CN104195141A

CN104195141A - 一种心肌肌钙蛋白i核酸适配子及其应用、试剂盒

Info

Publication number: CN104195141A
Application number: CN201410468490.8A
Authority: CN
Inventors: 刘振华
Original assignee: Sinocare Inc
Current assignee: Sinocare Inc
Priority date: 2014-09-15
Filing date: 2014-09-15
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-09-15
Also published as: CN104195141B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒。该心肌肌钙蛋白I核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的心肌肌钙蛋白I核酸适配子经过改造后，其与心肌肌钙蛋白I的结合能力很强，且序列短，易于合成，合成成功率高，生产时间短，降低了合成成本，同时能够更有效的了解反应区域。

Description

一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒。

背景技术

心血管疾病是当今社会影响人类健康的重要疾病之一，而在心血管疾病中，急性心肌梗死是造成病人死亡的主要原因。在世界卫生组织建议的急性心肌梗死诊断标准中，心肌坏死的血清心肌标志物浓度的动态改变是一个非常关键的判断依据，所以现阶段有不少用于早期心肌损伤血清标志物的诊断试剂。肌钙蛋白是心肌与骨骼肌的收缩调节蛋白，心肌肌钙蛋白是由心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白C(cTnC)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)三个亚单位组成，而cTnI具有高度的心肌特异性，其对微小心肌损伤检测有特殊临床价值，可以诊断心肌梗死和心肌细胞损伤，是目前诊断急性心肌梗死的新的“金标准”。现有的cTnI检测产品大多基于免疫技术，利用抗原抗体反应，但是基于抗体的产品存在较多的局限性，主要在于抗体本身的稳定均一性、保存环境、生产周期等方面。

核酸适配子(适配子/适体，aptamer)，是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的一条DNA或者RNA分子，它可以与其靶物质(氨基酸、蛋白质、金属离子、甚至整个细胞)进行高亲和力、专一性结合。因此，它在生化分析、环境监测、基础医学、新药的合成及筛选等方面展现出广阔的应用前景。

目前，现有的cTnI的核酸适配子即是由SELEX技术筛选得到，主要包括2条cTnI核酸适配子，其中一个cTnI核酸适配子的序列为：GCTTAATCGAGGGTATCGTGGGGCAGTTGGGAGGG，另一个cTnI核酸适配子的序列为：GCCGTCAACATGTCCTAGTAGGGGTCTCAGGGGTG。

然而，在现有的SELEX技术中，由于受制于方法和筛选环境的影响，有的筛选得到的核酸适配子并不是与靶物质产生作用的最简序列，或者说是关键序列，如果涉及到实际应用，这样的适配子将会产生一些不必要的合成等方面的浪费，而且也不利于关键结合序列的分析。因此，提供一种序列短、高亲和力的cTnI核酸适配子具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒。该心肌肌钙蛋白I核酸适配子经过改造后，其与心肌肌钙蛋白I的结合能力很强，且序列短，易于合成，合成成功率高，生产时间短，降低了合成成本，同时能够更有效的了解反应区域。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

在本发明中，对现有序列进行简化，去除无关序列，同时为了进一步分析其关键序列的位置，通过大量的试验和筛选获得简化后的核苷酸序列，其具有固定碱基的位置是结合心肌肌钙蛋白I的关键位置。获得的简化核苷酸序列和心肌肌钙蛋白I的结合能力与简化前的结合能力相当，且更易于合成，其序列更短，合成成功率更高，生产时间更短，降低了合成成本，能更有效的了解反应区域。

作为优选，心肌肌钙蛋白I核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

作为优选，心肌肌钙蛋白I核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示心肌肌钙蛋白I核酸适配子在非诊断目的检测肌钙蛋白I中的应用。

本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示心肌肌钙蛋白I核酸适配子在非诊断目的检测肌钙蛋白I中的应用。

本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示心肌肌钙蛋白I核酸适配子在非诊断目的检测肌钙蛋白I中的应用。

本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示在肌钙蛋白I纯化中的应用。

本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示在肌钙蛋白I纯化中的应用。

本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示在肌钙蛋白I纯化中的应用。

本发明还提供了一种试剂盒，包括如核苷酸序列如SEQ ID NO：1、核苷酸序列如SEQ ID NO：2或核苷酸序列如SEQ ID NO：3的心肌肌钙蛋白I核酸适配子。

