CN113201545A - 一种双靶向核酸适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双靶向核酸适配体及其应用，双靶向核酸适配体由带连接序列Ⅰ的核苷酸序列SEQ ID NO:1或带连接序列Ⅰ的SEQ ID NO:2与带连接序列Ⅱ的核苷酸序列SEQ IDNO:3连接组成；双靶向核酸适配体通过动物实验验证其对狂犬病的治疗效果；实验结果表明，本发明中的双靶向核酸适配体对于狂犬病毒有一定抑制作用，能延长攻毒小鼠的存活期；本发明在狂犬病的治疗中有广阔应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶向狂犬病毒大蛋白与趋化因子CCL5的双特异性核酸适配体及其应用，属抗病毒药物开发领域。
背景技术
狂犬病(Rabies)是由一种嗜神经病毒引起的疾病，狂犬病会引起神经性脑炎，死亡率近乎为100％。据WHO报道狂犬病在全球每年大约造成六万人死亡，我国因狂犬病造成的年死亡人数也曾达到三千余人，且再发复发的风险长期持续存在。在如此严峻的防治情况下，却尚未出现有效的治疗手段。目前看来，接种狂犬疫苗可以有效地预防狂犬病的产生，但是当感染已经发生时，如果仍处于感染早期阶段时往往可以通过注射免疫球蛋白进行干预。然而，一旦当患者已经表现出恐风、恐水等典型的临床症状时，几乎没有存活的可能。
目前，狂犬病没有有效治疗方法，只有疫苗可供暴露者注射，所有阻断狂犬病毒复制的抗病毒策略都对解决死亡率方面收效甚微，由于该病发病迅猛，难以治愈，幸存者寥寥无几并均伴有严重的后遗症，因此研发抗狂犬病毒的药物迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种靶向趋化因子CCL5与狂犬病毒大蛋白的双特异核酸适配体，本发明提供了一种治疗狂犬病的新策略，双靶向核酸适配体由带连接序列Ⅰ的核苷酸序列SEQ ID NO:1或带连接序列Ⅰ的SEQ ID NO:2与带连接序列Ⅱ的核苷酸序列SEQ ID NO:3连接组成。
所述连接序列Ⅰ的核苷酸序列为5’-GTTCTCATGCACACTTATAGC-3’，连接序列Ⅱ的核苷酸序列为5’-GCTATAAGTGTGCATGAGAAC-3’，连接序列Ⅰ与连接序列Ⅱ为互补序列。
本发明基于Western blot、qPCR、TCID50实验验证Apta-RABV-L33/49-linker对细胞培养物中病毒增殖的影响，并基于Transwell实验验证Apta-CCL5-21-linker对CCL5趋化性的影响。
本发明另一目的是将上述双靶向核酸适配体应用在制备抗狂犬病毒感染药物中。
本发明采用如下技术方案实现本发明目的：
1、双特异性核酸适配体的组装
对趋化因子CCL5的核酸适配体与狂犬病毒大蛋白的核酸适配体分别添加一对互补的连接序列，并孵育结合；
Apta-RABV-L的连接序列Ⅰ如下：5’-GTTCTCATGCACACTTATAGC-3’；
Apta-CCL5的连接序列Ⅱ如下：5’-GCTATAAGTGTGCATGAGAAC-3’；
2、双特异性核酸适配体二级结构预测
使用RNAstructure软件对趋化因子CCL5与狂犬病毒大蛋白的双靶向特异性核酸适配体进行二级结构的预测，结果表明两种双靶向特异性核酸适配体分子均存在多个茎环结构，其二级结构如图1、图2所示，吉布斯自由能：△G1＝-37.5、△G2＝-34.6。
3、靶向狂犬病毒大蛋白带有linker的核酸适配体Apta-RABV-L33/49-linker对细胞培养物中病毒的抑制
验证Apta-RABV-L33/49-linker对细胞培养物中病毒的抑制情况基于Westernblot、TCID50、qPCR的原理，以转染核酸适配体后接毒的细胞培养上清进行病毒滴度以及病毒基因组拷贝数的比较验证，以转染核酸适配体后接毒的细胞裂解液进行核蛋白表达情况验证，实验结果显示出病毒表达量有不同程度的下降。
