CN105319374A

CN105319374A - 一种筛选靶蛋白核酸配体的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN105319374A
Application number: CN201410841308.9A
Authority: CN
Inventors: 王雪根; 叶青; 章春荠
Original assignee: KAIJI BIOTECH DEVELOPMENT Co Ltd NANJING; NANJING NMG-ADDS Co Ltd
Current assignee: KAIJI BIOTECH DEVELOPMENT Co Ltd NANJING; NANJING NMG-ADDS Co Ltd
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2016-02-10

Abstract

本发明公开了一种快速筛选高特异亲和靶蛋白的核酸配体的方法及筛选试剂盒，筛选方法主要是将待筛核酸标记上生物素，将之与靶蛋白或提取物等样本进行结合反应后，加到预包被链霉亲和素的微孔板中，再经与抗靶蛋白抗体及标记二抗的孵育和洗脱后，检测标记二抗的信号强度，从而找到与靶蛋白高特异高亲和的核酸配体，该方法可用于筛选高特异性结合靶蛋白的核酸类药物、靶向制剂、疫苗、诊断或检测探针和试剂盒。而发明的筛选试剂盒则是由上述筛选和优化出的阳性核酸探针、竞争探针、靶蛋白或提取物，抗体等含结合、洗脱、显色体系所组成，用于筛选目的蛋白特异结合的核酸配体。本发明可以简单、快速、灵敏地筛选与靶蛋白高亲和特异结合的核酸配体。

Description

一种筛选靶蛋白核酸配体的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物领域，具体涉及一种筛选靶蛋白核酸配体的方法和试剂盒。

背景技术

许多核酸(DNA/RNA)因可特异结合某些靶蛋白而成为其配体，并发挥其各自的生物学作用，例如抑制HIV逆转录酶活性的单链DNA配体、抗组蛋白H4-K16位赖氨酸乙酰化的DNA配体，上市核酸药物Macugen即为血管表皮生长因子VEGF的RNA配体，作为抗肿瘤药靶向载体的前列腺膜表面抗原PMSA的配体，作为基因转录因子调控元件的DNA配体等等。核酸配体作为可以折叠成明确三维结构，通过空间构型互补与靶蛋白或靶分子高特异性高亲和性结合的寡聚核酸，与靶分子以氢键和范德华力等相结合，与抗体抗原结合相比较，核酸配体的结合范围更广，不仅结合于蛋白等大分子，也可与一些小分子产生结合，而且结合的特异性和亲和力更高，与靶分子结合的解离系数可达纳摩尔甚至皮摩尔级，并且结合核酸自身易修饰和标记，可逆，结构相对稳定等特点，因此核酸配体在医药、诊断和检测等领域得以重视、研究和开发。

作为研究核酸与蛋白相互作用、特异结合、鉴定与筛选的传统方法，包括凝胶阻滞电泳法(GELSHIFT或称EMSA法)、DNA足迹法，核酸酶保护法、指数富集的配基系统进化技术(SELEX法)，ChIP-on-chip等。EMSA电泳等前几种方法操作繁复、灵敏度低，不能高通量。SELEX等后两种方法需要使用PCR仪、或毛细管电泳或测序或芯片等昂贵仪器，筛选过程长，成本也较高，有一定的应用限制。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种一种快速筛选高特异亲和靶蛋白的核酸配体的方法和试剂盒。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提供一种快速筛选高特异亲和靶蛋白的核酸配体的方法，包括如下步骤：将各种待筛选的核酸配体用生物素标记5`端，加入结合缓冲液、靶蛋白或含靶蛋白的混合物，结合反应后再加到预包被的链霉亲和素多孔板中，依次经亲和孵育、洗脱、再加入抗靶蛋白的抗体孵育、洗脱、再加入标记二抗、孵育、洗脱，然后加入底物显色或直接检测信号强度，从而确定高亲和的核酸配体。

