샘플, 조직 샘플, 또는 조직 생검으로부터, 예를 들어 균질화된 고형 물질을 함유한 물질을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 또한 조직 배양 또는 세포 배양으로부터 유도된 물질을 포함한다. 생물학적 샘플을 함유하기 위한 임의의 적합한 방법은 이용될 수 있고; 예시적 방법은, 예를 들면, 정맥절개술, 면봉 (예를 들면, 구강 면봉), 및 미세 침상 흡입물 생검 절차를 포함한다. 미세 침상 흡인에 민감한 예시적 조직은 림프절, 폐, 갑상선, 유방, 췌장, 및 간을 포함한다. 샘플은 또한, 예를 들면, 현미 해부 (예를 들면, 레이저 포착 현미 해부 (LCM) 또는 레이저 현미 해부 (LMD)), 방광 세척, 도말표본 (예를 들면, PAP 도말표본), 또는 도관 세척에 의해 수집될 수 있다. 개체로부터 수득된 또는 유도된 "생물학적 샘플"은 개체로부터 수득된 후 임의의 적합한 방식으로 가공되는 임의의 상기 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈장 샘플이다.
추가로, 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 수많은 개체로부터 생물학적 샘플의 선택 및 이들의 풀링, 또는 분취량의 각 개체의 생물학적 샘플의 풀링에 의해 유도될 수 있다. 풀링된 샘플은 단일 개체로부터 샘플에 대하여 본원에서 기재된 바와 같이 처리될 수 있고, 그리고, 예를 들어, 좋지 못한 예측이 풀링된 샘플에서 확립되면, 각 개체의 생물학적 샘플은 개체(들)이 CV 사건의 증가된 또는 감소된 위험을 갖는지를 측정하기 위해 재-시험될 수 있다.
본 명세서의 목적을 위하여, 어구 "개체로부터 생물학적 샘플에 기인된 데이터"는 일부 형태로 데이터가 개체의 생물학적 샘플로부터 유도되거나, 또는 이를 이용하여 생성되었음을 의미하는 의도이다. 데이터는, 예컨대 한 측정 시스템에서의 단위로부터 또 다른 측정 시스템에서의 단위로 전환에 의해, 생성된 이후 어느 정도까지 재포멧, 개정, 또는 수학적으로 변경될 수 있지만; 그러나, 데이터는 생물학적 샘플로부터 유도되거나, 또는 생성된 것으로 이해된다.
"표적", "표적 분자", 및 "분석물"은 생물학적 샘플에서 존재할 수 있는 해당 임의의 분자를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "해당 분자"는, 예컨대, 단백질의 경우에, 특정한 분자의 임의의 작은 변형, 예를 들어, 아미노산 서열, 디설파이드 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변성에서 작은 변형, 예컨대 표지화 성분와 콘주게이션을 포함하고, 이는 분자의 동일성을 실질적으로 바꾸지 않는다. "표적 분자", "표적", 또는 "분석물"은 분자 또는 다중-분자 구조의 한 유형 또는 종의 복사 세트를 지칭한다. "표적 분자", "표적", 및 "분석물"은 분자 또는 다중-분자 구조의 1 초과 유형 또는 종을 지칭한다. 예시적 표적 분자는 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 아피바디, 항체 모방체, 바이러스, 병원체, 독성 물질, 기질, 대사물, 전이 상태 유사체, 보조인자, 저해제, 약물, 염료, 영양소, 성장 요소, 세포, 조직, 및 임의의 전술한 임의의 단편 또는 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 분자는 단백질이고, 이 경우에 표적 분자는 "표적 단백질"로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "포착 제제' 또는 "포착 시약"은 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. "표적 단백질 포착 시약"은 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 비제한 예시적 포착 시약은 하기를 포함한다: 앱타머, 항체, 아드넥틴, 안키린, 다른 항체 모방체 및 다른 단백질 스캐폴드, 자가항체, 키메라, 작은 분자, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 인식된 폴리머, 아비머, 펩티드모방체, 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체, 합성 수용체, 및 임의의 상기 언급된 포착 시약의 변성 및 단편. 일부 구현예에서, 포착 시약은 앱타머 및 항체로부터 선택된다.
용어 "항체"는, Fab 단편, F(ab')2 단편, 단일 사슬 항체, Fv 단편, 및 단일 사슬 Fv 단편을 포함하여, 임의의 종 및 단편의 전장 항체 및 상기 항체의 유도체를 지칭한다. 용어 "항체"는 또한 합성으로-유도된 항체, 예컨대 파아지 디스플레이-유도된 항체 및 단편, 아피바디, 나노바디, 등을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "마커" 및 "바이오마커"는 개체내 정상 또는 비정상 방법의 징후 또는 개체내 질환 또는 다른 병태의 징후를 나타내는 또는 징후인 표적 분자를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 더욱 구체적으로, "마커" 또는 "바이오마커"는, 정상 또는 비정상이든, 및, 비정상이면, 만성 또는 급성이든, 특정 생리적 상태 또는 방법의 존재와 관련된 해부적, 생리적, 생화학적, 또는 분자적 파라미터이다. 바이오마커는 실험실 검정 및 의료 영상화를 포함한 다양한 방법에 의해 검출가능 및 측정가능하다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 표적 단백질이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "바이오마커 수준" 및 "수준"은 생물학적 샘플에서 바이오마커 검출을 위한 임의의 분석적 방법을 이용하여 실시된 및 생물학적 샘플에서 바이오마커의, 바이오마커를 위한, 또는 바이오마커에 상응하는, 존재, 부재, 절대적인 양 또는 농도, 상대적인 양 또는 농도, 역가, 수준, 발현 수준, 측정된 수준의 비, 등등을 나타내는 측정을 지칭한다. "수준"의 정확한 성질은 바이오마커를 검출하기 위해 이용된 특정한 분석적 방법의 특이적 설계 및 성분에 좌우된다.
바이오마커가 개체에서 비정상 과정 또는 질환 또는 다른 병태를 나타내는 또는 이의 징후인 경우, 그 바이오마커는 정상 과정의 징후 또는 개체에서 질환 또는 다른 병태의 부재를 나타내는 또는 이의 징후인 바이오마커의 발현 수준 또는 값과 비교시 과-발현된 또는 저-발현된 것으로 일반적으로 기재된다. "상향조절", "상향조절된", "과-발현", "과-발현된", 및 이의 임의의 변형은 건강한 또는 정상 개체로부터 유사한 생물학적 샘플에서 전형적으로 검출된 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 또는 수준의 범위) 보다 더 큰 생물학적 샘플에서 바이오마커의 값 또는 수준을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 용어는 또한 특정한 질환의 상이한 단계에서 검출될 수 있는 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 또는 수준의 범위) 보다 더 큰 생물학적 샘플에서 바이오마커의 값 또는 수준을 지칭할 수 있다.
"다운-조절", "다운-조절된", "저-발현", "저-발현된", 및 이의 임의의 변형은 건강한 또는 정상 개체로부터 유사한 생물학적 샘플에서 전형적으로 검출된 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 또는 수준의 범위) 미만인 생물학적 샘플에서 바이오마커의 값 또는 수준을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 용어는 또한 특정한 질환의 상이한 단계에서 검출될 수 있는 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 또는 수준의 범위) 미만인 생물학적 샘플에서 바이오마커의 값 또는 수준을 지칭할 수 있다.
추가로, 과-발현된 또는 저-발현된 바이오마커는 또한 개체에서 정상 과정의 징후 또는 질환 또는 다른 병태의 부재를 나타내거나 또는 이의 징후인 바이오마커의 "정상" 발현 수준 또는 값과 비교시 "차등적으로 발현된" 것으로 또는 "차별적인 수준? 또는 "차별적인 값"을 갖는 것으로 지칭될 수 있다. 따라서, 바이오마커의 "차별적인 발현"은 또한 바이오마커의 "정상" 발현 수준으로부터 변형으로서 지칭될 수 있다.
표적 분자의 "대조군 수준"은 질환 또는 병태를 갖지 않는 개체로부터, 또는 질환 또는 병태를 가질 위험이 의심되지 않거나 위험에 있지 않는 개체로부터, 또는 2차 심혈관 사건이 아닌 1차 또는 제1 심혈관 사건을 가진 개체로부터, 또는 안정한 심혈관 질환을 갖는 개체로부터 동일한 샘플 유형에서 표적 분자의 수준을 지칭한다. 대조군 수준은 질환 또는 병태를 갖지 않는, 또는 질환 또는 병태를 가질 위험이 의심되지 않거나 또는 위험에 있지 않는, 또는 2차 심혈관 사건이 아닌 1차 또는 제1 심혈관 사건을 가진, 또는 안정한 심혈관 질환을 갖는 개체 또는 이의 조합의 집단으로부터 샘플에서 표적 분자의 평균 수준을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "개체", "대상체" 및 "환자"는 포유동물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 포유동물 개체는 인간 또는 비-인간일 수 있다. 다양한 구현예에서, 개체는 인간이다. 건강한 또는 정상 개체는 (예를 들어, 심혈관 사건 예컨대 심근경색증, 뇌졸중 및 울혈성 심부전을 포함한) 해당 질환 또는 병태가 종래 진단 방법에 의해 검출불가능한 개체이다.
"진단하다", "진단한", "진단" 및 이의 변형은 그 개체에 관련된 하나 이상의 징후, 증상, 데이터, 또는 다른 정보에 기초하여 개체의 건강 상황 또는 병태의 검출, 측정, 또는 인식을 지칭한다. 개체의 건강 상황은 건강한 / 정상 (즉, 질환 또는 병태의 부재 진단)으로서 또는 아픈 / 비정상 (즉, 존재, 또는 특징의 평가, 또는 특징의 평가, 질환 또는 병태의 진단)으로서 진단될 수 있다. 용어 "진단하다", "진단하는", "진단" 등은, 특정한 질환 또는 병태에 관해, 하기를 포함한다: 질환의 초기 검출; 질환의 특성규명 또는 분류; 질환의 진행, 차도, 또는 재발의 검출; 및 개체에 치료 또는 요법의 투여 이후 질환 반응의 검출. CV 사건의 위험 예측은 갖지 않은 개체로부터 CV 사건의 증가된 위험을 갖는 개체를 식별하는 단계를 포함한다.
"진단하다", "예측하는", "예측", 및 이의 변형은 질환 또는 병태를 갖는 개체에서 질환 또는 병태의 추가 과정의 예측 (예를 들면, 환자 생존 예측)을 지칭하고, 상기 용어들은 개체에 치료 또는 요법의 투여 이후 질환 또는 병태 반응의 평가를 포함한다.
"평가하다", "평가하는", "평가", 및 이의 변형은 모든 "진단하다" 및 "예측하다"를 포함하고 또한 질환을 갖지 않는 개체에서 질환 또는 병태의 추가 과정에 대한 측정 또는 예측 뿐만 아니라 질환이 명백하게 치유된 또는 분할된 병태를 갖는 개체에서 질환 또는 병태가 발생할 위험에 관한 측정 또는 예측을 포함한다. 용어 "평가하다"는 또한 요법에 대한 개체의 반응 평가, 예컨대, 예를 들어, 개체가 치료제에 유리하게 반응할 것 같은지 또는 치료제에 반응할 것 같지 않은지 (또는 독성 또는 다른 요망되지 않는 부작용을, 예를 들어 경험할) 예측, 개체에 투여를 위한 치료제 선택, 또는 개체에 투여되는 요법에 대한 개체의 반응 모니터링 또는 측정을 포함한다. 따라서, CV 사건의 위험 "평가"는, 예를 들어, 임의의 하기를 포함할 수 있다: 개체에서 CV 사건의 추가 위험 예측; CV 사안을 명백하게 갖지 않는 개체에서 CV 사건의 위험 예측; CV 사건의 특정한 유형 예측; CV 사건에 대한 시간 예측; 또는 개체의 생물학적 샘플로부터 유도된 바이오마커 값의 측정에 기반하여 개체에 투여하기 위한 CV 치료 선택 또는 CV 치료. CV 사건의 위험 평가는 구현예 예컨대 연속적 규모로 CV 사건의 위험 평가, 또는 상승하는 분류에서 CV 사건의 위험 분류를 포함할 수 있다. 위험의 분류는, 예를 들어, 2 이상의 분류 예컨대 "CV 사건의 상승된 위험 없음"; "CV 사건의 상승된 위험"; 및/또는 "CV 사건의 평균 위험 미만"으로 분류를 포함한다. 일부 구현예에서, CV 사건의 위험 평가는 한정된 기간 동안이다. 비제한 예시적 한정된 기간은 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년 및 5 년 초과를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "추가의 생체의학 정보"는, 본원에서 기재된 임의의 바이오마커 이용 이외에, CV 위험 또는, 더욱 구체적으로, CV 사건 위험과 관련된, 개체의 하나 이상의 평가를 지칭한다. "추가의 생체의학 정보"는 임의의 하기를 포함한다: 개체의 높이 및/또는 중량을 포함하여, 개체의 물리적 기술어; 개체의 연령; 개체의 성별; 중량의 변화; 개체의 인종; 직업적 이력; 심혈관 질환 (또는 다른 순환 시스템 장애)의 가족력; 개체에서 심혈관 질환 (또는 다른 순환 시스템 장애)의 더 높은 위험 또는 경동맥 내막 두께에서 패밀리 구성원 변경과 상관한 유전자 마커(들)의 존재; 임상 증상 예컨대 가슴 통증, 체중 증가 또는 손실 유전자 발현 값; 방사선학 영상화에 의해 관측된 물리적 기술어를 포함하여, 개체의 물리적 기술어; 흡연 상태; 알코올 사용 이력; 직업적 이력; 식이 습관 - 염, 포화 지방 및 콜레스테롤 섭취; 카페인 소비; 및 영상화 정보 예컨대 심전도, 심장초음파검사, 내막-중막 두께용 경동맥 초음파, 혈류 매개 팽창, 맥파 속도, 발목 -위팔 지수, 스트레스 심장초음파검사, 심근 관류 영상, CT에 의한 관상동맥 칼슘, 고해상도 CT 혈관조영술, MRI 영상화, 및 다른 영상화 양식; 및 개체의 약물. 다른 실험실 시험 (예를 들면, HDL, LDL 시험, CRP 수준, Nt-proBNP 시험, BNP 시험, 고감수성 트로포닌 시험, 갈렉틴-3 시험, 혈청 알부민 시험, 크레아틴 시험)을 포함하여, 임의의 추가의 생체의학 정보의 평가와 조합으로 바이오마커 수준의 시험은, 예를 들어, 추가의 생체의학 정보 단독 (예를 들면, 경동맥 내막 두께 영상화 단독)의 임의의 특정한 항목의 평가 또는 바이오마커 시험 단독과 비교시 CV 사건의 예측용 민감성, 특이성, 및/또는 AUC를 개선할 수 있다. 추가의 생체의학 정보는 당해 기술에 공지된 일상적인 기술을 이용하여 개체로부터, 예컨대 일상적인 환자 설문지 또는 건강 이력 설문지, 등의 사용에 의해 개체 자체로부터, 또는 개업의, 등으로부터 수득될 수 있다. 임의의 추가의 생체의학 정보의 평가와 조합으로 바이오마커 수준의 시험은, 예를 들어, 추가의 생체의학 정보 단독 (예를 들면, CT 영상화 단독)의 임의의 특정한 항목의 평가 또는 바이오마커 시험 단독과 비교시 CV 사건 (또는 다른 심혈관-관련 용도)의 예측용 민감성, 특이성, 및/또는 역치를 개선할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 바이오마커 값에 관해 "검출" 또는 "측정"은 바이오마커 수준에 상응하는 신호를 관찰 및 기록하기 위해 사용된 기기 및 그 신호를 발생하기 위해 요구된 물질/들 모두의 사용을 포함한다. 다양한 구현예에서, 바이오마커 수준은, 형광, 화학발광, 표면 플라즈몬 공명, 표면 음파, 질량 분광분석법, 적외선 분광법, 라만 분광법, 원자력 현미경검사, 스캐닝 터널링 현미경검사, 전기화학적 검출 방법, 핵자기 공명, 양자점, 등등을 포함하여, 임의의 적합한 방법을 이용하여 검출된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미국 심장병 학회 (ACC) 위험 스코어"는 Goff et al., "2013 ACC/AHA Guideline on the Assessment of Cardiovascular Risk: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines", published online in Circulation on November 12, 2013 (Print ISSN: 0009-7322, Online ISSN: 1524-4539)에 따라 측정된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "높은" 위험 스코어는 (비치명적 심근경색증 또는 관상동맥 심장 질환 (CHD) 사망, 또는 치명적 또는 비치명적 뇌졸중의 최초 발생으로서 한정된) 경화 죽상경화성/심혈관 질환 (ASCVD) 사건에 대하여 20.0% 이상 예상된 10-년 위험이고; "중간" 위험 스코어는 경화 ASCVD 사건에 대하여 10.0-19.9% 예상된 10-년 위험이고; 그리고 "낮은" 위험 스코어는 경화 ASCVD 사건에 대하여 <10.0% 예상된 10-년 위험이다. 참고 Goff 16페이지, 표 5.
"고형 지지체"는, 공유 또는 비-공유 결합을 통해, 직접적으로 또는 간접적으로, 분자가 부착될 수 있는 표면을 갖는 임의의 기질을 본원에서 지칭한다. "고형 지지체"는, 예를 들어, 하기를 포함할 수 있는, 다양한 물리적 포맷을 가질 수 있다: 막; 칩 (예를 들면, 단백질 칩); 슬라이드 (예를 들면, 유리 슬라이드 또는 커서슬립); 칼럼; 중공, 고체, 반-고형, 공극- 또는 공동-함유 입자, 예컨대, 예를 들어, 비드; 겔; 섬유 광학 물질을 포함한, 섬유; 매트릭스; 및 샘플 소켓. 예시적 샘플 소켓은 샘플 웰들, 튜브, 모세관, 바이알, 및 샘플을 담을 수 있는 임의의 다른 용기, 홈 또는 압입을 포함한다. 샘플 소켓은 다중-샘플 플랫폼, 예컨대 미세적정 플레이트, 슬라이드, 미세유체공학 장치, 등등에 함유될 수 있다. 지지체는 천연 또는 합성 물질, 유기 또는 무기 물질로 구성될 수 있다. 포착 시약이 부착되는 고형 지지체의 조성물은 일반적으로 부착의 방법 (예를 들면, 공유 결합)에 좌우된다. 다른 예시적 소켓은 제어된 미세액적 및 미세유체 또는 검정 및 관련된 조작이 발생할 수 있는 벌크 오일/수성 에멀젼을 포함한다. 적합한 고형 지지체는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 플라스틱, 수지, 다당류, 실리카 또는 실리카-기반 물질, 작용화된 유리, 변형된 실리콘, 탄소, 금속, 무기 유리, 막, 나일론, 천연 섬유 (예컨대, 예를 들어, 실크, 울 및 면), 폴리머, 등등. 고형 지지체를 구성한 물질은, 포착 시약의 부착을 위하여 사용되는, 반응성 기 예컨대, 예를 들어, 카복시, 아미노, 또는 하이드록실 기를 포함할 수 있다. 폴리머성 고형 지지체는, 예를 들면, 하기를 포함할 수 있다: 폴리스티렌, 폴리에틸렌 글리콜 테트라프탈레이트, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 부틸 고무, 스티렌부타디엔 고무, 천연 고무, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, (폴리)테트라플루오로에틸렌, (폴리)비닐리덴플루오라이드, 폴리카보네이트, 및 폴리메틸펜텐. 사용될 수 있는 적합한 고형 지지체 입자는, 예를 들면, 인코딩된 입자, 예컨대 Luminex®-유형 인코딩된 입자, 자기 입자, 및 유리 입자를 포함한다.
바이오마커의 예시적 용도
다양한 예시적 구현예에서, 본원에서 기재된 임의의 분석적 방법을 포함하여, 분석적 방법의 임의의 수에 의해, 예컨대 혈청 또는 혈장에서, 개체의 순환에 존재하는 하나 이상의 바이오마커에 상응하는 하나 이상의 바이오마커 값을 검출함으로써 개체에서 CV 사건의 위험 평가 방법이 제공된다. 이들 바이오마커는, 예를 들어, CV 사건의 증가된 위험 없이 개체에 비교시 CV 사건의 증가된 위험을 갖는 개체에서 차등적으로 발현된다. 개체에서 바이오마커의 차등적 발현 검출은, 예를 들어, 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 또는 5 년 시간 프레임 이내 CV 사건의 위험 예측을 허용하기 위해 사용될 수 있다.
독립형 진단 시험으로서 바이오마커 수준 시험에 더하여, 바이오마커 수준은 또한 질환 또는 병태의 감수성의 증가된 위험을 나타내는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs) 또는 다른 유전적 병변 또는 가변성의 측정과 함께 실시될 수 있다. (참고, 예를 들면, Amos et al., Nature Genetics 40, 616-622 (2009)).
독립형 진단 시험으로서 바이오마커 수준 시험에 더하여, 바이오마커 수준은 또한 방사선 스크리닝과 함께 사용될 수 있다. 바이오마커 수준은 또한 관련된 증상 또는 유전 검사와 함께 사용될 수 있다. 본원에서 기재된 임의의 바이오마커의 검출은, CV 사건 위험이 측정된 높은 위험 개체에서 치유의 더욱 적극적인 수준까지 증가를 포함하여, 개체의 적절한 임상 치유를 안내하기 위해 CV 사건의 위험이 평가된 이후 유용할 수 있다. 관련된 증상 또는 위험 요소와 함께 바이오마커 수준 시험에 더하여, 바이오마커에 관한 정보는 또한 다른 유형의 데이터, 특히 심혈관 사건용 개체의 위험 (예를 들면, 환자 임상 이력, 증상, 심혈관 질환의 가족력, 흡연 또는 알코올 사용의 이력, 위험 요소 예컨대 유전자 마커(들)의 존재, 및/또는 다른 바이오마커의 상태, 등)을 나타내는 데이터와 함께 평가될 수 있다. 이들 다양한 데이터는, 컴퓨터 또는 다른 장치/장치에서 형체화될 수 있는, 자동화 방법, 예컨대 컴퓨터 프로그램/소프트웨어로 평가될 수 있다.
높은 위험 개체에서 방사선 스크리닝과 함께 바이오마커 수준 시험 (예를 들면, 관상동맥 혈관조영에서 검출된 봉쇄와 함께 바이오마커 수준 평가)에 더하여, 바이오마커에 관한 정보는 또한 다른 유형의 데이터, 특히 CV 사건을 갖기 위한 개체의 위험을 나타내는 데이터 (예를 들면, 환자 임상 이력, 증상, 심혈관 질환의 가족력, 위험 요소 예컨대 개체가 흡연자인지 여부, 과다 알코올 사용자 및/또는 다른 바이오마커의 상태, 등)과 함께 평가될 수 있다. 이들 다양한 데이터는, 컴퓨터 또는 다른 장치/장치에서 형체화될 수 있는, 자동화 방법, 예컨대 컴퓨터 프로그램/소프트웨어로 평가될 수 있다.
바이오마커의 시험은 또한 임상 실시에서 현재 사용중인 지침 및 심혈관 위험 알고리즘과 관련될 수 있다. 예를 들어, 프라밍햄 위험 스코어는 위험 스코어를 제공하기 위해 위험 요소를 이용하고, 상기 위험 요소는 LDL-콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤 수준, 손상된 글루코오스 수준, 흡연, 수축 혈액 압력, 및 당뇨병을 포함한다. 고-위험 환자의 빈도는 연령에 따라 증가하고, 남성이 여성 보다 고-위험 환자의 더 높은 분율을 포함한다.
임의의 기재된 바이오마커는 또한 영상화 시험에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 조영제는, 치료적 개입에 대해 반응을 모니터하여, 다른 사용 중에서 임상 시도에서 표적 집단으로 선택하기 위해, 심혈관 사건의 위험 예측에 도움을 주기 위해 사용될 수 있는, 임의의 기재된 바이오마커에 커플링될 수 있다.
바이오마커 및 바이오마커 수준의 검출 및 측정
본원에서 기재된 바이오마커에 대하여 바이오마커 수준은 임의의 다양한 공지된 분석적 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 한 구현예에서, 바이오마커 값은 포착 시약을 이용하여 검출된다. 다양한 구현예에서, 포착 시약은 용액내 바이오마커에 노출될 수 있거나 또는 바이오마커에 노출될 수 있으면서 포착 시약은 고형 지지체 상에 고정된다. 다른 구현예에서, 포착 시약은 고형 지지체 상에서 2차 특징과 반응성인 특징을 함유한다. 이들 구현예에서, 포착 시약은 용액내 바이오마커에 노출될 수 있고, 그 다음 포착 시약 상에서 특징은 고형 지지체 상에서 바이오마커를 고정화하기 위해 고형 지지체 상에서 2차 특징과 함께 사용될 수 있다. 포착 시약은 수행되는 분석의 유형에 기반하여 선택된다. 포착 시약은 하기를 포함한다: 비제한적으로 앱타머, 항체, 아드넥틴, 안키린, 다른 항체 모방체 및 다른 단백질 스캐폴드, 자가항체, 키메라, 작은 분자, F(ab')2 단편, 단일 사슬 항체 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 아피바디, 나노바디, 인식된 폴리머, 아비머, 펩티드모사, 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체, 및 합성 수용체, 및 이들의 변형 및 단편.
일부 구현예에서, 바이오마커 수준은 바이오마커/포착 시약 복합체를 이용하여 검출된다.
일부 구현예에서, 바이오마커 수준은 바이오마커/포착 시약 복합체로부터 유도되고 간접적으로, 예컨대, 예를 들어, 바이오마커/포착 시약 상호작용에 따르는 반응의 결과로서 검출되지만, 그러나 바이오마커/포착 시약 복합체의 형성에 의존적이다.
일부 구현예에서, 바이오마커 수준은 생물학적 샘플에서 바이오마커로부터 직접적으로 검출된다.
일부 구현예에서, 바이오마커는 생물학적 샘플에서 2 이상의 바이오마커의 동시 검출을 허용하는 다중화된 포멧을 이용하여 검출된다. 다중화된 포멧의 일부 구현예에서, 포착 시약은 고형 지지체 상의 별개의 위치에서 직접적으로 또는 간접적으로, 공유적으로 또는 비-공유적으로 고정된다. 일부 구현예에서, 다중화된 포멧은 각각의 고형 지지체가 그 고형 지지체와 관련된 독특한 포착 시약, 예컨대, 예를 들어 양자점을 갖는 별개의 고형 지지체를 사용한다. 일부 구현예에서, 개별 장치는 생물학적 샘플에서 검출된 다중 바이오마커 중 각 하나의 검출을 위하여 사용된다. 개별 장치는 동시에 가공된 생물학적 샘플에서 각각의 바이오마커를 허용하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 미세적정 플레이트는 사용될 수 있어서 이로써 플레이트내 각각의 웰은 생물학적 샘플에서 검출된 하나 이상의 바이오마커를 독특하게 분석하기 위해 사용된다.
하나 이상의 전술한 구현예에서, 형광성 태그는 바이오마커 수준의 검출을 가능하게 하는 바이오마커/포착 시약 복합체의 성분을 표지화하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 형광성 표지는 공지된 기술을 이용하여 본원에서 기재된 임의의 바이오마커에 특이적인 포착 시약에 접합될 수 있고, 형광성 표지는 상응하는 바이오마커 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 형광성 표지는 희토류 킬레이트, 플루오레신 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 알로피코시아닌, PBXL-3, Qdot 605, 리스사민, 파이코에리트린, 텍사스 레드, 및 다른 상기 화합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 형광성 표지는 형광 염료 분자이다. 일부 구현예에서, 형광 염료 분자는 인돌륨 고리의 3-탄소 상에서 치환체가 화학적으로 반응성 기 또는 접합된 물질을 함유하는 적어도 하나의 치환된 인돌륨 고리 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 염료 분자는 AlexFluor 분자, 예컨대, 예를 들어, AlexaFluor 488, AlexaFluor 532, AlexaFluor 647, AlexaFluor 680, 또는 AlexaFluor 700을 포함한다. 다른 구현예에서, 염료 분자는 염료 분자의 제1 유형 및 제2 유형, 예컨대, 예를 들면, 2개의 상이한 AlexaFluor 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 염료 분자는 염료 분자의 제1 유형 및 제2 유형을 포함하고, 2개의 염료 분자는 상이한 방출 스펙트럼을 갖는다.
