CN111500586A - 特异结合狂犬病毒l蛋白加帽区的核酸适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了特异结合狂犬病毒L蛋白加帽区的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或如SEQ ID NO:2所示；其是通过基于SELEX筛选技术，使用固定介质为负向筛选介质，以重组狂犬病毒L蛋白为正向筛选介质筛选得到的；与狂犬病毒L蛋白特异性结合的核酸适配体具有高特异性、高亲和力、易进行化学修饰以及合成成本低等特点；通过病毒复制抑制实验证明核酸适配体能够抑制狂犬病毒的复制；本发明在研究病毒L蛋白或片段功能、制备以L蛋白为靶点的抗狂犬病治疗药物方面具有较大的应用价值与前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种特异结合狂犬病毒L蛋白加帽区的核酸适配体及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
狂犬病（Rabies）又称恐水症（Hydrophobia），由狂犬病毒（Rabies Virus，RABV）感染神经系统导致，是一种古老而缺乏有效广泛预防及治疗措施的人兽共患传染病，对人类生命危害极大。狂犬病是目前所知发病后死亡率最高的传染病，其死亡率接近100%，除2004年在美国威斯康星医学院有一起关于发病后治愈的报道外，再无确诊发病后治愈的病例；狂犬病在全球范围均有发生，全球共有超过150个国家或地区报告过狂犬病病例，其中绝大多数病例集中在非洲、亚洲及拉丁美洲国家或地区，患病人数前两位的国家为印度和中国。
狂犬病毒对于社会经济等方面造成沉重负担。在全世界范围每年因狂犬病死亡近6万人。尽管目前存在完善的暴露前以及暴露后预防措施，但该措施仅在出现临床症状前实施才有效。更为严重的是，目前狂犬疫苗对于流行狂犬病毒遗传谱系Ⅱ并未表现出保护性。因此狂犬病预防以及抗病毒药物的研发显得尤为重要。目前对于狂犬病毒感染的治疗方法主要有密尔沃基疗法以及狂犬病毒免疫球蛋白（RIG）与广谱抗病毒药物联合疗法。密尔沃基疗法简要来说就是以氯胺酮和金刚烷胺等其他药物联合治疗狂犬病毒感染。氯胺酮是一种解离性麻醉药，是一种非竞争性的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂。尽管密尔沃基疗法成功治愈了一名出现临床症状的患者，但随后密尔沃基法运用过程造成了31位病患死亡，仅有极少数的患者幸存下来。利巴伟林与干扰素-α是目前已知具有抗狂犬病毒活性的药物，研究结果表明干扰素对于狂犬病毒攻击食蟹猴并未表现出保护性；因此在出现狂犬病临床症状后以干扰素治疗并无保护作用。
近几十年，核酸适配体在癌症和病毒感染的治疗领域取得很大的发展。核酸适配体最早是在临床治疗领域获得应用的，而相较于抗体，核酸适配体具有高特异性、高亲合力以及较低的免疫原性等特性。因此，在靶标治疗等生物医学领域极具意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种特异性结合狂犬病毒L蛋白加帽区的核酸适配体，核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或如SEQ ID NO:2所示。
狂犬病毒所有蛋白中L蛋白是一种RNA依赖的RNA聚合酶，对于所有的病毒蛋白包括L蛋白基因转录过程是至关重要的；L蛋白参与病毒RNA的转录过程是通过影响自身的多酶活性包括转录酶活性、加帽以及多腺苷酸化酶活性；同样L蛋白通过其具有的复制酶活性介导病毒基因组RNA的复制。
本发明特异性识别狂犬病毒L蛋白核酸适配体的筛选方法，是基于配体指数富集进化系统（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）技术，以带有His标签的重组狂犬病毒L 蛋白为正筛蛋白，以固定介质Ni-NTA为反筛物，筛选出于狂犬病毒L蛋白加帽区特异性结合的核酸适配体。
本发明另一目的是将上述核酸适配体应用在制备检测狂犬病毒的试剂或试剂盒中。