本发明提供了一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒。该心肌肌钙蛋白I核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试验，结果显示本发明提供的cTnI核酸适配子与cTnI有明显结合现象，但与干扰蛋白无结合现象；通过抗体夹心法考察本发明提供的cTnI核酸适配子与cTnI蛋白的结合情况，结果显示本发明提供的cTnI核酸适配子与不同浓度cTnI的孵育产物，吸光度显示出了较大的梯度，证明本发明提供的cTnI核酸适配子与cTnI有较好的结合，与HSA的结合很少；由表面等离子体共振法检测cTnI核酸适配子与cTnI的结合常数为8.32nM～10.39nM之间，说明本发明提供的cTnI核酸适配子与目标蛋白cTnI有较高的亲和力，均已经达到nM级别。

另外，本发明提供的cTnI核酸适配子还具有如下优势：

本发明提供的cTnI核酸适配子序短，易于合成，合成成功率更高；

生产时间短，降低了合成成本；

更有效的了解反应区域。

附图说明

图1实施例3中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示cTnI核酸适配子与cTnI蛋白结合情况的电泳图；其中，泳道1示空白对照组泳道，只有cTnI蛋白；泳道2、3示阴性对照组泳道，泳道2的处理为0.5μg cTnI+100pmol阴性对照，泳道3的处理为1μg cTnI+100pmol阴性对照；泳道4～7示试验组泳道，泳道4的处理为0.5μg cTnI+100pmol SEQ ID NO：2所示cTnI核酸适配子，泳道5的处理为1μg cTnI+100pmol SEQ ID NO：2所示cTnI核酸适配子，泳道6的处理为0.5μgcTnI+100pmol SEQ ID NO：3所示cTnI核酸适配子，泳道7的处理为1μg cTnI+100pmol SEQ ID NO：3所示cTnI核酸适配子；

图2实施例3中第一阳性对照、第二阳性对照与cTnI蛋白结合情况的电泳图；其中，泳道1示空白对照组泳道，只有cTnI蛋白；泳道2、3示阴性对照组泳道，泳道2的处理为0.5μg cTnI+100pmol阴性对照，泳道3的处理为1μg cTnI+100pmol阴性对照；泳道4～7示阳性对照组泳道，泳道4的处理为0.5μg cTnI+μg第一阳性对照，泳道5的处理为1μg cTnI+100pmol第一阳性对照，泳道6的处理为0.5μg cTnI+100pmol第二阳性对照，泳道7的处理为1μg cTnI+100pmol第二阳性对照；

图3示实施例4中SEQ ID NO：2所示cTnI核酸适配子与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白等干扰蛋白结合情况的电泳图；其中，泳道1的处理为胸腺组蛋白，泳道2的处理为胸腺组蛋白+SEQ ID NO：2所示cTnI核酸适配子；泳道3的处理为HSA，泳道4的处理为HSA+SEQ ID NO：2所示cTnI核酸适配子；泳道5的处理为IgG，泳道6的处理为IgG+SEQ ID NO：2所示cTnI核酸适配子；泳道7的处理为血红蛋白，泳道8的处理为血红蛋白+SEQ ID NO：2所示cTnI核酸适配子；

图4示实施例4中第一阳性对照与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白等干扰蛋白结合情况的电泳图；其中，泳道1的处理为胸腺组蛋白，泳道2的处理为胸腺组蛋白+第一阳性对照；泳道3的处理为HSA，泳道4的处理为HSA+第一阳性对照；泳道5的处理为IgG，泳道6的处理为IgG+第一阳性对照；泳道7的处理为血红蛋白，泳道8的处理为血红蛋白+第一阳性对照；

图5示实施例1合成的cTnI核酸适配子与cTnI结合的拟合曲线；

图6示实施例2合成的cTnI核酸适配子与cTnI结合的拟合曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒中所用试剂和仪器均可由市场购得。其中，本发明中所有单链DNA由上海生工合成；cTnI抗原可由原核表达纯化获得，也可从市场上购得(Hytest)；试验中所用试剂均购自sigma公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 cTnI核酸适配子的合成