형광은 광범위한 검정 포맷과 양립가능한 다양한 기기장치로 측정될 수 있다. 예를 들어, 분광형광계는 미세적정 플레이트, 현미경 슬라이드, 인쇄된 배열, 큐벳, 등을 분석하기 위해 설계되었다. 참고 Principles of Fluorescence Spectroscopy, by J.R. Lakowicz, Springer Science + Business Media, Inc., 2004. 참고 Bioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Applications; Philip E. Stanley and Larry J. Kricka editors, World Scientific Publishing Company, January 2002.
하나 이상의 구현예에서, 화학발광 태그는 바이오마커 수준의 검출을 가능하게 하는 바이오마커/포착 복합체의 성분을 표지화하기 위해 임의로 사용될 수 있다. 적합한 화학발광 물질은 임의의 옥살릴 클로라이드, 로다민 6G, Ru(bipy)3 2 +, TMAE (테트라키스(디메틸아미노)에틸렌), 파이로갈롤 (1,2,3-트리하이드록시벤젠), 루시게닌, 퍼옥시옥살레이트, 아릴 옥살레이트, 아크리디늄 에스테르, 디옥세탄, 및 다른 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 검출 방법은 바이오마커 수준에 상응하는 검출가능한 신호를 발생시키는 효소/기질 조합을 포함한다. 일반적으로, 효소는, 분광광도법, 형광, 및 화학발광을 포함하여, 다양한 기술을 이용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학 변경을 촉매화한다. 적합한 효소는, 예를 들어, 루시퍼라아제, 루시페린, 말레이트 탈수소효소, 우레아제, 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRPO), 알칼리성 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 우리카제, 잔틴 옥시다아제, 락토페록시다아제, 마이크로페록시다아제, 등등을 포함한다.
일부 구현예에서, 검출 방법은 측정가능한 신호를 발생하는 형광, 화학발광, 방사선핵종의 조합 또는 효소/기질 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 다중봉 신호전달은 바이오마커 검정 포맷에서 독특한 및 유리한 특징을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바이오마커용 바이오마커 수준은 이하에서 논의된 바와 같이, 단일화 앱타머 검정, 다중화된 앱타머 검정, 단일화 또는 다중화된 면역검정, mRNA 발현 프로파일링, miRNA 발현 프로파일링, 질량 분광분석 분석, 조직학적/세포학적 방법, 등을 포함한 임의의 분석적 방법을 이용하여 검출될 수 있다.
앱타머 -기반 검정을 이용한 바이오마커 수준의 측정
생물학적 샘플 및 다른 샘플에서 생리적으로 유의미한 분자의 검출 및 정량화에 관한 검정은 과학적 연구에서 및 건강 관리 분야에서 중요한 도구이다. 상기 배열의 한 부류는 고형 지지체 상에 고정된 하나 이상의 앱타머를 포함하는 마이크로어레이의 사용을 포함한다. 앱타머는 각각 매우 특이적 방식으로 및 매우 높은 친화도로 표적 분자에 결합할 수 있다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,475,096 명칭 "Nucleic Acid Ligands"; 참고 또한, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,242,246, 미국 특허 번호 6,458,543, 및 미국 특허 번호 6,503,715, 이들 각각은 "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip"으로 명칭된다. 일단 마이크로어레이가 샘플과 접촉되면, 앱타머는 샘플에 존재한 이의 각 표적 분자에 결합하고 그렇게 함으로써 바이오마커에 상응하는 바이오마커 수준의 측정을 가능하게 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "앱타머"는 표적 분자에 대하여 특이적 결합 친화도를 갖는 핵산을 지칭한다. 친화도 상호작용이 정도의 문제임이 기술적으로 인식되지만; 그러나, 상기 맥락에서, 이의 표적에 대하여 앱타머의 "특이적 결합 친화도"는 시험 샘플에서 다른 성분에 결합하는 것보다 일반적으로 훨씬 높은 정도의 친화도로 이의 표적에 앱타머가 결합하는 것을 의미한다. "앱타머"는 특정한 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 한 유형 또는 종의 복사의 세트이다. 앱타머는, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드의 임의의 수를 포함한, 뉴클레오티드의 임의의 적합한 수를 포함할 수 있다. "앱타머"는 분자의 1 초과 상기 세트를 지칭한다. 상이한 앱타머는 뉴클레오티드의 동일한 또는 상이한 수를 가질 수 있다. 앱타머는 DNA 또는 RNA 또는 화학적으로 변형된 핵산일 수 있고 단일가닥, 이중가닥일 수 있거나, 또는 이중가닥 영역을 함유하고, 고차화된 구조를 포함할 수 있다. 앱타머는 또한 포토앱타머일 수 있고, 여기에서 광반응성 또는 화학적으로 반응성 작용기는 이의 상응하는 표적에 공유 결합되는 것을 허용하기 위해 앱타머에 포함된다. 본원에서 개시된 임의의 앱타머 방법은 동일한 표적 분자를 특이적으로 결합하는 2 이상의 앱타머의 사용을 포함할 수 있다. 아래 추가로 기재된 바와 같이, 앱타머는 태그를 포함할 수 있다. 앱타머가 태그를 포함하면, 앱타머의 모든 복사는 동일한 태그를 가질 필요가 없다. 게다가, 상이한 앱타머 각각이 태그를 포함하면, 이들 상이한 앱타머는 동일한 태그 또는 상이한 태그를 가질 수 있다.
앱타머는, SELEX 방법을 포함하여, 임의의 공지된 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 일단 확인되면, 앱타머는, 화학 합성 방법 및 효소 합성 방법을 포함하여, 임의의 공지된 방법에 따라 제조 또는 합성될 수 있다.
용어 "SELEX" 및 "SELEX 방법"은 (1) 바람직한 방식, 예를 들어 단백질에 높은 친화도를 이용한 결합으로 표적 분자와 상호작용하는 앱타머의 선택과, (2) 상기 선택된 핵산의 증폭과의 조합을 일반적으로 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. SELEX 방법은 특이적 표적 또는 바이오마커에 높은 친화도로 앱타머를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
SELEX는 일반적으로 핵산의 후보자 혼합물 제조, 친화도 복합체를 형성하기 위해 원하는 표적 분자에 후보자 혼합물 결합, 미결합된 후보자 핵산으로부터 친화도 복합체 분리, 친화도 복합체로부터 핵산의 분리 및 단리, 핵산의 정제, 및 특이적 앱타머 서열 확인을 포함한다. 상기 방법은 선택된 앱타머의 친화도를 추가로 개선하기 위해 다중 라운드를 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 방법내 하나 이상의 지점에서 증폭 단계를 포함할 수 있다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,475,096, 명칭 "Nucleic Acid Ligands". SELEX 방법은 이의 표적을 공유적으로 결합하는 앱타머 뿐만 아니라 이의 표적에 비-공유적으로 결합하는 앱타머를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,705,337 명칭 "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX".
SELEX 방법은 앱타머에 개선된 특징, 예컨대, 예를 들어, 개선된 생체내 안정성 또는 개선된 전달 특징을 부여하는 변형된 뉴클레오티드를 함유한 고-친화도 앱타머를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 상기 변형의 예는 리보오스 및/또는 포스페이트 및/또는 염기 위치에서 화학 치환을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드를 함유한 SELEX 방법-확인된 앱타머는, 피리미딘의 5'- 및 2'-위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 함유한 올리고뉴클레오티드를 기재하는, 미국 특허 번호 5,660,985, 명칭 "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides"에 기재된다. 미국 특허 번호 5,580,737 (참고 상기)은 2'-아미노 (2'-NH2), 2'-플루오로 (2'-F), 및/또는 2'-O-메틸 (2'-OMe)로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유한 고 특이적 앱타머를 기재한다. 참고: 또한, SELEX 및 photoSELEX에서 팽창된 물리적 및 화학 특성 및 이의 용도를 갖는 핵산 라이브러리를 기재하는, 미국 특허 출원 공개 20090098549, 명칭 "SELEX 및 PHOTOSELEX".
SELEX는 또한 바람직한 오프-레이트 특징을 갖는 앱타머를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 참고 표적 분자에 결합할 수 있는 앱타머의 개선된 SELEX 생성 방법을 기재하는, 미국 공개 번호 20090004667, 명칭 "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates". 이의 각 표적 분자로부터 해리의 더 느린 속도를 갖는 앱타머 및 포토앱타머 생산 방법이 기재된다. 상기 방법은 표적 분자와 후보자 혼합물의 접촉, 핵산-표적 복합체의 형성 발생 허용, 및 느린 오프-레이트 농축 과정의 수행을 포함하고 여기에서 빠른 해리 속도를 갖는 핵산-표적 복합체는 해리할 것이고 개선하지 않을 것이고, 반면에 느린 해리 속도를 갖는 복합체는 온전하게 남아있을 것이다. 추가로, 상기 방법은 개선된 오프-레이트 성능을 갖는 앱타머를 생성하기 위해 후보자 핵산 혼합물의 생산에서 변형된 뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 비제한 예시적 변형된 뉴클레오티드는, 예를 들어, 도 14에서 보여진 변형된 피리미딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 앱타머는 변형, 예컨대 염기 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 앱타머는, 표적 단백질과 소수성 접촉을 허용하는, 소수성 변형, 예컨대 소수성 염기 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 소수성 접촉은, 일부 구현예에서, 앱타머에 의해 더 큰 친화도 및/또는 더 느린 오프-레이트 결합에 기여한다. 소수성 변형을 갖는 비제한 예시적 뉴클레오티드는 도 14에서 보여진다. 일부 구현예에서, 앱타머는 소수성 변형을 갖는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10 뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 각각의 소수성 변형은 다른 것과 동일 또는 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 앱타머내 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10 소수성 변형은 도 14에서 보여진 소수성 변형으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, (소수성 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한 앱타머를 포함한) 느린 오프-레이트 앱타머는 ≥ 30 분, ≥ 60 분, ≥ 90 분, ≥ 120 분, ≥ 150 분, ≥ 180 분, ≥ 210 분, 또는 ≥ 240 분의 오프-레이트 (t1/2)를 갖는다.
일부 구현예에서, 검정은 앱타머가 이의 표적 분자를 공유적으로 결합하거나 또는 "광가교하는" 광반응성 작용기를 포함하는 앱타머를 사용한다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,544,776 명칭 "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". 이들 광반응성 앱타머는 또한 포토앱타머로 지칭된다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,763,177, 미국 특허 번호 6,001,577, 및 미국 특허 번호 6,291,184 (이들 각각의 명칭 "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"); 참고 또한, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,458,539, 명칭 "Photoselection of Nucleic Acid Ligands". 마이크로어레이가 샘플과 접촉되고 포토앱타머가 이의 표적 분자에 결합할 기회를 가진 후, 포토앱타머는 광활성화되고, 고형 지지체는 세정되어 임의의 비-특이적으로 결합된 분자를 제거한다. 포토앱타머에 결합되는 표적 분자가 포토앱타머 상에서 광활성화된 작용기(들)에 의해 창제된 공유 결합으로 인해 일반적으로 제거되지 않기 때문에, 가혹한 세정 조건은 사용될 수 있다. 이런 식으로, 검정은 시험 샘플에서 바이오마커에 상응하는 바이오마커 수준의 검출을 가능하게 한다.
일부 검정 포맷에서, 앱타머는 샘플과 접촉되기에 앞서 고형 지지체 상에서 고정된다. 특정 상황 하에서, 그러나, 샘플과 접촉에 앞서 앱타머의 고정화는 최적의 검정을 제공하지 않을 수 있다. 예를 들어, 앱타머의 사전-고정화는 고형 지지체의 표면 상에서 표적 분자와 앱타머의 비효율적인 혼합, 아마 너무 긴 반응 시간 유발 및, 따라서, 이의 표적 분자에 앱타머의 효율적인 결합을 허용하는 확장된 인큐베이션 기간을 초래할 수 있다. 추가로, 포토앱타머가 검정에서 이용된 경우 및 고형 지지체로서 이용된 물질에 의존하여, 고형 지지체는 포토앱타머와 이의 표적 분자 사이에서 공유 결합의 형성을 유효화하기 위해 사용된 광을 산란 또는 흡수하는 경향이 있을 수 있다. 게다가, 이용된 방법에 의존하여, 고형 지지체의 표면이 또한 사용되는 임의의 표지제에 노출될 수 있고 이에 영향받을 수 있기 때문에, 이의 앱타머에 결합된 표적 분자의 검출은 부정확성 처리될 수 있다. 마지막으로, 고형 지지체 상에서 앱타머의 고정화는 일반적으로 샘플에 앱타머의 노출에 앞서 앱타머-제조 단계 (즉, 고정화)를 포함하고, 상기 제조 단계는 앱타머의 활성 또는 기능성에 영향을 미칠 수 있다.
용액에서 이의 표적을 포착하기 위해 앱타머를 허용하는 및 그 다음 검출에 앞서 앱타머-표적 혼합물의 특이적 성분을 제거하기 위해 설계되는 분리 단계를 사용한 앱타머 검정은 또한 기재되어 있다 (참고 미국 공개 번호 20090042206, 명칭 "Multiplexed Analyses of Test Samples"). 기재된 앱타머 검정 방법은 핵산 (즉, 앱타머) 검출 및 정량화에 의해 시험 샘플에서 비-핵산 표적 (예를 들면, 단백질 표적)의 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 기재된 방법은 비-핵산 표적 검출 및 정량화를 위하여 핵산 대리 (즉, 앱타머)를 창제하고, 따라서 증폭을 포함한 광범위한 핵산 기술을, 단백질 표적을 포함하여, 더 넓은 범위의 원하는 표적에 적용되도록 한다.
앱타머는 앱타머 바이오마커 복합체 (또는 포토앱타머 바이오마커 공유 복합체)로부터 검정 성분의 분리를 용이하게 하기 위해 및 검출 및/또는 정량화용 앱타머의 단리를 허용하기 위해 작제될 수 있다. 한 구현예에서, 이들 작제물은 앱타머 서열 내에 절단가능 또는 방출가능 요소를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 추가의 기능성은 앱타머, 예를 들어, 표지된 또는 검출가능한 성분, 스페이서 성분, 또는 특이적 결합 태그 또는 고정화 요소에 도입될 수 있다. 예를 들어, 앱타머는 절단가능 모이어티, 표지, 표지를 분리한 스페이서 성분을 통해 앱타머에 연결된 태그, 및 절단가능 모이어티를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 절단가능 요소는 광절단가능 링커이다. 광절단가능 링커는 바이오틴 모이어티 및 스페이서 섹션에 부착될 수 있고, 아민의 유도체화를 위하여 NHS 기를 포함할 수 있고, 앱타머에 바이오틴 기를 도입하기 위해 사용될 수 있고, 그렇게 함으로써 나중에 검정 방법에서 앱타머의 방출을 허용한다.
용액내 모든 검정 성분로 실시된, 균질한 검정은 신호의 검출에 앞서 샘플 및 시약의 분리를 필요로 하지 않는다. 이들 방법은 신속하고 사용하기 쉽다. 이들 방법은 이의 특이적 표적과 반응하는 분자 포착 또는 결합 시약에 기반하여 신호를 발생한다. 본원에서 기재된 방법의 일부 구현예에서, 분자 포착 시약은 앱타머 또는 항체 등등을 포함하고 특이적 표적은 표 3에 보이는 바이오마커일 수 있다.
일부 구현예에서, 신호 생성 방법은 이의 특이적 바이오마커 표적과 형광단-표지된 포착 시약의 상호작용 때문에 비등방성 신호 변화를 이용한다. 표지된 포착이 이의 표적과 반응하는 경우, 증가된 분자량은 복합체에 부착된 형광단의 회전 운동을 일으켜 비등방성 값을 훨씬 느리게 변화시킨다. 비등방성 변화의 모니터링에 의해, 결합 사건은 용액내 바이오마커를 정량적으로 측정하기 위해 사용될 수 있다. 다른 방법은 형광 국소 분극화 검정, 분자 항로표지 방법, 시간 분해 형광 켄칭, 화학발광, 형광 공명 에너지 전달, 등등을 포함한다.
생물학적 샘플에서 바이오마커 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있는 예시적 용액-기반 앱타머 검정은 하기 단계를 포함한다: (a) 제1 태그를 포함하는 및 바이오마커에 대하여 특이적 친화도를 갖는 앱타머와 생물학적 샘플을 접촉시킴으로써 혼합물을 제조하는 단계로서, 여기에서 앱타머 친화도 복합체는 바이오마커가 샘플에 존재하는 경우 형성되는, 단계; (b) 제1 포착 요소를 포함한 제1 고형 지지체에 혼합물을 노출시키는 단계, 및 제1 태그를 제1 포착 요소와 회합시키는 단계; (c) 제1 고형 지지체와 회합되지 않은 혼합물의 임의의 성분을 제거하는 단계; (d) 제2 태그를 앱타머 친화도 복합체의 바이오마커 성분에 부착시키는 단계; (e) 제1 고형 지지체로부터 앱타머 친화도 복합체를 방출시키는 단계; (f) 제2 포착 요소를 포함하는 제2 고형 지지체에 방출된 앱타머 친화도 복합체를 노출시키는 단계 및 제2 태그를 제2 포착 요소와 회합시키는 단계; (g) 앱타머 친화도 복합체로부터 비-복합된 앱타머를 분할시킴으로써 혼합물로부터 임의의 비-복합된 앱타머를 제거하는 단계; (h) 고형 지지체로부터 앱타머를 용리시키는 단계; 및 (i) 앱타머 친화도 복합체의 앱타머 성분을 검출함으로써 바이오마커를 검출하는 단계.
당해 기술에서 공지된 임의의 수단은 앱타머 친화도 복합체의 앱타머 성분을 검출함으로써 바이오마커 값을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 수많은 상이한 검출 방법, 예컨대, 예를 들어, 하이브리드화 검정, 질량 분광법, 또는 QPCR은 친화도 복합체의 앱타머 성분을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 시컨싱 방법은 앱타머 친화도 복합체의 앱타머 성분을 검출 및 그렇게 함으로써 바이오마커 값을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 간단히, 시험 샘플은 시험 샘플에 존재하는 하나 이상의 앱타머의 서열 또는 서열들을 확인 및 정량화하기 위해 임의의 종류의 핵산 시컨싱 방법으로 처리될 수 있다. 일부 구현예에서, 서열은 분자를 독특하게 확인하기 위해 사용될 수 있는 분자의 임의의 부분 또는 전체 앱타머 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 시컨싱 확인은 앱타머에 부가된 특이적 서열이고; 상기 서열은 종종 "태그", "바코드", 또는 "짚코드"로 지칭된다. 일부 구현예에서, 시컨싱 방법은 앱타머 서열을 증폭하기 위해 또는, 시컨싱에 적절한 핵산의 임의의 다른 종류로, 임의의 위치에 대한 화학 변형을 함유하는 RNA 및 DNA를 포함한, 핵산의 임의의 종류의 전환하기 위해 효소 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 시컨싱 방법은 하나 이상의 클로닝 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 시컨싱 방법은 클로닝 없이 직접적인 시컨싱 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 시컨싱 방법은 시험 샘플에서 하나 이상의 앱타머를 표적하는 특이적 프라이머를 이용한 지향된 접근법을 포함한다. 다른 구현예에서, 시컨싱 방법은 시험 샘플에서 모든 앱타머를 표적하는 샷건 접근법을 포함한다.
일부 구현예에서, 시컨싱 방법은 시컨싱용으로 표적화된 분자를 증폭하기 위해 효소 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 시컨싱 방법은 단일 분자를 직접적으로 배열한다. 생물학적 샘플에서 바이오마커에 상응하는 바이오마커 값을 검출하기 위해 사용될 수 있는 예시적 핵산 시컨싱-기반 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 효소 단계를 이용하여 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 앱타머의 혼합물을 비변형된 핵산으로 전환하는 단계; (b) 엄청나게 평행한 시컨싱 플랫폼 예컨대, 예를 들어, 454 시컨싱 시스템 (454 Life Sciences/Roche), Illumina 시컨싱 시스템 (Illumina), ABI 고체 시컨싱 시스템 (Applied Biosystems), HeliScope 단일 분자 시퀀서 (Helicos Biosciences), 또는 Pacific Biosciences 실시간 단일-분자 시컨싱 시스템 (Pacific BioSciences) 또는 Polonator G 시컨싱 시스템 (Dover Systems)으로 수득한 비변형된 핵산의 샷건 시컨싱 단계; 및 (c) 특이적 서열 및 서열 카운트에 의해 혼합물에 존재하는 앱타머의 확인 및 정량화 단계.
앱타머를 이용한 생물학적 샘플에서 바이오마커 검출의 비제한 예시적 방법은 실시예 1에 기재된다. 참고 또한 Kraemer et al., 2011, PLoS One 6(10): e26332.
면역검정을 이용한 바이오마커 수준의 측정
면역검정 방법은 이의 상응하는 표적 또는 분석물에 대한 항체의 반응에 기반하고 특이적 검정 포멧에 의존하여 샘플에서 분석물을 검출할 수 있다. 면역-반응성에 기반하여 검정 방법의 특이성 및 민감성을 개선하기 위해, 단클론성 항체 및 이의 단편은 이의 특이적 에피토프 인식 때문에 종종 사용된다. 다클론성 항체는 또한 단클론성 항체와 비교시 표적에 대한 이의 증가된 친화도 때문에 다양한 면역검정에서 성공적으로 사용되었다. 면역검정은 광범위한 생물학적 샘플 매트릭스로 사용을 위하여 설계되었다. 면역검정 포맷은 정성적, 세미-정량적, 및 정량적 결과를 제공하도록 설계되었다.
정량적 결과는 검출된 특이적 분석물의 공지된 농도로 창제된 표준 곡선의 사용을 통해 생성된다. 미공지된 샘플로부터 반응 또는 신호는 표준 곡선 상에서 작도되고, 미공지된 샘플에서 표적에 상응하는 양 또는 수준은 확립된다.
수많은 면역검정 포맷은 설계되었다. ELISA 또는 EIA는 분석물의 검출을 위하여 정량적일 수 있다. 상기 방법은 분석물 또는 항체에 표지의 부착에 의존하고 표지 성분은, 직접적으로 또는 간접적으로, 효소를 포함한다. ELISA 시험은 분석물의 직접적, 간접적, 경쟁적, 또는 샌드위치 검출을 위하여 포멧될 수 있다. 다른 방법은 표지 예컨대, 예를 들어, 방사선동위원소 (I125) 또는 형광에 의존한다. 추가의 기술은, 예를 들어, 응집, 혼탁법, 비탁법, 웨스턴 블랏, 면역침강, 면역세포화학, 면역조직화학, 유세포측정, Luminex 검정, 및 다른 것을 포함한다 (참고 면역검정: A Practical Guide, edited by Brian Law, published by Taylor & Francis, Ltd., 2005 edition).
예시적 검정 포맷은 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정, 형광성, 화학발광, 및 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 또는 시간 분할된-FRET (TR-FRET) 면역검정을 포함한다. 바이오마커 검출용 절차의 예는 바이오마커 면역침강 그 다음 크기 및 펩티드 수준 분별값, 예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 평면 전기크로마토그래피, 등등을 허용하는 정량적 방법을 포함한다.
물질을 생성하는 검출가능한 표지 또는 신호의 검출 및/또는 정량화 방법은 표지의 성질에 의존한다. (검출가능한 표지가 효소인 경우; 참고 상기) 적절한 효소에 의해 촉매화된 반응의 생성물은, 비제한적으로, 형광성, 발광성, 또는 방사성일 수 있거나 또는 이들은 가시광선 또는 자외선을 흡수할 수 있다. 상기 검출가능한 표지의 검출에 적합한 검출기의 예는, 비제한적으로, x-선 필름, 방사능 카운터, 섬광 계수기, 분광측정기, 비색계, 형광광도계, 발광분석기, 및 농도계를 포함한다.
임의의 검출 방법은 반응의 임의의 적합한 제조, 가공, 및 분석을 허용하는 임의의 포멧에서 수행될 수 있다. 이는, 예를 들어, 다중-웰 검정 플레이트 (예를 들면, 96 웰들 또는 386 웰들)에서 또는 임의의 적합한 어레이 또는 마이크로어레이를 이용하여 될 수 있다. 다양한 제제를 위한 원액은 수작업으로 또는 로봇식으로 제조될 수 있고, 모든 후속의 피펫팅, 희석, 혼합, 분포, 세척, 인큐베이팅, 샘플 판독, 데이터 수집 및 분석은 검출가능한 표지를 검출할 수 있는 상업적으로 이용가능한 분석 소프트웨어, 로보트, 및 검출 기기장치를 이용하여 로봇식으로 실시될 수 있다.
유전자 발현 프로파일링을 이용한 바이오마커 수준의 측정
생물학적 샘플에서 mRNA 측정은, 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 상응하는 단백질의 수준 검출용 대리로서 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바이오마커 또는 바이오마커 패널은 적절한 RNA 검출에 의해 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA 발현 수준은 역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR 그 다음 qPCR)에 의해 측정된다. RT-PCR은 mRNA로부터 cDNA를 창출하기 위해 사용된다. cDNA는 DNA 증폭 방법이 진행함에 따라 형광을 생산하기 위해 qPCR 검정에서 사용될 수 있다. 표준 곡선과의 비교로, qPCR은 절대 측정 예컨대 세포 당 mRNA의 복사의 수를 생산할 수 있다. 노던 블랏, 마이크로어레이, 인베이더 검정, 및 모세관 전기영동과 조합된 RT-PCR은 샘플에서 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위해 모두 사용되었다. 참고 Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004.
생체내 분자 영상화 기술을 이용한 바이오마커의 검출
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바이오마커는 분자 영상화 시험에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 조영제는, 생체내 바이오마커를 검출하기 위해 사용될 수 있는, 포착 시약에 커플링될 수 있다.
생체내 영상화 기술은 개체의 바디에서 특정한 질환의 상태를 검출하기 위한 비-침습성 방법을 제공한다. 예를 들어, 바디의 전체 부분, 또는 심지어 전체 바디는 3차원 이미지로서 시각화될 수 있고, 그렇게 함으로써 바디에서 형태학 및 구조에 관한 귀중한 정보를 제공한다. 상기 기술은 생체내 바이오마커에 관한 정보를 제공하기 위해 본원에서 기재된 바이오마커의 검출과 조합될 수 있다.
생체내 분자 영상화 기술의 사용은 기술에서 다양한 진전으로 인해 확대하고 있다. 이들 진전은, 유용한 정보를 제공하기 위해 충분한 민감성 및 정확도로, 바디 내에 강한 신호를 제공할 수 있는, 신규 조영제 또는 표지, 예컨대 방사선표지 및/또는 형광성 표지의 개발; 및 바디 외부로부터 이들 신호를 검출 및 분석할 수 있는, 강력한 신규 영상화 기술의 개발을 포함한다. 조영제는 적절한 영상화 시스템에서 시각화될 수 있고, 그렇게 함으로써 조영제가 위치한 바디의 부분 또는 부분들의 이미지를 제공한다. 조영제는 포착 시약, 예컨대 앱타머 또는 항체, 예를 들어, 및/또는 펩티드 또는 단백질, 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자 발현의 검출을 위하여), 또는 임의의 이들과 하나 이상의 거대분자 및/또는 다른 미립 형태를 함유한 복합체에 결합될 수 있거나 또는 이와 관련될 수 있다.
조영제는 영상화에서 유용한 방사선 원자를 또한 특징으로 한다. 적합한 방사선 원자는 섬광계수법 연구를 위하여 테크네튬-99m 또는 요오드-123을 포함한다. 다른 쉽게 검출가능한 모이어티는, 예를 들어, 자기 공명 영상 (MRI)용 스핀 표지 예컨대, 예를 들어, 요오드-123 재차, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함한다. 상기 표지는 당해 기술에서 잘 알려지고 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 선택될 수 있다.
표준 영상화 기술은 비제한적으로 자기 공명 영상, 전산화단층촬영법 스캐닝, 양전자 방출 단층촬영 (PET), 단일 광자 방출 전산화단층촬영법 (SPECT), 등등을 포함한다. 생체내 영상화 진단을 위하여, 이용가능한 검출 기기의 유형은 주어진 조영제, 예컨대 표적 (단백질, mRNA, 등등)에 사용되는 주어진 방사선핵종 및 특정한 바이오마커 선택에서 주요 요소이다. 전형적으로 선택된 방사선핵종은 기기의 주어진 유형에 의해 검출가능한 붕괴의 유형을 갖는다. 또한, 생체내 진단을 위하여 방사선핵종 선택 경우, 이의 반감기는 표적 조직에 의한 최대 흡수의 시간에서 검출을 가능하게 하는데 충분히 긴 그러나 호스트의 유해한 방사선이 최소화되도록 충분히 짧아야 한다.
