CN102816764A - 特异性结合于人心肌肌钙蛋白ⅰ的dna适体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的DNA适体、含有所述DNA适体的用于诊断急性心血管疾病的组合物以及含有所述DNA适体的用于诊断急性心血管疾病的诊断试剂盒。由于在特异性和稳定性上比常规用于诊断急性心血管疾病的抗体更为优越，所述特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的DNA适体可制成以高敏感度和高准确度测定人心肌肌钙蛋白I水平的生物传感器，这大大有助于急性心血管疾病的早期诊断。预期对诊断准确性的提高大有帮助。

Description

特异性结合于人心肌肌钙蛋白Ⅰ的DNA适体
技术领域
本发明涉及特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的DNA适体，以及含有所述DNA适体的用于诊断急性心血管疾病的组合物和试剂盒。
背景技术
肌钙蛋白是由三种调节蛋白(肌钙蛋白C、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T)组成的一种复合物，所述复合物连接于原肌球蛋白并位于肌肉组织中的肌动蛋白纤维之间的沟槽内，从而调节肌肉细胞的收缩和舒张。Ca2+的细胞内水平提高时，Ca2+结合于肌钙蛋白C上的特异性位点，从而在肌钙蛋白I中产生构象变化，以使肌球蛋白可结合于肌动蛋白纤维的活性位点，产生肌肉的收缩。在骨骼肌和心肌中均观察到该机能。对心肌发挥作用的肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的氨基酸序列的长度与在骨骼肌中表达的相应的氨基酸序列长度不同。
已知心肌肌钙蛋白I的表达水平在急性心血管疾病发作后迅速上升。因此，就急性心血管疾病的初步诊断而言，对该蛋白的检测是非常重要的。
适体为一种结合于特异性标靶的单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)。得益于适体对特异性标靶的高亲和性和高稳定性，最近它们被广泛地研制并活跃地应用于疾病的治疗以及诊断疾病的传感器中。适体的合成可相对容易，并且可使用细胞、蛋白甚至小的有机物质来作为它们的标靶，这使新的检测方法得以发展。此外，因为适体与先前研制的抗体相比具有更良好的特异性和稳定性，发现适体可在各种领域中广泛应用，包括治疗方法、药物递送系统、用于诊断的生物传感器的研制等等。
为诊断用途而研制的抗体使用免疫系统来制备，因此它们具有制备时间相对长、成本相对高的缺点。此外，与适体、DNA或RNA相比，上述为诊断用途而研制的抗体是具有较低稳定性的蛋白，这可阻碍高度敏感的传感器的研制。
如上所提及的，尽管基于肌钙蛋白I的抗体已研制出多种用于肌钙蛋白I的检测系统，但它们具有许多限制。因此，需要一种更为稳定的、可以低成本操作且可有效诊断初期急性心血管疾病的检测系统。
发明内容
本发明提供特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的DNA适体、包含所述DNA适体的用于诊断急性心血管疾病的组合物以及包含所述DNA适体的用于诊断急性心血管疾病的试剂盒。
然而，本发明将要实现的技术目的并非仅仅限于上面提及的目的，本领域技术人员可从下列给出的描述中清楚地理解其他目的。
本发明一方面提供特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的适体，所述特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的适体的碱基序列选自：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6。
本发明另一方面提供用于诊断急性心血管疾病的组合物，所述组合物包含特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的DNA适体。
本发明又一方面提供用于急性心血管疾病的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒使用特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的DNA适体。
由于在特异性和稳定性上比常规用于诊断急性心血管疾病的抗体更加优越，本发明的特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的DNA适体可制成生物传感器，所述生物传感器敏感且准确地测定人心肌肌钙蛋白I水平，这大大有助于急性心血管疾病的早期诊断。预期对诊断准确性的提高大有帮助。
附图说明
本发明的上述内容及其他目的、特征及其他优势将从下列结合附图的详细描述中得到更清晰的理解，其中：
图1显示由SDS PAGE所测得的肌钙蛋白I蛋白的表达。
图2显示由SDS PAGE所测得的肌钙蛋白复合物蛋白的表达。