本发明另一目的是将上述核酸适配体应用在制备治疗狂犬病药物中。
本发明另一目的是将上述核酸适配体应用在作为分子探针中。
本发明中对所述核酸适配体的5’或者3’端进行包括但不限于FITC、生物素、氨基、聚乙二醇等修饰，以延长其体内半衰期和用于示踪等。
本发明目的通过如下技术方案实现：
1、狂犬病毒L蛋白加帽区特异性核酸适配体的筛选
特异性狂犬病毒L蛋白核酸适配体的筛选基于配体指数富集进化系统（SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment）的原理，以带有His标签的重组狂犬病毒L蛋白为正筛蛋白，以固定介质Ni-NTA为反筛物，筛选结束后所得到的核酸适配体次级文库被连接至pMD19T载体上经测序得到适配体序列，得到两条狂犬病毒L蛋白加帽区特异核酸适配体，核苷酸序列如下：
Apta-RABV-L-33：5‘-ATCCAGAGTGACGCAGCACGGCGGCATGACGGGGGCTGATCTCTGTGTGTGGTTGGGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’（ SEQ ID NO:1）；
Apta-RABV-L-49：5‘-ATCCAGAGTGACGCAGCACGGGGGGCGGTATCAGGTTACGGAGTTAGGGACTTGGCGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’（SEQ ID NO:2）；
2、核酸适配体二级结构预测
使用在线软件Mfold对狂犬病毒L蛋白加帽区特异的核酸适配体进行二级结构的预测，结果表明核酸适配体分子存在茎环结构，核酸适配体Apta-RABV-L-33的二级结构如图1所示，吉布斯自由能：△G=-6.391；核酸适配体Apta-RABV-L-49的二级结构如图2所示，吉布斯自由能：△G=-5.491；
3、狂犬病毒L蛋白加帽区特异核酸适配体的亲和力和特异性的检测
合成生物素标记的狂犬病毒L蛋白加帽区核酸适配体，以新型的酶联寡核苷酸检测法对核酸适配体的亲和力和特异性进行检测；结果显示核酸适配体Apta-RABV-L-33或Apta-RABV-L-49对于狂犬病毒具有很高的特异性和亲和力。
4、狂犬病毒L蛋白加帽区特异核酸适配体对病毒增殖抑制试验
合成未带有任何标记的核酸适配体转染至感染狂犬病毒HEP-Flury的N2a细胞中，48h后分别对N2a细胞中进行间接免疫荧光检测及其细胞培养上清中病毒滴度检测；结果表明，核酸适配体对于狂犬病毒增殖具有抑制作用。
较现有技术而言，本发明的优点在于：
1、核酸适配体具有高特异性的优点，只具有特异性识别狂犬病毒L蛋白的能力，对于其他蛋白质等不具有或具有较弱的识别力；
2、核酸适配体还具有高亲和力、可以体外合成以及修饰、化学性质稳定、药代动力性质佳、无免疫原性等特点；
3、核酸适配体的合成与抗体制备相比，成本更低，且周期短，稳定性和重复性好；核酸适配体在临床实验室诊断学和临床靶向治疗方面具有广阔的运用前景。
附图说明
图1为核酸适配体Apta-RABV-L-33的二级结构示意图；
图2为核酸适配体Apta-RABV-L-49的二级结构示意图；
图3为狂犬病毒L蛋白加帽去基因扩增M为DNA maker DL5000；泳道1为狂犬病毒L蛋白加帽区基因扩增片段；泳道3为阴性对照；
图4为BL/21-pET-32a（+）菌液PCR，其中：M为DNA maker DL2000；泳道1、2分别为阳性菌落扩增片段；泳道3为阴性对照；
图5为重组L蛋白加帽区的表达，其中M为maker；泳道1为未诱导菌体蛋白，泳道2为诱导后菌体蛋白；
图6为重组L蛋白的Western blot鉴定，其中泳道1阴性对照，vero细胞裂解蛋白；泳道2为纯化后L蛋白；M为蛋白maker；
图7为利用ELONA方法对核酸适配体的解离常数绘制曲线，图中横坐标为生物素标记核酸适配体的浓度，纵坐标为在450nm下的吸光度值；
图8为利用ELONA方法对核酸适配体的特异性进行分析，图中横坐标从左到右分别为狂犬病毒L蛋白、空白对照BSA、寨卡病毒PrM蛋白和重组趋化因子mCCL5；