예시적 영상화 기술은, 방사선핵종이 개체에 합성으로 또는 국소로 투여되는 영상화 기술인, 비제한적으로 PET 및 SPECT를 포함한다. 방사선추적자의 후속의 흡수는 경시적으로 측정되고 표적화된 조직 및 바이오마커에 대한 정보를 수득하기 위해 사용된다. 이용된 특이적 동위원소의 고-에너지 (감마-선) 방출 및 이들을 검출하기 위해 사용된 기기의 민감성 및 정교화 때문에, 방사능의 2-차원 분포는 바디의 외부로부터 추론될 수 있다.
PET에서 통상적으로 사용된 양전자-방출 핵종은, 예를 들어, 탄소-11, 질소-13, 산소-15, 및 불소-18을 포함한다. 전자 포착 및/또는 감마-방출에 의해 붕괴하는 동위원소는 SPECT에서 사용되고, 예를 들어 요오드-123 및 테크네튬-99m을 포함한다. 테크네튬-99m으로 아미노산 표지화를 위한 예시적 방법은 불안정한 테크네튬-99m-전구체 복합체를 형성하기 위해 킬레이트화 전구체의 존재하에 과테크네튬산 이온의 환원이고, 이는, 결국, 2기능적으로 변형된 화학주성 펩티드의 금속 결합 기와 반응하여 테크네튬-99m-화학주성 펩티드 콘주게이트를 형성한다.
항체는 상기 생체내 영상화 진단 방법을 위하여 빈번하게 사용된다. 생체내 진단을 위하여 항체의 제조 및 사용은 당해 분야에 공지되어 있다. 유사하게, 앱타머는 상기 생체내 영상화 진단 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기재된 특정한 바이오마커를 확인하기 위해 사용된 앱타머는 생체내 바이오마커를 검출하기 위해 개체에 적절하게 표지 및 주사될 수 있다. 사용된 표지는 앞서 기재된 바와 같이 사용된 영상화 양식에 따라 선택될 것이다. 앱타머-지향된 조영제는 다른 조영제와 비교시 조직 침투, 조직 분포, 동력학, 제거, 효력, 및 선택성에 관해 독특한 및 유리한 특징을 가질 수 있다.
상기 기술은, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 영상화를 통해 유전자 발현의 검출을 위하여 표지된 올리고뉴클레오티드로 또한 임의로 수행될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 표지로서 형광성 분자 또는 방사선핵종으로 원위치 하이브리드화에 사용된다. 유전자 발현의 검출을 위한 다른 방법은, 예를 들어, 리포터 유전자의 활성 검출을 포함한다.
영상화 기술의 또 다른 일반적인 유형은 광학 영상이고, 여기에서 대상체 내의 형광성 신호는 대상체에 대해 외부인 광학적 장치에 의해 검출된다. 이들 신호는 실제의 형광 및/또는 생물발광에 기인될 수 있다. 광학적 검출 장치의 민감성에서 개선은 생체내 진단 검정을 위하여 광학 영상의 유용성을 증가시켰다.
다른 기술의 검토를 위하여, 참고 N. Blow, Nature Methods, 6, 465-469, 2009.
질량 분광분석법 방법을 이용한 바이오마커 수준의 측정
질량 분광분석기의 다양한 입체배치는 바이오마커 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 질량 분광분석기의 몇 개의 유형은 이용가능하거나 또는 다양한 입체배치로 생산될 수 있다. 일반적으로, 질량 분광분석기는 하기 주요 성분을 갖는다: 샘플 유입구, 이온 공급원, 질량 분석기, 검출기, 진공 시스템, 및 기기-대조군 시스템, 및 데이터 시스템. 샘플 유입구, 이온 공급원, 및 질량 분석기에서 차이는 일반적으로 기기의 유형 및 이의 능력을 한정한다. 예를 들어, 유입구는 모세관-칼럼 액체 크로마토그래피 공급원일 수 있거나 또는 예컨대 매트릭스-보조 레이저 탈착에서 사용된 직접적인 프로브 또는 단계일 수 있다. 공통의 이온 공급원은, 예를 들어, 나노스프레이 및 마이크로스프레이를 포함한 전기분무 또는 매트릭스-보조 레이저 탈착이다. 공통의 질량 분석기는 사중극자 질량 필터, 이온 트랩 질량 분석기 및 비과시간 질량 분석기를 포함한다. 부가 질량 분광분석법 방법은 당해 기술에서 잘 알려진다 (참고 Burlingame et al. Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter and Sherman, New York (2000)).
단백질 바이오마커 및 바이오마커 수준은 임의의 하기에 의해 검출 및 측정될 수 있다: 전기분무 이온화 질량 분광분석법 (ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비과시간 질량 분광분석법 (MALDI-TOF-MS), 표면-향상된 레이저 탈착/이온화 비과시간 질량 분광분석법 (SELDI-TOF-MS), 실리콘 상의 탈착/이온화 (DIOS), 2차 이온 질량 분광분석법 (SIMS), 사중극자 비과시간 (Q-TOF), 탠덤 비과시간 (TOF/TOF) 기술, 소위 ultraflex III TOF/TOF, 대기압 화학적 이온화 질량 분광분석법 (APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)N, 대기압 광이온화 질량 분광분석법 (APPI-MS), APPI-MS/MS, 및 APPI-(MS)N, 사중극자 질량 분광분석법, 푸리에 변환 질량 분광분석법 (FTMS), 정량적 질량 분광분석법, 및 이온 트랩 질량 분광분석법.
샘플 제조 전략은 표지에 사용되고 단백질 바이오마커 및 측정 바이오마커 수준의 질량 분광 특성규명 전에 샘플을 강화한다. 표지화 방법은 비제한적으로 상대적 및 절대적 정량화용 등압 태그 (iTRAQ) 및 세포 배양에서 아미노산으로 안정한 동위원소 표지화 (SILAC)를 포함한다. 질량 분광 분석에 앞서 후보자 바이오마커 단백질을 위하여 샘플을 선택적으로 강화하기 위해 사용된 포착 시약은 비제한적으로 하기를 포함한다: 앱타머, 항체, 핵산 프로브, 키메라, 작은 분자, F(ab')2 단편, 단일 사슬 항체 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 아피바디, 나노바디, 안키린, 도메인 항체, 대안적인 항체 스캐폴드 (예를 들면 디아바디 등) 인식된 폴리머, 아비머, 펩티드모사, 펩토이드, 펩티드 핵산, 트레오스 핵산, 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체, 및 합성 수용체, 및 이들의 변형 및 단편.
근접 결찰 검정을 이용한 바이오마커 수준의 측정
근접 결찰 검정은 바이오마커 값을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 간단히, 시험 샘플은, 쌍의 각각의 구성원이 올리고뉴클레오티드로 확장된, 한 쌍의 항체 또는 한 쌍의 앱타머일 수 있는 한 쌍의 친화도 프로브와 접촉된다. 친화도 프로브의 쌍을 위한 표적은, 호모- 또는 헤테로-다량체 복합체로서 존재할 수 있는, 1개의 단백질에 관한 2개의 상이한 측정자 또는 2개의 상이한 단백질 각각에 관한 1개의 측정자일 수 있다. 프로브가 표적 측정자에 결합하는 경우, 올리고뉴클레오티드 확대의 유리 말단은 충분히 가깝게 근접되어 함께 하이브리드화한다. 올리고뉴클레오티드 확대의 하이브리드화는 이들이 충분한 근접으로 배치된 경우 함께 올리고뉴클레오티드 확대를 브릿지 작용을 하는 공통의 컨넥터 올리고뉴클레오티드에 의해 용이하게 된다. 프로브의 올리고뉴클레오티드 확대가 하이브리드화되면, 확대의 말단은 효소 DNA 결찰에 의해 함께 연결된다.
각각의 올리고뉴클레오티드 확대는 PCR 증폭을 위하여 프라이머 부위를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 확대가 함께 결찰되면, 올리고뉴클레오티드는, PCR 증폭을 통해, 표적 단백질의 동일성 및 양에 관한 정보, 뿐만 아니라, 표적 측정자가 2개의 상이한 단백질 상에 있는 단백질-단백질 상호작용에 관한 정보를 누설하는 연속적 DNA 서열을 형성한다. 근접 결찰은 실시간 PCR의 사용을 통해 실시간 단백질 농도에 대한 고 민감성 및 특이적 검정 및 상호작용 정보를 제공할 수 있다. 해당 측정자를 결합하지 않는 프로브는 근접되지 않는 상응하는 올리고뉴클레오티드 확대를 갖지 않고 결찰 또는 PCR 증폭은 진행할 수 없으며, 신호가 생산되지 않는다.
전술한 검정은 CV 사건의 위험 예측 방법에서 유용한 바이오마커 값의 검출을 가능하게 하고, 여기에서 상기 방법은, 개체로부터 생물학적 샘플에서, MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 9개 모두의 바이오마커 검출 단계를 포함하고, 여기에서 아래에서 기재된 바와 같이, 바이오마커 값을 이용한 분류는 개체가 1 년, 2 년, 3 년, 또는 4 년 기간 내에 발생한 CV 사건의 상승된 위험을 갖는지를 나타낸다. 본원에서 기재된 임의의 방법에 따라, 바이오마커 값은 개별적으로 검출 및 분류될 수 있거나 또는 이들은, 예를 들어 다중화 검정 포멧에서와 같이, 종합적으로 검출 및 분류될 수 있다.
바이오마커의 분류 및 질환 스코어의 계산
일부 구현예에서, 주어진 진단 시험에 대하여 바이오마커 "서명"은 바이오마커의 세트를 함유하고, 각각의 바이오마커는 해당 집단에서 특징적인 수준을 갖는다. 특징적인 수준은, 일부 구현예에서, 특정한 그룹내 개체에 대하여 바이오마커 수준의 중간 또는 평균을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 진단 방법은 개체로부터 미공지된 샘플을 2개 그룹 중 하나에 CV 사건의 증가된 위험에서 또는 없이 배정하기 위해 사용될 수 있다.
2 이상의 그룹에 샘플의 배정은 분류로서 공지되고, 상기 배정을 달성하기 위해 사용된 절차는 분류기 또는 분류 방법으로서 공지된다. 분류 방법은 또한 평점 방법으로서 지칭될 수 있다. 바이오마커 수준의 세트로부터 진단 분류기를 작제하기 위해 사용될 수 있는 많은 분류 방법이 있다. 일부 사례에서, 분류 방법은 식별하기 원하는 2개 (또는 초과, 다중 분류 상태에 대하여) 상이한 그룹 내에 개체로부터 수득된 샘플을 이용하여 데이터 세트가 수집된 지도 학습 기술을 이용하여 수행된다. 각각의 샘플이 속하는 부류 (그룹 또는 집단)이 미리 각각의 샘플에 대하여 공지되기 때문에, 분류 방법은 원하는 분류 반응을 제공하기 위해 훈련될 수 있다. 진단 분류기를 생산하기 위해 지도 학습 기술을 사용하는 것이 또한 가능하다.
진단 분류기 개발을 위한 공통의 접근법은 하기를 포함하고: 측정 트리; 배깅 + 부스팅 + 숲; 규칙 추론 기반 학습; 파르젠 윈도우; 선형 모델; 기호논리; 신경 네트워크 방법; 비지도 클러스터링; K-평균; 계층적 오름차순/내림차순; 준-지도 학습; 원형 방법; 최근린내삽법; 알맹이 밀도 추정; 서포트 벡터 머신; 숨겨진 마르코브 모델; 볼츠만 학습; 분류기는 단순하게 또는 특정한 객관적 기능을 최소화하는 방식으로 조합될 수 있다. 검톨르 위하여, 참고, 예를 들면, Pattern Classification, R.O. Duda, et al., editors, John Wiley & Sons, 2nd edition, 2001; 참고 또한, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al., editors, Springer Science+Business Media, LLC, 2nd edition, 2009.
지도 학습 기술을 이용하여 분류기를 생산하기 위해, 데이터 훈련으로 불리는 샘플의 세트가 수득된다. 진단 시험의 맥락에서, 훈련 데이터는 미공지된 샘플이 나중에 배정될 상이한 그룹 (클래스)으로부터 샘플을 포함한다. 예를 들어, 대조군 집단내 개체 및 특정한 질환 집단내 개체로부터 수집된 샘플은 질환을 갖는 것으로서 또는 질환이 없는 것으로서 미공지된 샘플 (또는, 더 상세하게는, 샘플이 수득된 개체)를 분류할 수 있는 분류기를 개발하기 위해 훈련 데이터를 구성할 수 있다. 훈련 데이터로부터 분류기의 개발은 분류기 훈련으로서 공지된다. 분류기 훈련에 관한 특이적 세부사항은 지도 학습 기술의 성질에 의존한다. 미접촉 베이지안 분류기 훈련은 그와 같은 지도 학습 기술의 예이다 (참고, 예를 들면, Pattern Classification, R.O. Duda, et al., editors, John Wiley & Sons, 2nd edition, 2001; 참고 또한, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al., editors, Springer Science+Business Media, LLC, 2nd edition, 2009). 미접촉 베이지안 분류기의 훈련은, 예를 들면, 미국 공개 번호: 2012/0101002 및 2012/0077695에 기재된다.
훈련 세트에서 샘플 보다 많은 더 강력한 바이오마커 수준이 전형적으로 있기 때문에, 과-적합화를 피하기 위해 치유가 사용되어야 한다. 통계적 모델이 기저 관계 대신 랜덤 에러 또는 잡음을 기재하는 경우 과-적합화가 발생한다. 과-적합화는, 예를 들어, 분류기 개발에서 사용된 바이오마커의 수 제한, 바이오마커가 반응하는 것이 서로 독립적이라는 추정, 이용된 기저 통계적인 모델의 복합성 제한, 및 기저 통계적인 모델이 데이터에 순응한다는 확신에 의해 포함하여, 다양한 방식으로 회피될 수 있다.
바이오마커의 세트를 이용한 진단 시험 개발의 예증적인 예는 미접촉 베이즈 분류기, 바이오마커의 엄격한 독립적 치료와 이로부터 베이즈에 기반한 단순 확률적 분류기의 적용을 포함한다. 각각의 바이오마커는 각각의 부류에서 측정된 RFU 값 또는 log RFU (상대적 형광 단위) 값에 대하여 부류-의존적 확률 밀도 함수 (pdf)에 의해 기재된다. 한 부류에서 바이오마커의 세트에 대한 결합 pdfs는 각각의 바이오마커에 대하여 개체 부류-의존적 pdfs의 생성물인 것으로 추정된다. 상기 맥락에서 미접촉 베이즈 분류기 훈련은 부류 의존적 pdfs를 특성화하기 위한 파라미터 배정이 된다 ("파라미터화"). 부류-의존적 pdfs에 대한 임의의 기저 모델은 사용될 수 있지만, 그러나 그 모델은 훈련 세트에서 관측된 데이터에 일반적으로 순응해야 한다.
미접촉 베이즈 분류기의 성능은 분류기를 작제 및 훈련하기 위해 사용된 바이오마커의 수 및 품질에 의존적이다. 단일 바이오마커는 이의 KS-거리 (Kolmogorov-Smirnov)에 따라 수행할 것이다. 양호한 KS 거리 (>0.3, 예를 들어)를 갖는 후속의 바이오마커의 부가는, 일반적으로, 그 뒤에 부가된 바이오마커가 제1 바이오마커와 독립적이면 분류 성능을 개선할 것이다. 분류기 스코어로서 민감성 플러스 특이성을 이용하여, 많은 높은 평점 분류기는 탐욕 알고리즘의 변화와 함께 생성될 수 있다. (탐욕 알고리즘은 전역 최적을 찾을 희망으로 각각의 단계에서 국소로 최적 선택의 문제 해결 메타휴리스틱을 따르는 임의의 알고리즘이다).
분류기 성능을 묘사하는 또 다른 방식은 수신기 작동 특성　(ROC), 또는 단순　ROC 곡선 또는 ROC 도표를 통한다. 이의 분별값 역치가 가변됨에 따라 2원 분류기　시스템에 대하여, ROC는 민감성, 또는 진양성율 대 위양성율 (1 -　특이성　또는 1 - 진음성율)의 도표이다. ROC는 또한 양성들 중에 진양성의 분획 (TPR = 진양성율) 대 음성들 중에 위양성의 분획 (FPR = 위양성율)을 작도함으로써 동등하게 표지될 수 있다. 기준이 변화함에 따라 2개의 작동 특징 (TPR & FPR)의 비교이기 때문에, 상대적 작동 특성 곡선으로서 또한 공지된다. ROC 곡선 (AUC)하 영역은 진단 정확도의 요약 평가로서 통상적으로 사용된다. 0.0 내지 1.0의 값을 취할 수 있다. AUC는 중요한 통계적인 특성을 갖는다: 분류기의 AUC는 분류기가 무작위로 선택된 음성 사례보다 더 높은 무작위로 선택된 양성 사례를 등급을 매길 확률과 동등하다 (Fawcett T, 2006. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters .27: 861-874). 이는 등급의 윌콕슨 시험과 동등하다 (Hanley, J.A., McNeil, B.J., 1982. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve. Radiology 143, 29-36.). 공지된 참조 표준과 관련하여 진단 시험의 성능 기재의 또 다른 방식은 순 재분류 지수이다: 참조 표준 시험과 비교된 경우 위험을 정확하게 업그레이드 또는 다운그레이드하기 위한 신규 시험의 능력. 참고, 예를 들면, Pencina et al., 2011, Stat. Med. 30: 11-21. ROC 곡선하 AUC가 2-부류 분류기의 성능 평가에 최적인 반면, 계층화된 및 개인화된 의약은 집단이 2 보다 더 많은 클래스를 함유한다는 추론에 의존한다. 상기 비교를 위하여 상위 대 하위 4분위수 (또는 다른 계층화 예컨대 10분위수)의 위험 비율은 더욱 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명을 통해 가능해진 위험 예측은 1차 진료에서 또는 전문 심혈관 센터에서 개체에, 또는 소비자에 심지어 직접 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 사건을 예측하기 위해 사용된 분류기는 이들이 적용되는 - 예를 들어 인종 또는 지형 때문에 변화될 수 있는 집단에 일부 보정을 포함할 수 있다. 상기 보정은, 일부 구현예에서, 큰 집단 연구에서 미리 확립될 수 있고, 이로써 개별 환자에 적용된 경우 이들은 위험 예측에 앞서 편입된다. 정맥 혈액 샘플은 본원에서 기재된 바와 같이 선택되고, 적절하게 가공되고 분석된다. 분석이 완료되면, 위험 예측은 본원에서 기재된 예컨대 유전적 또는 인구통계학적 의료 기록으로부터 다른 메타데이터의 편입과 또는 편입 없이 수학적으로 작성될 수 있다. 정보의 다양한 형태의 출력은 소비자의 전문지식의 수준에 따라 가능하다. 출력의 최단순 유형을 찾는 소비자를 위하여 정보는, 일부 구현예에서, "이 사람이 다음 x 년 (여기에서 x는 1-4이다)에서 사건날 것 같은가, 예/아니오" 또는 대안적으로 "신호등" 적색/오렌지/녹색 또는 구두 또는 문서화된 등가물 예컨대 높은/중간/낮은 위험과 같을 수 있다. 더 큰 상세를 찾는 소비자를 위하여, 일부 구현예에서, 위험은 연속식 스코어로서 단위 시간 당 사건의 확률을 예증하는 그래픽 또는 수로서, 또는 계층의 더 큰 수 (예컨대 10분위수), 및/또는 사건에 대한 평균 시간 및/또는 사건의 가장 유사한 유형으로서 출력일 수 있다. 일부 구현예에서, 출력은 치료적 권고를 포함할 수 있다. 동일한 환자의 종축 모니터링은 경시적으로 개입에 대한 반응 또는 생활방식 변화를 보여주는 그래픽을 가능하게 할 것이다. 일부 구현예에서, 1 초과 유형의 출력은 상이한 수준의 전문지식을 가진 진료팀의 개별 구성원 및 환자의 요구를 이행하기 위해 동시에 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 표 3에서 보이는 9 바이오마커 ("CVD9 바이오마커")는 대상체로부터, 예를 들어, 앱타머, 예컨대 느린 오프-레이트 앱타머를 이용하여 혈액 샘플 (예컨대 혈장 샘플 또는 혈청 샘플)에서 검출된다. log RFU 값은 예후 지수 (PI)를 계산하기 위해 사용된다. 비제한 예시적 PI 식은 아래 보여진다:
Figure pct00001
여기에서 단백질 수준은 log10 RFU로 선택된다. 당해 분야의 숙련가는 PI 식이 대상체가 선택되는 집단에 따라 재-보정될 수 있음을 인식할 것이다. 상기 재보정은 본원에서 기재된 방법 및/또는 당해 기술에서 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
PI가 주어지면, 대상체가 다음 "t" 년에서 심혈관 사건 (CV 사건)를 겪을 확률이 하기 식으로 주어진다:
Figure pct00002
여기에서 PI는 예후 지수 (또는 선형 예측변수)이고 및 s는 극단적 값 분포에 대하여 관련된 척도 파라미터이다. 다양한 구현예에서, "t"는 5 년 이하, 4 년 이하, 3 년 이하, 또는 2 년 이하이다.
키트
본원에서 기재된 임의의 조합의 바이오마커는 적합한 키트를 사용하여, 예컨대 본원에서 개시된 방법의 수행에서 사용을 위하여 검출될 수 있다. 더욱이, 임의의 키트는 본원에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 검출가능한 표지, 예컨대 형광성 모이어티, 등을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 하기를 포함한다: (a) 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커를 검출하기 위한 하나 이상의 포착 시약 (예컨대, 예를 들어, 적어도 하나의 앱타머 또는 항체), 여기에서 바이오마커는 MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 9개 모두의 바이오마커를 포함한다, 및 임의로 (b) CV 사건의 증가된 위험을 갖거나 또는 갖지 않는 채로 생물학적 샘플이 수득된 개체를 분류하기 위한 또는, 추가로 본원에서 기재된 바와 같이, 개체가 CV 사건의 증가된 위험을 가질 확률을 측정하기 위한 하나 이상의 소프트웨어 또는 컴퓨터 프로그램 생성물. 대안적으로, 하나 이상의 컴퓨터 프로그램 생성물 보다는, 인간에 의해 상기 단계를 수작업으로 수행하기 위한 하나 이상의 설명이 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 고형 지지체, 포착 시약, 및 신호 발생 물질을 포함한다. 키트는 또한 장치 및 시약의 설명, 샘플의 취급, 및 데이터의 분석을 포함할 수 있다. 추가로 키트는 생물학적 샘플의 분석 결과를 분석 및 보고하기 위한 컴퓨터 시스템 또는 소프트웨어로 사용될 수 있다.
키트는 또한 생물학적 샘플의 가공을 위하여 하나 이상의 시약 (예를 들면, 가용화 버퍼, 세제, 세척액, 또는 버퍼)를 함유할 수 있다. 본원에서 기재된 임의의 키트는 또한, 예를 들면, 버퍼, 차단제, 질량 분광분석법 매트릭스 물질, 항체 포착 제제, 양성 대조군 샘플, 음성 대조군 샘플, 소프트웨어 및 정보 예컨대 프로토콜, 안내 및 참조 데이터를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서 키트는 CV 사건 위험 상태의 분석을 위하여 제공되고, 여기에서 키트는 본원에서 기재된 바이오마커에 특이적인 하나 이상의 앱타머용 PCR 프라이머를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 추가로 CV 사건의 위험 예측을 이용한 바이오마커의 상관관계 및 사용 지침을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 또한 본원에서 기재된 바이오마커에 특이적인 하나 이상의 앱타머의 보체, 시약, 및/또는 샘플 DNA 증폭 또는 단리용 효소를 함유한 DNA 배열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 실시간 PCR용 시약, 예를 들어, TaqMan 프로브 및/또는 프라이머, 및 효소를 포함할 수 있다.
예를 들어, 키트는 (a) 시험 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 적어도 하나의 포착 시약을 포함한 시약, 및 임의로 (b) 시험 샘플에서 정량화된 각각의 바이오마커 대 하나 이상의 예정된 컷오프의 양 비교 단계의 수행을 위한 하나 이상의 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램은 상기 비교에 기반하여 정량화된 각각의 바이오마커에 대하여 스코어를 배정하고, 일부 구현예에서, 총 스코어를 수득하기 위해 정량화된 각각의 바이오마커에 대하여 배정된 스코어를 조합한다. 추가로, 일부 구현예에서, 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램은 총 스코어를 예정된 스코어와 비교하고, 그 비교를 이용하여 개체가 CV 사건의 증가된 위험을 갖는지를 측정한다. 대안적으로, 하나 이상의 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램 보다는, 인간에 의해 상기 단계의 수작업으로 수행을 위하여 하나 이상의 설명이 제공될 수 있다.
컴퓨터 방법 및 소프트웨어
바이오마커 또는 바이오마커 패널이 선택되면, 개체의 진단 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 1) 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 2) 생물학적 샘플 내 패널에서 바이오마커 또는 바이오마커를 검출 및 측정하기 위한 분석적 방법을 수행하는 단계; 3) 임의의 데이터 정규화 또는 표준화를 임의로 수행하는 단계; 4) 각각의 바이오마커 수준을 측정하는 단계; 및 5) 결과를 보고하는 단계. 일부 구현예에서, 결과는 대상체의 집단 / 인종에 대해 보정된다. 일부 구현예에서, 바이오마커 수준은 일부 방식으로 조합되고 조합된 바이오마커 수준에 대한 단일 값이 보고된다. 상기 접근법에서, 일부 구현예에서, 스코어는 질환의 존재 또는 부재의 적응증인 사전-세트 역치 값과 비교된 모든 바이오마커의 통합으로부터 측정된 단일 수일 수 있다. 또는 진단적 또는 예측적 스코어는 각각이 바이오마커 값을 나타내는 일련의 바일 수 있고 반응의 패턴은 질환, 병태 또는 사건의 증가된 위험 (또는 없이)의 존재 또는 부재의 측정을 위하여 사전-세트 패턴과 비교될 수 있다.
본원에서 기재된 방법의 적어도 일부 구현예는 컴퓨터를 사용하여 시행될 수 있다. 컴퓨터 시스템 100의 예는 도 12에서 보여진다. 도 12를 참조로, 시스템 100은, 프로세서 101, 입력 장치 102, 출력 장치 103, 저장 장치 104, 컴퓨터-판독가능한 저장 매체 판독기 105a, 통신 시스템 106, 가공 가속 (예를 들면, DSP 또는 특수-목적 프로세서) 107 및 메모리 109를 포함하여, 버스 108을 통해 전기적으로 커플링되는 하드웨어 요소로 구성됨을 보여준다. 컴퓨터-판독가능한 저장 매체 판독기 105a는 컴퓨터-판독가능한 저장 매체 105b에 추가로 커플링되고, 조합은 포괄적으로, 저장 장치 104, 메모리 109 및/또는 임의의 다른 상기 접근가능한 시스템 100 자원을 포함할 수 있는, 컴퓨터-판독가능한 정보를 일시적으로 및/또는 더욱 영구적으로 함유하기 위한 원격, 국부, 고정된 및/또는 제거가능 저장 장치 플러스 저장 매체, 메모리, 등을 나타낸다. 시스템 100은 또한 작동 시스템 192 및 다른 코드 193, 예컨대 프로그램, 데이터 등등을 포함한 (작업 메모리 191 내에 현재 위치한 것으로 보여지는) 소프트웨어 요소를 포함한다.