图3显示由凝胶过滤纯化的肌钙蛋白I蛋白的分离。
图4显示由凝胶过滤纯化的肌钙蛋白复合物蛋白的分离。
图5为显示ssDNA适体与肌钙蛋白I的结合强度的图，所述结合强度根据肌钙蛋白I的特异性适体的选择，通过UV分光仪测得。
图6显示SEQ ID NO：1的适体和SEQ ID NO：2的适体的二级结构，所述SEQ ID NO：1的适体和SEQ ID NO：2的适体特异性结合于人心肌肌钙蛋白I。
图7显示SEQ ID NO：3的适体和SEQ ID NO：4的适体的二级结构，所述SEQ ID NO：3的适体和SEQ ID NO：4的适体特异性结合于人心肌肌钙蛋白I。
图8显示SEQ ID NO：5的适体和SEQ ID NO：6的适体的二级结构，所述SEQ ID NO：5的适体和SEQ ID NO：6的适体特异性结合于人心肌肌钙蛋白I。
图9为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白I蛋白与SEQ ID NO：1的适体之间的结合强度。
图10为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白I蛋白与SEQ ID NO：2的适体之间的结合强度。
图11为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白I蛋白与SEQ ID NO：3的适体之间的结合强度。
图12为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白I蛋白与SEQ ID NO：4的适体之间的结合强度。
图13为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白I蛋白与SEQ ID NO：5的适体之间的结合强度。
图14为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白I蛋白与SEQ ID NO：6的适体之间的结合强度。
图15为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白I蛋白与抗体之间的结合强度。
图16为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白复合物蛋白与SEQ ID NO：1的适体之间的结合强度。
图17为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白复合物蛋白与SEQ ID NO：2的适体之间的结合强度。
图18为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白复合物蛋白与SEQ ID NO：3的适体之间的结合强度。
图19为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白复合物蛋白与SEQ ID NO：4的适体之间的结合强度。
图20为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白复合物蛋白与SEQ ID NO：5的适体之间的结合强度。
图21为SPR(表面等离子共振)谱图，所述SPR谱图显示肌钙蛋白复合物蛋白与SEQ ID NO：6的适体之间的结合强度。
具体实施方式
为了研制作为心肌肌钙蛋白I的抗体的替代物的适体，在细菌表达系统中表达人心肌肌钙蛋白I，将其纯化，并用SELEX(配体指数富集法系统演化)技术来选择DNA适体，随后分析所述DNA适体的序列和结构，从而达到本发明的目的。
更详细地，本发明提供特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的DNA适体，所述DNA适体的碱基序列为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中的一种。
另外，本发明提供用于诊断急性心血管疾病的组合物和用于诊断急性心血管疾病的试剂盒，所述组合物和试剂盒包含特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的DNA适体。
除了所述DNA适体之外，本发明的组合物还可包含药学上或生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
所述载体、赋形剂和稀释剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、无定形纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、对羟基苯甲酸甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。当配制成剂型时，所述组合物还可包含典型的过滤器、增稠剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、芳香剂、乳化剂和/或防腐剂。