本发明同时提出了应用上述方法的试剂盒，该试剂盒包括生物素标记的阳性核酸探针、竞争对照探针、靶蛋白或含靶蛋白提取物，抗靶蛋白抗体、标记二抗、结合缓冲液、洗脱液、显色液和链霉亲和素包被的微孔板。

其中，所述的靶蛋白为酶、转录因子、标志蛋白、受体、信号蛋白和病毒蛋白中的任意一种。

所述的含靶蛋白的混合物为细胞裂解物或提取物、组织消化与提取物、血清、体液和尿液中的任意一种。

所述的核酸配体为DNA或RNA；或者是经结构修饰的DNA或RNA，构型为单链、双链或茎环。

所述的标记二抗为标记酶或荧光素标记，如以辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶ALP等各种标记酶和各种荧光素标记的二抗。

所述的底物显色通过化学发光或荧光底物显色实现，如为以四甲基联苯胺TMB或鲁米诺化学发光或荧光底物进行显色。

其中，所述的检测信号强度通过使用酶标仪、微孔读板机、荧光光谱仪检测可见光信号、化学发光信号和荧光信号等实现。

本发明进一步提出了所述试剂盒在筛选核酸药物、疫苗、诊断与检测用核酸探针中的应用。

在具体应用时，根据靶蛋白的种类来确定相应的核算配体、标记二抗等。

一般地，本发明的核酸配体筛选试剂盒因靶蛋白的不同而组成有异，每种试剂盒均由特异组份(组份1-5)和通用组份(组份6-14)两大部份所组成，每种试剂盒也可按检测方法不同而区分。具体如下表所列：

具体地，对应的靶蛋白和相应的待筛选的核酸序列的选择如下表所示：

缩写说明：B＝BIOTIN生物素；ssRNA＝单链RNA；ssDNA＝单链DNA；dsDNA＝双链DNA；L＝线形；SL＝茎环；H＝发夹heparin；修饰类型：全硫代0＝WPS；两端硫代2＝EPS；特定位点硫代1＝PPS，锁核酸3＝LNA；肽核酸4＝PNA；吗啉代氨基磷酸酯5＝MF，3’氨基代6＝NP；2’-氧甲基7＝OMe；(RNA)2’-氧甲氧乙基8＝MOE(RNA)2’-氟代9＝F嘧啶UTC；2’-氟代戊糖核酸＝FANA；其它修饰M＝OM；碱基有下划线为特定修饰位点。

有益效果：本发明采用高通量筛选与靶蛋白特异结合核酸配体的方法，方法基于设计和合成不同序列或修饰的待筛核酸并标记上生物素，将核酸与既定的靶蛋白或混合物进行结合反应后，加到预包被链霉亲和素的微孔板中，再经与抗靶蛋白抗体及标记二抗的孵育和洗脱后，检测标记二抗的信号强度，从而的找到与靶蛋白结合最高的核酸配体。本方法具有高通量、快速、灵敏、可定量、简便、经济的特点，其中高通量是本方法使用96孔、384孔、1536孔等多孔板，也可用自动液体工作站进行筛选，适用大规模多样本筛选；快速是即可将传统EMSA等数小时至数日的试验，缩短至三个半小时内即可完成，比EMSA法的快40倍；灵敏是每孔只需不低于0.5μg的细胞提取物，或不低于0.5ng的靶蛋白，比EMSA方法灵敏10倍以上。通过生物传感级联放大，并使用荧光、化学发光等灵敏信号，可检测到pmol的信号；可定量是指在0.5～10μg细胞提取物范围内，可提供定量检测结果；简便是因微孔板读板仪普及，自动化程度高，操作简便。经济是指筛选的试剂使用非常微量，而且微孔读板仪型号多价格不高。