도 12에 관해, 시스템 100은 광범위한 가요성 및 설정성을 갖는다. 따라서, 예를 들어, 단일 구조는 현재 바람직한 프로토콜, 프로토콜 변화, 확대, 등에 따라 추가로 구성될 수 있는 하나 이상의 서버를 실행하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 구현예가 더욱 특이적 적용 요건에 따라 양호하게 이용될 수 있음이 당해 분야의 숙련가에 명백할 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 시스템 요소는 시스템 100 성분 내에 (예를 들면, 통신 시스템 106 내에) 하위-요소로서 시행될 수 있다. 맞춤형 하드웨어는 또한 이용될 수 있고/있거나 특정한 요소는 하드웨어, 소프트웨어 또는 모두에서 시행될 수 있다. 추가로, 다른 컴퓨팅 장치 예컨대 네트워크 입력/출력 장치 (도시되지 않음)에 대한 연결이 이용될 수 있어도, 유선, 무선, 모뎀, 및/또는 다른 컴퓨팅 장치에 대한 다른 연결 또는 연결들이 또한 이용될 수 있음이 이해된다.
일 측면에서, 시스템은 CV 사건의 위험 예측의 바이오마커 특성의 특징을 함유한 데이터베이스를 포함할 수 있다. 바이오마커 데이터 (또는 바이오마커 정보)는 컴퓨터 시행 방법의 일부로서 사용을 위하여 컴퓨터에 대한 입력으로서 이용될 수 있다. 바이오마커 데이터는 본원에서 기재된 바와 같이 데이터를 포함할 수 있다.
일 측면에서, 시스템은 추가로 하나 이상의 프로세서에 입력 데이터 제공을 위하여 하나 이상의 장치를 포함한다.
시스템은 추가로 등급화된 데이터 요소의 데이터 세트 저장용 메모리를 포함한다.
또 다른 측면에서, 입력 데이터 제공용 장치는 데이터 요소, 예를 들면, 예컨대 질량 분광분석기 또는 유전자 칩 판독기의 특징 검출용 검출기를 포함한다.
시스템은 추가로 데이터베이스 관리 시스템을 포함할 수 있다. 사용자 리퀘스트 또는 쿼리는 훈련 세트의 데이터베이스로부터 관련된 정보를 추출하기 위해 쿼리를 처리하는 데이터베이스 관리 시스템에 의해 이해된 적절한 언어로 포멧될 수 있다.
시스템은 네트워크 서버 및 하나 이상의 클라이언트가 연결되는 네트워크에 연결가능할 수 있다. 네트워크는, 당해 기술에서 공지되어 있는 대로, 로컬 영역 네트워크 (LAN) 또는 광역 네트워크 (WAN)일 수 있다. 바람직하게는, 서버는 사용자 리퀘스트 가공용 데이터베이스 데이터에 접근하기 위해 컴퓨터 프로그램 생성물 (예를 들면, 소프트웨어) 운영에 필요한 하드웨어를 포함한다.
시스템은 데이터베이스 관리 시스템으로부터 설명 실행용 작동 시스템 (예를 들면, UNIX 또는 리눅스)을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 작동 시스템은 전면적인 통신 네트워크, 예컨대 인터넷 상에서 작동할 수 있고, 그와 같은 네트워크에 연결하기 위해 전면적인 통신 네트워크 서버를 이용할 수 있다.
시스템은 당해 기술에서 공지된 그래픽 사용자 인터페이스에서 일상적으로 발견된 대로 인터페이스 요소 예컨대 버튼, 풀다운 메뉴, 스크롤 바, 텍스트 입력용 필드를 포함한 그래픽 표지 인터페이스를 포함하는 하나 이상의 장치를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스 상에서 입력된 리퀘스트는 하나 이상의 시스템 데이터베이스에서 관련된 정보를 찾기 위해 포멧팅용 시스템에서 응용 프로그램에 전송될 수 있다. 사용자에 의해 입력된 리퀘스트 또는 쿼리는 임의의 적합한 데이터베이스 언어로 구성될 수 있다.
그래픽 사용자 인터페이스는 작동은 작동 시스템의 일부로서 그래픽 사용자 인터페이스 코드에 의해 생성될 수 있고 데이터를 입력하기 위해 및/또는 입력된 데이터를 표지하기 위해 사용될 수 있다. 가공된 데이터의 결과는 인터페이스에서 표지될 수 있고, 시스템과 통신에서 프린터에 인쇄될 수 있고, 메모리 장치에 저장될 수 있고, 및/또는 네트워크에 걸쳐 전송될 수 있거나 또는 컴퓨터 판독가능 매체의 형태로 제공될 수 있다.
시스템은 데이터 요소에 관한 데이터를 시스템 (예를 들면, 발현 값)에 제공하기 위해 입력 장치와 통신될 수 있다. 일 측면에서, 입력 장치는, 예를 들면, 질량 분광분석기, 유전자 칩 또는 배열 판독기, 등등을 포함한 유전자 발현 프로파일링 시스템을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에 따른 CV 사건 위험 예측 바이오마커 정보 분석용 방법 및 장치는 임의의 적합한 방식, 예를 들어, 컴퓨터 시스템 상에서 작동한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 시행될 수 있다. 프로세서 및 랜덤 액세스 메모리, 예컨대 원격으로-접근가능한 응용 서버, 네트워크 서버, 퍼스널 컴퓨터 또는 워크스테이션을 포함한 종래 컴퓨터 시스템이 사용될 수 있다. 추가의 컴퓨터 시스템 성분은 메모리 장치 또는 정보 저장 시스템, 예컨대 대용량 저장 시스템 및 사용자 인터페이스, 예를 들어 종래 모니터, 키보드 및 추적 장치를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 서버 및 하나 이상의 데이터베이스를 포함한 컴퓨터의 네트워크의 일부 또는 독립형 시스템일 수 있다.
CV 사건 위험 예측 바이오마커 분석 시스템은 데이터 분석, 예컨대 데이터 수집, 가공, 분석, 보고 및/또는 진단을 완료하기 위해 기능 및 연산을 제공할 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, 컴퓨터 시스템은 CV 사건 위험 예측 바이오마커에 관한 정보를 수신, 저장, 검사, 분석, 및 보고할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 시행할 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 다양한 기능 또는 연산을 수행한 다중 모듈, 예컨대 미가공 데이터 가공 및 보충의 데이터 생성용 가공 모듈 및 CV 사건 위험 예측 상태 및/또는 진단 또는 위험 계산을 생성하기 위한 미가공 데이터 및 보충의 데이터 분석용 분석 모듈을 포함할 수 있다. CV 사건에 대한 위험 상태의 계산은, 추가 시험이 바람직할 수 있는지 확인한, 또는 다르게는 개체의 건강 상황을 평가한, 질환, 병태 또는 사건에 비하여 개체의 병태에 관해, 추가의 생체의학 정보를 포함한, 임의의 다른 정보 생성 또는 수집을 임의로 포함할 수 있다.
본원에서 기재된 일부 구현예는 컴퓨터 프로그램 생성물을 포함하기 위해 시행될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 생성물은 데이터베이스로 컴퓨터 상에서 응용 프로그램을 시행하기 위한 매체에서 형체화된 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드를 갖는 컴퓨터 판독가능 매체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "컴퓨터 프로그램 생성물"은 임의의 성향 (예를 들면, 서면, 전자적, 자기, 광학적 또는 다르게는)의 물리적 매체 상에서 함유되는 및 컴퓨터 또는 다른 자동화 데이터 가공 시스템으로 사용될 수 있는 천연 또는 프로그래밍 언어 서술의 형태로 설명의 조직화된 세트를 지칭한다. 상기 프로그래밍 언어 서술은, 컴퓨터 또는 데이터 가공 시스템에 의해 실행된 경우, 서술의 특정한 내용에 따라 컴퓨터 또는 데이터 가공 시스템을 작동하게 한다. 컴퓨터 프로그램 생성물은 비제한적으로 하기를 포함한다: 공급원 및 목적 코드에서 프로그램 및/또는 컴퓨터 판독가능 매체에서 포매된 시험 또는 데이터 라이브러리. 더욱이, 사전-선택된 방식으로 컴퓨터 시스템 또는 데이터 가공 장비 장치를 작동시키는 컴퓨터 프로그램 생성물은, 비제한적으로, 최초 소스 코드, 어셈블리 코드, 목적 코드, 기계 언어, 전술의 암호화된 또는 압축된 버전 및 임의의 및 모든 등가물을 포함한, 수많은 형태로 제공될 수 있다.
일 측면에서, 컴퓨터 프로그램 생성물은 CV 사건의 위험 평가를 위하여 제공된다. 컴퓨터 프로그램 생성물은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 구현한 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하고, 프로그램 코드는 개체로부터 생물학적 샘플에 기인된 데이터를 회수하는 코드 (여기에서 데이터는 각각이 표 3에서 바이오마커 중 하나에 상응하는 바이오마커 수준을 포함한다); 및 바이오마커 값의 기능으로서 개체의 CV 사건 위험 상태를 나타내는 분류 방법을 시행하는 코드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 컴퓨터 프로그램 생성물은 CV 사건의 위험 확률을 나타내기 위해 제공된다. 컴퓨터 프로그램 생성물은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 구현한 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하고, 프로그램 코드는 개체로부터 생물학적 샘플에 기인된 데이터를 회수하는 코드 (여기에서 데이터는 표 3에서 제공된 바이오마커로부터 선택된 생물학적 샘플에서 바이오마커에 상응하는 바이오마커 값을 포함한다); 및 바이오마커 값의 기능으로서 개체의 CV 사건 위험 상태를 나타내는 분류 방법을 시행하는 코드를 포함한다.
다양한 구현예가 방법 또는 장치로서 기재되어도, 구현예가 컴퓨터와 커플링된 코드, 예를 들면, 컴퓨터 상에서 상주하는 또는 컴퓨터에 의해 접근가능한 코드를 통해 시행될 수 있다. 예를 들어, 소프트웨어 및 데이터베이스는 상기 논의된 많은 방법을 시행하기 위해 이용될 수 있다. 하드웨어에 의해 달성된 구현예에 더하여, 이들 구현예가 그안에 형체화된 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드를 갖는 컴퓨터 사용가능한 매체로 구성된 제조 물품의 사용을 통해 달성될 수 있음이 또한 주목되고, 이는 상기 설명에 개시된 기능의 가능화를 유발한다. 따라서, 구현예가 또한 이의 프로그램 코드 수단에서 역시 본 특허에 의해 보호되도록 여겨지는 것이 요망된다. 더욱이, 구현예는, 비제한적으로, RAM, ROM, 자기 매체, 광학적 매체, 또는 자기-광학적 매체를 포함한 사실상 임의의 종류의 컴퓨터-판독가능한 메모리에 저장된 코드로서 형체화될 수 있다. 더욱더 일반적으로, 구현예는, 비제한적으로, 일반적인 목적 프로세서, 마이크로코드, 프로그래밍가능한 논리 배열 (PLAs), 또는 용도-특이적 집적회로 (ASICs) 상에서 실행한 소프트웨어를 포함하여 소프트웨어에서, 또는 하드웨어에서, 또는 이의 임의의 조합에서 시행될 수 있다.
구현예가 반송파, 뿐만 아니라 전파 매체를 통해 전파된 신호 (예를 들면, 전기적 및 광학적)로 형체화된 컴퓨터 신호로서 달성될 수 있음이 또한 구상된다. 따라서, 상기 논의된 정보의 다양한 유형은 구조, 예컨대 데이터 구조에서 포멧화될 수 있고, 전파 매체를 통해 전기적 신호로서 전송 또는 컴퓨터 판독가능 매체 상에서 저장될 수 있다.
본원에서 인용된 많은 구조, 물질, 및 행위가 기능 수행용 수단 또는 기능 수행용 단계로서 인용될 수 있음이 또한 주목된다. 따라서, 상기 언어가, 참고로 편입된 물질을 포함하여, 본 명세서 내에 개시된 모든 상기 구조, 물질, 또는 행위 및 이의 등가물을 포함하기 위해 지칭되는 것으로 이해되어야 한다.
바이오마커 확인 방법, 본원에서 개시된 바이오마커의 이용, 및 바이오마커 값 측정을 위한 다양한 방법이 CV 사건의 위험 평가에 관해 상기 상세히 기재된다. 그러나, 그 방법의 적용, 확인된 바이오마커의 이용, 및 바이오마커 값 측정 방법은 심혈관 병태의 다른 특이적 유형에, 임의의 다른 질환 또는 의료 병태에, 또는 보조적인 의료 처치에 의해 유익해질 수 있거나 아닐 수 있는 개체의 확인에 완전히 적용가능하다.
다른 방법
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바이오마커 및 방법은 의료보험 수가 또는 적용범위 결정 및/또는 생명보험 수가 또는 적용범위 결정을 결정하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 방법의 결과는 의료보험 수가 및/또는 생명보험 수가를 결정하기 위해 사용된다. 일부 상기 사례에서, 의료 보험 또는 생명 보험을 제공하는 기관은 CV 사건의 대상체의 위험에 관한 정보를 요청하거나 또는 다르게는 수득하고 대상체에 대하여 적절한 의료보험 수가 또는 생명보험 수가를 결정하기 위해 그 정보를 사용한다. 일부 구현예에서, 의료 보험 또는 생명 보험을 제공하는 기관에 의해 시험이 요청되고, 지불된다. 일부 구현예에서, 취득이 진행되면 추가로 부채 또는 비용을 예측하기 위해 실무 또는 건강 시스템 또는 회사의 잠재적 취득자에 의해 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바이오마커 및 방법은 의료 자원의 이용을 예측 및/또는 관리하기 위해 사용된다. 일부 상기 구현예에서, 방법은 상기 예측의 목적을 위하여 수행되지 않지만, 그러나 상기 방법으로부터 수득된 정보는 의료 자원의 이용의 그와 같은 예측 및/또는 관리에서 사용된다. 예를 들어, 시험 시설 또는 병원은 특정한 시설 또는 특정한 지리학적 지역에서 의료 자원의 이용을 예측 및/또는 관리하기 위해 많은 대상체에 대하여 본 방법으로부터 정보를 모을 수 있다.
실시예
하기 실시예는 단지 설명하기 위해 제공되고 첨부된 청구항에 의해 한정된 바와 같이 적용의 범위를 제한할 의도는 아니다. 하기 실시예에 기재된 일상적인 분자 생물학 기술은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 하기에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001).
실시예 1: 앱타머를 이용한 예시적 바이오마커 검출
샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 예시적 검출 방법은, 예를 들면, Kraemer et al., PLoS One 6(10): e26332에 기재되고, 아래 기재된다. 3개의 상이한 정량화 방법: 마이크로어레이-기반 하이브리드화, 루미넥스 비드-기반 방법, 및 qPCR이 기재된다.
시약
HEPES, NaCl, KCl, EDTA, EGTA, MgCl2 및 Tween-20은, 예를 들면, Fisher Biosciences로부터 구매될 수 있다. 덱스트란 설페이트 나트륨 염 (DxSO4), 명목상으로 8000 분자량은, 예를 들면, AIC로부터 구매될 수 있고 1회 교환으로 적어도 20 시간 동안 탈이온수에 대해 투석된다. KOD EX DNA 폴리머라제는, 예를 들면, VWR로부터 구매될 수 있다. 테트라메틸염화암모늄 및 CAPSO는, 예를 들면, Sigma-Aldrich로부터 구매될 수 있고 스트렙타비딘-파이코에리트린 (SAPE)은, 예를 들면, Moss Inc.로부터 구매될 수 있다. 4-(2-아미노에틸)-벤젠설포닐플루오라이드 하이드로클로라이드 (AEBSF)는, 예를 들면, Gold Biotechnology로부터 구매될 수 있다. 스트렙타비딘-코팅된 96-웰 플레이트는, 예를 들면, Thermo Scientific (Pierce Streptavidin Coated Plates HBC, 투명, 96-월, 제품 번호 15500 또는 15501)로부터 구매될 수 있다. NHS-PEO4-바이오틴은, 예를 들면, Thermo Scientific (EZ-Link NHS-PEO4-Biotin, 제품 번호 21329)로부터 구매될 수 있고, 무수 DMSO에서 용해될 수 있고, 단일-사용 분액에서 냉동 보관될 수 있다. IL-8, MIP-4, 리포칼린-2, RANTES, MMP-7, 및 MMP-9는, 예를 들면, R&D Systems로부터 구매될 수 있다. 레지스틴 및 MCP-1은, 예를 들면, PeproTech으로부터 구매될 수 있고, tPA는, 예를 들면, VWR로부터 구매될 수 있다.
핵산
종래 (아민- 및 바이오틴-치환된 포함) 올리고데옥시뉴클레오티드는, 예를 들면, Integrated DNA Technologies (IDT)로부터 구매될 수 있다. Z-블록은 서열 5'-(AC-BnBn)7-AC-3'의 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오티드이고, 여기에서 Bn은 벤질-치환된 데옥시우리딘 잔기를 나타낸다. Z-블록은 종래 포스포르아미다이트 화학을 이용하여 합성될 수 있다. 앱타머 포착 시약은 또한 종래 포스포르아미다이트 화학으로 합성될 수 있고, 그리고, 예를 들어, 팀버라인 TL-600 또는 TL-150 가열기 및 생성물을 용리하기 위해 트리에틸암모늄 바이카보네이트 (TEAB) / ACN의 구배를 이용하여, Waters Autopurification 2767 시스템 (또는 Waters 600 시리즈 세미-자동화 시스템) 상에 80℃에서 작동하는, 예를 들어, 21.5×75 mm PRP-3 칼럼 상에서 정제될 수 있다. 검출은 260 nm에서 수행되고 분획은 풀링 최고 분획에 앞서 주요 피크를 거쳐 수집된다.
버퍼
버퍼 SB18은 NaOH로 pH 7.5까지 조정된 40 mM HEPES, 101 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 및 0.05% (v/v) Tween 20으로 구성된다. 버퍼 SB17은 1 mM 삼나트륨 EDTA로 보강된 SB18이다. 버퍼 PB1은 NaOH로 pH 7.5까지 조정된 10 mM HEPES, 101 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM 삼나트륨 EDTA 및 0.05% (v/v) Tween-20으로 구성된다. CAPSO 용출 버퍼는 100 mM CAPSO pH 10.0 및 1 M NaCl로 이루어진다. 중화 버퍼는 500 mM HEPES, 500 mM HCl, 및 0.05% (v/v) Tween-20을 함유한다. 애질런트 하이브리드화 버퍼는 키트 (Oligo aCGH/ChIP-온-칩 하이브리드화 키트)의 일부로서 공급되는 전매 제형이다. 애질런트 세척 버퍼 1은 전매 제형 (Oligo aCGH/ChIP-온-칩 세척 버퍼 1, Agilent)이다. 애질런트 세척 버퍼 2는 전매 제형 (Oligo aCGH/ChIP-온-칩 세척 버퍼 2, Agilent)이다. TMAC 하이브리드화 용액은 4.5 M 테트라메틸염화암모늄, 6 mM 삼나트륨 EDTA, 75 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 및 0.15% (v/v) 사르코실로 이루어진다. (10-배 농축된) KOD 버퍼는 1200 mM 트리스-HCl, 15 mM MgSO4, 100 mM KCl, 60 mM (NH4)2SO4, 1% v/v 트리톤-X 100 및 1 mg/mL BSA로 이루어진다.
샘플 제조
(100 μL 분액내 -80℃에서 보관된) 혈청은 10 분 동안 25℃ 수조에서 해동되고, 그 다음 샘플 희석에 앞서 얼음에 보관된다. 샘플은 8 초 동안 부드러운 와동에 의해 혼합된다. 6% 혈청 샘플 용액은 0.6 mM MgCl2, 1 mM 삼나트륨 EGTA, 0.8 mM AEBSF, 및 2 μM Z-블록으로 보강된 0.94× SB17에 희석에 의해 제조된다. 6% 혈청 원액의 부분은 SB17에서 10-배 희석되어 0.6% 혈청 원료를 창제한다. 6% 및 0.6% 원료는 사용되어, 일부 구현예에서, 높은- 및 낮은-존재도 분석물을, 각각 검출한다.
포착 시약 ( 앱타머 ) 및 스트렙타비딘 플레이트 제조
앱타머는 이의 동족 분석물 (또는 바이오마커)의 상대 존재비에 따라 2개 혼합물로 그룹화된다. 모액 농도는 각각의 앱타머에 대하여 4 nM이고, 각 앱타머의 최종 농도는 0.5 nM이다. 앱타머 원료 혼합물은 SB17 버퍼에서 4-배 희석되고, 5분 동안 95℃까지 가열되고 사용에 앞서 15 분 기간에 걸쳐 37℃로 냉각된다. 상기 변성-복원 사이클은 앱타머 이형태체 분포를 정규화할 의도이고 따라서 가변형 이력에도 불구하고 재생가능한 앱타머 활성을 보장할 의도이다. 스트렙타비딘 플레이트는 사용에 앞서 150 μL 버퍼 PB1로 2회 세정된다.
평형 및 플레이트 포착
열-냉각된 2× 앱타머 혼합물 (55 μL)은 6% 또는 0.6% 혈청 희석액의 동등 용적과 조합되고, 3% 및 0.3% 혈청을 함유한 평형 혼합물을 생성한다. 플레이트는 Silicone Sealing Mat (Axymat Silicone sealing mat, VWR)로 밀봉되고 1.5시간 동안 37℃에서 인큐베이션된다. 평형 혼합물은 그 다음 세정된 96-웰 스트렙타비딘 플레이트의 웰들로 이동되고 추가로 2 시간 동안 800 rpm으로 교반하면서 37℃에서 Eppendorf Thermomixer 세트 상에서 인큐베이션된다.
매뉴얼 검정
다르게 구체화되지 않는 한, 액체는 투기, 그 다음 층상 종이 타월에 2회 두드림에 의해 제거된다. 세척 용적이 150 μL이고 모든 교반 인큐베이션이 25℃, 800 rpm에서 Eppendorf Thermomixer 세트 상에서 실시된다. 평형 혼합물은 피펫팅에 의해 제거되고, 플레이트는 1 mM 덱스트란 설페이트 및 500 μM 바이오틴으로 보강된 버퍼 PB1로 1 분 동안 2회, 그 다음 버퍼 PB1로 15 초 동안 4회 세정된다. 버퍼 PB1 (150 μL/웰)내 1 mM NHS-PEO4-바이오틴의 새롭게 제조된 용액은 부가되고, 플레이트는 교반하면서 5 분 동안 인큐베이션된다. NHS-바이오틴 용액은 제거되고, 플레이트는 20 mM 글리신으로 보강된 버퍼 PB1로 3회, 및 버퍼 PB1로 3회 세정된다. 1 mM DxSO4로 보강된 85 μL의 버퍼 PB1은 그 다음 각각의 웰에 부가되고, 플레이트는 교반하면서 20 분 동안 5 cm의 거리에서 BlackRay UV 램프 (명목 파장 365 nm)하에서 조사된다. 샘플은 신선한, 세정된 스트렙타비딘-코팅된 플레이트, 또는 현존하는 세정된 스트렙타비딘 플레이트의 미사용된 웰에 이동되어, 높은 및 낮은 샘플 희석 혼합물을 단일 웰 속으로 조합한다. 샘플은 10 분 동안 교반하면서 실온에서 인큐베이션된다. 미흡착된 물질은 제거되고 플레이트는 30% 글리세롤로 보강된 버퍼 PB1로 각각 15 초 동안 8회 세정된다. 플레이트는 그 다음 버퍼 PB1로 1회 세정된다. 앱타머는 100 μL CAPSO 용출 버퍼로 실온에서 5 분 동안 용출된다. 90 μL의 용출액은 96-웰 HybAid 플레이트에 이동되고 10 μL 중화 버퍼는 부가된다.
세미-자동화 검정
흡착된 평형 혼합물을 보유한 스트렙타비딘 플레이트는 BioTek EL406 플레이트 세척기의 데크에 배치되고, 하기 단계를 수행하도록 프로그래밍된다: 미흡착된 물질이 흡인에 의해 제거되고, 웰들은 1 mM 덱스트란 설페이트 및 500 μM 바이오틴으로 보강된 300 μL의 버퍼 PB1로 4회 세정된다. 웰들은 그 다음 300 μL 버퍼 PB1로 3회 세정된다. 버퍼 PB1내 1 mM NHS-PEO4-바이오틴의 (DMSO내 100 mM 원료로부터) 새롭게 제조된 용액 150 μL가 부가된다. 플레이트는 교반하면서 5 분 동안 인큐베이션된다. 액체는 흡인되고, 웰들은 10 mM 글리신으로 보강된 300 μL 버퍼 PB1로 8회 세정된다. 1 mM 덱스트란 설페이트로 보강된 100 μL의 버퍼 PB1이 부가된다. 이들 자동화 단계 이후, 플레이트는 플레이트 세척기로부터 제거되고 20 분 동안 5 cm의 거리에서 UV 광원 (BlackRay, 명목 파장 365 nm) 하에 실장된 가열교반기 상에 두었다. 가열교반기는 800 rpm 및 25℃에서 설정된다. 20 분 조사 후, 샘플은 신선한, 세정된 스트렙타비딘 플레이트에 (또는 현존하는 세정된 플레이트의 미사용된 웰에) 수작업으로 이동된다. 높은-존재도 (3% 혈청+3% 앱타머 혼합물) 및 낮은-존재도 반응 혼합물 (0.3% 혈청+0.3% 앱타머 혼합물)은 이 시점에서 단일 웰 속으로 조합된다. 상기 "Catch-2" 플레이트는 BioTek EL406 플레이트 세척기의 데크에 배치되고, 하기 단계를 수행하도록 프로그래밍된다: 플레이트는 교반하면서 10 분 동안 인큐베이션된다. 액체는 흡인되고, 웰들은 30% 글리세롤로 보강된 300 μL 버퍼 PB1로 21회 세정된다. 웰들은 300 μL 버퍼 PB1로 5회 세정되고, 최종 세정은 흡인된다. 100 μL CAPSO 용출 버퍼는 부가되고, 앱타머는 교반하면서 5 분 동안 용출된다. 이들 자동화 단계 이후, 플레이트는 그 다음 플레이트 세척기의 데크로부터 제거되고, 90 μL 분액의 샘플은 10 μL 중화 버퍼를 함유하는 HybAid 96-웰 플레이트의 웰들에 수작업으로 이동된다.
맞춤 Agilent 8×15k 마이크로어레이에 대한 하이브리드화
24 μL의 중화된 용출액은 신규 96-웰 플레이트에 이동되고 10 Cy3 앱타머로 구성된 하이브리드화 대조군의 세트를 함유한, 6 μL의 10× Agilent 블록 (Oligo aCGH/ChIP-온-칩 하이브리드화 키트, 대 용적, Agilent 5188-5380)은 각 웰에 부가된다. 30 μL 2× Agilent 하이브리드화 버퍼는 각각의 샘플에 부가되고 혼합된다. 40 μL의 수득한 하이브리드화 용액은 하이브리드화 가스킷 슬라이드 (Hybridization Gasket Slide, 슬라이드 포멧 당 8-마이크로어레이, Agilent)의 각 "웰" 속으로 수작업으로 피펫팅된다. 각 앱타머의 40 뉴클레오티드 랜덤 영역에 상보적인 배열 당 10 프로브를 20× dT 링커와 함께 보유한 맞춤 Agilent 마이크로어레이 슬라이드는 제조자 프로토콜에 따라 가스킷 슬라이드 상에 배치된다. 어셈블리 (하이브리드화 챔버 키트 - SureHyb-가능해진, Agilent)는 고정되고 20 rpm에서 회전하면서 60℃에서 19시간 동안 인큐베이션된다.
후 하이브리드화 세척
대략 400 mL Agilent 세정 버퍼 1은 각각의 2개의 별개의 유리 염색 접시에 배치된다. 슬라이드 (한번에 2개 이하)는 분해되고 세정 버퍼 1 에 잠겨진 동안 분리되고, 그 다음 또한 세정 버퍼 1을 함유한 제2 염색 접시내 슬라이드 선반에 이동된다. 슬라이드는 교반하면서 세정 버퍼 1에서 추가의 5 분 동안 인큐베이션된다. 슬라이드는 37℃까지 사전-평형화된 세정 버퍼 2에 이동되고 교반하면서 5 분 동안 인큐베이션된다. 슬라이드는 아세토니트릴을 함유한 제4 염색 접시에 이동되고, 교반하면서 5 분 동안 인큐베이션된다.
마이크로어레이 영상화
마이크로어레이 슬라이드는, 100% PMT 셋팅에서 5 μm 해상도로 Cy3-채널을 이용하여, Agilent G2565CA 마이크로어레이 스캐너 시스템으로 영상화되고, XRD 옵션은 0.05에서 가능하였다. 수득한 TIFF 이미지는 the GE1_105_Dec08 프로토콜을 갖춘 Agilent 특징 추출 소프트웨어 버전 10.5.1.1을 이용하여 가공된다.