由上海生工合成序列如SEQ ID NO：2所示的cTnI核酸适配子。

实施例2 cTnI核酸适配子的合成

由上海生工合成序列如SEQ ID NO：3所示的cTnI核酸适配子。

实施例3 电泳检测cTnI核酸适配子与cTnI的结合情况

取实施例1、2合成的cTnI核酸适配子进行与cTnI的结合试验，考察实施例1、2合成的cTnI核酸适配子与cTnI的结合能力。

1、实验设计

试验分为试验组和对照组。

试验组为：0.5μg cTnI+100pmol SEQ ID NO：2所示cTnI核酸适配子、1μgcTnI+100pmol SEQ ID NO：2所示cTnI核酸适配子、0.5μg cTnI+100pmol SEQID NO：3所示cTnI核酸适配子、1μg cTnI+100pmol SEQ ID NO：3所示cTnI核酸适配子。

对照组分为空白对照组、阴性对照组和阳性对照组：

a、空白对照组不加任何核苷酸序列，只有cTnI蛋白；

b、阴性对照组为：0.5μg cTnI+100pmol阴性对照、1μg cTnI+100pmol阴性对照。其中阴性对照的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其不会与cTnI结合；

c、阳性对照组为：0.5μg cTnI+100pmol第一阳性对照、1μg cTnI+100pmol第一阳性对照、0.5μg cTnI+100pmol第二阳性对照、1μg cTnI+100pmol第二阳性对照。其中，第一阳性对照、第二阳性对照为现有的2个cTnI核酸适配子，第一阳性对照的序列如SEQ ID NO：5所示，第二阳性对照的序列如SEQ IDNO：6所示，第一阳性对照、第二阳性对照与cTnI的结合能力强。

2、具体操作

分别取实施例1、2合成的cTnI核酸适配子、阴性对照、第一阳性对照、第二阳性对照，95℃变性10分钟，然后迅速插入冰中10分钟，加入结合缓冲液。按照上述实验设计分别加入0.5、1μg的cTnI，37℃孵育10分钟。上样到非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染观察结果。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳配制方法：15mL体系，30％Acr-bis 6mL，5倍TB缓冲液3mL，超纯水5.85mL，10％过硫酸铵0.15mL，TEMED15μL。电泳缓冲液(1L)：Tris-base 3克，甘氨酸14.4克，调至pH8.3。

3、结果分析

电泳结果见图1、图2。由图1、图2可知，实施例1、2合成的cTnI核酸适配子、第一阳性对照、第二阳性对照与cTnI均有明显结合现象。而将单独的cTnI蛋白，以及与阴性对照序列孵育的cTnI蛋白进行电泳，其泳道内未出现阻滞现象，即无结合反应发生。

实施例4 电泳检测cTnI核酸适配子与干扰蛋白的结合情况

取实施例1合成的cTnI核酸适配子、实施例3中第一阳性对照(序列如SEQID NO：5所示)，分别进行与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白等干扰蛋白的结合试验，考察实施例1合成的cTnI核酸适配子、实施例3中第一阳性对照与干扰蛋白的结合能力。具体操作如下：

取实施例1合成的cTnI核酸适配子分别与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白进行孵育，37℃孵育10分钟，将孵育产物上样到非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色观察结果。同时设置胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白做为对照。电泳结果见图3。

取实施例3中第一阳性对照分别与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白进行孵育，37℃孵育10分钟，将孵育产物上样到非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色观察结果。同时设置胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白做为对照。电泳结果见图4。

由图3、4可以看出，实施例1合成的cTnI核酸适配子、实施例3中第一阳性对照与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白等干扰蛋白的孵育产物，与单纯的胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白相比，其电泳结果并无差异，可见这两序列与干扰蛋白并无结合反应。

取实施例2合成的cTnI核酸适配子，进行与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白等干扰蛋白的结合试验，考察实施例2合成的cTnI核酸适配子与干扰蛋白的结合能力。结果与实施例1合成的cTnI核酸适配子的电泳结果相似，同样与干扰蛋白无结合反应。

实施例5 抗体夹心法检测cTnI核酸适配子与cTnI的结合情况

试验设计：取实施例1、2合成的cTnI核酸适配子，和实施例3中第一阳性对照、第二阳性对照、阴性对照，采用抗体夹心法考察这些序列与cTnI蛋白的结合情况，具体试验操作如下：