图9为凝胶阻滞检测核酸适配体与狂犬病毒重组L蛋白结合，图中泳道1为核酸适配体；泳道2、3为Apta-RABV-L-33与重组狂犬病毒L蛋白孵育处理；泳道4，5为Apta-RABV-L-49与重组狂犬病毒L蛋白孵育处理；
图10 为基于核酸适配体的竞争ELISA检测狂犬病毒结果示意图；
图11为核酸适配体处理狂犬病毒感染N2a细胞间接免疫荧光结果，其中图a、c分别为Apta-RABV-L-33、Apta-RABV-L-49处理狂犬病毒感染N2a细胞；图b、d为阳性对照；
图12为核酸适配体对病毒增殖的影响结果。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：重组狂犬病毒L蛋白加帽区蛋白表达载体构建及重组蛋白纯化
1、狂犬病毒L蛋白加帽区基因的获取
（1）NCBI中检索出狂犬病毒HEP-Flury 毒株L蛋白加帽区的基因片段，利用primer 5软件设计如下引物；为了重组克隆和表达载体的实验需要，在引物上分别添加酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ并加入保护碱基（下划线部分），引物由昆明硕擎公司合成；
Award primer：5’-GGAATTCTGCTCTTCAGAGAGGGC-3’
Revers primer：5’-CCGCTCGAGATATCCTCAATGGGCC-3’；
（2）狂犬病毒总RNA的提取以及cDNA获取：N2a细胞培养病毒72 h收集病毒，狂犬病毒总RNA的提取如下：
①取200µL病毒上清和500µL TRIzol LS（Themo Fisher）于1mL离心管中，充分混匀，置于室温放置10min；
②加入200µL的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡使溶液充分乳化呈乳白色，无分相现象，室温放置10min（注意：氯仿沸点低，易挥发，震荡离心时可能爆开）；
③4℃离心，12000rpm离心15min，取上层液相移入另一管中（切忌吸到中间白色层）
④加入等体积的丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；
⑤4℃离心，12000 rpm离心15min，用移液枪小心吸取所有上清；
⑥1mL 75%乙醇洗涤一次，4℃下8000rpm离心10min，用移液枪小心吸取去所有上清，在超净台中干燥5min；
⑦加入适量DEPC水（如果材料丰富的话加入的水量为下一步逆转的总量减去其他试剂的量）；
（3）采用试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Themo Fisher）对步骤（2）中提取的病毒RNA进行逆转录，实验步骤按试剂盒使用说明进行；
（4）步骤（3）所得产物用于狂犬病毒L蛋白加帽区基因的扩增；
表1目的基因扩增体系
将20 µL体系配置完毕后PCR反应程序为：94℃变性5 min；其中35个循环包括94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s；最终延伸5 min；16℃终止反应；
琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，并回收目的片段，结果见图3所示，使用特异性引物进行扩增获得狂犬病毒L蛋白加帽区基因。
2、重组表达载体的构建及转化
（1）阳性克隆筛选以及质粒提取
将狂犬病毒L蛋白加帽区基因片段连接至pMD19T载体中，连接步骤参照TA cloningKit（Takara）的使用说明进行；将连接过夜的载体转化至大肠杆菌感受态中；培养过夜后，挑取平板上生长状态好且大小合适的单菌落于1mL的LB培养基中，37℃培养箱中200rpm震荡培养至LB培养基浑浊即可；进行PCR检测（方法同上）并送昆明擎科生物科技有限公司测序，对于结果为阳性菌落进行扩大培养，提取质粒；提取质粒的步骤见擎科质粒提取试剂盒的使用说明。
（2）克隆载体的双酶切鉴定
将所得到的克隆载体进行双酶切，酶切片段进行回收；狂犬病毒L蛋白的克隆载体双酶切体系如下:
表2狂犬病毒L蛋白克隆载体双酶切体系