通过以下实施例可更好地理解本发明，以下实施例是为了举例说明，并无意限制本发明。
实施例
实施例1：肌钙蛋白I基因克隆
合成用于扩增人心肌肌钙蛋白I基因的具有BamH1的限制性位点的5’引物(GGATCC ATG GCGGAT GGG AGC AG)和具有Hind3的限制性位点的3’引物(AAGCTT TCAAAA CTT TTT CTT GCG G)。合成用于扩增人心肌肌钙蛋白T基因的具有EcoRI的限制性位点的5’引物(GAATTC ATG TCTGAC ATA GAA GAG GTG GTG)和具有XhoI的限制性位点的3’引物(CTCGAG CTA TTT CCA GCG CCC GGT)。合成用于扩增人心肌肌钙蛋白C基因的具有EcoRI的限制性位点的5’引物(GAATTC ATG GAT GAC ATCTAC AAG GCT GC)和具有XhoI的限制性位点的3’引物(CTCGAG CTA CTCCAC ACC CTT CAT GAA CTC)。在存在i-pfu聚合酶的条件下，使用这些引物扩增从HEK293细胞获取的cDNA。就这点而言，PCR按照下列步骤进行30个循环：1)95℃使模板的双链变性，持续1min，2)58℃使模板与所述引物退火，持续30sec，以及3)72℃延伸新链，持续1min。
用限制性内切酶消化扩增的人心肌肌钙蛋白I基因和人心肌肌钙蛋白C基因，将其连接到包含(His)6-标签的pET28a载体上。用限制性内切酶消化扩增的人心肌肌钙蛋白T基因，并将其连接到pET21a载体上。将肌钙蛋白I基因和肌钙蛋白C基因转化至BL21(DE3)E.coli内。为了与肌钙蛋白I共表达，将肌钙蛋白T基因转化至BL21-CodonPlus(DE3)-RIG E.coli内。
实施例2：肌钙蛋白I蛋白的表达
37℃下，在LB(Luria Bertani)培养基中培养用所述人心肌肌钙蛋白I基因转化的BL21(DE3)细胞，直到OD600(光密度)达到0.6。然后，通过在存在0.2mM IPTG(异丙基-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)的条件下，18℃孵育所述细胞持续16小时来诱导所述蛋白表达。由SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)来确定所述蛋白的表达。通过离心进行收集之后，用PBS(10mM磷酸钠、150mM NaCl，pH 7.4)洗涤所述细胞一次。SDS-PAGE结果在图1中显示。
图1中，指示蛋白尺寸的标记(M)在泳道1上进行电泳分离，IPTG诱导前获取的蛋白(bf)在泳道2上进行电泳分离，IPTG诱导后获取的蛋白(af)在泳道3上和泳道4上进行电泳分离。如图1的SDS PAGE所示，在IPTG诱导之后，在28KD处检测到肌钙蛋白I。
实施例3：肌钙蛋白复合物的表达
对于肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的表达而言，在37℃下，在LB(Luria Bertani)培养基中培养用人心肌肌钙蛋白I基因和肌钙蛋白T基因转化的BL21-CodonPlus(DE3)-RIG E.coli，直到OD600(光密度)达到0.6；在37℃下，在LB(Luria Bertani)培养基中培养用所述人心肌肌钙蛋白C基因转化的BL21(DE3)，直到OD600(光密度)达到0.6。然后，通过在存在0.2mM IPTG(异丙基-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)的条件下，18℃孵育细胞16小时来诱导所述蛋白表达。由SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)来确定所述蛋白的表达。通过离心进行收集之后，用PBS(10mM磷酸钠、150mMNaCl，pH 7.4)洗涤所述细胞一次。所述SDS-PAGE结果在图2中显示。
图2中，指示蛋白尺寸的标记(M)在泳道1上进行电泳分离，在IPTG诱导前获取的蛋白(bf)在泳道2上进行电泳分离。如图2的SDS PAGE所示，在IPTG诱导之后检测到肌钙蛋白I、肌钙蛋白T和肌钙蛋白C。
实施例4：肌钙蛋白I蛋白的纯化
为了将在细菌细胞BL21(DE3)中表达的人心肌肌钙蛋白I蛋白分离至高纯度，在裂解缓冲液(20mM Tris、500mM NaCl、0.5mM β-巯基乙醇、3％丙三醇、0.01％吐温20，pH 8.0)中裂解所述细胞，并由超声波分解法破碎10分钟。以15,000rpm的速度离心30min，从细胞碎片中分离上清液蛋白。
Ni-NTA(镍-氮川三乙酸)对(His)6-标签氨基酸残基的亲和性用于将蛋白分离至高纯度。就这点而言，FPLC(快速蛋白液相色谱)与Ni-NTA柱联合使用，随后将包含心肌肌钙蛋白I的上清液上样至所述Ni-NTA柱。因为蛋白的(His)6-标签与咪唑竞争，所以用洗脱缓冲液(20mM Tris、500mM NaCl、0.5mM β-巯基乙醇、3％丙三醇、0.01％吐温20、300mM咪唑，pH 8.0)来洗脱结合于柱的靶蛋白。