取实施例1合成的cTnI核酸适配子，经在3′端标记生物素、连接10个T碱基，得到生物素化的cTnI核酸适配子。在酶标板上包被一层亲和素，然后将生物素化的cTnI核酸适配子与包被的亲和素孵育，洗涤后将不同浓度梯度(1μg/mL、1×10^-1μg/mL、1×10^-2μg/mL、1×10^-3μg/mL、1×10^-4μg/mL、1×10^-5μg/mL、1×10^-6μg/mL、0μg/mL)的cTnI加入进行反应，洗涤后加入cTnI的单克隆抗体，洗涤后再加入标记了辣根过氧化物酶的二抗，最后TMB系统显色，检测吸光度。

作为对照，采用上述相同的方法，考察了第一阳性对照、第二阳性对照、阴性对照序列与cTnI蛋白的结合情况。

结果如表1所示。

表1 序列与cTnI蛋白的结合情况

表1的结果显示，实施例1、2合成的cTnI核酸适配子、第一阳性对照、第二阳性对照与不同浓度cTnI的孵育产物，吸光度显示出了较大的梯度，这证明这些序列与cTnI有较好的结合。阴性对照序列则与cTnI吸光度梯度很小，表明阴性对照序列与cTnI的结合很少。

实施例6 抗体夹心法检测cTnI核酸适配子与HSA蛋白的结合情况

试验设计：取实施例1、2合成的cTnI核酸适配子，和实施例3中第一阳性对照、第二阳性对照，采用抗体夹心法考察这些序列与HSA蛋白的结合情况，具体试验操作方法参见实施例5。试验结果见表2。

表2 序列与HSA蛋白的结合情况

表2的结果显示，实施例1、2合成的cTnI核酸适配子、第一阳性对照、第二阳性对照在不同HSA浓度下的孵育产物，吸光度梯度很小，表明实施例1、2合成的cTnI核酸适配子、第一阳性对照、第二阳性对照与HSA的结合很少。试验结果进一步表明实施例1、2合成的cTnI核酸适配子特异性强。

实施例7 表面等离子体共振法检测cTnI核酸适配子与cTnI的结合常数

将20ug/ml的cTnI孵育组装到金膜上，用BSA封闭并清洗未组装上的蛋白后读取数据，再将溶于结合缓冲液的实施例1合成的cTnI核酸适配子加入到金膜上，待其反应完成后，洗脱未结合的序列，待数值稳定后读取波长红移数据。按照此方法分别读取cTnI核酸适配子浓度为6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM的数值，再根据此数值拟合实施例1合成的cTnI核酸适配子与cTnI的结合常数K_d值(采用sigmaplot软件计算)。波长红移数据见表3，拟合曲线见图5。结合常数K_d值的计算方法如下：

y = \frac{B_{\max} x}{K_{d} + x};

其中B_max表示最大结合量。

表3 实施例1合成的cTnI核酸适配子与cTnI结合后的波长红移值

经过拟合，结果显示实施例1合成的cTnI核酸适配子与cTnI的结合常数K_d为10.39nM。

取实施例2合成的cTnI核酸适配子，采用同样的方法拟合结合常数。波长红移数据见表4，拟合曲线见图6。

表4 实施例2合成的cTnI核酸适配子与cTnI结合后的波长红移值

经过拟合，结果显示实施例2合成的cTnI核酸适配子与cTnI的结合常数K_d为8.32nM。

从上述试验结果可以看出，实施例1、2合成的cTnI核酸适配子测得的与cTnI结合常数K_d分别为10.39nM和8.32nM，这说明这两条序列与目标蛋白cTnI有较高的亲和力，均已经达到nM级别。

实施例8 试剂盒的制备

取实施例1合成的cTnI核酸适配子，制备成试剂盒。

实施例9 试剂盒的制备

取实施例2合成的cTnI核酸适配子，制备成试剂盒。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白I核酸适配子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白I核酸适配子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求1至3中任一项所述的心肌肌钙蛋白I核酸适配子在非诊断目的检测肌钙蛋白I中的应用。

5.如权利要求1至3中任一项所述的心肌肌钙蛋白I核酸适配子在肌钙蛋白I纯化中的应用。

6.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至3中任一项所述的心肌肌钙蛋白I核酸适配子。