上述体系配置后，37℃金属浴，酶切90min；琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，对成功酶切后的产物进行琼脂糖凝胶回收。
（3）重组表达载体的构建及转化
pET-32a（+）载体的抽提：菌体活化，将冻存的转化pET-32a（+）的大肠杆菌刮取适量的冰晶于含有氨苄的BL平板中划线，过夜培养；挑取长势大小良好的单克隆菌落于BL培养基中培养至对数生长期，取适量菌液进行质粒的抽提；提取质粒采用擎科质粒提取试剂盒。
抽提好的pET-32a（+）质粒，用于表达载体的构建；对抽提好的质粒进行双酶切；将该质粒于带有酶切位点已经进行双酶切的目的片段进行连接；将连接好的表达载体转化至表达宿主中以得到能够表达狂犬病毒L蛋白的菌株；
表3 pET-32a（+）载体双酶切反应体系
上述体系配置后，37℃金属浴，酶切90min；琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，对成功酶切后的产物进行琼脂糖凝胶回收；然后将目的片段与表达载体进行连接，连接体系如下：
表4狂犬病毒L蛋白表达载体构建体系
配置好上述的25µL体系后，16℃金属浴过夜；连接完成后获得重组表达载体pET-32-RABV-L，将pET-32-RABV-L载体转化至BL21感受态细胞中，实验步骤为：①将感受态细胞BL21置于冰上融化，与质粒DNA片段连接体系混匀，置于冰上30min。将感受态细胞于42℃热击90s；向离心管中补足为加入氨苄霉素的BL培养基，37℃、150rpm下培养1 h；将菌体6000rpm离心4min；弃去离心管的部分培养基，用移液枪利用剩余的培养基悬浮起来，将菌体均匀涂布于含氨苄青霉素的培养基中，37℃短时正置培养后置于培养箱中，倒置培养过夜。
（4）pET-32-RABV-L重组表达载体的菌液PCR鉴定
挑取步骤（3）LB固体培养基中长势良好大小合适的单克隆菌落，接种于含有氨苄霉素的1mL LB培养基中；于37℃下培养6h至菌液开始浑浊；在无菌操作台中，以菌液为模版进行菌液PCR鉴定，PCR的体系如下所示，引物同实施例1；
表5菌液PCR鉴定体系
按照上表所述方案配置好PCR体系后，94℃预变性5min；其中35个循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；最终延伸5min；16℃终止反应；反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳进行检测。
一代测序：对于PCR结果呈阳性的菌落，取适量的菌液于昆明硕擎生物技术有限公司使用通用引物进行一代测序。
结果如图4所示，选取菌液PCR阳性的样品，以扩增得到的狂犬病毒L蛋白基因为对照；大量培养菌液PCR阳性的样品，提取质粒送昆明硕擎生物科技有限公司进行测序，以确定表达载体构建成功；菌液PCR结果显示，得到与狂犬病毒L蛋白基因大小一致的片段；测序结果经过NCBI以及手工对比后显示，插入载体的片段与HEP-Flury毒株的相似度为100%，插入序列无发生突变等问题；成功构建了pET-32a-RABV-L表达载体。
（5）pET32a-RABV-L重组载体的转化
上步骤中冻存的pET32a-RABV-L-BL21大肠杆菌菌种中取少量的冰晶于含氨苄霉素的LB固体平板中，采用划线的方式，倒置于37℃培养箱中培养过夜，在过夜后的平板中挑取单克隆于250mL含1mM氨苄霉素的LB液体培养基中37℃、200 rpm下培养至OD600为0.6，向剩下的培养基中加入IPTG使终浓度为1mM；将加入诱导剂的菌体继续置于培养箱中，16℃、100rpm下的培养箱中诱导12h；诱导结束后取1mL的菌体进行实验，剩余菌体10000 rpm、4℃下离心后用PBS溶液进行悬浮，冻存于-80℃；利用SDS-PAGE检测重组蛋白的过表达。
结果如图5所示，重组表达质粒pET-32a（+）-RABV-L成功转入BL21后，经过扩大培养与IPTG诱导目的蛋白的表达；对于诱导前后的菌液进行SDS-PAGE检测，重组表达菌在IPTG诱导下，大量表达相对分子量为42KD的目的蛋白（图泳道2），未进行诱导菌体内只产生了少量的目的蛋白。