4、靶向趋化因子CCL5带有linker的核酸适配体Apta-CCL5-21-linker对细胞趋化性的抑制
将重组趋化因子CCL5蛋白以及Apta-CCL5-21-linker置于RAW264.7细胞培养液中，通过Transwell实验对细胞迁移情况进行检测，结果表明该核酸适配体能够抑制趋化因子CCL5的趋化作用。
5、脑靶向短肽RVG29-9R-His的活性鉴定
脑靶向短肽RVG29-9R-His参考吉林大学博士学位论文《狂犬病病毒靶向RNA干扰制剂的研制与鉴定研究》第二篇第一章中的方法制得，并利用凝胶阻滞实验证实其能够结合核酸适配体，ELISA实验证实其具有特异性结合神经细胞的能力。
6、双靶向核酸适配体药物组装及其对攻毒小鼠生存期的影响，实验结果表明双靶向核酸适配体对于狂犬病毒有一定抑制作用，能延长攻毒小鼠的存活期。
本发明的优点在于：
1、本发明双特异性核酸适配体具有高特异性的优点，具有识别趋化因子CCL5蛋白以及狂犬病毒大蛋白的能力，对于其他蛋白质等不具有或具有较弱的识别力；
2、本发明双特异性核酸适配体具有高亲和力、可以体外合成以及修饰、化学性质稳定、药代动力性质佳和无免疫原性等特点；
3、本发明双特异性核酸适配体的合成与抗体制备相比成本更低、周期更短、稳定性和重复性好；
4、本发明双特异性核酸适配体在狂犬病的治疗中有着不可估量的价值。
附图说明
图1为带连接序列Ⅰ的核苷酸序列SEQ ID NO:1与带连接序列Ⅱ的核苷酸序列SEQID NO:3连接组成的双特异性核酸适配体的二级结构示意图；
图2为带连接序列Ⅰ的核苷酸序列SEQ ID NO:2与带连接序列Ⅱ的核苷酸序列SEQID NO:3连接组成的双特异性核酸适配体的二级结构示意图；
图3为利用Western blot方法检测Apta-RABV-L33/49-linker对细胞裂解液中病毒核蛋白表达的抑制情况，其中图a为Western blot条带图，图b为使用ImageJ软件对图a中各条带进行灰度分析得到的柱状图；
图4为利用TCID50方法检测Apta-RABV-L33/49-linker对细胞培养上清中病毒增殖的抑制情况；
图5为利用qPCR方法检测Apta-RABV-L33/49-linker对细胞培养上清中病毒基因组拷贝数的抑制情况；
图6为利用Transwell实验检测Apta-CCL5-21-linker对趋化因子CCL5趋化性的抑制情况；
图7为实施例6中各实验组的迁移细胞计数结果；
图8为利用凝胶阻滞实验检测RVG29-9R-His结合核酸适配体的能力；
图9为利用ELISA实验检测RVG29-9R-His结合神经细胞的能力；
图10为双特异性核酸适配体与药物载体RVG29-9R-His复合后通过尾静脉注射对攻毒小鼠生存期的影响，图中横坐标为时间(天)，纵坐标为小鼠生存率(％)。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：靶向狂犬病毒大蛋白及趋化因子CCL5蛋白带有linker的核酸适配体制备
由昆明擎科生物科技有限公司合成。
实施例2：靶向狂犬病毒大蛋白带有linker的核酸适配体Apta-RABV-L33/49-linker对细胞裂解液中病毒核蛋白表达的影响
(1)取出一瓶N2a细胞，加入1mL PBS轻轻摇晃洗涤并弃去上清，加入胰蛋白酶于室温放置数十秒以消化细胞，弃去胰蛋白酶，加入10mL 1％DMEM培养基吹打细胞使其脱落并混匀，将该细胞悬液均匀加入于96孔板中，100μL/孔；
(2)将该细胞板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养2h，至细胞贴壁并伸展出形态；
(3)从-40℃冰箱中取出靶向狂犬病毒大蛋白的核酸适配体Apta-RABV-L33/49-linker，瞬时离心防止粉末损失，每管加入60μL灭菌水稀释至20μM；