Luminex 프로브 설계
비드에 고정된 프로브는 표적 앱타머의 40 뉴클레오티드 랜덤 영역의 3' 말단에 상보적인 40 데옥시뉴클레오티드를 갖는다. 앱타머 상보적 영역은 5' 아미노 말단을 보유한 헥사에틸렌글리콜 (HEG) 링커를 통해 Luminex 마이크로구형체에 커플링된다. 바이오티닐화된 검출 데옥시올리고뉴클레오티드는 표적 앱타머의 5' 프라이머 영역에 상보적인 17-21 데옥시뉴클레오티드를 포함한다. 바이오틴 모이어티는 검출 올리고의 3' 말단에 첨부된다.
Luminex 마이크로구형체에 대한 프로브의 커플링
프로브는 본질적으로 제조자의 설명에 따라, 그러나 하기 변형을 갖는 Luminex Microplex 마이크로구형체에 커플링된다: 아미노-말단 올리고뉴클레오티드 양은 2.5×106 마이크로구형체 당 0.08 nMol이고, 제2 EDC 부가는 10 mg/mL에서 5 μL이다. 커플링 반응은 25℃ 및 600 rpm에서 Eppendorf ThermoShaker 세트에서 수행된다.
마이크로구형체 하이브리드화
마이크로구형체 원액 (약 40000 마이크로구형체/μL)은 마이크로구형체를 현탁하기 위해 60 초 동안 Health Sonics 초음파 클리너 (모델: T1.9C)에서 와동 및 초음파처리된다. 현탁된 마이크로구형체는 1.5× TMAC 하이브리드화 용액에서 반응 당 2000 마이크로구형체로 희석되고 와동 및 초음파처리로 혼합된다. 비드 혼합물의 반응 당 33 μL는 96-웰 HybAid 플레이트에 이동된다. 1× TE 버퍼내 7 μL의 15 nM 바이오티닐화된 검출 올리고뉴클레오티드 원료는 각각의 반응에 부가되고 혼합된다. 10 μL의 중화된 검정 샘플은 부가되고 플레이트는 실리콘 캡 매트 시일로 밀봉된다. 플레이트는 5 분 동안 96℃에서 먼저 인큐베이션되고 종래 하이브리드화 오븐에서 밤새 교반 없이 50℃에서 인큐베이션된다. 필터 플레이트 (Dura pore, 밀리포어 파트 수 MSBVN1250, 1.2 μm 기공 크기)는 0.5% (w/v) BSA로 보강된 75 μL 1× TMAC 하이브리드화 용액으로 사전습성화된다. 하이브리드화 반응으로부터 전체 샘플 용적은 필터 플레이트에 이동된다. 하이브리드화 플레이트는 0.5% BSA를 함유한 75 μL 1× TMAC 하이브리드화 용액으로 린스되고 임의의 잔류 물질은 필터 플레이트에 이동된다. 샘플은, 약 8 초에 걸쳐 진공처리된 150 μL 버퍼로, 느린 진공 하에서 여과된다. 필터 플레이트는 0.5% BSA를 함유한 75 μL 1× TMAC 하이브리드화 용액으로 1회 세정되고 필터 플레이트내 마이크로구형체는 0.5% BSA를 함유한 75 μL 1× TMAC 하이브리드화 용액에서 재현탁된다. 필터 플레이트는 광으로부터 보호되고 1000 rpm에서 5 분 동안 Eppendorf Thermalmixer R 상에서 인큐베이션된다. 필터 플레이트는 그 다음 0.5% BSA를 함유한 75 μL 1× TMAC 하이브리드화 용액으로 1회 세정된다. 1× TMAC 하이브리드화 용액내 75 μL의 10 μg/mL 스트렙타비딘 파이코에리트린 (SAPE-100, MOSS, Inc.)은 각각의 반응에 부가되고 60 분 동안 1000 rpm으로 25℃에서 Eppendorf Thermalmixer R 상에서 인큐베이션된다. 필터 플레이트는 0.5% BSA를 함유한 75 μL 1× TMAC 하이브리드화 용액으로 2회 세정되고 필터 플레이트내 마이크로구형체는 0.5% BSA를 함유한 75 μL 1× TMAC 하이브리드화 용액에서 재현탁된다. 필터 플레이트는 그 다음 5 분 동안 1000 rpm으로 Eppendorf Thermalmixer R 상에서 광으로부터 보호된 인큐베이션된다. 필터 플레이트는 그 다음 0.5% BSA를 함유한 75 μL 1× TMAC 하이브리드화 용액으로 1회 세정된다. 마이크로구형체는 0.5% BSA로 보강된 75 μL 1× TMAC 하이브리드화 용액에서 재현탁되고, XPonent 3.0 소프트웨어로 운영하는 Luminex 100 기기 상에서 분석된다. 적어도 100 마이크로구형체는, 높은 PMT 보정 및 7500 내지 18000의 이중항 변별기 셋팅 하에서, 비드 유형 당 카운트된다.
QPCR 판독
qPCR용 표준 곡선은 10-배 희석액 및 무-템플레이트 대조군을 이용하여 108 내지 102 복사 범위의 물에서 제조된다. 중화된 검정 샘플은 diH2O 속으로 40-배 희석된다. qPCR 마스터 혼합물은 2× 최종 농도 (2× KOD 버퍼, 400 μM dNTP 혼합물, 400 nM 정방향 및 역방향 프라이머 혼합물, 2× SYBR 녹색 I 및 0.5 U KOD EX)에서 제조된다. 10 μL의 2× qPCR 마스터 혼합물은 10 μL의 희석된 검정 샘플에 부가된다. qPCR은 BioRad MyIQ iCycler 상에서 96℃에서 2 분으로 그 다음 5 초 동안 96℃ 및 30 초 동안 72℃의 40 사이클로 운영된다.
실시예 2. 방법
연구 설계 및 샘플 수집
안정한 CHD로 대상체로부터 달성된 혈장 샘플은 2개의 공지된, 독립적인 집단 연구로부터 수득되었다. 연구 집단의 특징은 표 1에서 보여진다. 10 년의 이어진 후속조치와 함께, Heart and Soul 연구로부터 938 혈장 샘플에서 단백질 바이오마커 발견 및 모델 혼련을 수행하였다. 참고, 예를 들면, Shlipak et al., Am J Med. 2008;121:50-57; Whooley et al., JAMA. 2008;300:2379-2388. 5 년의 후속조치와 함께 HUNT3, 노르웨이 전향 집단 연구로부터 971 샘플 상에서 모델을 입증하였다. 참고 Krokstad et al., Int J Epidemiol. 2013;42:968-977. 상기 분석을 위하여 더 큰 HUNT3 집단으로부터 안정한 CHD를 갖는 모든 참가자를 선택하기 위해 Heart and Soul 포함 및 배제 기준을 사용하였다. 발견 혈장 샘플은 양호하게-제어된 학계 전향 연구의 대표이었다: 대상체는 단식되었고, 샘플은 동일자로 수집되었고 수집의 시간내에 -80℃에서 원심분리 및 냉동되었다. 그에 반해서, HUNT3 검증 세트에서 샘플 수집은 유망한 "현실 세계" 조건의 대표이었고; 대상체는 단식되지 않았고, 다양한 일시에서 보여졌고, 혈장은 샘플이 4℃에서 잔류하는 최대 24h 동안 세포로부터 분리되지 않았다. 이런 식으로 모델 성능 평가는 임상 샘플의 실제적 수집과 관련된 요소에 대한 모델의 강건성, 바이오마커 검증의 중요한 고려사항을 확인하게 한다. 참고 McShane et al., Nature. 2013;502:317-320. 모든 연구는 관련 임상연구심의위원회에 의해 승인되었다.
표 1: 연구 집단 특징
발견 (Heart and Soul) 검증 (HUNT3)
샘플 출처 샌프란시스코만 지역내 12 외래환자 병상에서 유망 UCSF-계집단 연구 50,807 참가자에서 노르웨이 유망 집단 연구로부터 1017 환자의 주거 집단
기입 특징 안정한 관상동맥성 심장 질환은 이전 MI, 혈관조영술에 관한 >50% 협착증, 운동 유발 허혈, 이전 혈관재생에 의해 진단한다 운동 데이터가 이용불가능한 것을 제외하고, 모든 대상체는 Heart and Soul 집단에 관한 동일 특징으로 선택된, 안정한 관상동맥성 심장 질환을 가졌다.
샘플 가공 수집일: 2000-2002
단식
고정 시간의 일
EDTA 혈장
전형적으로 세포로부터 분리에
대한 시간 <1 hr
-80oC에서 저장		 수집일: 2006-2008
비 단식
무작위 시간의 일
EDTA 혈장
세포로부터 분리에 대한 시간
최대 24h, 4 oC에서 샘플 유지됨
-80oC에서 저장
사건 및 사건 판결 복합 사건 종점은 하기의 시초로서 정의하였다: 임의 원인으로 사망; 심근경색용 입원; 뇌졸중 또는 일과성 뇌허혈 발작; 심부전의 징후 및 증상용 입원. 각각의 사건은 2명의 독립된 맹목적 검토자에 의해 판결되었다. 불일치의 사건에서, 판결자는 상의하였고, 그들의 분류를 재고하였고, 필요하면, 제3 맹목적 판결자로부터 협의를 요청하였다. 사건 정의는 숙련된 심장전문의에 의해 의료 기록 검토로부터 판결된, 발견용에서와 동일하다
후속조치 시간 마지막 후속조치의 시기: 11.09년
중위 (IQR) 후속조치 시간: 7.9 (5.5) 년		 마지막 후속조치의 시기: 5.57 년

중위 (IQR) 후속조치 시간: 4.3(1.0) 년
맹목적 실험실 기사는 임상 특징 및 결
과에 맹목적이었다. 결과 판결은
단백체 결과에 맹목적이었다. 		실험실 기사는 임상 특징 및 결
과에 맹목적이었다. 결과 판결은
단백체 결과에 맹목적이었다.
모델 적용 확인된 바이오마커, 훈련된 모델, 적용된 모델 확인된 바이오마커 없음, 훈련된
모델 없음, 단지 Heart and Soul-훈련된 모델 적용됨
소마스캔 ( SOMAscan ) 단백체 검정
단백질 검정에서 사용된 개체 친화도 시약은 이의 단백질 표적에 대하여 매우 높은 친화도를 갖는 느린 오프-레이트 변형된 DNA 앱타머 (소마머)이다. 참고 Vaught et al., J Am Chem Soc. 2010;132:4141-4151. 앱타머에서 DNA 염기에 대한 화학 변형은 이의 결합 특징을 향상시킨다. 참고 Davies et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:19971-19976. SOMAscan™ 멀티플렉스 검정 8-10에서 이들 시약의 1130 개를 사용하였다. 간단히 말해서, 96 웰 플레이트의 각 웰에서 혈장의 샘플은 이의 표적 단백질에 결합하는 소마머의 혼합물과 인큐베이션된다. 2개의 비드-기반 고정화 단계는 미결합된 또는 비-특이적으로 결합된 단백질의 제거 및 미결합된 소마머의 제거를 가능하게 한다. 최초 샘플에서 단백질 농도에 정량적으로 비례하는 각각의 수로, 표적-단백질-결합된 시약만이 검정을 견딘다. 각 시약에서 DNA는 Agilent 하이브리드화 배열 상에서 정량화되고, 샘플은 정규화 및 보정되어 이로써 배열의 스팟 상에서 형광의 정도는 특이적 단백질의 농도에 관련한다. 품질 대조군을 통과한 1054 단백질은 인트라-검정 및 인터-검정 변동 계수 <5%를 가졌다. 참고 Gold et al., PLoS One. 2010;5:e15004.
소마스캔 ( SOMAscan ) 검정 및 데이터
혈장 샘플은 32 별도 검정 운전에서 3 작업 주의 기간에 걸쳐 분석되었다. 연구 샘플은 보정 및 대조군 샘플의 세트와 함께 검정 운전에 무작위로 배정되었다. 검정을 작동하는 실험실 기술자에 이용가능한 정보 확인은 없었다.
인트라-운전 정규화 및 인터-운전 보정은 SomaLogic 우수 실험실 관리기준 (GLP) 품질 시스템에서 한정된 바와 같이 소마스캔(SOMAscan) 버전 3 검정 데이터 품질 대조군 (QC) 절차에 따라 수행되었다. 인터-운전 보정은 연속적 검정 운전 사이에서 "배치 효과"를 제거하기 위해 설계되고 반면에 인트라-운전 정규화는 각 운전 내에 샘플 사이에서 단백질 농도에서 벌크 변화 (및 따라서 신호 세기)를 제거한다.
간단히, 인터-운전 보정은 각각의 단백질에 대하여 신호 수준을 평가하여 이로써 운전 보정 표준에서 관측된 수준이 외부 보정 참조에 의해 나타내는 예상된 수준과 일치한다. QC 내성은 외부 참조에 의해 생성된 신호 수준에 대해 복제 보정 표준 상에서 중앙 신호 수준을 일치시키기 위해 요구된 승법식 스케일링의 규모에 관하여 한정된다.
인트라-운전 정규화는 샘플에서 총 단백질 농도를 변화하는 차별적인 하이브리드화 효율 또는 차별적인 샘플 희석 (또는 다른 수집 프로토콜 인공물)에서 비롯될 수 있는 "벌크" 신호 세기 바이어스에 대하여 제어한다. 전자 효과는 각 샘플에 대하여 하이브리드화 반응을 모니터하기 위해 사용된 대조군의 세트에 의해 포착되고 후자는 각 샘플에서 중앙 신호 수준 대 운전 내에 모든 샘플에 걸쳐 중앙 신호 수준의 비의 중앙을 이용한다. 샘플 수집 프로토콜에서 차이가 다수의 단백질에 대하여 신호 수준에서 체계적인 세기 바이어스를 생성하는 것이 흔하다. 도 1은 1130 단백질이 샘플 희석에 의해 그룹화된 경우 2개 집단에서 승법식 스케일 요소의 박스 도표를 보여준다. 40% 및 1% 샘플 희석에서 측정된 단백질은 1 보다 더 작은(더 큰) 상응하는 정규화 규모 요소를 초래한 검증(발견) 세트에서 체계적으로 더 높은(더 낮은) 신호 수준을 가졌다. 정규화 절차 이후 3 희석의 각각에서 단백질에 대한 중앙 신호 수준은 발견 및 검증 세트에서 동일하다.
단백질 수준은 상대적 형광 단위 (RFU)로 보고되고 후속의 분석에 앞서 log 형질전환되었다.
분석으로부터 제외된 샘플 및 단백질
관련된 인터-운전 보정 품질 대조군 (QC) 내성이 32 독립적인 검정 운전 중 적어도 하나에서 초과되었다면 단백질은 제외되었다. 이는 76 단백질에 대하여 발생하였고; 많은 사례에서 대다수의 운전은 요구된 내성 이내이었지만, 그러나 간단히 본원에서 존재한 바이오마커 발견 분석에서 모든 76 단백질을 배제하도록 선택하였다.
샘플은 하기 이유로 바이오마커 발견 분석으로부터 제외되었다: 1) 인트라-운전 정규화 QC 내성을 충족시키는데 실패, 2) 유래없는 높은 수의 특이점, 또는 3) 헤모글로빈의 극단적인 수준 또는 비정상적인 (적색) 혈장 색상을 나타낸 검정 기술자에 의해 지적된 바와 같이 용혈의 증거. 단일 단백질 특이점은 중앙 ± 6*중앙 절대적인 편차 (MADN)1 에 의해 주어진 범위의 밖에서 신호 수준을 갖는 단백질로서 정의되었다 -- 측정된 단백질의 5% 초과로 특이점을 갖는 환자 샘플은 분석으로부터 제외되었다. 1 Let Φ-1(z)가 정상 누적 분포 함수의 역함수를 나타낸다. 그 다음 정상적으로 분포된 데이터에 대하여 강력한 추정 MADN(x) = σ*Φ-1(3/4), 그래서 3*MADN ∼ 2σ 및 언급된 범위는 가우스 측정에 대하여 ±4σ이다. 표 2는 각각의 기준에 기반하여 제외된 샘플의 수를 요약한다.
표 2: 기준에 의해 제외된 샘플
정상화 QC
기준 실패		 잠재적
용혈작용		 >5% 단백질
극단값		 총
발견 세트 18 22 15 55
검증 세트 10 27 10 47
총 28 49 25
통계적인 방법
상기 연구의 결과는 사망, 심근경색증 (MI), 뇌졸중, 일시적 허혈 발작 (TIA), 또는 심부전 입원 중에서 제1 사건로서 정의되었다. 아래와 같이, 심혈관 사건의 단백질 수준과 위험 사이에서 일변량 회합을 추정하기 위해 콕스 비례 위험 모델을 사용하였다.
심혈관 위험을 예측하는 단백질의 선택
단일 가변형 콕스 비례 위험 모델은 2차 심혈관 사건의 증가된 위험과 개별적으로 관련된 단백질의 세트를 확인하기 위해 사용되었다. 5% 본페로니 정정된 유의성 수준에서, 정확하게 200 단백질은 심혈관 결과의 증가된 위험과 관련되었다. 도 2에서 "화산형" 도표는 상대적 형광 단위 (RFU) (상단부)의 표준 편차 당 또는 RFU 4분위수 멤버쉽 (최하부)에 대해 카테고리 인디케이터의 극단적인 수준 사이에서 위험 비율의 함수로서 왈드 통계량 p-값의 음성 로그를 보여준다. 후자의 경우에 보고된 위험 비율은 최저 위험 (1st) 4분위수에서 대상체에 비교된 최고 위험 (4th) 4분위수에서 대상체에 의해 경험된 위험의 증가를 제공한다.
이들 200 단백질의 일부는 비교적 작은 효과 크기과 관련되지만, 그러나 표 14에서 열거된 117은 범위 [0.75 - 1.25] 밖의 위험 비율을 갖는다. 이들 200 단백질 중에서 상응하는 상관관계 구조 (데이터 도시되지 않음) 조사는 유사한 쌍별 상관관계를 갖는 단백질의 몇 개의 클러스터를 드러낸다. 이들 단백질 클러스터의 생물학적 기능의 포괄적인 논의는 이 문서의 범위를 넘어서고 다른 곳에서 논의될 것이다.
LASSO (Tibshirani, Stat Med 1997;16:385-95)는 증가된 CV 위험과 공동으로 관련된 단백질의 서브셋을 확인하기 위한 가변형 스크리닝 절차로서 사용된다. R 패키지 글림넷 (Friedman et al., Journal of Statistical Software 2010;33:1-22)에서 콕스넷 (Simon et al., Journal of Statistical Software 2011;39:1-13)을 이용한 일반화된 교차-검증은 LASSO 규칙화 파라미터를 설정하기 위해 사용되었다. 규칙화 수준의 설정을 위하여 "1 표준 오차" 경험 (Hastie et al., Elements of Statistical Learning, Second ed. . 2 ed: Springer; 2009)을 사용하였다. 교차-검증 단계의 동요는 선택된 단백질의 수득한 세트의 "안정성"에 관한 단순 체크로서 사용되었다. 상기 분석은 CVD9에 포함된 단백질이 대다수의 시간 선택되므로 이들이 "안정"하여 "LASSO 이후 역방향 제거" 절차가 적용되는 신뢰를 제공한다. 뒤이은 분석에 대하여 재생가능한 결과를 생성하기 위해 LASSO 교차-검증에 앞서 1에서 랜덤 수 종자를 고정시켰다. 16 단백질을 함유한 LASSO 모델에서 교차-입증된 부분 가능성 이상 결과를 최소화하는 값 1 표준 오차 초과로 LASSO 규칙화 파라미터 설정 및 상기 값 초기화는 본원에서 논의하였다.
최종 예후 모델로서 완전히 매개변수적 (와이블) 생존 모델을 선호하는, 가변적 선택만으로 LASSO를 사용하였다. 후자는 외부 검증 연구에서 사용을 위하여 보정에 (Royston et al., BMC medical research methodology 2013;13:33; van Houwelingen, Stat Med 2000;19:3401-15) 잘 받아들이는 수학적 형태 및 단순 묘사를 갖는다. 전체 LASSO 모델로부터 시작된 단계적인 역방향 제거는 LASSO 불이익에 의해 부여된 구속의 부재에서 유의미한 예측변수가 아닌 단백질을 제거하기 위해 사용되었다. 모델 성능 및 복합성의 균형을 위하여 베이지안 정보 기준 (BIC) 중지 기준을 이용한 경우, 역방향 제거는 7 단백질: 표 3에서 보이는 9 단백질 CVD9 모델을 초래한 카텝신 H, EGF 수용체, 성장 호르몬 수용체, T 세포막 단백질 TIM-3, MMP-7, 세포 부착 종양유전자-관련 CDO 및 트롬보스폰딘-2를 버렸다.
표 3: CVD9 바이오마커의 분석적 성능 특징
표적 % 샘플 희석 교정기 % CV 정량화 한계값
(pg/ml)		 범위 (Logs) 검정간 정확도 (n=3)
(%CV)
하한 상한 낮은 중간 높은
안지오포이에틴-2 0.01 5.66 8.4x100 1.8x104 3.3 1.6 2.0 0.6
보체 C7 0.00 8.66 1.7x101 3.0x104 3.2 7.0 7.2 6.3
MMP12 0.40 4.89 2.8x10-1 1.4x104 4.7 1.1 2.0 2.5
트로포닌 I, 심장 0.40 7.62 - - - - - -
안지오포이에틴 -관련 단백질 4 0.40 6.46 1.4x101 1.4x104 3.0 9.6 4.9 7.6
α1-항키모트립신 복합체 0.00 5.97 1.8x100 1.9x104 4.0 4.5 5.8 5.3
GDF11 0.01 6.03 6.5x10 4.2x103 2.8 1.5 1.2 3.6
CCL18/PARC 0.00 6.83 1.6x10-1 2.6x103 4.2 5.1 1.6 5.6
α2-항플라스민 0.00 7.46 9.8x100 1.7x104 3.2 3.7 2.7 1.8
CVD9 모델
최종 모델 (CVD9)은 9 단백질을 함유한다. 임상 변수에 대하여 상기 모델의 조정이 부합을 약간 (아래 참고) 개선하여도 이들 조정은 발견 세트에서 "단백질 단독" 모델로 달성된 분별값 또는 보정 성능에서 유의미한 개선을 산출하는데 실패하였다. 이는 검증 성능 평가용 "1차" 모델로서 및 연령, 성별, 당뇨병 상태 및 추정된 사구체 여과율 (eGFR)를 포함한 모델을 2차 모델로서 CVD9를 지정하도록 유도하였다.
가속화된 실패 시간 모델에 대하여, 간격 [0,t]에서 발생하는 사건의 확률은 하기 식으로 제공된다:
Figure pct00003
여기에서 PI는 예후 지수 (또는 선형 예측변수)이고 s는 극단적인 값 분포에 대하여 관련된 척도 파라미터이다. 모델 적합화 경우 표준화된 변수로 작업하였다 - 여기에서 집단 평균 및 표준 편차를 절편 항으로 흡수하여 예후 지수 및 척도 요소를아래와 같이 보고할 수 있다:
Figure pct00004
여기에서 단백질 수준은 log10 RFU로 선택된다.
임상 변수 편입
HUNT3 연구는 심혈관 질환 연구로서 특이적으로 설계되지 않아서 발견 세트에서 이용가능한 일부 병력 파라미터 및 임상 실험실 측정은 검증 세트 (예를 들면 에코심박동그래픽 좌심실 박출률, 좌심실 비대, 심장확장 기능)에서 이용불가능하였다. 이를 염두하여 모든 수집에서 이용가능했던 그리고 사건이 있는 환자와 없는 환자 사이에서 상이했던 임상 변수에 대하여 단지 고려하였다.
CVD9에 부가된 경우, 임상 변수 성별(남성), 연령, 당뇨병(예), ACE 저해제(예), 및 추정된 사구체 여과율(eGFR)는 개별적으로 (및 공동으로) 수득한 조합된 모델 (p < 0.001)의 부합을 증가시켰다. 약물이 HUNT3 집단에서 이용불가능하기 때문에, ACE 저해제 또는 ARB 사용은 최종 모델에서 포함되지 않았다.
CVD9에서 사용된 9 단백질에 더하여 연령 및 성별을 먼저 부가하고, 그 다음 당뇨병 상태 및 eGFR을 부가하여 결과를 예측했던 통상적으로 이용가능한 임상 변수와 단백질을 조합하는 추가의 모델을 제공하였다. 가속화된 실패 시간 (AFT) 모델 선형 예측변수의 계수용 점 추산치 및 극단적인 값 분포용 추정된 척도 파라미터는 표 4에 열거된다. 약어는 하기이다: ANGPT2 = "안지오포이에틴-2"; C7 = "보체 C7"; SERPINF2 = "α2- 항플라스민"; CCL18 = "케모카인 (C-C 모티프) 리간드 18" 또한 "폐 및 활성화-조절된 케모카인 (PARC)"으로 공지됨, ANGL4 = "안지오포이에틴-관련 단백질 4; KLK3.SERPINA3 = "α1- 항키모트립신 복합체"; TNNI3 = "트로포닌-I, 심장"; 및 eGFR= "추정된 사구체 여과율".
표 4: 3 후보자 모델에 대한 추정된 계수
모델 용어 CVD9 CVD9+ 연령+ 성별 CVD9+ 연령+ 성별+ 당뇨병+ eGFR
규모 0.848 0.849 0.845
절편값 -16.612 -18.614 -17.478
당뇨병=유 0 0 0.277
eGFR 0 0 -0.005
연령 0 0.012 0.012
성별=남성 0 0.358 0.391
ANGPT2 1.547 1.712 1.510
GDF11 -1.224 -1.320 -1.347
C7 2.115 2.092 2.025
SERPINF2 -2.643 -2.057 -1.663
CCL18 0.574 0.554 0.375
ANGL4 1.022 0.902 0.848
KLK3.SERPINA3 1.433 1.409 1.361
MMP12 0.718 0.522 0.436
TNNI3 0.588 0.587 0.610
분별값 성능의 몇 개의 상이한 평가는 통상적으로 보고된다 - "c-통계", 통합된 분별값 지수 (IDI) 및 카테고리-자유 순 재분류 지수 (NRI)를 보고한다.
표 5는 3 모델에 대하여 요약된 보정 성능에 대한 호스머-레메쇼우 통계 및 Q4/Q1 위험 비율과 함께 이들 분별값 평가를 열거한다. 보고된 신뢰 구간은 100 부트스트랩 샘플을 이용하여 생성된 경험적 95% CI이다. 제1 칼럼은 기준선 (단백질 단독) 모델과 확장된 모델을 비교한 가능성 비 시험에 대한 p-값을 열거한다. 제1 칼럼은 단백질 단독 모델과 확장된 모델을 비교한 가능성 비 (LR) 시험에 대한 p-값을 제공한다. 분별값의 후속 평가는 입사/동적 ROC 곡선 (Cτ), 통합된 분별값 지수 (IDI), 순 재분류 지수 (NRI) 및 제4 대 제1 4분위수 위험 비율 (Q4/Q1) 하에서 칭량된 면적이다. 보정 성능은 호스머-레메쇼우 통계로 평가되었다.
통합된 AUC "C-통계"가 본질적으로 변함없이 남아도, 기준선 값이 사건 및 무-사건 그룹을 식별하는 임상 변수 부가가 IDI의 점 추산치, NRI(>0) 및 Q4/Q1 위험 비율에서 약간의 개선을 제공한다.
표 5: CVD9에 대한 발견 세트에서 분별값 및 보정 성능 모델의 평가
Figure pct00005
1 CKD-EPI 2009 eGFR 공식은, 이것이 발견 및 검증 세트 둘 모두에서 이용가능하므로 사용되었음.
검증용 CVD9 재-보정
CVD9의 성능과 프라밍햄 스코어의 비교 전에 모든 모델은 검증 세트에서 이의 사용을 위하여 재-보정되었다. 반 하위링겐 (Stat Med 2000;19:3401-15)에서와 같이 검증 집단에서 사용을 위하여 모델 계수를 재-보정하기 위해 와이블 가속화된 실패 시간 보정 모델을 사용하였다. 만일 PI가 예후 지수이고 H(t|PI)가 누적 위험 기능을 나타낸다고 하면, 보정 모델은 하기이다:
Figure pct00006
,
여기에서 오차 용어 e는 극단적인 값 분포를 갖는다. H0(t)으로 기준선 누적 위험 표지 및 H(t|PI) = H0(t)ePI 이용은 하기를 제공한다:
Figure pct00007
(1)
(반 하위링겐에 의해 "보정에 의한 검증"으로 칭해지는) 형식적 보정 평가는 완벽한 보정 가설,
Figure pct00008
시험을 포함한다. R 패키지 생존 (Therneau, A Package for Survival Analysis in S. R package version 237-7 2014)으로부터 서브레그를 이용한 모델 (1) 적합화는 표 6에서 열거된 보정 계수를 제공한다.