3、重组狂犬病毒L蛋白加帽区蛋白的纯化与鉴定
（1）重组狂犬病毒L蛋白加帽区蛋白的纯化
本实验使用pET-32a表达载体进行目的蛋白的表达，其中载体上带有组氨酸标签，镍离子与组氨酸具有很强的亲和能力。因此目的蛋白的纯化可以使用镍柱纯化系统；目的蛋白纯化步骤如下所示。
①菌体收集：将500mL表达目的蛋白的大肠杆菌菌液11400rpm离心5min，弃掉上清，收集沉淀并用30mL PBS悬浮菌体；
②超声波破碎：将菌液置于冰上，启动超声波破碎仪，破碎程序设置为频率250W，工作3s，间歇3s，全程时间3min，重复多次直至悬浮液澄清；4℃、8000 rpm离心10min，上清与沉淀分别收集；
③将沉淀用20mL、3mol/L尿素溶液溶液悬浮，震荡混匀，8000rpm离心10min，将上清与沉淀分别收集；
④取沉淀用20mL结合buffer，震荡均匀后置于摇床中180rpm混匀1h，使目的蛋白充分溶解在结合buffer中，将以上处理后的液体至于冰上超声波破碎，参数设置为频率250W，工作3s，间歇3s，全程时间3min，重复三次；此过程中避免因超声而产生气泡；
⑤上述处理后的液体，4℃、11400rpm下离心20-30min，取上清移至干净的离心管中待用；
⑥备置镍柱：将填料镍柱取出，移取适量体积的镍柱于层析柱中，室温静置一段时间使Ni-NTA与保护液分离开来；打开层析柱的底部封口，直立层析柱使保护液缓缓流；
⑦镍柱洗涤：用6倍柱体积的ddH2O洗涤镍柱，在用5倍柱体积结合缓冲液对镍柱进行清洗，此步骤的目的是除去保护液以及保证结合液的缓冲能力；
⑧目的蛋白与镍柱结合：使用5mL结合液悬浮镍柱，尽可能将所有的镍柱转移至步骤⑤的离心管中，室温震荡1h，使带有组氨酸标签的目的蛋白与镍柱充分结合；
⑨将与目的蛋白结合的镍柱全部转移至层析管中，利用重力将杂蛋白与目的蛋白分离开来；使用5倍柱体积的结合液洗涤镍柱以除去非特异性结合的杂蛋白；
⑩分别配置100mM、200mM、300mM、400mM以及500mM的梯度的洗脱缓冲液；分别将不同浓度的洗脱液加入层析柱中，收集流下的液体；收集完毕后，加入6倍体积的结合缓冲液清洗层析柱，在用6倍体积的去离子水清洗层析柱；最后使用20%乙醇，4℃保存层析柱；
将得到的不同浓度咪唑洗脱液洗脱的液体进行标记，且将这些蛋白样品进行SDS-PAGE检测，以确定最适合咪唑浓度来进行洗脱。然后根据以上的步骤，用最适合的咪唑浓度去洗脱蛋白质，以制备大量的蛋白质。
（2）重组L蛋白的Western blot鉴定
分别将纯化后的重组狂犬病毒L蛋白、诱导前BL21/pET32a-（+）菌体蛋白与loadingbuffer倍比混合均匀，95℃中加热10min，使蛋白质完全变形；SDS-PAGE检测后利用鼠抗组氨酸标签抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot检测。
结果见图6，将纯化后的重组狂犬病毒L蛋白与阴性对照Vero细胞裂解蛋白进行Western bolt检测结果如下所示，Vero蛋白中不存在多聚His标签。纯化后的重组中带有His标签能够与抗His标签的抗体结合。在二抗孵育以及显色能够看见明显的条带。蛋白实验过程中以抗His标签的一抗标记上述两种蛋白质。其中Vero细胞裂解蛋白中为天然蛋白，不会含有在外源表达过程中由与表达载体中所带有的多聚His标签。重组狂犬病毒L蛋白带有His标签，能够被以抗His标签抗体的Western blot检测出来。
（8）目的蛋白的复性
本实验中采用8M尿素溶解包涵体蛋白，蛋白质的复性步骤如下：
①透析带预处理：选取最大截留分子量小于目的蛋白三分之一大小的透析带。将透析带剪成适当长度（10～20 cm）小段，在大体积（500 mL）的2%（W/V）的碳酸氢钠和1mmol/LEDTA·2Na（pH=8.0）中将透析袋煮沸10min；用蒸馏水彻底清洗透析袋，放在500mL的1 mMEDTA·2Na（pH8.0）中煮沸10min；冷却后，置于30%或50%的乙醇中，4℃保存；
②取出透析袋使用蒸馏水洗净以后，密封夹夹紧透析袋一段；加入适量的蒸馏水，将另一端也夹紧；检验透析袋是否有破损，避免透析样品的损失；