(4)取1.5mL EP管，分别加入200nM Apta-RABV-L33-linker、Apta-RABV-L49-linker或Apta-RABV-L33-linker+Apta-RABV-L49-linker适配体及不加适配体作为对照，各个条件重复三个，加入25μL无血清培养基，轻轻吹打混匀，室温静置2min，加入0.5μL转染试剂，再次轻轻吹吸混匀，室温静置15min；
(5)将步骤(4)混合液加入细胞培养板中，轻晃混匀后于培养箱继续培养18h；
(6)分别加入0.1MOI狂犬病毒CVS毒株于转染适配体及未转染适配体(对照)的孔中，于培养箱37℃、5％CO2继续培养2h；
(7)弃去培养上清，PBS洗涤一遍后，加入新鲜的1％DMEM培养基200μL/孔，继续培养；
(8)培养24h、48h、72h后分别收取三组细胞裂解液样品，每个样品取10μg分析；
(9)配置蛋白胶，在90V的恒压条件下电泳90min，直至考马斯亮蓝指示剂到达玻璃板下方；
(10)将胶取出，加入NC膜，在转膜电泳槽中90V、160mA的条件下恒流转膜90min；至预染Marker的条带全部转移到NC膜上；
(11)将膜浸入5％脱脂奶中4℃封闭过夜，弃去脱脂奶，加入PBST洗涤5次；
(12)加入狂犬病毒核蛋白单克隆抗体腹水稀释液(1:1000)与GAPDH抗体稀释液(1:1000)共同于37℃孵育2h；
(13)回收一抗稀释液，将膜于PBST中洗涤5次；
(14)加入HRP标记的二抗稀释液(1:50000)孵育1h；
(15)弃去二抗，将膜于PBST中洗涤5次，并加入显影液，观察结果；
结果见图3，结果显示在转染后接毒并感染了不同时间(24h，48h和72h)时所收集的细胞裂解液中的病毒蛋白含量检测有所变化，且在这三个时间点时，加入了
Apta-RABV-L33-linker、Apta-RABV-L49-linker或
Apta-RABV-L33-linker+Apta-RABV-L49-linker适配体的组别，病毒蛋白的含量相比较于只接毒，未转染适配体的组别来说，有明显的降低。实验批间重复三次，每个样品设三个生物学重复。
实施例3：Apta-RABV-L33/49-linker对细胞培养上清中病毒增殖的影响
(1)取出一瓶N2a细胞，加入1mL PBS轻轻摇晃洗涤并弃去上清，加入胰蛋白酶于室温放置数十秒以消化细胞，弃去胰蛋白酶，加入10mL 1％DMEM培养基吹打细胞使其脱落并混匀，将该细胞悬液均匀加入于96孔板中，100μL/孔；
(2)将该细胞板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养2h，至细胞贴壁并伸展出形态；
(3)从-40℃冰箱中取出靶向狂犬病毒大蛋白的核酸适配体Apta-RABV-L33/49-linker，瞬时离心防止粉末损失，每管加入60μL灭菌水稀释至20μM；
(4)取1.5mL EP管，分别加入200nM Apta-RABV-L33-linker、Apta-RABV-L49-linker或Apta-RABV-L33-linker+Apta-RABV-L49-linker适配体及不加适配体作为对照，各个条件重复三个，加入25μL无血清培养基，轻轻吹打混匀，室温静置2min，加入0.5μL转染试剂，再次轻轻吹吸混匀，室温静置15min；
(5)将步骤(4)混合液加入细胞培养板中，轻晃混匀后于培养箱继续培养18h；
(6)分别加入0.1MOI狂犬病毒CVS毒株于转染适配体及未转染适配体(对照)的孔中，于培养箱37℃、5％CO2继续培养2h；
(7)弃去培养上清，PBS洗涤一遍后，加入新鲜的1％DMEM培养基200μL/孔，继续培养；
(8)培养24h、48h、72h后分别收取三组细胞培养上清样品100μL以备后续使用；