附图说明

图1为本发明筛选方法的示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种快速筛选高特异亲和靶蛋白的核酸配体的的试剂盒，包括生物素标记的阳性核酸探针、竞争对照探针、靶蛋白或含靶蛋白提取物，抗靶蛋白抗体、标记二抗、结合缓冲液、洗脱液、显色液和链霉亲和素包被的微孔板。筛选方法包括如下步骤：将待筛选的核酸配体用生物素标记5’端，加入结合缓冲液、靶蛋白或含靶蛋白的混合物，结合反应后再加到预包被的链霉亲和素多孔板中，依次经亲和孵育、洗脱、再加入抗靶蛋白的抗体孵育、洗脱、再加入标记二抗、孵育、洗脱，然后加入底物显色或直接检测信号强度，从而确定高亲和的核酸配体。整个流程如图1所示。

本发明的核酸配体筛选试剂盒因靶蛋白的不同而组成有异，每种试剂盒均由特异组份(组份1～5)和通用组份(组份6～14)两大部份所组成，每种试剂盒也可按检测方法不同而区分。如表1所示：

表1

试剂盒中的靶蛋白或提取物(组份5)的准备与配制：

本项发明试剂盒因靶蛋白的不同，可分别采用重组蛋白、细胞裂解物或提取物，定量后按试剂盒中的配方用量作为其中靶蛋白的组分。其中既可使用商品化的重组蛋白或细胞提取物，也可自行制备。本发明所使用的重组蛋白多以常规基因重组方法表达和纯化目的蛋白，细胞提取物可自行培养细胞中按一定方法提取，如以K-562、Hela、Jurkat、MCF7细胞的核提取物为例，其制备方法为：按常规细胞培养方法分别培养Hela、Jurkat、MCF7和K-562等细胞，待细胞生长至10⁷-10⁸个/mL时，Hela细胞直接离心收集，Jurkat细胞在收集前2小时加入50ng/ml佛波酯TPA和0.5μM钙离子载体A23187(CAS号52665-69-7I、K-562细胞加入50ng/ml佛波酯TPA，剌激和37C培养后、离心收集细胞，按商品化核蛋白提取试剂盒的说明书上的方法，提取各自的细胞核提取物，测定蛋白含量后备用，

各试剂盒中组分结合缓冲液(组份8)的配方和配制：

结合缓冲液的配方选择和优化，分别对下述五个配方进行试验和优化；

配方1：10mMHEPES-KOH(pH8.0)、60mMKCl、4mMMgCl₂、0.1mMEDTA0.1mg/mLBSA(nuclease-free)、0.25mMDTT、10％Glyceral.

配方2：13.5mMHEPES-KOH(pH7.9)、67mMKCl、7.5mMMgCl2、0.135mMEDTA、1.135mMDTT、0.125mg/mLBSA、0.335mMPMSF、13.5％Glyceral(V/V)、20ng/μLpoly(dI-dC)。

配方3：25mMHEPES-KOH(pH7.6)、150mMNaCl、0.1mMEDTA、1mMDTT、200ng/μLsalmonspermDNA(sheared)

配方4：50mMTris-HCl(pH7.5)、100mMNaCl、0.1mMEDTA、50μg/mLBSA10mM2-ME、10％甘油

配方5：50mMTris-HClpH(7.5)、250mMNaCl、5mMMgCl₂、2.5mMEDTA、2.5mMDTT、20％甘油、0.25mg/mLpoly(dI-dC)