③将待透析的样品全部移入透析袋中，密封夹夹紧；装有透析样品的透析带置于含有TGE缓冲液的烧杯中，4℃透析；期间可以适当混匀TGE透析缓冲液；每隔4h换一次透析液，进行多次透析；
④收集透析好的蛋白质，测定好蛋白浓度；作好标记，分装于多管中；-80℃冰箱中保存待用。
实施例2：狂犬病毒L蛋白加帽区核酸适配体的筛选
1、狂犬病毒L蛋白与Ni-NTA的偶联：重组狂犬病毒L蛋白被固定于Ni-NTA介质中，方便进行后续的适配体筛选工作，将重组蛋白固定于Ni-NTA介质的具体步骤为：取1mL的复性后的狂犬病毒L蛋白，置于4℃使蛋白质融化待用；取1mL Ni-NTA于层析柱中，弃去固定介质中所含的保存液，并用5倍柱体积的去离子水洗涤固定介质以除去残留的保存液；将融化后的重组蛋白溶液转移至含有Ni-NTA介质的层析柱中；室温下置于摇床中，200 rpm缓慢摇晃4h左右。
2、体外筛选狂犬病毒L蛋白的核酸适配体
为了得到高特异性、高亲和力的核酸适配体，可适当使用严苛的筛选条件。在筛选的过程中，逐渐缩短ssDNA与重组蛋白的孵育时间，降低筛选过程中重组蛋白浓度、适当增加洗涤次数以及增加负向筛选步骤，用于筛选狂犬病毒L蛋白核酸适配体的SELEX方案具体如下：
表6狂犬病毒L蛋白核酸适配体SELEX筛选方案
注：（+）表示在筛选起始步骤加入负向筛选步骤；（-）表示筛选起始不加入负向筛选步骤；
3、负向筛选：在设计的核酸适配体文库中核酸序列丰富度极高，可能存在能够与固定介质相结合的序列，为了避免后续筛选中出现非特异性结合即能够与固定介质亲和但与靶标分子亲和力低的情况。在将重组蛋白与文库孵育之前，需将核酸文库与未与重组蛋白固定的Ni-NTA介质进行孵育。以除去部分与介质亲和的核酸提高靶标分子筛选的效率以及核酸适配体的特异性；负向筛选的步骤为：
4、基于Ni-NTA亲和层析柱的核酸适配体正向筛选
Apta-F：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’；
Apta-R：5’-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’；
表7单链DNA文库扩增体系
将20 µL体系配置完毕后，PCR反应程序为：94℃变性5 min；其中35个循环包括94℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸20s；最终延伸5min；16℃终止反应；
将经过PCR扩增以后的文库进行琼脂糖凝胶回收，以得到纯净的文库片段；将回收液中的dsDNA置于金属浴中95℃加热10min，至于冰箱中完全冷却；以获得单链DNA作为下次筛选使用；
5、狂犬病毒L蛋白核酸适配体的测序
表8 核酸适配体文库-pMD-19T载体构建体系
配置好上述10µL体系，16℃连接过夜；经琼脂糖凝胶电泳检测后，将载体转化至感受态DH5α细胞中；
测序：在平板中挑取单克隆菌落于1mL含氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃、200 rpm下培养置培养基刚好混浊。取菌液进行PCR扩增，挑取50个RCR阳性单克隆菌液测序。送昆明擎科生物科技有限公司，使用通用引物M13F测序。对测序结果进行手动对比，分析测序结果。
表9核酸适配体一代测序
经分析测序结果如表9所示，50条序列中出现了重复的序列；表明在SELEX筛选过程中这些序列被富集了起来，得到了4条序列不同的核酸适配体序列。
实施例3：核酸适配体亲合力的检测
基于ELONA法，将定量的靶标分子固定于酶标孔中与核酸适配体进行孵育，测定核酸适配体与靶标分子结合的解离常数可用来对核酸适配体的亲合力进行表征；实验步骤如下：
1、抗原的包被：用50mM的碳酸盐包被缓冲液溶解重组蛋白，使其终浓度分别为200、100、50、10 μg/mL，加入100μL蛋白溶液至96孔酶标板，4℃放置包被过夜；
2、封闭：第二天弃去包被液，用PBST于水平摇床洗涤三次，每孔加入150μL 1%的BSA封闭1 h；
3、加入生物素标记的核酸适配体进行孵育：弃去封闭液，PBST于水平摇床洗涤三次，加入100μL 20nM适配体的PBS溶液； 37℃中孵育2 h；