(9)取出三瓶N2a细胞，分别加入1mL PBS轻轻摇晃洗涤并弃去上清，并加入胰蛋白酶于室温放置数十秒以消化细胞，弃去胰蛋白酶，每个细胞瓶加入20mL 1％DMEM培养基吹打细胞使其脱落并混匀，将该细胞悬液均匀加入于96孔板中，100μL/孔，于培养箱37℃、5％CO2培养过夜至贴壁；
(10)将收取的24h培养上清于-80℃取出，于冰上溶解；
(11)步骤(8)的样品取100μL加入新的EP管中，加入900μL无血清DMEM混匀即将病毒培养原液稀释至10-1倍，再从上一步10-1倍的病毒稀释液中取100μL加入新的EP管中，加入900μL无血清DMEM混匀即为将病毒培养原液稀释至10-2倍，再从上一步10-2倍的病毒稀释液中取100μL加入新的EP管中，加入900μL无血清DMEM混匀即为将病毒培养原液稀释至10-3倍，如此稀释直至10-6倍，分别将不同稀释倍数的稀释液加入96孔板中，每孔100μL，每个梯度重复8个孔；所有样品均按照此方法稀释；
(12)将上述步骤操作后的细胞板置于培养箱37℃、5％CO2培养48h；
(13)48h后弃去上清，每孔加入200μL PBS洗涤一遍；
(14)每孔加入200μL预冷固定液(甲醇:丙酮＝1:1)，于-20℃放置20min以固定并通透细胞；
(15)弃去固定液，在通风橱中吹干细胞板；
(16)每孔加入200μL 5％脱脂奶，于37℃封闭2h；
(17)弃去封闭液，加入100μL/孔狂犬病毒核蛋白单克隆抗体腹水稀释液(1:1000)于37℃孵育2h；
(18)弃去上清，加入100μL/孔PBST溶液洗涤5遍；
(19)FITC标记的二抗(1:2000)稀释在5％脱脂奶中，100μL/孔加入细胞板，于37℃避光孵育1h；
(20)在暗处弃去上清，并用PBST洗涤3遍；
(21)将孔板置于荧光显微镜观察；
(22)48h、72h收取的样品均按照此方法检测病毒滴度；
实验结果图4显示在这三个时间点时，加入了Apta-RABV-L33-linker、Apta-RABV-L49-linker或Apta-RABV-L33-linker+Apta-RABV-L49-linker适配体的组别，病毒滴度相比较于只接毒，未转染适配体的组别来说，有明显的降低。实验批间重复三次，每个样品设三个生物学重复；在48h和72h的时间点，抑制效果较为明显，且49#适配体效果更好。
实施例4：Apta-RABV-L33/49-linker对细胞培养上清中病毒基因组拷贝数的影响
1、Apta-RABV-L33/49-linker处理细胞培养上清液的制备
(1)取出一瓶N2a细胞，加入1mL PBS轻轻摇晃洗涤并弃去上清，加入胰蛋白酶于室温放置数十秒以消化细胞，弃去胰蛋白酶，加入10mL 1％DMEM培养基吹打细胞使其脱落并混匀，将该细胞悬液均匀加入于96孔板中，100μL/孔；
(2)将该细胞板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养2h，至细胞贴壁并伸展出形态；
(3)从-40℃冰箱中取出靶向狂犬病毒大蛋白的核酸适配体Apta-RABV-L33/49-linker，瞬时离心防止粉末损失，每管加入60μL灭菌水稀释至20μM；
(4)取1.5mL EP管，分别加入200nM Apta-RABV-L33-linker、Apta-RABV-L49-linker或Apta-RABV-L33-linker+Apta-RABV-L49-linke适配体及不加适配体作为对照，各个条件重复三个，加入25μL无血清培养基，轻轻吹打混匀，室温静置2min，加入0.5μL转染试剂，再次轻轻吹吸混匀，室温静置15min；
(5)将步骤(4)混合液加入细胞培养板中，轻晃混匀后于培养箱继续培养18h；
(6)分别加入0.1MOI狂犬病毒CVS毒株于转染适配体及未转染适配体(对照)的孔中，于培养箱37℃、5％CO2继续培养2h；