对于进一步纯化而言，通过使用Superdex75柱的凝胶过滤，对包含心肌肌钙蛋白的部分来进行体积排阻色谱分析，从而获得更纯的蛋白。所使用的咪唑用最终缓冲液(20mM Tris、300mM NaCl、0.5mM β-巯基乙醇、3％丙三醇、0.01％吐温20，pH 8.0)除去。结果在图3中显示。
图3中，指示蛋白尺寸的标记是泳道1上进行电泳分离，从上述纯化过程中所获取的部分在泳道2上进行电泳分离。如图3的SDS-PAGE所示，在25kD处检测到高纯度的肌钙蛋白I。
实施例5：肌钙蛋白复合物(肌钙蛋白T、肌钙蛋白C、肌钙蛋白I)的纯化
为了将肌钙蛋白复合物蛋白分离至高纯度，在裂解缓冲液(20mM Tris、500mM NaCl、0.5mM β-巯基乙醇、5％丙三醇，pH 8.0)中裂解表达肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的细胞并由超声波分解法破碎。通过离心分离可溶蛋白。
纯化肌钙蛋白T蛋白和肌钙蛋白I蛋白时，Ni-NTA(镍-氮川三乙酸)对(His)6-标签氨基酸残基的亲和性用于将蛋白分离至高纯度。就这点而言，将FPLC(快速蛋白液相色谱)与Ni-NTA柱联合使用，随后将包含肌钙蛋白T和肌钙蛋白I的上清液上样于所述Ni-NTA柱。结合于柱的靶蛋白用洗脱缓冲液(20mM Tris、500mM NaCl、0.5mM β-巯基乙醇、5％丙三醇、300mM咪唑，pH 8.0)洗脱。
对于肌钙蛋白复合物的确定和SPR的测量而言，制备了含有(His)6-标签的肌钙蛋白C。肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的(His)6-标签通过TEV(烟草蚀刻病毒)蛋白酶消除。具体地，为了使TEV蛋白酶在(His)6-标签之后识别并消除所述标签，将TEV蛋白酶和蛋白在20℃下反应6hr。
肌钙蛋白I和肌钙蛋白T通过使用G-25柱除去洗脱缓冲液中的咪唑而洗脱。然后上样于Ni-NTA柱，通过从(His)6-标签中分离来得到纯化的肌钙蛋白I和肌钙蛋白T。
含有(His)6-标签的肌钙蛋白C通过Ni-NTA柱纯化并由G-25柱从咪唑中洗脱。
为了得到肌钙蛋白复合物，将包含纯化的(His)6-标签的肌钙蛋白C与Ni-NTA偶联，用包含肌钙蛋白T和肌钙蛋白I的上清液上样，然后诱导肌钙蛋白复合物的形成。
不与肌钙蛋白C偶联的肌钙蛋白I和肌钙蛋白T流经Ni-NTA，通过洗脱缓冲液获得肌钙蛋白复合物。
就进一步纯化而言，通过使用Superdex200柱的凝胶过滤，对包含肌钙蛋白复合物的部分进行体积排阻色谱分析，从而获得更纯的蛋白。所使用的咪唑用最终缓冲液(20mM Tris、300mM NaCl、0.5mM β-巯基乙醇、5％丙三醇，pH 8.0)除去。结果在图4中显示。
图4中，指示蛋白尺寸的标记在泳道1上进行电泳分离，从上述纯化过程中获取的部分在泳道2上进行电泳分离。
实施例6：用SELEX寻找肌钙蛋白I的适体
<6-1>ssDNA(单链DNA)文库的构建
构建含有90条序列的文库，每条序列两端具有用于PCR扩增和克隆的引物序列，并在所述引物序列之间具有40个碱基的随机DNA序列(5’-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3’)。
此外，5’引物(5′-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3′)、3’引物(5’-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3’)和生物素-结合的3’引物(5’-生物素-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3’)也用于PCR扩增及ssDNA的制备。本发明所使用的所有寡核苷酸均由Bionics(韩国)合成并进行PAGE纯化。
<6-2>将人心肌肌钙蛋白I固定至Ni-NTA磁珠
将纯化的人心肌肌钙蛋白I固定于磁珠Dynabead(Invitrogen公司，挪威)上，使His-标签结合于其钴包被的表面。
就这点而言，通过如下方式将所述蛋白固定于所述磁珠上：凭借外部磁体用结合缓冲液(20mM Tris、300mM NaCl、3％丙三醇、0.01％吐温20、5mM MgCl，pH 8.0)洗涤20μL的磁珠，并用150μL的包含150pmol所述蛋白的结合缓冲液孵育该磁珠。
<6-3>选择人心肌肌钙蛋白I的特异性适体
为了选择人心肌肌钙蛋白I的特异性适体，实施了一种使用磁体的特异性分离方法。
首先，将所述ssDNA文库(1nmol)溶解于100μL的结合缓冲液中，90℃下孵育3min后，在4℃下孵育一小时，使ssDNA形成最稳定的构象。然后，使该文库与固定于磁珠的肌钙蛋白I蛋白反应一小时，伴随轻柔搅拌。然后，用结合缓冲液洗涤磁珠两次，从而除去仍然未与固定至所述磁珠的肌钙蛋白I结合的ssDNA。