根据试剂盒选用靶蛋白或提取物和提取方法的不同，所采用的结合缓冲液配方体系均有所不同，一般基本配方采用两种缓冲体系，如下表所示：

本发明试剂盒从中优选出最佳配方，并作为试剂盒的通用组份(组份8)。

试剂盒其它通用的组份：复合蛋白酶抑制剂、洗液、抗体孵育液、显色液、终止液、化学发光底物、反应液、荧光底物、链霉亲和素预包被多孔板等均为常规通用试剂。

各组待筛选核酸序列(仅列其中一部份，反义链略)(缩写等说明详见备注1和备注2)如表2所示：

表2

备注1：将5’-生物素-待筛序列-3与互补链3’-生物素-反义互补序列等摩尔数混合、水浴加温至85℃10分钟，自然冷却至室温，退火结合成双链，备用；

备注2：缩写说明：B＝BIOTIN生物素；ssRNA＝单链RNA；ssDNA＝单链DNA；dsDN＝双链DNA；L＝线形；SL＝茎环；H＝发夹heparin；修饰类型：全硫代0＝WPS；两端硫代2＝EPS；特定位点硫代1＝PPS，锁核酸3＝LNA；肽核酸4＝PNA；吗啉代氨基磷酸酯5＝MF，3’氨基代6＝NP；2’-氧甲基7＝OMe；(RNA)2’-氧甲氧乙基8＝MOE(RNA)2’-氟代9＝F嘧啶UTC；2’-氟代戊糖核酸＝FANA；其它修饰M＝OM；碱基有下划线为特定修饰位点。

下面通过具体的实例来说明本发明。

(一)筛选试剂盒的准备

分别配制七种转录因子高亲和核酸配体筛选试剂盒，在该系列试剂盒中的特异组分(组份1-5)的构成分别如下各表，通用组份(组份6-14)见发明内容及表1和表2。

(1)转录因子AP1结合核酸筛选试剂盒特异组份

转录因子AP1结合核酸筛选试剂盒特异组份见表3：

表3

(2)转录因子AP2结合核酸筛选试剂盒特异组份

转录因子AP2结合核酸筛选试剂盒特异组份见表4：

表4

(3)转录因子E2F结合核酸筛选试剂盒特异组份

转录因子E2F结合核酸筛选试剂盒特异组份见表5：

表5

(4)转录因子MYC结合核酸筛选试剂盒特异组份

转录因子MYC结合核酸筛选试剂盒特异组份如表6：

表6

(5)转录因子CREB结合核酸筛选试剂盒特异组份

转录因子CREB结合核酸筛选试剂盒特异组份如表7：

表7

(6)转录因子NFκ3结合核酸筛选试剂盒特异组份

转录因子NFκB结合核酸筛选试剂盒特异组份如表8：

表8

(7)转录因子STAT3结合核酸筛选试剂盒特异组份

转录因子STAT3结合核酸筛选试剂盒特异组份如表9：

表9

(二)筛选试验及筛选试剂盒的应用

试验先将试剂盒和待筛的核酸分为不同的试验组，包括：阳性组、竞争对照组、待筛核酸样本组(分成7个浓度组)，将各组探针、待筛的生物素标记核酸的样本用结合缓冲液(临用前加入终浓度1mM的DTT、0.1μg/μL复合蛋白酶抑制剂和0.1μg/μL的poly(dI-dC)或经剪切的鲑鱼精DNA)配制成0.01nmo1/L-10μmol/L的7个浓度的核酸待检液(每浓度递增10倍，即分别为0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM)，试剂盒中的细胞核提取物用结合缓冲液配制成50-150μg/mL(常为100-125μg/mL)的蛋白液，如是重组蛋白则用结合缓冲液配制成50-150ng/mL(常为100-125ng/mL)，在链霉亲和素预包被的96板中，每孔加入配好的30μL核酸待检液，空白和对照孔只加入30μL空白结合缓冲液，每孔再加入20μL浓度为配制好的一定浓度的蛋白液，将加好上述各种试样的微板板，置于室温摇床温和摇匀1小时，进行核酸与靶蛋白进行结合反应，反应结束后，每孔加入200μL的1×洗液洗三次，每孔加入100μL的一抗工作液(一抗用1×抗体孵育液稀释500-1000倍)室温，摇床温和摇匀1小时进行抗体孵育反应，然后每孔加入200μL的1×洗液洗三次，每孔加入100μL的二抗工作液(HRP或ALP酶标或荧光素标记、并用1×抗体孵育液稀释500-1000倍)室温，摇床温和摇匀1小时，每孔加入200μL的1×洗液洗3-4次，按检测方法不同按如下方法进行显色反应后检测或直接检测。