(7)弃去培养上清，PBS洗涤一遍后，加入新鲜的1％DMEM培养基200μL/孔，继续培养；
(8)培养24h、48h、72h后分别收取三组细胞培养上清样品100μL以提取狂犬病毒RNA。
2、标准质粒的构建
(1)使用病毒基因组提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取狂犬病毒CVS毒株的RNA，利用260nm与280nm处的吸光度的比值确定其浓度，并使用反转录试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司)使其反转录为cDNA，各步骤均按说明书进行；
(2)扩增狂犬病毒磷蛋白(RABV-P)的基因片段(培养上清用于评价病毒基因组RNA拷贝数，细胞用于评价病毒磷蛋白转录本的拷贝数)，Primer 1：CCTCCTTTCAAACCATCCCA；Primer 2：ACTTGCCTTCTCCCACCCTA
反应体系(50μL):
扩增反应程序：
并将该扩增后的片段与pMD-19T载体使用T4 DNA Ligase连接，连接体系如下：
16℃连接反应8h。
将该连接产物转化至DH5α感受态细胞中，步骤为：
将感受态细胞从-80℃冰箱取出放冰上20min；取10μL的连接产物加入到感受态细胞中，用枪头缓慢吹打混匀，冰上放置30min；42℃水浴锅中放置60s，轻拿轻放，再与冰上放置2min，加入890μL的LB培养基；37℃，200rpm，摇菌1h后，5000rpm离心3min，倒掉500μL上清液，然后吹打混匀(轻轻吹打)；取200μL涂布于含有氨苄抗生素的LB固体培养基平板上，在37℃中正置10min后，再倒置培养14h。
pMD19-T-RABV-P载体菌落PCR鉴定：
试剂盒：(南京诺唯赞生物科技有限公司)2×Taq Master Mix
反应体系(20μL):
PCR扩增反应程序：
(3)对该标准质粒进行菌液PCR鉴定，并送昆明擎科生物科技有限公司测序。
(4)将鉴定成功的质粒使用质粒提取试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司)纯化并保存于-20℃冰箱。
3、使用病毒基因组提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取24h、48h、72h收取的三组细胞培养上清样品中的狂犬病毒病毒RNA，并使用反转录试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司)使其反转录为cDNA，各步骤均按说明书进行；
4、qPCR的测定
(1)从-20℃冰箱中取出cDNA样品以及标准质粒，并制备体系SYBR Green MasterMix10μL、Primer 1/2(10mM)0.4μL、cDNA/不同浓度标准质粒1μL、RNase-Free ddH2O补齐至20μL，且每个样品重复三个；
(2)将上述体系混匀后放入qPCR仪中，以95℃预变性5min，40个扩增循环：95℃变性10s、60℃退火30s、72℃延伸10s，溶解曲线使用仪器默认值的条件进行扩增；
(3)绘制标准曲线，并计算样本中的病毒拷贝数；
结果见图5，结果显示转染后接毒并感染不同时间(24h、48h和72h)时所收集的细胞培养上清中的病毒基因组拷贝数有所变化，且在这三个时间点时，加入Apta-RABV-L33-linker、Apta-RABV-L49-linker或Apta-RABV-L33-linker+Apta-RABV-L49-linker适配体的组别，病毒基因组拷贝数相比较于只接毒、未转染适配体的组别来说，有明显的降低。实验批间重复三次，每个样品设三个生物学重复。在48h和72h的时间点，抑制效果较为明显，这与TCID50结果一致。