然后，从与ssDNA结合的蛋白中分离所述ssDNA。在此情况下，用洗脱缓冲液(20mM Tris、300mM NaCl、3％丙三醇、0.01％吐温20、5mM MgCl2、300mM咪唑，pH8.0)洗脱ssDNA和与其结合的蛋白。ssDNA洗脱液在乙醇中沉淀，将得到的沉淀物溶解于100μL的蒸馏水中，并用作PCR扩增的模板，所述PCR扩增在存在i-pfu聚合酶(Intron Biotechnology公司，韩国)的条件下，使用5’引物和生物素-结合的3’引物进行。为了分离用于选择的ssDNA，在偶联缓冲液(5mM Tris-HCl、5mM EDTA、1M NaCl，0.01％)中，用链霉亲和素包被的磁珠孵育生物素结合的PCR产物持续一小时，然后用100μL的100mM NaOH孵育5分钟，从而仅仅分离出ssDNA。使用外部磁体来获得所述ssDNA。
在后续的重复选择中使用第一次选择的ssDNA。就严格选择而言，ssDNA的量和肌钙蛋白I的浓度在后续的重复选择中逐渐下降。在选择的过程中，ssDNA与肌钙蛋白I的结合通过测量重复选择中洗脱的ssDNA的浓度来监测，所述监测使用UV分光仪(Biochrom Libra S22分光仪)。结果在图5中显示。
图5显示在适体的选择中适体与固定于磁珠的蛋白的结合程度。所述结合程度表示为结合的适体的浓度对所使用的适体的浓度的百分比(％)。如图5所示，结合于所述蛋白的适体DNA的数量随着选择次数的增加而增加。
<6-4>适体的序列分析和结构分析
使用未修饰的5’引物和3’引物通过PCR对第12次重复选择中所选的ssDNA进行扩增并克隆至pENTR/TOPO(TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen公司，美国)，随后转化至E.coli TOP10(Invitrogen公司，美国)中。然后使用小量提取试剂盒(GeneAll公司，韩国)来纯化包含所述ssDNA的克隆并对其进行碱基测序(COSMO Genetech公司，韩国)。由此，确定所述ssDNA的序列为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6，并在下表1中列出。
为了分析所选择的ssDNA的结构相似性，使用Mfold程序(http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-forml.cgi)对所选出的ssDNA序列的二级结构进行分析。如图6至图8所示，发现它们具有共同的茎环结构，所述共同的茎环结构可归因于连续的T-C序列。
表1
  SEQ ID NO：   碱基序列
  1   TCACACCCTCCCTCCCACATACCGCATACACTTTCTGATT
  2   CCCGACCACGTCCCTGCCCTTTCCTAACCTGTTTGTTGAT
  3   ATGCGTTGAACCCTCCTGACCGTTTATCACATACTCCAGA
  4   CAACTGTAATGTACCCTCCTCGATCACGCACCACTTGCAT
  5   CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA
  6   CGCATGCCAAACGTTGCCTCATAGTTCCCTCCCCGTGTCC
实施例7：肌钙蛋白I与适体之间的结合强度的SPR(表面等离子共振)分析
SPR(表面等离子共振)是发生于光与诸如金之类的金属上的电子之间的一种现象，其中，当具有特定波长的光入射到金属表面上时，大部分光能量转移到金属的自由电子上，伴随着倏逝波的产生引起共振。结合强度可通过测量共振波长的改变来确定，所述共振波长随结合于金属样本表面的成分的改变而改变。为了测定肌钙蛋白I与所述适体的结合强度，使用Ni-NTA(镍-氮川三乙酸)包被的表面芯片(Biacore AB，瑞典)进行SPR测量。
将肌钙蛋白I蛋白(200nM)固定至上述Ni-NTA芯片，然后与所述适体DNA偶联。使用的适体DNA的浓度为25nM、50nM、100nM和200nM。为了对比，还测量了一种商售抗体(Abcam，英国)与心肌肌钙蛋白I的结合强度。观察到其Kd为20.1nM，比本发明的适体的Kd值高。
在图9至图15中及表2中分别显示了SPR吸收数据和Kd值。
表2
  适体   Kd
  SEQ ID NO：1   3.41nM
  SEQ ID NO：2   1.13nM
  SEQ ID NO：3   1.14nM
  SEQ ID NO：4   3.25nM
  SEQ ID NO：5   270pM
  SEQ ID NO：6   317pM
  抗体(对照)   20.1nM
适体与肌钙蛋白复合物的结合强度以上述相同的方式测量。所使用的适体DNA的浓度为50nM、100nM、200nM和400nM。由此，观察到肌钙蛋白复合物有效地结合于适体。观察到其Kd比结合肌钙蛋白I的Kd或类似物的Kd更高。
SPR吸收数据及Kd值分别在图16至图21及表3中显示。
表3
  适体   Kd
  SEQ ID NO：1   3.2nM
  SEQ ID NO：2   4.5nM