荧光免疫法的检测：以荧光标记二抗孵育并洗脱后，直接用多功能酶标仪(MolecularDevicesSpectramacM3)激发波长488nm，发射波长512nm测定，计算光度值。

酶免法则在经酶标二抗孵育并洗脱后，每孔加入100μL显色液，暗室避光室温显色反应5-10分钟，而后每孔加入100μL终止液，以酶标仪(Bio-TekELX800)测定450nm，减去空白对照孔的OD值，计算各孔的OD450nm。

酶免化学发光法则在经酶标二抗孵育并洗脱后，每孔加入50μL化学发光工作液，(化学发光试剂和反应液分别室温预热后按1比2混合，室温放置1小时后，以多功能酶标仪(MolecularDevicesSpectramacM3)读板，425nm读取光度值。

酶免荧光法则在经酶标二抗孵育并洗脱后，每孔加入50μL荧光底物Amplex或称ADHP[10-Acetyl-3，7-dihydroxyphenoxazine]工作液，反应5分钟，上机多功能酶标仪(MolecularDevicesSpectramacM3)读板，激发波长571nm发射波长585nm，读取各孔荧光光度值。

时间分辨荧光法则在经Eu标二抗孵育并洗脱后，每孔加入100μL抗体液，上机多功能酶标仪(MolecularDevicesSpectramacM5)读板，激发波长346nm，发射波长617nm，读取荧光光度值。

根据各孔测定光度值减空白对照孔的光度值，并以阳性对照孔减空白孔的光度值为100，将每个核酸序列各个浓度下的光度值的百分比进行计算，再由上述光度值百分比的点平均值所得的拟合曲线，折算出每个样本的半数亲和率IC₅₀。则七种转录因子结合的一部份待测核酸样本的IC₅₀列入下表10，其中筛选出多为nmoL级，最高亲和达pmoL，灵敏度很高，竞争对照的设计增加筛选的特异性，使用本发明试剂盒与实验方法，可同时进行数十或数百个样本的筛选，实验操作仅用3.5小时，因此本发明的筛选方法和试剂盒在靶转录因子与其核酸配体筛选应用上十分地简便和可行。

表10各转录因子结合序列的IC₅₀(nM)

AP1/IC₅₀

AP2/IC₅₀

E2F/IC₅₀

Myc/IC₅₀

CREB/IC₅₀

NFκB/IC₅₀

STAT3/IC₅₀

1101/15.21

2111/0.67

3100/11.38

4110/1.35

5122/0.76

6101/11.87

7121/2.31

1201/2.06

2210/0.83

3211/3.56

4111/1.67

5110/1.24

6111/0.46

7222/2.75

1301/3.34

2314/0.32

3111/1.48

4112/1.88

5111/1.63

6212/0.48

7321/2.32

1114/2.21

2313/1.08

3212/2.86

4123/2.93

5211/1.71

6313/0.72

7322/2.14

1111/0.68

2312/1.40

3112/0.43

4113/1.22

5221/3.20

6214/0.97

7323/1.83

1121/0.84

2311/1.71

3132/1.27

4210/1.45

5112/1.52

6211/1.11

7324/1.67

1131/0.31

2315/0.41

3142/31.01

4310/1.59

5123/0.68

6312/0.43

7313/1.58

1141/28.17

2316/1.32

3152/11.51

4420/62.20

5223/1.41

6311/0.51

7303/33.15

1151/30.41

2317/0.89

3102/17.09

4510/32.07

5212/2.07

6301/34.15

7421/1.87

1113/0.71

2111/0.67

3122/1.05

4511/32.12

5213/1.39

6321/0.53

7411/1.63

(三)筛选靶酶、细胞因子、受体、信号蛋白、病毒蛋白的核酸配体

本发明开发的以酶、细胞因子、受体、信号蛋白等为靶蛋白的核酸配体筛选方法与试剂盒，试剂盒的通用组份与发明内容及表1和表2相同，而几种代表性特异蛋白的试剂盒及筛选如下表所示。