实施例5：靶向趋化因子CCL5带有linker的核酸适配体Apta-CCL5-21-linker的制备由昆明擎科生物科技有限公司合成。
实施例6：Apta-CCL5-21-linker对CCL5趋化活性影响
(1)取一瓶RAW264.7细胞弃上清，加入1mL PBS轻晃洗涤两遍并弃去，加入1mL胰蛋白酶消化数秒后，加入1mL 10％RPMI1640并吹打；细胞计数可得细胞密度约5×106个/mL；则加入5×104个细胞约需10μL细胞液；
(2)Tanswell的上层皿中加入290μL不完全RPMI 1640培养基，将10μL细胞液加入；
(3)Tanswell的下层皿中加入750μL 10％RPMI 1640培养基，三个孔分别加入40μLPBS、20μg的重组趋化因子、20μg的重组趋化因子CCL5与20nM CCL5-Apta-21-Linker混匀，重组蛋白经0.2μm滤膜过滤；
(4)将该Transwell板置于37℃、5％CO2培养箱中培养18h；
(5)弃去培养上清，并用PBS洗涤两遍，拭去膜上细胞；
(6)加入4％多聚甲醇(上室200μL，下室500μL)固定细胞，PBS洗两次并晾干；
(7)加入0.1％结晶紫没过膜，室温染色20min；
(8)弃去染色液，PBS洗两次，晾干；
(9)显微镜观察结果(观察5-10个视野)；
结果见图6、7加入了适配体的组别，被染色的细胞明显低于未加入适配体的组别，基本与空白对照相同，且两组之间差异非常显著，P<0.0001。
实施例7：脑靶向短肽RVG29-9R-His结合核酸适配体的活性测定
(1)脑靶向短肽RVG29-9R-His参考吉林大学博士学位论文《狂犬病病毒靶向RNA干扰制剂的研制与鉴定研究》中第二篇第一章中的方法制得；
(2)取纯化后的RVG29-9R-6His蛋白50μg加入1.5mL离心管中，再加入10pmolApta-RABV-L49-linker，将二者混合均匀并在37℃、60rpm条件下孵育2h使其结合；
(3)配置2％琼脂糖凝胶，即称取琼脂糖2g，加入100mL 1×TAE溶液并加热至溶液澄清透明，加入花青素(10000×)1μL，缓慢摇晃均匀，以防止气泡产生；倒入插好梳子的胶槽中，待其凝固；
(4)约40min后，取结合后的蛋白适配体聚合物，加入5μL 5×Loading buffer(核酸专用)并混匀，依次加入到胶孔中；将胶放置于加满TAE的电泳槽中，在110V的恒压条件下进行琼脂糖凝胶电泳40min，利用凝胶成像系统检验是否有凝胶阻滞现象；
结果见图8，从图中可以看出当核酸片段与目的蛋白同时加入时该泳道出现了明显的阻滞现象，说明经上述实验纯化得到的目的蛋白具有结合核酸片段的活性。
实施例8：RVG29-9R-His特异性结合神经细胞活性测定
(1)取出一瓶N2a细胞，加入1mL PBS轻轻摇晃洗涤，胰蛋白酶消化细胞约60s；加入6mL 5％DMEM培养基吹打，取出5mL均匀铺板于96孔板中的半块，100μL/孔；
(2)取出一瓶BHK细胞，加入1mL PBS轻轻摇晃洗涤，胰蛋白酶消化细胞约60s；加入6mL 5％DMEM培养基吹打，取出5mL均匀铺板于96孔板中的另外半块，100μL/孔；
(3)将该细胞板置于37℃、5％CO2中培养24h，至细胞密度为80％左右；
(4)将培养上清弃去，加入PBS洗板两次，使用4％多聚甲醛固定液室温固定15min；
(5)将固定液弃去，加入PBS洗板三次并晾干；
(6)每孔加200μL 5％脱脂奶，37℃孵育2h，弃去封闭液，PBS洗板三次；
(7)每孔加入RVG29-9R-His稀释液(5μg/mL)，37℃孵育2h，PBS洗板五次；
(8)每孔加100μL His标签抗体稀释液(1:1000)37℃孵育2h，PBS洗板五次；
(9)用山羊抗小鼠的HRP酶标抗体IgG(1:20000)于37℃孵育1h，PBS洗板三次；
(10)加入TMB显色液，于避光处显色30min，加入2M H2SO4终止反应。使用酶标仪测量OD450nm；