  SEQ ID NO：3   5.7nM
  SEQ ID NO：4   10.6nM
  SEQ ID NO：5   3.1nM
  SEQ ID NO：6   3.4nM
本领域技术人员将理解的是，本发明的上述说明易于得到多种变化、改变和改编，且这些变化、改变和改编可理解为在所附权利要求的等同含义及范围内。因此，本发明所公开的实施方式及附图意在描述本发明，并无意限制本发明的技术实质。本发明的技术实质并不局限于这些实施方式及附图。
Figure ISA00000660082400011
Figure ISA00000660082400021

Claims (3)

1.一种特异性结合于人心肌肌钙蛋白I的DNA适体，其中，所述DNA适体的碱基序列选自：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6。
2.一种用于诊断急性心血管疾病的组合物，所述组合物包含权利要求1所述的DNA适体。
3.一种急性心血管疾病的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒使用权利要求1所述的DNA适体。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104195141A (zh) * 2014-09-15 2014-12-10 三诺生物传感股份有限公司 一种心肌肌钙蛋白i核酸适配子及其应用、试剂盒
CN108004246A (zh) * 2017-12-25 2018-05-08 中国人民解放军第四军医大学 利用金属亲和法快速进行液相靶标selex筛选的方法
CN110241119A (zh) * 2018-03-07 2019-09-17 中国科学技术大学 心肌肌钙蛋白i特异性核酸适配体及其筛选方法和应用
CN111662909A (zh) * 2019-03-05 2020-09-15 中国科学技术大学 心肌肌钙蛋白i特异性核酸适配体及其应用
CN113195722A (zh) * 2018-12-19 2021-07-30 Md保健株式会社 与基孔肯雅热病毒e2特异性结合的dna适体及其用途
CN113227377A (zh) * 2018-12-19 2021-08-06 Md保健株式会社 与黄热病病毒ediii特异性结合的dna适体及其用途
CN113227378A (zh) * 2018-12-19 2021-08-06 Md保健株式会社 与登革病毒ediii特异性结合的dna适配体及其用途
CN113552364A (zh) * 2021-06-02 2021-10-26 中南大学 用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10670611B2 (en) 2014-09-26 2020-06-02 Somalogic, Inc. Cardiovascular risk event prediction and uses thereof
CA3114763A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 WearOptimo Pty Ltd System for performing measurements on a biological subject
TWI741915B (zh) * 2019-03-06 2021-10-01 國立清華大學 檢測心血管疾病的檢驗套組及心血管疾病相關生物標記的濃度檢測方法
TWI716827B (zh) * 2019-03-06 2021-01-21 國立清華大學 檢測心血管疾病的檢驗套組及心血管疾病相關生物標記的濃度檢測方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1974594A (zh) * 2006-11-16 2007-06-06 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 人心肌肌钙蛋白ⅰ亚基核酸适配子及应用
EP2133696A1 (en) * 2008-06-10 2009-12-16 Eberhardt Spanuth Very low concentrations of troponin I or T for assessing a cardiovascular risk with respect to the administration of anti-inflammatory drugs
KR20100050071A (ko) * 2008-11-05 2010-05-13 한국과학기술연구원 고감도의 마이크로 캔틸레버 기반 생체물질 검출 시스템