표 6: 검증 세트에서 사용을 위하여 CVD9에 적용된 와이블 보정 모델용 계수.
CVD9
추산 95% CI p-값
Figure pct00009
 -0.230 -0.4189
 -0.0412
 0.02
Figure pct00010
 -0.998 -1.1752 -0.8212 0.98
Figure pct00011
 0.149 0.0384 0.2598 0.008
이하에서 논의된 바와 같이 검증 세트에서 체계적인 세기 바이어스가 절편 항에 대한 대부분의 기여를 책임져도, 절편 (
Figure pct00012
) 및 척도 항 (
Figure pct00013
)은 CVD9가 검증 집단에 적용되기 전에 보정이 필요함을 지적한다.
HUNT3 검증 세트에서 혈액 샘플은 발견 세트에서 보다 더욱 관대한 수집 프로토콜을 이용하여 수집되었고 결과적으로 검증 샘플에서 측정된 대부분의 1054 단백질을 거쳐 체계적인 세기 바이어스를 관측하였다. 이하에서 보여진 바와 같이 작은 잔류 바이어스가 모델 CVD9에서 사용된 9 단백질에 대한 신호 수준에서 잔류하여도, 본원에서 논의된 바와 같이, 상기 바이어스는 정규화 단계에 이해 고도로 제거되었다. 상기 바이어스는 정규화 방법의 인공물이고 (검증 샘플은 정규화 이전 발견 샘플 보다 더 높은 신호 수준 그러나 이후 더 낮은 신호 수준을 갖는다) 이하에서 보여진 바와 같이 계수,
Figure pct00014
의 추정된 값을 크게 책임진다.
도 3에서 강력한 퇴행 라인의 절편은 CVD9에서 모든 9 단백질에 공통인 세기 바이어스의 추정치를 제공한다. 만일 △가 추정된 바이어스를 나타내고 βj 및 σj가 jth 단백질에 대한 모델 계수 및 집단 표준 편차라고 하면, 다르게는 모델 절편의 기여일 검증 데이터에 CVD9 적용은 일정한 요소의 부가를 초래한다:
Figure pct00015
(2),
이런 식으로 단백질 신호에서 세기 바이어스는, 정확하게 보정 모델 (1)에서 파라미터
Figure pct00016
와 관련된 항, 발견 및 검증 세트에서 기준선 생존자 함수의 시간 척도에서 차이로서 나타난다. 선형 예측변수에서 0.23145를 공제한 CVD9 모델 계수 및 집단 표준 편차와 함께 (2)에서 강력한 선형회귀의 절편에 의해 생성된 추정치 △ = -0.056을 이용하여, 거의 정확하게 값 (
Figure pct00017
)은 보정 모델에서 절편으로 추정하였다. 따라서 정규화 절차 이후 잔류한 "잔류" 세기 바이어스는 발견 및 검증 집단에서 기준선 생존자 함수 사이에서 실제의 차이 보다 (
Figure pct00018
)의 규모를 크게 책임진다.
HUNT3 샘플 수집에서 신호 세기 바이어스는 더욱 엄격한 수집 프로토콜하에 수집된 샘플에 일반화하도록 예상하지 않은 상기 특정한 검증 세트의 측면이다. 이를 염두해 두고 아래 기재된 재-보정된 CVD9 모델을 이용하여 검증 세트에서 성능을 평가하였다.
사건 시간 분포가 척도 a 및 형상 b를 갖는 와이블인 경우, 상응하는 기준선 생존자 함수는 하기이고:
Figure pct00019
,
여기에서 누적 기준선 위험 (H0)에 관하여 log(H0) = b log(t/a)로서 작성한다. 이를 방정식 (1)의 좌측으로 치환, 및 (오류! 참조 공급원텍스트를 발견할 수 없음.)에서 보정 계수 이용으로, 위험 스코어를 생성하기 위해 수득한 발현은 하기 가속화된 실패 시간 모델의 형태로 배치될 수 있고:
Figure pct00020
,
"보정된" 모델 계수를 갖는다:
Figure pct00021
.
이들 모델 계수를 이용하여, 관련 보정된 위험 스코어는 하기 식을 이용하여 생성된다:
Figure pct00022
,.
여기에서
Figure pct00023
.
검증 세트에서 사용된 재-보정된 CVD9 모델에 대하여 수득한 예후 지수 (PI) 및 극단적인 값 척도 요소는 하기이다:
Figure pct00024
유사한 보정 모델은 임상 변수를 포함하는 CVD9의 변이체로 작제되었다. 수득한 보정 모델 계수는 표 7에 열거된다. CVD9에 대한 경우와 같이, 임상 변수를 포함한 모델은 9 단백질에서 동일한 체계적인 세기 바이어스를 가졌고 이와 함께 바이어스는 각 보정 모델에서 (
Figure pct00025
) 추정치에 대해 -0.254 및 -0.245의 기여를 생성하였다.
표 7: 임상 변수를 포함하는 CVD9의 변이체에 적용된 와이블 보정 모델용 계수.
CVD9 + 연령 + 성별="남성"
추산 95% CI p-값
Figure pct00026
 -0.275 -0.4633
 -0.08623
 0.004
Figure pct00027
 -1.042 -1.2388 -0.8460 0.67
Figure pct00028
 0.1577 0.005
CVD9 + 연령 + 성별="남성" + 당뇨병="유"+ eGFR
추산 95% CI p-값
Figure pct00029
 -0.228 -0.4228
 -0.03383
 0.03
Figure pct00030
 -1.079 -1.3041 -0.8532 0.49
Figure pct00031
 0.1737 0.002
(5% 유의성 수준에서 본페로니 정정 이후) 심혈관 사건와 유의미하게 관련된 단백질의 확인 이후, 가변형 (단백질) 선택 목적을 위하여 L1 불이익된 (LASSO; 참고 Tibshirani, Stat Med. 1997;16:385-395) 콕스 퇴행을 이용하였다. 변수의 동시 선택 및 수반되는 계수 축소 덕에, LASSO는, 널리 입증된 바와 같이, 양호한 예측의 모델을 수득한다. 참고 Hastie et al., Elements of statistical learning, second ed. Springer; 2009. 상기 L1 벌칙 접근법은 1054 단백질에 의해 예시된 고차원 예측변수 셋팅에서 특히 유효하다. 완전히 매개변수 모델을 수득하기 위해, LASSO 선택된 단백질의 풀 세트를 이용한 와이블 가속화된 실패 시간에 단계식 역방향 제거를 적용하였다. 이는 7 최소 중요한 원인제공자를 제거하였고 프라밍햄의 정신에서 인색한 9-단백질 모델 (CVD9), 완전히 매개변수 예후 모델을 초래하였다.
평판있는 비교 참조 표준으로서, 위험 예측은 아래와 같이 발견 및 검증 데이터 세트에서 사용을 위하여 재보정된 프라밍햄 2차 사건 위험 모델 (D'Agostino, et al., Am Heart J. 2000;139:272-281)로부터 생성되었다.
디아고스티노는 2차 심혈관 사건 예측에 대하여 하기 가속화된 실패 시간 모델을 나타낸다:
Figure pct00032
여기에서 남성용 예후 지수 및 척도 파라미터는 하기이다:
Figure pct00033
CVD9와 프라밍햄 모델의 비교 전에, 발견 및 검증 세트에서 사용을 위하여 모델을 재-보정하였다.
발견 및 검증 세트용 프라밍햄 재보정
발견 세트 및 검증 세트에서 사용을 위하여 프라밍햄 2차 위험 스코어를 재-보정하기 위해 단일 가변형 콕스 비례 위험 보정 (van Houwelingen, Stat Med 2000;19:3401-15; Steyerberg. Clinical Prediction Models: Springer; 2010) 모델을 사용하였다. S0(t)에 의해 기준선 생존자 함수를 나타내면, 보정된 4-년 프라밍햄 위험 스코어는 하기이다:
Figure pct00034
여기에서
Figure pct00035
는 특정한 샘플 세트에서 프라밍햄 예후 지수의 값에 대한 보정 모델 적합에서 추정치이고
Figure pct00036
(t)는 그 집단에서 생존자 함수의 카플란-메이어의 추정치이다. 표 8은 수득한 보정 모델 계수를 열거한다.
표 8: 각 발견 또는 검증 세트에 대하여 프라밍햄 2차 위험을 재-보정하기 위해 사용된 단일 가변형 콕스 비례 위험 보정 모델용 보정 계수
추산 콕스 보정 계수
(
Figure pct00037
 표준 오차 p-값
발견 0.472 0.066 <0.001
검증 0.396 0.067 <0.001
보정 성능은 관측된 사건와 예상된 사건의 빈도 사이에서 일치를 평가함으로써 평가된다. 도 4는 발견에서 프라밍햄 모델에 대하여 위험의 각 10분위수로 예상된 및 관측된 사건의 빈도를 보여주고 도 5는 검증 세트에서 보여준다. 각각의 경우에 왼쪽 프레임은 최초 프라밍햄 스코어를 보여주고 오른쪽 프레임은 표 8에서 열거된 계수를 갖는 모델을 이용한 재-보정된 스코어를 보여준다.
보정 성능이 발견 집단에서 허용가능한 반면, 예상된 및 관측된 사건 빈도 사이에서 유사한 수준의 일치는 도 5에서 보여질 수 있는 바와 같이 검증 집단에서 달성되지 않았다. 도 4 및 도 5에서 그래프로 보여진 보정 성능을 요약하기 위해 χ2 (호스머-레메쇼우) 통계를 보고한다 - 상기 통계 및 관련된 p-값은 R 패키지 predictABLE에서 도표보정 함수로 계산되었다. Kundu et al., PredictABEL: 위험 예측 모델의 평가. R 패키지 버전 12-1 2012. 호스머-레메쇼우 시험용 p-값 0.70 및 0.02는 발견에서 프라밍햄 모델의 양호한 보정 및 검증 집단에서 좋지 못한 보정과 일치된다.
표 9에서 기입은 모든 발견 및 검증 세트에서 재-보정된 프라밍햄 스코어의 분별값 및 보정 성능을 요약한다. 본원에서 더 상세히 논의된 바와 같이, 분별값 성능, 제4 및 제1 4분위수와 "C-통계" 사이의 위험 비율의 2가지 평가를 보고한다. 후자 일치 지수에 대하여 입사/동적 ROC 곡선하 칭량된 영역, Cτ (τ= 4 년)를 보고한다. c-통계는 발견 및 검증 집단에서 프라밍햄 모델의 상대적으로 좋지 못한 분별값과 일치된다.
표 9: 발견 및 검증 세트에서 재-보정된 프라밍햄 모델의 분별값 및 보정 성능.
데이터 세트 분별값 보정
C1 (제1년) C4 (제4년) HR Q4/Q1 호스머-레메쇼 X2 p-값
발견 0.620 0.615 2.8 5.54 0.70
검증 0.616 0.609 2.3 18.75 0.02
상기 스코어가 4 년을 포함하여 예측 최대로 입증되었음에 따라, CVD9 단백질 모델과 성능 비교를 위하여 4-년 시간 간격을 사용하였다. 이하에서 논의된 바와 같이 CVD9 단백질 모델 대 프라밍햄에 대하여 카테고리-자유 순 재분류 지수 (NRI; Pencina et al., Stat Med. 2011;30:11-21)를 또한 계산하였다. 프라밍햄 위험 스코어는 MI 및 사망의 예측에 대해서만 앞서 입증되었지만 그러나 뇌졸중 및 심부전 사건을 또한 예상하고 있다. 상기 연구에서 이의 성능이 모든 사건 유형에 거쳐 유사하기 때문에 그리고 상기 집단용 과학적 공동체에 대해 아마도 해당 스코어로서 보여지기 때문에 비교측정기로서 프라밍햄 2차 사건 위험 스코어를 보유한다. 다중-단백질 심혈관 위험 예측 모델을 생성한 방법 및 이를 프라밍햄 2차 사건 위험 스코어와 비교하는 메트릭스 (D'Agostino et al., Am Heart J. 2000;139:272-281)는 도 6에서 요약되고 아래 논의된다. CVD9에 (모든 집단에서 이용가능했던 그리고 사건이 있는 환자 및 없는 환자 사이에서 상이했던 변수로부터 선택된) 통상적으로 이용가능한 임상 파라미터의 부가 영향은 2차 모델 (참고 상기)에서 또한 평가되었다. 모든 통계적인 컴퓨팅은 통계적인 컴퓨팅을 위하여 R 언어를 이용하여 수행되었다. 참고 R Core Team RFfSC, Vienna, Austria R: A language and environment for statistical computing. Manual. 2013.
검증 성능
도 7에서 보여준 숲 도표는 모든 발견 및 검증 세트에서 16 LASSO 단백질에 대한 위험 비율의 비교를 보여준다. 안지오포이에틴-관련 단백질 4 및 보체 C7을 예외로, CVD9 모델에서 개별 단백질에 대한 위험 비율은 발견 및 검증 세트에서 유사하다. 이는 개별 단백질의 검증 성능의 평가이다 - 상기 섹션의 나머지는 모델 CVD9를 초래하는 상기 단백질의 특이적 조합의 검증 성능을 논의한다.
모델 예측이 임상 측정을 알리기 위해 사용된 경우 보정 성능은 특히 중요하다. 스테예베르그 (Epidemiology 2010;21:128-38)에서와 같이 검증 집단에서 절대적인 위험의 CVD9 추정치를 먼저 평가하고 그 다음 C-통계에서의 변화에 관하여 분별값 성능 및 프라밍햄 모델에 비하여 위험 재분류를 평가하였다.
보정
보정 성능은 기준선 혈액 샘플 이후 4-년 간격으로 관측된 및 예상된 사건의 빈도 사이에서 일치를 평가함으로써 평가되었다. 도 8은 검증 세트에서 사용을 위하여 재-보정된 CVD9 (왼쪽) 및 프라밍햄 모델 (오른쪽)용 검증 세트에서 위험의 각 10분위수에 대하여 예상된 및 관측된 사건의 빈도를 보여준다.
전체 범위에 거쳐 CVD9에 의해 생성된 주어진 위험 10분위수에서 예상된 사건 빈도는 관측된 사건 빈도의 8 이내 (및 전형적으로 3 이내) 퍼센트이다. 바의 각 쌍의 각 오른쪽은 거의 100 환자를 나타내고 오차 막대가 지적한 대로, 각 10분위수에서 환자에 대한 위험 스코어는 인접하는 위험 10분위수에서 환자의 것이 아닌 각각과 더욱 유사하다. 이런 의미로 CVD9에서 단백질에 의해 제공된 정보를 고려한 경우 "개별화된" 위험 평가를 증명한다는 것이다.
일반적으로 예상된 및 관측된 사건 빈도 사이의 일치는 (특히 10-20th 위험 백분위에서 환자에 대하여) 프라밍햄 모델에서 더 약하다. 도 9는 검증 세트에서 사용을 위하여 재-보정된 프라밍햄 스코어 및 CVD9용 예측성 곡선 (Pepe et al., Stat Med 2013;32:1467-82)을 보여준다.
도 9에서 동일한 규모로 2개의 모델로부터 위험 스코어로, CVD9 모델이 10th 백분위 미만의 대상체의 (낮은) 위험 및 90th 위험 백분위 초과의 대상체에 대한 파국적으로 (65%) 높은 위험을 정확하게 예측함으로써 위험 스펙트럼의 모든 말단에서 프라밍햄 보다 절대적인 위험의 더욱 정확한 묘사를 생성함을 목격한다. 또한 CVD9에 대한 예측성 곡선의 기울기는 CVD9가 전통적 프라밍햄 모델 보다 각각의 위험 10분위수에서 환자에 대하여 절대적인 위험의 더욱 미세한 해상도 추정치를 제공하는 위험 백분위의 상위 절반에 걸쳐 더 급격하다.
분별값
표 10에서 기입은 검증 집단에 대하여 재-보정된 CVD9 및 프라밍햄 모델의 분별값 성능을 요약한다. 일치 지수로서, Harrell, Pencina 및 D'Agostonio's "C-통계"에 등가인, 고정된 후속조치 간격 [0,τ] (Heagerty et al., Biometrics 2005;61:92-105)과 관련된, 입사/동적 ROC 곡선하 칭량된 영역, Cτ를 보고한다. 참고, 예를 들면, Harrell et al., Stat Med 1996;15:361-87; 및 Pencina et al., Stat Med 2012;31:1543-53. R 패키지 riskSetROC에서 risksetAUC 함수를 이용하여 τ=1 및 4 년에 대하여 Cτ를 계산하였다. 참고 Heagerty et al., risksetROC: Riskset ROC curve estimation from censored survival data. R Package version 104 2012.
표 10: 검증 집단에서 사용을 위하여 재-보정된 CVD 및 프라밍햄 모델용 분별값 및 보정 성능 요약.
모델 Ct NRI IDI 위험도 비율 보정
제1년 제4년 NRI(초과0) 사건 무 사건 Q4/Q1 호스머-레메쇼
X2 		p- 값
CVD9 0.71
(0.68-0.74)		 0.70
(0.67-0.73)		 52%
(37-67%)		 18%
(5-31%)		 34%
(26-41%)		 0.10
(0.07-0.13)		 6.0 7.90 0.44
CVD9 + 연령 + 남성 0.69
(0.66,0.73)		 0.68
(0.65,0.71)		 41% (27-55%) 16%
(3-29%)		 26%
(19-33%)		 0.08
(0.05-0.12)		 4.9 1.51 0.99
CVD9 + 연령 + 남성 + 당뇨병 + eGFR 0.67
(0.64-0.71)		 0.65
(0.63-0.69)
 35%
(22-51%)		 11%
(1-25%)		 24%
(18-30%)		 0.07
(0.04-0.09)		 4.6 9.99 0.266
프라밍햄 0.616
(0.58-0.66)		 0.609
(0.58,0.64)		 - - - 0.02 2.3 18.75 0.02
ROC 곡선
도 10은 모든 발견 및 검증 세트에 대하여 riskSetROC 패키지로 생성된 CVD9 및 프라밍햄 모델용 ROC 곡선을 보여준다. 각각의 모델에 대하여 년 1 및 4에서 ROC 곡선을 생성하였다.
위험 재분류
4-년 사건 확률은 발견 세트에서 사용을 위하여 재-보정된 후자를 갖는 프라밍햄 2차 모델 및 CVD9로 생성되었다. 카테고리 자유 순 재분류 지수19 NRI(>0)는 R 패키지 엔리센스를 이용하여 계산되었다. 참고 Eisuke. NRI for risk prediction models with time to event and binary response data. R package version 12 2013.
표 11은 NRI(>0)에서 용어 및 모든 발견 및 검증 세트에서 프라밍햄과 CVD9를 비교한 재분류 확률을 열거한다. 보고된 신뢰 구간은 100 부트스트랩 샘플로 계산된 경험적 95% 간격이다. 섹션 (오류! 참조 공급원텍스트를 발견할 수 없음.)에서 논의된 바와 같이, 모든 CVD9 및 프라밍햄 모델은 상기 계산에 앞서 검증 세트에서 사용을 위하여 재-보정되었다.
표 11: 발견 세트에서 프라밍햄 모델에 비교된 CVD9에 대한 순 재분류 지수 및 재분류 확률.
발견 검증
점
추산치		 95% CI 하한 95% CI 상한 Point 추산 95% CI
하한		 95% CI
상한
NRI(초과0) 0.57 0.43 0.71 0.52 0.38 0.67
사건 NRI 0.16 0.04 0.29 0.18 0.06 0.31
무 사건 NRI 0.41 0.34 0.47 0.34 0.27 0.41
Pr(위험 증가|사건) 0.58 0.52 0.64 0.59 0.53 0.65
Pr(위험 감소|사건) 0.42 0.36 0.48 0.41 0.35 0.47
Pr(위험 감소|무사건) 0.71 0.67 0.74 0.67 0.63 0.70
Pr(위험 상승|무사건) 0.29 0.26 0.33 0.33 0.30 0.37
실시예 3. 결과
기준선 특징
기준선에서 2개 연구 집단의 임상 특징은 표 12에 요약된다. 예상대로, 공지된 위험 요소는 사건이 있는 그룹에서 유의미하게 더욱 우세하다. 더 짧은 후속조치 때문에, Heart and Soul에서 보다 HUNT3에서 더 적은 전체 사건이 있었고; 그럼에도 불구하고, 집단은 단위 시간 및 사건 유형의 분포 당 사건율에서 일반적으로 비교할만하였다. 표 12에서, P-값은 카테고리 공변량에 대하여 피셔 정확 시험 및 연속적 공변량에 대하여 만-위트니 U 시험과 관련된다. 연속적 값은 중앙 및 4분위간 범위 (IQR)로 요약하였다. HUNT3 검증 세트는 CHD 연구로서 설계되지 않았고 결과적으로 일부 임상 정보는 이용불가능하였고 N/A로 표지된다. 범례: BMI = 체질량 지수; ACE = 안지오텐신 전환효소; ARB = 안지오텐신 수용체 차단제; LDL-C = 저밀도 지질단백질 콜레스테롤; HDL-C = 고밀도 지질단백질 콜레스테롤; TG = 트리글리세라이드; eGFR = 추정된 사구체 여과율.
표 12: 연구 집단 기준선 특징
Figure pct00038
1 검증 세트에서 CKD-EPI 2009 및 누락 값이 2012 식의 계산을 방지한 경우 가능하다면 CKD-EPI 2009와 발견 세트에서 CKD-EPI 2012.
3 검증 세트에서 CKD-EPI 2009 및 누락 값이 2012 식의 계산을 방지한 경우 가능하다면 CKD-EPI 2009와 발견 세트에서 CKD-EPI 2012.
심혈관 ( CV ) 위험과 관련된 단백질
5% 본페로니 정정된 유의성 수준에서, 일변량 콕스 퇴행 분석은 품질 대조군을 통과한 1054 단백질 중 117이 심혈관 사건의 증가된 위험과 관련되었고 또한 >1.25 또는 <0.75의 일변량 제4 대 제1 4분위수 위험 비율을 가졌다는 것을 드러냈다 (이들 117 단백질은 아래 표 14에 열거된다). 이들 단백질의 일부는 상관되었고, 117 상이한 생물학적 방법 보다 훨씬 적은 존재를 제안하고; 이들 단백질의 생물학은 추가 분석의 표적일 것이다. LASSO 방법에 의해 상기 목록으로부터 선택된 16 단백질에 대한 위험 비율 및 최종 CVD9 모델에 대하여 선택된 9 단백질의 서브셋은 도 7에서 보여진다. LASSO-선택된 16 단백질의 관련된 생물학적 특성은 아래 요약된다.
상기 분석에서 확인된 바이오마커는 강력한 심혈관 위험 예측 모델을 유도하는 작용을 할 뿐만 아니라, 심혈관 질환 (CVD)의 생물학 이해를 알려주는 및 잠재적 약물 표적 및 치료 선택을 확인하는 작용을 한다. 아래, CV 위험 예측 모델 내 LASSO에 의해 선택된 16 단백질의 공지된 기능(들)의 간단한 설명을 제공한다.
성장 및 리모델링
성장 분화 요소 11 (GDF11)은 잠재적 임상 유의성의 발견과 함께 비편향된 프로테오믹스 검정 도구를 이용한 생물학적 발견의 예이다. 소마스캔(SOMAscan)을 이용하여, 리와 동료는 마우스에서 연령-관련 심장 비대증의 원인으로서 GDF11의 연령-관련 손실을 정확히 기술하였다. 참고 Loffredo et al., Cell 2013;153:828-39. GDF11은 인간에 있어서 심장 비대증 및 심장확장 심부전 억제에서 이의 역할에 대하여 현재 활성 조사 중이다. 참고, 예를 들면, Olson et al., Journal of the American College of Cardiology 2014;63:A780. 흥미롭게도, GFD-11 농도가 연구에서 심혈관 사건 위험 증가와 함께 감소되는 반면, GDF11 활성의 저해제, 폴리스타틴-유사 3은 증가한 심혈관 위험과 양성으로 관련된다 (참고 표 14).
표피 성장 요소 (EGF) 수용체 (EGFR)는 죽상경화성 병변에서 단핵구 및 대식세포 상에서 발현된다. 리간드 결합에 의한 활성화는 세포성 증식 및 화학주성을 자극시킨다. Dreux et al., Atherosclerosis 2006;186:38-53. 동물 연구로부터 증거는 EGF 수용체가 심장 비대증에 대하여 보호하고 적절한 혈관벽 구조 및 용기 반응성을 지지한다는 것을 보여준다. Schreier et al, Hypertension 2013;61:333-40.
가용성 형태의 성장 호르몬 수용체 (GHR) 및 표피 성장 요소는 세포분화, 세포 기능에서 관여된 순환 요소의 모든 저장기 및 저해제로서 작용할 수 있고, 암에서 공지된 역할을 가질 수 있다. 흥미롭게도, 이의 동화작용 매개체 인슐린-유사 성장 요소 I의 자극을 통해, 성장 호르몬 수용체 신호전달은 관상동맥 질환의 발생 위험과 음성 상관관계를 가짐을 이미 보여주었다. Juul et al., Circulation 2002;106:939-44.
티로신-단백질 키나제 수용체 Tie-2 수용체 상에서 안지오포이에틴-1 활성을 길항화하는 및 혈관신생 동안 안지오포이에틴-1과 협력하여 작용하는, 안지오포이에틴-2 (ANGPT2)는 세포-매트릭스 접촉의 완화를 촉진시키고 혈관신생26동안 내피 세포 세포자멸사 및 용기 파괴를 유도할 수 있다. Maisonpierre et al., Science 1997;277:55-60. 동일한 유전자 패밀리의 구성원, 안지오포이에틴-관련 단백질 4 (ANGPTL4)는 저산소증에 의해 유도되고 혈관 기능 및 매트릭스-내피 세포 상호작용 뿐만 아니라, 지질단백질 리파아제27의 강력한 저해제로서 지질 대사에 영향을 미친다. Li et al., Current opinion in lipidology 2006;17:152-6.
세포외 매트릭스 및 세포의 제어된 상호작용은 정상 발달 동안, 혈관 및 심근 손상에 대한 반응에서, 및 암 전이 동안, 정상 장기 생리학에 생명 유지 관련된다. 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 이의 저해제는 혈관 세포외 매트릭스에서 몇 개의 표적을 갖고 죽상경화판 안정성, 동맥류 형성 및 다른 심혈관 질환과 관련되어 있다. Dollery et al., Cardiovascular research 2006;69:625-35. 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)-7 및 MMP12는 예측의 모델에서 나타나고, 반면에 TIMP1은 또한 심혈관 위험과 유의미한 관련을 갖는다 (참고 표 14). 트롬보스폰딘-2 (THBS2)는 혈관 및 심장 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 매개하고 혈관신생, 혈전증, 및 염증의 조절에서 연루되고 있다. 증가된 혈청 트롬보스폰딘-2 농도는 노인에 있어서 심장 사망률의 위험과 관련된다. Golledge et al., The American journal of cardiology 2013;111:1800-4. 세포 부착 종양유전자-관련 CDO (CDON)는 근육발생 및 근육 세포 부착에 관여된 Ig/파이브로넥틴 슈퍼패밀리의 세포 표면 단백질 구성원이다. Tenzen et al., Developmental cell 2006;10:647-56. 세포-세포 상호작용에서 이의 역할은 종양 침습력에서 주목되고 있지만 심혈관 시스템에 대한 이의 관계에 대하여 거의 공지되지 않는다.