结果见图9，从图中可以看出在神经细胞(N2a)的阳性反应显著高于对照组肾细胞(BHK)。说明该目的蛋白具有与神经细胞特异结合的能力，为后续实验奠定了基础。
实施例9：双靶向核酸适配体药物组装及其对攻毒小鼠生存期的影响
(1)将靶向狂犬病毒大蛋白带有linker的核酸适配体和靶向趋化因子CCL5带有linker的核酸适配体1:1混合(各4.8nmol)，在37℃孵育2h聚合得到双靶向特异核酸适配体；
(2)按照每0.2nmol双靶向特异核酸适配体与1mgRVG29-9R-His的比例混合，在37℃孵育2h聚合为脑靶向药物；
(3)选取六到八周龄小鼠四组，每组3只；分别设置为只攻毒不给药的病毒对照组、只进行溶剂注射的溶剂对照组、攻毒6h后给药组、给药6h后攻毒组；
(4)攻毒：拿起容器，将小鼠放在正置的容器中，1mL注射器吸取108μL(92μL/dm3)异氟烷推入棉球上，将装有小鼠的容器盖于放有棉球的盖子上，等待约40s至小鼠完全失去意识；左手固定小鼠使其鼻孔45度朝上，狂犬病毒CVS毒株(107TCID50/0.1mL)在两侧鼻腔共滴加25μL；
(5)给药：将药物分四次，间隔12h进行尾静脉注射给药，并观察其变化及存活情况；
结果见图10，从图中可以看出可见溶剂本身对小鼠生存率并无影响，且注射了药物的小鼠相比较于只攻毒小鼠的生存期均有明显延长。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种双靶向核酸适配体及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
atccagagtg acgcagcacg gcggcatgac gggggctgat ctctgtgtgt ggttggggtg 60
gacacggtgg cttagtgttc tcatgcacac ttatagc 97
<210> 2
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
atccagagtg acgcagcacg gggggcggta tcaggttacg gagttaggga cttggcggtg 60
gacacggtgg cttagtgttc tcatgcacac ttatagc 97
<210> 3
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
atccagagtg acgcagcact gaaagaccgg cagttacgcg tggaggggtg gatggttatg 60
gacacggtgg cttagtgcta taagtgtgca tgagaac 97
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
cctcctttca aaccatccca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
acttgccttc tcccacccta 20
Claims (3)
1.一种双靶向核酸适配体，其特征在于其由带连接序列Ⅰ的核苷酸序列SEQ ID NO:1或带连接序列Ⅰ的SEQ ID NO:2与带连接序列Ⅱ的核苷酸序列SEQ ID NO:3连接组成。
2.根据权利要求1所述的双靶向核酸适配体，其特征在于：连接序列Ⅰ的核苷酸序列为5’-GTTCTCATGCACACTTATAGC-3’，连接序列Ⅱ的核苷酸序列为5’-GCTATAAGTGTGCATGAGAAC-3’，连接序列Ⅰ与连接序列Ⅱ互补。
3.权利要求1所述的双靶向核酸适配体在制备抗狂犬病毒感染药物中的应用。
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