CN101738425A (zh) * 2010-01-06 2010-06-16 天津科技大学 用于抗生素和心脏病标记物快速检测的适配子生物传感器的制作方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2200358B (en) * 1987-01-27 1991-02-27 Univ Birmingham Materials for in vivo detection of cardiac damage, and methods for their preparation
AU3483395A (en) * 1994-09-28 1996-04-19 Spectral Diagnostics Inc. A monoclonal antibody to human cardiac troponin i
CA3086149A1 (en) * 2006-04-04 2007-10-11 Singulex, Inc. Highly sensitive system and methods for analysis of troponin
EP1890153A1 (en) * 2006-08-16 2008-02-20 F. Hoffman-la Roche AG Cardiac troponin as an indicator of advanced coronary artery disease

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1974594A (zh) * 2006-11-16 2007-06-06 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 人心肌肌钙蛋白ⅰ亚基核酸适配子及应用
EP2133696A1 (en) * 2008-06-10 2009-12-16 Eberhardt Spanuth Very low concentrations of troponin I or T for assessing a cardiovascular risk with respect to the administration of anti-inflammatory drugs
KR20100050071A (ko) * 2008-11-05 2010-05-13 한국과학기술연구원 고감도의 마이크로 캔틸레버 기반 생체물질 검출 시스템
CN101738425A (zh) * 2010-01-06 2010-06-16 天津科技大学 用于抗生素和心脏病标记物快速检测的适配子生物传感器的制作方法

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104195141A (zh) * 2014-09-15 2014-12-10 三诺生物传感股份有限公司 一种心肌肌钙蛋白i核酸适配子及其应用、试剂盒
CN104195141B (zh) * 2014-09-15 2017-12-12 三诺生物传感股份有限公司 一种心肌肌钙蛋白i核酸适配子及其应用、试剂盒
CN108004246A (zh) * 2017-12-25 2018-05-08 中国人民解放军第四军医大学 利用金属亲和法快速进行液相靶标selex筛选的方法
CN110241119B (zh) * 2018-03-07 2022-07-15 中国科学技术大学 心肌肌钙蛋白i特异性核酸适配体及其筛选方法和应用
CN110241119A (zh) * 2018-03-07 2019-09-17 中国科学技术大学 心肌肌钙蛋白i特异性核酸适配体及其筛选方法和应用
CN113195722A (zh) * 2018-12-19 2021-07-30 Md保健株式会社 与基孔肯雅热病毒e2特异性结合的dna适体及其用途
CN113227377A (zh) * 2018-12-19 2021-08-06 Md保健株式会社 与黄热病病毒ediii特异性结合的dna适体及其用途
CN113227378A (zh) * 2018-12-19 2021-08-06 Md保健株式会社 与登革病毒ediii特异性结合的dna适配体及其用途
CN113195722B (zh) * 2018-12-19 2023-11-24 Md保健株式会社 与基孔肯雅热病毒e2特异性结合的dna适体及其用途
CN113227378B (zh) * 2018-12-19 2023-11-24 Md保健株式会社 与登革病毒ediii特异性结合的dna适配体及其用途
CN113227377B (zh) * 2018-12-19 2023-11-28 Md保健株式会社 与黄热病病毒ediii特异性结合的dna适体及其用途
CN111662909A (zh) * 2019-03-05 2020-09-15 中国科学技术大学 心肌肌钙蛋白i特异性核酸适配体及其应用
CN113552364A (zh) * 2021-06-02 2021-10-26 中南大学 用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法

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