염증
심혈관 질환에서 염증 및 면역력의 복합체 역할을 나타내면, 모델은, T 세포의 동원에 관여된 것으로 보여지는 단핵구/대식세포-정교화된 케모카인인, 폐 및 활성화-조절된 케모카인 CCL18/PARC로서 앞서 공지된, 염증성 케모카인 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 18을 편입한다. Chenivesse et al., J Immunol 2012;189:128-37. CCL18/PARC의 혈장 수준은 불안정한 협심증의 에피소드 동안 상승되고 또한 안정한 협심증을 가진 환자에서 CV 사건을 예측하는 것으로 발견되었다. De Sutter et al., Journal of molecular and cellular cardiology 2010;49:894-6. T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-함유 단백질 3 (TIM-3)은 대식세포 활성화 및 다른 면역 시스템 활성에 관여된다. Anderson, Expert opinion on therapeutic targets 2007;11:1005-9
보체 C7 (C7)은 생물활성 말단 보체 복합체 (TCC)를 형성하는 5 성분 중 하나이다. 내피 세포 상에 침착된 TCC는 세포 증식, 성장 요소 및 염증성 사이토카인의 방출, 및 조직 요소의 증가된 발현을 초래한다. TCC는 또한 죽상경화판에서 평활근 세포의 증식을 자극시킨다. Speidl et al., JTH 2011;9:428-40. 증상 심부전을 가진 환자에서 상승된 혈청 가용성 TCC는 부정적인 결과 (사망, 긴급 심장 이식, 또는 악화되는 심부전으로 입원)를 예측한다. Clark et al., Am Heart J 2001;141:684-90. 보체 C9, TCC의 또 다른 구성원은 연구에서 또한 상승된다 (표 14).
프로테아제
α1-항키모트립신 복합체 (SERPINA3) 복합체는 몇 개의 생물학적 기질을 갖는 프로테아제 저해제 α1-안티키모트립신의 결합된 형태를 나타낸다. 혈액 압력을 포함한 다중 급성 및 만성 질환을 조절할 수 있다. Tang et al., Clin Exp Hypertens 2008;30:648-61. α2-항플라스민 (SERPINF2)은 플라스민을 불활성화하고 따라서 섬유소분해를 감소시키는 세린 프로테아제 저해제 (SERPIN)이다. Matsuno et al., Journal of thrombosis and haemostasis : JTH 2003;1:1734-9; Mutch et al., JTH 2007;5:812-7. 카텝신 H (CTSH)는 리소좀 단백질39의 분해에서 중요한 리소좀 시스테인 프로테이나제이다. Cheng et al., Circulation 2012;125:1551-62. 그러나, 현재 연구까지 CV 질환에 대한 이의 관계는 불확실하였다. Lutgens et al., FASEB J. 2007;21:3029-41.
심근 괴사 마커
심혈관 질환의 인과관계 경로에서 잠재적으로 관여되는 많은 상기 언급된 단백질과 달리, 트로포닌 I는 심근세포 괴사의 및 심혈관 위험의 확고한 마커이다.
CVD9 위험 모델의 적용
CVD9 위험은 각각의 대상체에 대하여 계산되었고, 4분위수로 분할되었고 수득한 5-년 무사건 생존 곡선은 도 11에서 보여진다. CVD9에 대한 Q4/Q1 위험 비율은 발견 세트에서 8.2 및 검증 세트에서 6.0이고; (이들 집단에서 사용을 위하여 재-보정된) 프라밍햄 2차 위험 스코어에 대하여 Q4/Q1 위험 비율은 발견 집단에서 2.8 및 검증 집단에 대하여 2.3이다.
프라밍햄 모델에 대하여 1 년 (국립 심장, 폐 및 혈액 협회 작업 그룹에 의해 권고된 시점; 참고 Eagle et al., Circulation. 2010;121:1447-1454)에서 및 4 년의 최대 입증된 시계에서 순 재분류 지수 및 C-통계를 이용하여 CVD9 대 프라밍햄 모델의 비교 성능을 또한 평가하였다. 참고 D'Agostino et al., Am Heart J. 2000;139:272-281. 표 13에서 보이는 바와 같이, CVD9 위험 예측 모델은, 0.14/0.09의 C-통계에서 및 발견/검증 집단 각각에서 0.57/0.54의 카테고리-자유 NRI 증가에 의해 입증된, 분별값에서 실질적인 개선을 전달한다. 검증 집단에서 관측된 및 예상된 사건율 (보정) 사이에서 CVD9 모델에 대한 양호한 일치가 있다. 통상적으로 이용가능한 임상 및 인구통계 파라미터 (연령, 성별, 당뇨병, 및 추정된 사구체 여과율)의 부가는 CVD9 모델 (표 13)에 유의미한 개선을 만들지 못했다. 모든 모델에 대한 비교 성능 데이터는 표 13에서 보여진다. 표 2에서, NRI (>0) = 카테고리 자유 순 재분류 지수, eGFR = 추정된 사구체 여과율.
표 13: CVD9 모델 및 프라밍햄 모델의 비교 성능
프라밍햄 2차 단백질 단독 (CVD9) CVD9 + 연령 + 성별 CVD9 + 연령 + 성별 + 당뇨병 + eGFR
포맷 내 나타난 모든 단위: 발견/검증
1 개년
C-통계치 		0.62/0.62 0.76/0.71 0.76/0.69 0.77/0.67
4 개년
C-통계치 		0.62/0.61 0.74/0.70 0.75/0.68 0.75/0.65
4 개년
NRI(>0 )
대 프라밍햄 		0.57/0.52 0.64/0.41 0.67/0.35
사건 NRI
대 프라밍햄 		0.16/0.18 0.19/0.16 0.20/0.11
무 사건 NRI
대 프라밍햄 		0.41/0.34 0.45/0.26 0.47/0.24
위험도 비율
Q4/Q1 		2.8/2.3 8.2/6.0 10.0/4.9 10.3/4.6
실시예 4: 논의
상기 연구에서, 현재까지 수행된 최대 단백체 분석에서 바이오마커 발견을 이용함으로써, 특히 단기에, 심혈관 결과의 예측을 개선하기 위해 노력하였다. 안정한 CHD를 가진 938 환자의 발견 집단에서 1130 혈장 단백질을 분석하기 위해 변형된 앱타머 기술을 사용하였고 971 환자의 독립적인 집단에서 발견을 입증하였다. 발견 집단에서, 통일체 (표 14)로부터 25% 보다 더 큰 위험 비율을 가진 복합체 심혈관 종점의 117 단백질 예후를 찾아내었다. 이들로부터, 성능이 문헌에 기재된 전통적 위험 요소 또는 혈액 바이오마커의 것보다 우수한 9 단백질 (CVD9)로 이루어진 다중-가변형 모델을 작제하였고 (참고, 예를 들면, Eagle et al., Circulation. 2010;121:1447-1454; D'Agostino et al., Am Heart J. 2000;139:272-281; and Pearson et al., Circulation. 2003;107:499-511), 후보자-기반 접근법과 비교된 넓은-기반 프로테오믹스의 잠재적 이점을 보여준다. 개별 바이오마커 단백질 및 CVD9 모델은, 전형적인 임상 실무와 일치된 더 낮은 혈액 샘플 품질에도 불구하고, 검증 집단에서 양호하게 복제하였다.
예방적 및 치료적 전략의 적절한 적용은 건강 관리 전문가가 최고-위험 개체에 가장 집중 치료를 표적화하는 위험 분류 시스템에 의존한다. 참고 Eagle et al., Circulation. 2010;121:1447-1454. 통상적으로 사용된 접근법은 전통적 위험 요소에 기반하여 위험 평가에 의존하고 제한을 갖는다. 많은 이들 위험 요소는 만성적 또는 심지어 고정된, 미변성가능한 조건 예컨대 성별, 인종, 고령화 또는 가족력이다. 놀랄 것 없이, 이들은 단기 위험 보다 장기간 (10 년) 또는 수명 위험을 예측하는데 훨씬 더 양호하게 적합하다. 전통적 위험 요소는 만연된 CHD를 가진 대상체에서 특히 저조하게 2차 사건을 예측한다. 규정된 치료를 이용한 심혈관 예방, 개입 및 순응도의 가장 긴급한 요구로 개체를 정확히 기술함에 따라, 심혈관 사건의 단기 고위험에서 환자 확인은 중요한 미충족 요구를 나타낸다.
몇 개의 "오믹스" 기술은 심혈관 위험 평가에서 전통적 위험 요소를 보완하기 위해 제안되어 왔다. 참고, 예를 들면, McShane et al., Nature. 2013;502:317-320. 이들 중에서, 게놈 위험 스코어는 가장 광범위하게 조사되었다. 공통의 단일 뉴클레오티드 다형성에 기반한 게놈 접근법은 본 연구 (c-통계 및 순 재분류)에서 CVD9 단백체 스코어에 의해 유리하게 영향받았던 동일한 메트릭스에 의한 판단으로, 전통적 위험 요소에 걸쳐 위험 분별값 또는 재분류를 개선하는데 실패하였다. 참고, 예를 들면, Paynter et al., JAMA. 2010;303:631-637; Ripatti et al., Lancet. 2010;376:1393-1400. 심지어 게놈 접근법이 궁극적으로 성공적이면, 유전적 위험 요소가 경시적으로 변화하지 않고 일생 노출을 통하여 이의 효과를 발휘함에 따라 단기 위험 보다 장기간 위험 예측일 것이다. 유전체학과 비교되면, 프로테오믹스는 몇 개의 잠재적 이점을 제공한다. 프로테오믹스는 환경적 및 유전적 영향을 통합하고, 단백질 수준은 경시적으로 변화할 수 있어서, 치료 또는 생활방식 변화에서 이익 또는 손해를 반영하고 단백질은 종종 질환의 인과관계 경로이고 따라서 요법의 잠재적 표적이다. 참고, 예를 들면, Nissen et al., N Engl J Med. 2005;352:29-38; Ridker et al., Lancet. 2009;373:1175-1182; 및 Stein et al., N Engl J Med. 2012;366:1108-1118.
혈장의 작은 용적 (< 100μl)으로 1130 단백질을 평가하기 위해 변형된 앱타머로 이루어진 새로운 단백체 플랫폼을 사용하였다. 심혈관 위험 (표 14)의 117 후보자 단백질 바이오마커를 발견하였다. 현저하게, 많은 이들 단백질은 심혈관 위험의 바이오마커로서 앞서 보고되지 않았다. 이들 단백질로부터 생물학적 접근법 보다는 (역방향 제거와 함께 LASSO) 통계를 이용하여 인색한 완전 매개변수 모델을 작제하였다. 이 방법에서 합리적인 위험 비율을 갖는 일부 단백질은 이들이 모델에서 이미 단백질에 의해 포착되는 정보를 전달함에 따라 제외되었고 (CRP, 예를 들어) 반면에 더 낮은 일변량 위험 비율을 가진 다른 단백질은 이들이 제공한 독특한 정보 때문에 유지된다. LASSO 선택된 단백질의 생물학적 기능은 본원에서 논의된다.
CVD9 단백질 위험 스코어는 프라밍햄 2차 위험 스코어 보다 더 양호하게 수행하였고 (D'Agostino et al., Am Heart J. 2000;139:272-281), 이는 전통적 위험 요소에 의존한다. 사건 집단에서 유의미하게 상이한 임상 변수 예컨대, 2차 모델에서 연령, 성별, 당뇨병 또는 추정된 사구체 여과율 (eGFR) 포함은 발견 집단 (표 13)에서 순 재분류 지수 및 4분위간 위험 비율에서 CVD9의 보통의 개선만이 제공된다. CVD9를 가진 단백질 또는 이들을 대신한 유사한 모델의 그 평가를 제안하지 않아도, 후자가 여전히 장기간 위험의 더 나은 인디케이터 및 치료의 특이적 표적임에 따라, 전통적 위험 요소와 관련된 위험을 내재하는 생물학을 CVD9가 이미 요약하는 것이 가능하다. 그러나, CVD9 단백질 수준은 특히 극단적인 위험 (도 6 및 7)의 환자에 대하여 프라밍햄 보다 단기 심혈관 위험의 우수한 개별화된 평가를 제공하는 것은, 짐작컨대 이들이 심혈관 합병증과 관련된 경로가 활성화되는지 여부 및 말단-장기 손상이 발생하는지 여부를 지시하기 때문이다 (예를 들면 트로포닌; 참고 Beatty et al., JAMA Intern Med. 2013;173:763-769).
연구는, 고 처리량, 대규모 단백체 플랫폼을 이용한, 심혈관 위험의 제1 대규모 단백체 분석이다. 상기 접근법은 수많은 새로운 개별 단백질 바이오마커의 발견을 초래하였고 2차 심혈관 사건의 단기 위험 예측용 우수한 성능을 가진 강력한 다중-가변형 위험 예측 모델의 작제를 이끌었다. 연구는 2개 대륙에 걸쳐 결과 사건의 탁월한 판결을 가진 2개의 큰, 잘-특성화된 집단에서 수행되었다. 과학자의 숙련된 패널과 협력하여, 미국 국립 암 협회는 임상 시험에서 환자 돌봄 안내용 오믹스-기반 기술의 준비를 측정하기 위해 사용될 수 있는 기준의 체크리스트를 개발하였다. 시료 품질은 한 실험실로부터 보고된 오믹스 발견이 다른 곳에서 복제할 수 없는 중요한 이유로서 주목되었다. 따라서, 학회 (Heart and Soul) 및 임상 실무 표준 (HUNT3)의 대표인, 시료 품질의 범위를 거쳐 단백체 분석을 수행하였고 발견은 시료 품질의 상기 발견을 거쳐 강력하다.
확립된 관상동맥 심장 질환 (CHD)을 가진 고-위험 대상체의 집단에 관해 초기 조사를 목적성으로 집중하였다. 더 낮은 위험 일반 집단에서 또는 심지어 CHD를 가진 더 높은 위험 개체에서 정확한 심혈관 위험 예측에 대하여 추가의 필요성이 있다. 이들 연구는 현재 다른 집단으로 진행중이다. 또 다른 제한은 정량화된 1130 보다 더 많은 단백질이 혈액에 있다는 것이다. 이들이 동일한 경로이고 따라서 이미 평가한 단백질에 불필요함에 따라 그들의 평가가 심혈관 위험 평가를 개선하는지를 알지 못했다. 본 연구에서 보고된 것보다 더욱더 큰 수의 단백질을 평가하는 연구는 또한 진행중이다.
요약하면, 2 백만 넘는 개별 단백질 측정으로, 현재까지 심혈관 위험의 최대 단백체 연구를 성공적으로 수행하였고, 위험의 수많은 신규 바이오마커를 확인하였고 우수한 및 강력한 성능을 가진 위험 예측 모델을 입증하였다.
표 14: 심혈관 위험과 관련된 개별 단백질의 표. CVD9 패널에서 바이오마커는 볼드체이다. 위험 비율 (HR)이 1 초과이면, 바이오마커의 증가된 수준은 증가된 위험과 관련되고; HR이 1 미만이면, 바이오마커의 감소된 수준은 증가된 위험과 관련된다.
표적 UniProt ID Q4/Q1 HR HR 당 표준 편차 연속 HR에 대한 p-값
안지오포이에틴 -2 O15123 3.13 1.67 <1e-16
MMP12 P39900 3.52 1.65 <1e-16
T 세포막 단백질 TIM-3 Q8TDQ0 2.98 1.61 <1e-16
인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 P18065 2.93 1.58 <1e-16
TNF R-II P20333 3.33 1.56 <1e-16
폴라스타틴-유사 3 O95633 3.52 1.56 <1e-16
혈액여과액 CC 케모카인 1 Q16627 2.63 1.55 <1e-16
β 2-마이크로글로불린 P61769 3.58 1.54 <1e-16
트롬보스폰딘-2 P35442 3.19 1.54 <1e-16
MMP-7 P09237 3.54 1.53 <1e-16
엔도스타틴 P39060 2.45 1.52 <1e-16
카텝신 H P09668 4.06 1.52 <1e-16
EPH 수용체 B2 P29323 2.20 1.50 <1e-16
인터류킨-18 결합 단백질 O95998 2.55 1.49 <1e-16
코르딘-유사 1 Q9BU40 2.87 1.49 <1e-16
시스타틴 C P01034 3.54 1.49 <1e-16
보체 C9 P02748 2.81 1.48 8.80E-14
CCL18 / PARC P55774 2.55 1.47 1.11E-16
보체 C7 P10643 3.09 1.47 <1e-16
RELT 종양 괴사 인자 수용체(recepto) Q969Z4 3.23 1.46 <1e-16
재기드(Jagged)- P78504 2.17 1.45 3.66E-15
네트린 수용체 UNC5H3
 O95185 3.15 1.44 <1e-16
에프린-A4 P52798 3.37 1.44 <1e-16
뇌-특이적 세린 프로테아제 4 Q9GZN4 2.54 1.44 <1e-16
신경아세포종 억제제 (종양유발성 1) | DAN P41271 3.24 1.43 <1e-16
에프린 유형-A 수용체 2 P29317 2.86 1.43 <1e-16
스폰딘-1 Q9HCB6 2.99 1.42 <1e-16
페리오스틴 Q15063 2.11 1.40 6.08E-12
혈관 내피 성장 인자 A P15692 2.43 1.40 1.02E-12
스캐빈져 수용체 부류 F 부재 1 Q14162 2.90 1.39 <1e-16
α1 - 항키모트립신 복합체 P07288, P01011 2.53 1.39 1.95E-14
어댑터 단백질 Crk-I P46108 2.71 1.39 <1e-16
에프린-A5 P52803 2.35 1.37 2.89E-15
내피 세포-선택적 부착 분자 Q96AP7 2.13 1.37 1.02E-14
글루타티온 S-전이효소 Pi 1 P09211 2.37 1.37 1.27E-12
사멸 수용체 6 | DR6 O75509 1.98 1.36 1.35E-10
대식세포-캡핑 단백질 P40121 3.01 1.36 <1e-16
코일형-코일 도메인-함유 단백질 80 Q76M96 2.07 1.35 1.36E-10
림프구-활성화 유전자 3 P18627 2.06 1.35 2.47E-10
Ck-β-8-1 | 대식세포 염증 단백질 3 스플라이스 변이체 P55773 1.84 1.35 1.26E-08
엘라핀 P19957 2.18 1.35 9.09E-12
TIMP-1 P01033 3.94 1.34 <1e-16
HSP 70 P08107 2.08 1.34 1.24E-10
스탄니오칼신-1 P52823 2.29 1.34 2.62E-11
면역글로불린 G Fc 영역 수용체 III-B O75015 1.91 1.34 2.53E-10
분비성 백혈구 프로테아제 억제제 P03973 2.37 1.34 7.91E-11
TRAIL R4 Q9UBN6 2.02 1.33 1.29E-09
MMP-3 P08254 2.40 1.33 1.36E-09
췌장 호르몬PH P01298 2.19 1.33 1.18E-10
보존된 도파민 신경영양 인자 Q49AH0 1.82 1.32 5.46E-10
시스타틴 D P28325 2.11 1.32 9.36E-10
GPVI Q9HCN6 1.79 1.32 3.09E-09
카텝신 Z/X/P Q9UBR2 2.07 1.32 9.36E-10
델타-유사 단백질 1 O00548 3.28 1.31 <1e-16
MPIF-1 P55773 1.88 1.31 2.73E-09
칼리크레인 11 Q9UBX7 1.86 1.31 1.22E-11
인터류킨-1 수용체-유사 1 | ST2 Q01638 2.02 1.30 1.91E-09
신호전달 림프성 활성화 분자 5 Q9UIB8 2.49 1.30 9.99E-16
TFF3 Q07654 3.62 1.30 3.50E-13
PAFAH β 하부단위 P68402 2.41 1.29 7.94E-14
인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질-1 P08833 1.87 1.29 1.11E-08
CD48 P09326 2.07 1.29 4.61E-10
레닌 P00797 1.70 1.29 1.67E-08
뉴로리긴 4, X-연결 Q8N0W4 2.24 1.29 1.91E-12
B 림프구 화학주성 O43927 2.34 1.29 1.24E-11
임신-연관된 혈장 단백질-A Q13219 1.69 1.29 6.82E-08
uPAR Q03405 3.00 1.28 3.77E-13
레시스틴 Q9HD89 1.77 1.28 2.26E-08
푸코실전달효소 5 Q11128 1.55 1.28 8.30E-07
기질 세포-유도 인자 1 P48061 1.79 1.28 2.17E-07
니도겐 P14543 1.67 1.28 1.11E-07
TNF-유사 리간드 1A O95150 2.66 1.28 6.61E-13
높은 온도 요건 세린 펩티다아제 A2 O43464 2.01 1.28 6.35E-09
인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질-7 Q16270 1.78 1.28 1.55E-07
인터류킨-1 수용체 1 P14778 1.83 1.27 1.12E-06
비-췌장 분비성 포스포리파아제 A2 P14555 1.98 1.27 5.23E-09
안지오포이에틴 -관련 단백질 4 Q9BY76 2.84 1.27 4.93E-11
지방산 결합 단백질, 심장-유형 P05413 2.58 1.27 1.29E-10
지질다당류-결합 단백질 P18428 1.99 1.27 1.80E-06
인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 IGF-I sR P08069 1.75 1.27 9.87E-07
테나신-C P24821 1.89 1.27 3.14E-07
X-연결된 엑토디스플라신-A2 수용체 | XEDAR Q9HAV5 3.64 1.27 <1e-16
트로포닌 I, 심장 P19429 2.94 1.27 1.01E-12
Bone sialoprotein 2 P21815 1.79 1.27 7.52E-08
인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질-6 P24592 2.29 1.26 3.04E-11
마트릴린-2 O00339 1.89 1.26 4.44E-07
T-림프구 표면 항원 Ly-9 Q9HBG7 1.56 1.26 1.79E-06
라일린(Layilin) Q6UX15 2.50 1.26 1.42E-09
dCTP 피로포스파타아제 1 Q9H773 1.59 1.26 7.35E-06
피브리노겐 γ-쇄 이량체 P02679 1.98 1.25 3.29E-06
EPH 수용체 B6 O15197 1.79 1.25 3.26E-09
탄산무수화효소 III P07451 1.88 1.25 5.33E-07
산화된 낮은-밀도 지질단백질 수용체 1 P78380 1.89 1.25 2.37E-07
시스타틴 SA P09228 1.59 1.25 2.82E-06
섬유아세포 성장 인자 7 P21781 2.08 1.25 2.90E-12
뉴렉소필린-1 P58417 0.58 0.75 1.11E-08
소기(Soggy)-1 Q9UK85 0.54 0.75 2.57E-08
15-하이드록시프로스타글란딘 탈수소효소 P15428 0.51 0.74 1.93E-08
단백질 C P04070 0.38 0.74 1.29E-13
섬유아세포 활성화 단백질 α Q12884 0.49 0.74 1.47E-06
TWEAK O43508 0.44 0.74 4.06E-06
혈관 내피 성장 인자 수용체 2 P35968 0.47 0.74 2.21E-10
보체 C1q 결합 단백질 Q07021 0.49 0.74 9.01E-05
안지오스타틴 P00747 0.48 0.73 5.89E-11
ErbB3 P21860 0.39 0.72 2.03E-10
GDF11 O95390 0.41 0.72 8.75E-09
BMP-1 P13497 0.39 0.71 2.54E-13
세포 부착 종양유전자-조절 CDO Q4KMG0 0.39 0.70 9.06E-14
CK-MM P06732 0.45 0.70 3.60E-11
카르노신 디펩티다아제 1 Q96KN2 0.36 0.69 <1e-16
cAMP 및 cGMP 포스포디에스테라아제 11A Q9HCR9 0.39 0.69 5.18E-12
CK-MB P12277 P06732 0.41 0.69 5.06E-13
카드헤린-3 P22223 0.41 0.67 1.11E-16
광-종양유전자 티로신-단백질 키나아제 수용체 Ret P07949 0.42 0.66 4.89E-13
α2 - 항플라스민 P08697 0.37 0.64 <1e-16
성장 호르몬 수용체 P10912 0.29 0.63 <1e-16
EGF 수용체 P00533 0.29 0.60 <1e-16
실시예 5: GDF11 및 FSTL3 모델
3 콕스 비례 위험 모델이 생성 및 비교되었다.
· GDF11: GDF11 단백질을 가진 일변량 단백질 모델
· FSTL3: 폴리스타틴-관련 단백질 3 (FSTL3)을 가진 일변량 단백질 모델
· GDF11.FSTL3: GDF11 및 FSTL3을 가진 조합 단백질 모델
모델간 비교를 위하여, ANOVA, 선형 예측변수의 AQ4/Q1 위험 비율, 4-년 위험 확률의 NRI, 및 4 년 이내 통합된 AUC는 계산되었다. GDF11.FSTL3 모델은 모든 평가 방법을 가진 최상의 모델이었다.
특이점 샘플은 분석에서 제외되었다. 모든 모델은 베이스 10으로 형질전환된 log로 계산되었고 표준화되었다.
모델 속으로 2개 단백질 조합 전에, 스피어먼 상관관계는 GDF11과 FSTL3 사이의 관계를 체크하기 위해 적용되었다. 2개 단백질 사이의 상관관계는 유의미하지만 (p = 3.123 - 12), 그러나 스피어먼 상관관계는 강하지 않다 (rho = -0.2251). 표 15는 R의 상관관계 시험의 결과를 보여준다.
표 15: GDF11과 FSTL3 사이의 스피어먼 상관관계 시험.
스피어먼 순위 상관관계 rho
data: gdf11 and fstl3
S = 1.68e+08, p-value = 3.123e-12
alternative hypothesis: true rho is not equal to 0
sample estimates:
rho
-0.2251
GDF11과 FSTL3 사이의 상관관계는 도 15에서 보여진다. RFU는 베이스 10을 이용하여 log 공간으로 전환되었다. 왼쪽 도는 모든 샘플의 상관관계를 보여주고 오른쪽 도는 생략된 한 샘플이 없는 상관관계를 보여주고, 이는 높은 GDF11 값을 가졌다. 흑색 및 적색 서클은 무-사건 샘플 및 사건 샘플, 각각을 의미한다.
3개의 콕스 비례 위험 모델이 생성되었다: GDF11, FSTL3, 및 GDF11.FSTL3. GDF11, FSTL3 모델은 단일 단백질을 가진 콕스 모델이고 GDF11.FSTL3은 2 단백질을 가진 조합된 모델이다. 모델의 적합화 전에, 특이점은 제외되었고 RFU 값은 log 형질전환 및 표준화되었다. 표 16 및 17은 ANOVA 일탈성 표를 가진 조합된 모델과 단일 모델 사이의 비교를 보여준다. 조합된 모델은 단일 단백질 모델로부터 유의미하게 개선된다. GDF11 대 GDF11.FSTL3 및 FSTL3 대 GDF11.FSTL3에 대한 p-값은 2e-16 및 3.5e-06, 각각이다.
표 16: GDF11과 GDF11.FSTL3 모델 사이의 ANOVA 시험
편차값 표 분석
Cox model: response is s
Model 1: ~ GDF11.2765.4.3
Model 2: ~ GDF11.2765.4.3 + FSTL3.3438.10.2
loglik Chisq Df P(>|Chi|)
1 -2936
2 -2896 79 1 <2e-16 ***
---
Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
표 17: FSTL3과 GDF11.FSTL3 모델 사이의 ANOVA 시험
편차값 표 분석
Cox model: response is s
Model 1: ~ FSTL3.3438.10.2
Model 2: ~ GDF11.2765.4.3 + FSTL3.3438.10.2
loglik Chisq Df P(>|Chi|)
1 -2907
2 -2896 21.5 1 3.5e-06 ***
---
Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
표 18은 각각의 모델에 대하여 선형 예측변수의 Q4/Q1 위험 비율을 보여준다. 조합된 모델은 단일 모델보다 더 높은 위험 비율을 보여준다. 4분위수는 각 콕스 모델의 선형 예측변수에 의해 한정된다.
표 18: Q4/Q1 위험 비율
Q4/Q1 HR 하한 .95 상한 .95
GDF11 2.475 1.894 3.233
FSTL3 3.637 2.738 4.830
GDF11.FSTL3 4.080 3.068 5.426
도 16은 모든 모델의 각 4분위수의 생존 곡선을 보여준다. 1st 내지 4th 4분위수는 흑색, 적색, 녹색 및 청색으로 기재된다 (최상부부터 최하부까지, 라인은 흑색, 적색, 녹색, 그 다음 청색이다). 그늘짐은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. GDF11.FSTL3 모델의 1st와 4th 4분위수 사이의 거리는 단일 단백질 모델보다 더 넓다. 게다가, GDF11.FSTL3 모델의 2nd와 3rd 4분위수 사이의 거리는 또한 단일 단백질 모델보다 더 넓다.