(1)凝血酶thrombin核酸配体的筛选试剂盒：其特异组份如下表11所示：

表11

(2)ErbB2HER2癌蛋白核酸配体的筛选试剂盒：特异组份如下表12：

表12

(3)受体蛋白TLR2核酸配体筛选试剂盒：特异组份如下表13：

(4)信号蛋白4-1BB核酸配体筛选试剂盒：特异组份如下表14：

表14

(6)细胞因子VEGF核酸配体筛选试剂盒：特异组份如下表15：

表15

	试剂盒的组份名称与每孔的配用量(注：200μL体积/孔)
		组份1	0.1μg抗VEGF抗体
组份2	1pmol阳性对照核酸(5`-B-acgctacaagtccgctgtggtagacaagagtgcaggcaag-3`
		组份3	10pmol野生竞争对照5`-tcaagcactcccgtcttccagacaagagtgcagggcctct-3`
组份4	10pmol突变对照5`-Acgctacaagtccgctgtggtagacatttttgcaggcaag-3’
		组份5	0.5-10ng VEGF重组蛋白

(7)艾滋病霉HIV逆转录酶核酸配体筛选试剂盒：特异组份如下表16：

其中，各组带筛选的核酸序列(部份)如表17所示：

表17

采用用上述组分制成的试剂盒，参照第(二)部分，进行筛选，结果如下表18：

表18

核酸配体代码	半数亲和率IC₅₀
		8193	0.51
8201	6.32
		9100	151.7
9100	72.3
		9271	0.84
9272	2.16
		10-121	4.61
10-122	7.28
		11-191	3.35
11-291	85.6
		12-121	9.42
12-261	0.79
		13-191	1.47
13-192	32.76

筛选实验结果说明本发明的方法和试剂盒对不同的靶蛋白的核酸配体样品，能够根据亲和性和特异性检测出显著性的差异，达到筛选较高亲和性和特异性的核酸配体的目的。

综上所述，利用本发明的方法和试剂盒，能够应用于各种靶蛋白的核酸配体的筛选实验，有快速、简便、灵敏的特点，对于筛选各种核酸药物、疫苗、检测或诊断探针均可应用。

Claims

1.一种快速筛选高特异亲和靶蛋白的核酸配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：将待筛选的核酸配体用生物素标记5’端，加入结合缓冲液、靶蛋白或含靶蛋白的混合物，结合反应后再加到预包被的链霉亲和素多孔板中，依次经亲和孵育、洗脱、再加入抗靶蛋白的抗体孵育、洗脱、再加入标记二抗、孵育、洗脱，然后加入底物显色或直接检测信号强度，从而确定高亲和的核酸配体。

2.一种快速筛选高特异亲和靶蛋白的核酸配体的的试剂盒，其特征在于，包括生物素标记的阳性核酸探针、竞争对照探针、靶蛋白或含靶蛋白提取物，抗靶蛋白抗体、标记二抗、结合缓冲液、洗脱液、显色液和链霉亲和素包被的微孔板。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的靶蛋白为酶、转录因子、标志蛋白、受体、信号蛋白和病毒蛋白中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的含靶蛋白的混合物为细胞裂解物或提取物、组织消化与提取物、血清、体液和尿液中的任意一种。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的核酸配体为DNA或RNA；或者是经结构修饰的DNA或RNA，构型为单链、双链或茎环。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记二抗为标记酶或荧光素标记。

7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的底物显色通过化学发光或荧光底物显色实现。

8.权利要求1所述的试剂盒在筛选核酸药物、疫苗、诊断与检测用核酸探针中的应用。