GDF11 모델 및 GDF11.FSTL3 모델에 대한 생존 곡선 사이의 비교는 도 3에서 보여진다. 왼쪽 도는 저위험 그룹의 비교를 보여주고 오른쪽 도는 고위험 그룹의 비교를 보여준다. 흑색 및 적색은 GDF11 모델 및 GDF11.FSTL3 모델, 각각을 나타낸다. GDF11.FSTL3 모델에 의해 확인된 저위험 그룹은 GDF11 모델에 의해 확인된 저위험 그룹 보다 더 적은 사건 샘플을 갖고, GDF11.FSTL3 모델에 의해 확인된 고위험 그룹은 GDF11 모델에 의해 확인된 고위험 그룹 보다 더 많은 사건 샘플을 가졌다. GDF11.FSTL3 모델은 따라서 샘플의 모든 그룹에 대하여 더욱 정확하였다. FSTL3의 봉입체는 모든 고위험 그룹 및 저위험 그룹에 대하여 모델을 개선하였다.
NRI는 단일 단백질 모델 GDF11 및 FSTL3 및 GDF11.FSTL3 사이에서 계산되었다. 확률은 4 년 내에 계산되었고 기준선 위험은 카플란-마이어 추정량으로 추정되었다. 표에서 하부 및 상부는 NRI의 95% 신뢰 구간이고, 부트스트랩핑으로 추정된다. GDF11은 사건 샘플의 NRI를 개선하고 FSTL3은 비-사건 샘플의 NRI를 개선한다.
표 19: 단일 단백질 모델과 GDF11.FSTL3 모델 사이의 NIR.
GDF11 대 GDF11.FSTL3 FSTL3 대 GDF11.FSTL3
추산 하한 상한 추산 하한 상한
NRI 0.4326 0.28552 0.5772 NRI 0.31532 0.17287 0.4639
NRI+ 0.1446 0.01143 0.2655 NRI+ 0.22840 0.10174 0.3612
NRI- 0.2880 0.21878 0.3563 NRI- 0.08692 0.01022 0.1653
Pr(Up|Case) 0.5721 0.50573 0.6329 Pr(Up|Case) 0.61422 0.55081 0.6807
Pr(Down|Case) 0.4276 0.36706 0.4942 Pr(Down|Case) 0.38582 0.31923 0.4491
Pr(Down|Ctrl) 0.6441 0.60935 0.6780 Pr(Down|Ctrl) 0.54345 0.50504 0.5828
Pr(Up|Ctrl) 0.3560 0.32190 0.3906 Pr(Up|Ctrl) 0.45653 0.41738 0.4949
도 18은 GDF11 및 GDF11.FSTL3 (왼쪽), 및 FSTL3 및 GDF11.FSTL3 (오른쪽) 사이의 4-년 확률의 비교를 보여준다. 흑색, 적색, 및 녹색 점은 대조군, 사례, 및 제4년에서 검열받은 샘플을 기재한다.
4 년 내에 통합된 AUC (C인덱스(Cindex))는 표 20에서 보여진다. 95% 신뢰 구간은, NRI와 유사한, 부트스트랩핑으로 계산되었다.
표 20: 4 년 내에 통합된 AUC (C인덱스(Cindex)).
C인덱스 ( Cindex ) 하한.95 상한.95
GDF11 0.5882 0.5555 0.6096
FSTL3 0.6038 0.5786 0.6321
GDF11.FSTL3 0.6286 0.6050 0.6566
제4년에서 ROC 곡선은 도 19에서 보여진다. 범례에서 에서 숫자는 제4년에서 AUC (통합되지 않은 AUC)를 지칭한다.
3개 콕스 비례 위험 모델은 단일 마커 모델 및 조합 마커 모델에 대하여 몇 개의 평가 통계로 비교되었다. GDF11 및 FSTL3을 포함하는, 조합 모델은 모든 평가 값에 따라 최상으로 수행하였다.
하기 박스는 상기 실시예에서 사용된 3개 모델을 보여준다.
Figure pct00039
Figure pct00040
실시예 6: 특이적 사건 그룹에 대한 GDF11 및 FSTL3 모델
GDF11, FSTL3, 및 GDF11.FSTL3의 콕스 모델은, 모델이 각각의 CV 사건 유형에 대하여 수행하는 방법을 측정하기 위해, CHF 및 사망 샘플, 및 혈전성 사건 샘플로 별도로 구비되었다. 4 년 내에 AUC (C인덱스(Cindex))를 통합한, 모델의 선형 예측변수의 Q4/Q1 위험 비율, 및 4 년 위험 확률의 NRI는 계산되었다. 위험 확률의 계산을 위하여, 카플란-마이어 추정량은 기준선 위험으로서 사용되었다.
GDF11, FSTL3, 및 GDF11.FSTL3을 가진 콕스 비례 위험 모델을 특이적 사건 그룹: CHF 및 사망 그룹, 및 혈전성 사건 그룹으로 맞추었다. CHF 및 사망 그룹은 CHF(125), CVDD사망(55), 사망(135) 및 NONE(472)를 포함한다. 혈전성 사건 그룹은 MI(104), 뇌졸중(30), TIA(16) 및 NONE(472)를 포함한다. 비-사건 샘플인, NONE는 모든 그룹에서 사용되었다. 모델의 평가를 위하여, 4 년 내에 AUC를 통합한, 선형 예측변수의 Q4/Q1 위험 비율, 및 4 년 위험 확률의 NRI는 게산되었다. 위험 확률은 카플란-마이어 추정량의 기준선 위험으로 계산되었다.
표 21은, 위험 비율 및 이의 95% 신뢰 구간의 반대인, Q4/Q1 위험 비율을 보여준다. GDF11 및 FSTL3의 Q4/Q1 위험 비율은 DHF.DEATH와 혈전성 사건 샘플 사이에서 유의미하게 상이하지 않지만, 그러나 GDF11.FSTL3의 위험 비율은 CHF.DEATH 그룹 보다 혈전성 사건 그룹으로 더 양호하다.
표 21: 각각의 모델 및 그룹의 Q4/Q1 위험 비율.
$GDF11
Q4/Q1 HR Q1/Q4 HR CI Lower CI Upper
All 2.475 0.4040 1.894 3.233
CHF.DEATH 2.726 0.3668 1.964 3.784
Thrombotic.Event 2.743 0.3645 1.698 4.432
$FSTL3
Q4/Q1 HR Q1/Q4 HR CI Lower CI Upper
All 3.637 0.2750 2.738 4.830
CHF.DEATH 4.478 0.2233 3.125 6.416
Thrombotic.Event 4.605 0.2171 2.731 7.765
$GDF11.FSTL3
Q4/Q1 HR Q1/Q4 HR CI Lower CI Upper
All 4.080 0.2451 3.068 5.426
CHF.DEATH 4.394 0.2276 3.069 6.291
Thrombotic.Event 5.493 0.1821 3.185 9.473
도 1은 GDF11.FSTL3 모델의 각 그룹의 선형 예측변수의 4분위수의 생존 곡선을 보여준다. 1st 내지 4th 4분위수는 흑색 (최상부 라인), 적색 (제2 라인 아래), 녹색 (제3 라인 아래) 및 청색 (최하부 라인)으로 기재된다. 그늘짐은 95% 신뢰 구간을 보여준다. 혈전성 사건 (저위험 그룹)의 1st 4분위수는 더 적은 사건을 보여준다. 이는 모델이 혈전성 사건에 상당히 민감할 수 있음을 제시한다.
4 년 내에 통합된 AUC (C인덱스(Cindex)) 및 95% 신뢰 구간은 표 22에서 보여진다. C인덱스(Cindex)와 함께, 심지어 Q4/Q1 위험 비율이 그룹 사이에서 상이한 것으로 발견되었어도, CHF.DEATH 그룹과 혈전성 사건 그룹 사이에서 유의차가 없다.
표 22: 4 년 내에 통합된 AUC (C인덱스(Cindex))
$GDF11
Cindex Cindex.CI.lower.95 Cindex.CI.upper.95
All 0.5882 0.5614 0.6165
CHF.DEATH 0.5892 0.5582 0.6220
Thrombotic.Event 0.6057 0.5641 0.6503
$FSTL3
Cindex Cindex.CI.lower.95 Cindex.CI.upper.95
All 0.6038 0.5808 0.6344
CHF.DEATH 0.6018 0.5754 0.6482
Thrombotic.Event 0.5994 0.5667 0.6600
$GDF11.FSTL3
Cindex Cindex.CI.lower.95 Cindex.CI.upper.95
All 0.6286 0.6047 0.6558
CHF.DEATH 0.6308 0.6020 0.6645
Thrombotic.Event 0.6292 0.5939 0.6777
결론적으로, GDF11, FSTL3, 및 GDF11.FSTL3의 콕스 모델은 특이적 샘플 그룹으로 생성되었다. GDF11.FSTL3 모델은 혈전성 사건 그룹으로 Q4/Q1 위험 비율을 갖는 최상의 결과를 보여준다. C인덱스(Cindex)로, 모든 모델은 유사한 결과를 보여주었다.
실시예 7: GDF11 및 GASP1 / GASP2 모델
2개의 다른 단백질, GASP1 (WFIKKN2, SwissProt Q8TEU8) 및 GASP2 (WFIKKN1, SwissProt Q96D09)과 GDF11의 조합이 또한 시험되었다.
하기 4개의 콕스 모델이 생성되었다: (1) GDF11, GDF11 단백질을 가진 콕스 모델; (2) GDF11.WFIKKN1, GDF11 및 GASP2를 가진 콕스 모델; (3) GDF11.WFIKKN2, GDF11 및 GASP1을 가진 콕스 모델; 및 (4) GDF11.WFIKKN1.WFIKKN2, GDF11, GASP1, 및 GASP2를 가진 콕스 모델. 모델을 창출하기 전에, 단백질 측정은 가우스(0,1)로 표준화되었다.
선형 예측변수의 Q4/Q1 위험 비율은 모델에 대하여 계산되었다. Q1 그룹은 저위험 그룹으로서 추정되고 Q4 그룹은 고위험 그룹으로서 추정된다. GASP2(WFIKKN1) 부가는 GDF11 모델을 개선하지 않는 것으로 발견되었지만, 그러나 WFIKKN2 부가는 (2.432부터 2.719까지) 일부 개선을 보여주었다. Q4/Q1 위험 비율의 값 및 4분위수의 생존 곡선은 표 23 및 도 21에서 보여진다.
표 23. 각 모델의 Q4/Q1 위험 비율.
## Q4/Q1 HR Q1/Q4 HR CI Lower CI Upper
## GDF11 2.432 0.4111 1.864 3.175
## GDF11.WFIKKN1 2.392 0.4180 1.830 3.127
## GDF11.WFIKKN2 2.719 0.3678 2.071 3.569
## GDF11.WFIKKN1.WFIKKN2 2.758 0.3626 2.102 3.619
또한, 모델은 ANOVA 일탈성 표와 비교되었다. GDF11과 조합된 모델 사이에서 비교의 R 결과는 아래 보여진다. GDF11.WFIKKN2 및 GDF11.WFIKKN1.WFIKKN2는 GDF11 모델 (p = 3.1e-05, 0.00015, 각각)과 비교된 경우 유의미하였다. WFIKKN1 부가는 유의성 (p = 0.38)을 보여주지 않았다. p 값은 아래 강조된다.
Figure pct00041
GDF11과 GDF11.WFIKKN1 사이의 비교
## 편차 표 분석
## Cox model: response is s
## Model 1: ~ GDF11.2765.4.3
## Model 2: ~ GDF11.2765.4.3 + WFIKKN1.3191.50.2
## loglik Chisq Df P(>|Chi|)
## 1 -2938
## 2 -2937 0.77 1 0.38
Figure pct00042
GDF11과 GDF11.WFIKKN2 사이의 비교
## 편차 표 분석
## Cox model: response is s
## Model 1: ~ GDF11.2765.4.3
## Model 2: ~ GDF11.2765.4.3 + WFIKKN2.3235.50.2
## loglik Chisq Df P(>|Chi|)
## 1 -2938
## 2 -2929 17.4 1 3.1e-05 ***
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
Figure pct00043
GDF11 및 GDF11.WFIKKN1.WFIKKN2 사이의 비교
## 편차 표 분석
## Cox model: response is s
## Model 1: ~ GDF11.2765.4.3
## Model 2: ~ GDF11.2765.4.3 + WFIKKN1.3191.50.2 + WFIKKN2.3235.50.2
## loglik Chisq Df P(>|Chi|)
## 1 -2938
## 2 -2929 17.6 2 0.00015 ***
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
모델 평가를 위하여, NRI 계산은 또한 수행되었다. 확률은 4 년 내에 계산되었다. GASP1(WFIKKN2) 부가는 특히 비-사건 샘플 (0.12)로 NRI (0.16)를 개선하였다. 상기 결과로부터, GASP1은 진음성율을 개선할 수 있다. 그에 반해서, GASP2는 0.1 초과의 NRI를 개선하지 않았다. NRI의 R 결과는 아래 보여진다.
Figure pct00044
GDF11 및 GDF11.WFIKKN1 사이의 NRI
## ----- GDF11 vs GDF11.WFIKKN1 -----
## Estimate Lower Upper
## NRI 0.05855 -0.08109 0.20126
## NRI+ 0.09245 -0.02881 0.20405
## NRI- -0.03391 -0.11142 0.04671
## Pr(Up|Case) 0.54627 0.48586 0.60175
## Pr(Down|Case) 0.45382 0.39769 0.51467
## Pr(Down|Ctrl) 0.48303 0.44431 0.52336
## Pr(Up|Ctrl) 0.51694 0.47665 0.55573
Figure pct00045
GDF11 및 GDF11.WFIKKN2 사이의 NRI
## ----- GDF11 vs GDF11.WFIKKN2 -----
## Estimate Lower Upper
## NRI 0.16315 0.02639 0.3063
## NRI+ 0.04422 -0.07236 0.1727
## NRI- 0.11892 0.04351 0.1919
## Pr(Up|Case) 0.52206 0.46394 0.5861
## Pr(Down|Case) 0.47784 0.41338 0.5363
## Pr(Down|Ctrl) 0.55948 0.52176 0.5960
## Pr(Up|Ctrl) 0.44056 0.40405 0.4783
Figure pct00046
GDF11 및 GDF11.WFIKKN1.WFIKKN2 사이의 NRI
## ----- GDF11 vs GDF11.WFIKKN1.WFIKKN2 -----
## Estimate Lower Upper
## NRI 0.13460 -0.01276 0.2759
## NRI+ 0.02732 -0.09310 0.1643
## NRI- 0.10728 0.02863 0.1758
## Pr(Up|Case) 0.51364 0.45354 0.5820
## Pr(Down|Case) 0.48632 0.41779 0.5467
## Pr(Down|Ctrl) 0.55365 0.51428 0.5879
## Pr(Up|Ctrl) 0.44637 0.41211 0.4857
모델 사이의 4-년-확률은 도 22에서 보여진다.
마지막으로, AUC 계산은 모델 사이의 평가를 위하여 수행되었다. 아래 결과에 따라서, 어느 단백질도 GDF11 모델을 개선하지 않았다. 각 모델에 대하여 ROC 곡선은 도 23에서 보여진다. 각 모델에 대하여 ROC 곡선은 유사하였다.
Figure pct00047
GDF11
## ----- -----
## Cindex lower.95 upper.95
## 1 0.586 0.5579 0.6143
Figure pct00048
GDF11.WFIKKN1
## ----- -----
## Cindex lower.95 upper.95
## 1 0.5849 0.5572 0.6133
Figure pct00049
GDF11.WFIKKN2
## ----- -----
## Cindex lower.95 upper.95
## 1 0.5994 0.5717 0.6305
Figure pct00050
GDF11.WFIKKN1.WFIKKN2
## ----- -----
## Cindex lower.95 upper.95
## 1 0.5988 0.5712 0.63
요약하면, GASP1 (WFKKN2)은 GDF11 모델을 개선할 수 있지만, 그러나 그 개선은 작다. GASP2 (WFKKN1)는 GDF11 모델을 개선하지 않았다.
상기 실시예에서 사용된 콕스 모델은 아래 보여진다.
Figure pct00051
GDF11
## Call:
## coxph(formula = f, data = x, x = T)
##
## n= 938, number of events= 465
##
## coef exp(coef) se(coef) z Pr(>|z|)
## GDF11.2765.4.3 -0.3325 0.7171 0.0578 -5.75 8.7e-09 ***
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
##
## exp(coef) exp(-coef) lower .95 upper .95
## GDF11.2765.4.3 0.717 1.39 0.64 0.803
##
## Concordance= 0.602 (se = 0.014 )
## Rsquare= 0.037 (max possible= 0.998 )
## Likelihood ratio test= 35.6 on 1 df, p=2.42e-09
## Wald test = 33.1 on 1 df, p=8.75e-09
## Score (logrank) test = 26.6 on 1 df, p=2.53e-07
Figure pct00052
GDF11.WFIKKN1
## Call:
## coxph(formula = f, data = x, x = T)
##
## n= 938, number of events= 465
##
## coef exp(coef) se(coef) z Pr(>|z|)
## GDF11.2765.4.3 -0.3206 0.7257 0.0590 -5.43 5.6e-08 ***
## WFIKKN1.3191.50.2 -0.0409 0.9599 0.0466 -0.88 0.38
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
##
## exp(coef) exp(-coef) lower .95 upper .95
## GDF11.2765.4.3 0.726 1.38 0.646 0.815
## WFIKKN1.3191.50.2 0.960 1.04 0.876 1.052
##
## Concordance= 0.601 (se = 0.014 )
## Rsquare= 0.038 (max possible= 0.998 )
## Likelihood ratio test= 36.4 on 2 df, p=1.26e-08
## Wald test = 34.3 on 2 df, p=3.55e-08
## Score (logrank) test = 28.8 on 2 df, p=5.65e-07
Figure pct00053
GDF11.WFIKKN2
## Call:
## coxph(formula = f, data = x, x = T)
##
## n= 938, number of events= 465
##
## coef exp(coef) se(coef) z Pr(>|z|)
## GDF11.2765.4.3 -0.3369 0.7140 0.0575 -5.86 4.6e-09 ***
## WFIKKN2.3235.50.2 0.2014 1.2232 0.0484 4.16 3.2e-05 ***
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
##
## exp(coef) exp(-coef) lower .95 upper .95
## GDF11.2765.4.3 0.714 1.401 0.638 0.799
## WFIKKN2.3235.50.2 1.223 0.818 1.112 1.345
##
## Concordance= 0.609 (se = 0.014 )
## Rsquare= 0.055 (max possible= 0.998 )
## Likelihood ratio test= 53 on 2 df, p=3.18e-12
## Wald test = 50.7 on 2 df, p=9.63e-12
## Score (logrank) test = 42.1 on 2 df, p=7.26e-10
Figure pct00054
GDF11.WFIKKN1.WFIKKN2
## Call:
## coxph(formula = f, data = x, x = T)
##
## n= 938, number of events= 465
##
## coef exp(coef) se(coef) z Pr(>|z|)
## GDF11.2765.4.3 -0.3294 0.7193 0.0589 -5.60 2.2e-08 ***
## WFIKKN1.3191.50.2 -0.0256 0.9747 0.0466 -0.55 0.58
## WFIKKN2.3235.50.2 0.1989 1.2201 0.0486 4.10 4.2e-05 ***
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
##
## exp(coef) exp(-coef) lower .95 upper .95
## GDF11.2765.4.3 0.719 1.39 0.641 0.807
## WFIKKN1.3191.50.2 0.975 1.03 0.890 1.068
## WFIKKN2.3235.50.2 1.220 0.82 1.109 1.342
##
## Concordance= 0.609 (se = 0.014 )
## Rsquare= 0.055 (max possible= 0.998 )
## Likelihood ratio test= 53.2 on 3 df, p=1.62e-11
## Wald test = 51.4 on 3 df, p=4.1e-11
## Score (logrank) test = 43.7 on 3 df, p=1.73e-09

Claims (44)

  1. 하기 단계를 포함하는, 심혈관 사건 (CV)의 위험에 대한 대상체의 스크리닝 방법:
    (a) MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 N 바이오마커 (여기에서 N은 2 내지 9의 정수이다)를 포함한 바이오마커 패널을 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 대상체 유래의 샘플 내 상기 패널의 상기 N 바이오마커의 각각의 수준을 검출하는 단계.
  2. 하기 단계를 포함하는, 대상체가 CV 사건을 가질 가능성의 예측 방법:
    (a) MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 N 바이오마커 (여기에서 N은 2 내지 9의 정수이다)를 포함한 바이오마커 패널을 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 대상체 유래의 샘플 내 상기 패널의 상기 N 바이오마커의 각각의 수준을 검출하는 단계.
  3. 상기 대상체 유래의 샘플 내 MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 9개 모두의 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 심혈관 사건 (CV) 사건의 위험에 대한 대상체의 스크리닝 방법.
  4. 상기 대상체 유래의 샘플 내 MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 9개 모두의 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 대상체가 CV 사건을 가질 가능성의 예측 방법.
  5. 상기 대상체 유래의 샘플 내 GDF11 및 FSTL3의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 심혈관 사건 (CV) 사건의 위험에 대한 대상체의 스크리닝 방법.
  6. 상기 대상체 유래의 샘플 내 GDF11 및 FSTL3의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 대상체가 CV 사건을 가질 가능성의 예측 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, MMP12, 안지오포에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC 및 알파1-항키모트립신 복합체의 수준으로부터 선택된 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 7개 모두의 바이오마커의 수준이 상기 각 단백질의 대조군 수준보다 높을 경우, 그리고 GDF11 및 알파2-항플라스민으로부터 선택된 적어도 하나의 바이오마커 또는 모든 바이오마커의 수준이 상기 각 단백질의 대조군 수준보다 낮을 경우, 4 년 내에 CV 사건을 가진 상기 대상체의 가능성이 높은, 방법.
  8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, GDF11의 수준이 GDF11의 대조군 수준보다 낮고/낮거나 FSTL3의 수준이 FSTL3의 대조군 수준보다 높을 경우, 4 년 내에 CV 사건을 갖는 상기 대상체의 가능성이 높은, 방법.
  9. 제 5 항, 제 6 항, 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CV 사건이 혈전성(thrombotic) 사건인, 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 혈전성 사건이 심근경색증, 뇌졸중, 및 일시적 허혈 발작으로부터 선택되는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 MMP12의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 안지오포이에틴-2의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 보체 C7의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 심장 트로포닌 I의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 안지오포이에틴-관련 단백질 4의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 CCL18/PARC의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 알파-1-항키모트립신 복합체의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 GDF11의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 알파-2-항플라스민의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 관상동맥 질환을 갖는, 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 CV 사건의 이력을 갖지 않는, 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 대상체가 높은 미국 심장병 학회 (ACC) 위험 스코어를 갖는, 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 대상체가 중간 ACC 위험 스코어를 갖는, 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 상기 대상체가 낮은 ACC 위험 스코어를 갖는, 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 적어도 하나의 CV 사건을 갖는, 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CV 사건이 심근경색증, 뇌졸중, 울혈성 심부전, 형질전환 허혈 발작, 및 사망으로부터 선택되는, 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 및 소변 샘플로부터 선택되는, 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 샘플이 혈장 샘플인, 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 시험관내 수행되는, 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 바이오마커가 단백질 바이오마커인, 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체 유래의 상기 샘플의 바이오마커를, 바이오마커 포착 시약의 세트와 접촉시키는 단계를 포함하고,
    바이오마커 포착 시약의 상기 세트의 각각의 바이오마커 포착 시약이, 검출된 상이한 바이오마커에 특이적으로 결합하는, 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 각각의 바이오마커 포착 시약이 항체 또는 앱타머인, 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 각각의 바이오마커 포착 시약이 앱타머인, 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 적어도 하나의 앱타머가 느린 오프-레이트(off-rate) 앱타머인, 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 적어도 하나의 느린 오프-레이트 앱타머가, 변형을 갖는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10개 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, 각각의 느린 오프-레이트 앱타머가 30 분 이상, 60 분 이상, 90 분 이상, 120 분 이상, 150 분 이상, 180 분 이상, 210 분 이상, 또는 240 분 이상의 오프 레이트 (t1/ 2)로 이의 표적 단백질에 결합하는, 방법.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, CV 사건의 가능성이 상기 바이오마커 수준 및 하기로부터 선택된 추가 생체의학 정보의 적어도 하나의 항목에 기반한, 방법:
    r) 이전 심근경색증, 하나 이상의 관상혈관내 50% 초과 협착증의 혈관조영 증거, 드레드밀 또는 핵 시험에 의한 운동-유발 허혈 또는 이전 관상동맥 혈관재생으로 이루어진 상기 군으로부터 선택된 심혈관 위험 요소의 상기 존재에 상응하는 정보,
    s) 상기 개체의 물리적 기술어에 상응하는 정보,
    t) 상기 개체의 중량에서 변화에 상응하는 정보,
    u) 상기 개체의 상기 인종에 상응하는 정보,
    v) 상기 개체의 상기 성별에 상응하는 정보,
    w) 상기 개체의 흡연 이력에 상응하는 정보,
    x) 상기 개체의 알코올 사용 이력에 상응하는 정보,
    y) 상기 개체의 직업적 이력에 상응하는 정보,
    z) 심혈관 질환 또는 다른 순환 시스템 병태의 상기 개체의 가족력에 상응하는 정보,
    aa) 상기 개체 또는 상기 개체의 패밀리 구성원에서 심혈관 질환의 더 높은 위험에 상관한 적어도 하나의 유전자 마커의 상기 개체에서 상기 존재 또는 부재에 상응하는 정보,
    bb) 상기 개체의 임상 증상에 상응하는 정보,
    cc) 다른 실험실 시험에 상응하는 정보,
    dd) 상기 개체의 유전자 발현 값에 상응하는 정보, 및
    ee) 공지된 심혈관 위험 요소 예컨대 고 포화 지방, 고 염, 고 콜레스테롤의 다이어트의 상기 개체의 소비에 상응하는 정보,
    ff) 심전도, 심장초음파검사, 내막-중막 두께용 경동맥 초음파, 혈류 매개된 팽창, 맥파 속도, 발목-위팔 지수, 스트레스 심장초음파검사, 심근 관류 영상, CT에 의한 관상동맥 칼슘, 고해상도 CT 혈관조영술, MRI 영상화, 및 다른 영상화 양식으로 이루어진 상기 군으로부터 선택된 기술에 의해 수득된 상기 개체의 영상화 결과에 상응하는 정보,
    gg) 상기 개체의 약물에 관한 정보, 및
    hh) 상기 개체의 신장 기능에 관한 정보.
  39. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 의료보험 수가(medical insurance premium) 또는 생명보험 수가(life insurance premium) 결정의 목적을 위하여, CV 사건의 가능성을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 방법이, 의료 보험 또는 생명 보험에 대한 적용범위(coverage) 또는 수가(premium)를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이, 의료 자원의 이용을 예측 및/또는 관리하기 위해 상기 방법에서 비롯된 정보 이용 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이, 의료 실무진, 병원, 또는 회사로 하여금 구매 또는 결정을 하도록 하기 위하여 상기 방법에서 비롯된 정보를 이용하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 심혈관 (CV) 사건의 위험 평가용 컴퓨터-실행된 방법으로서,
    대상체에 대한 컴퓨터 바이오마커 정보를 검색하는 단계로서, 상기 바이오마커 정보는 상기 대상체 유래의 샘플 내 MMP12, 안지오포이에틴-2, 보체 C7, 심장 트로포닌 I, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, CCL18/PARC, 알파-1-항키모트립신 복합체, GDF11 및 알파-2-항플라스민으로부터 선택된 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 9개 모두의 바이오마커의 수준을 포함하는, 상기 검색 단계;
    각각의 상기 바이오마커 값의 분류를 상기 컴퓨터로 수행하는 단계; 및
    복수의 분류에 기반한 상기 개체에 대하여 CV 사건에 대한 위험의 평가의 결과를 표지하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 대상체에 대한 CV 사건의 위험의 평가의 결과를 표지하는 것은 컴퓨터 디스플레이에서 상기 결과를 디스플레이하는 것을 포함하는, 방법.
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