4、链霉亲和素标记的辣根过氧化物霉的孵育：PBST洗涤三次，每孔加入100μL 1:500～1:1000稀释的SM-HRP二抗，置于恒温摇床37℃、100 rpm下孵育1h；孵育结束后每孔中加入200 µL PBST洗涤液，置于恒温摇床中37℃震荡；共洗涤5次；
5、显色：加入100μL TMB底物避光显色20min，后加入2M H2SO4终止反应，在450nm处测量吸光度，每个样品设置三个重复；
结果见图7，从图中可以看出Apta-RABV-L-1和Apta-RABV-L-10与重组狂犬病毒亲合力低，因此不对其进行进一步研究；Apta-RABV-L-33的解离平衡常数为KD=5.331nM；Apta-RABV-L-49的解离平衡常数为KD=3.698nM，说明这两条适配体与重组狂犬病毒L蛋白具有较高的亲和力。
实施例3：核酸适配体Apta-RABV-L-33和Apta-RABV-L-49的特异性检测
1、抗原的包被：用50mM的碳酸盐包被缓冲液溶解重组蛋白mCCL5、ZIKV-PrM、重组狂犬病毒L蛋白至10μg/mL，加入100μL每孔到96孔酶标板，4℃放置过夜；
2、封闭：第二天弃去包被液，用PBST于水平摇床洗涤三次，每孔加入150μL 1%的BSA封闭1 h；
3、加入生物素标记的核酸适配体进行孵育：弃去封闭液，PBST于水平摇床洗涤三次，加入100 μL 20nM适配体的PBS溶液；37℃中孵育2 h；
4、链霉亲和素标记的辣根过氧化物霉的孵育：PBST洗涤三次，每孔加入10μL的1:500～1:1000稀释的SM-HRP二抗，置于恒温摇床37 ℃、100rpm下孵育1h；孵育结束后每孔中加入200µL PBST洗涤液，置于恒温摇床中37℃震荡，共洗涤5次；
结果见图8，由于ZIKV-PrM以及mCCL5中都含有组氨酸标签，说明核酸适配体对于组氨酸标签无交叉反应，从图中可以看出核酸适配体Apta-RABV-L-33、Apta-RABV-L-49能够特异性识别重组狂犬病毒L蛋白。
实施例4：核酸适配体-重组狂犬病毒L蛋白复合物检测
为了验证重组蛋白与核酸适配体之间是否存在相互作用，利用EMSA技术对核酸适配体与重组狂犬病毒L蛋白进行了验证；实验步骤如下：
表10 5%TAE-PAGE凝胶配方
将20µg重组狂犬病毒L蛋白分别与20µM核酸适配体Apta-RABV-L-33、Apta-RABV-L-49于20mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中孵育2h；配置5%的TAE-PAGE凝胶，待其凝固后，在1×TAE溶液中电泳；将核酸适配体与重组狂犬病毒L蛋白孵育后的样品和非变性的loading buffer混匀后上样，120 V电泳40min；电泳结束后，凝胶使用SYBR Green Ⅰ染色30min，在凝胶成像系统中观察结果。
结果见图9，从图中可以看出核酸适配体Apta-RABV-L-33以及Apta-RABV-L-49识别重组狂犬病毒L蛋白。
实施例5：应用核酸适配体检测狂犬病毒
ELISA竞争法：将乳鼠脑部注入10µL狂犬病毒HEP-Flury毒株，一周后去鼠脑加入无血清1640培养基研磨均匀，离心取上清将所得脑组织上清进行10倍梯度稀释；ELISA方法如下所示：
1、抗原的包被：用50mM的碳酸盐包被缓冲液溶解稀释重组狂犬病毒L蛋白至10μg/mL，加入100μL每孔到96孔酶标板，4℃放置过夜；
2、封闭：第二天弃去包被液，用PBST于水平摇床洗涤三次，每孔加入150μL 1%的BSA封闭1h；
3、加入生物素标记的核酸适配体以及梯度稀释病毒感染脑组织上清进行孵育：弃去封闭液，PBST于水平摇床洗涤三次，加入100μL 20nM适配体的PBS溶液和100µL梯度稀释病毒感染脑组织上清，37℃中孵育2 h；
4、链霉亲和素标记的辣根过氧化物霉的孵育：PBST洗涤三次，每孔加入100 μL的1:500～1:1000稀释的SM-HRP二抗，置于恒温摇床37℃、100rpm下孵育1h；孵育结束后每孔中加入200 µL PBST洗涤液，置于恒温摇床中37℃震荡，共洗涤5次；
结果见图10，从图中可知抗原蛋白与脑组织上清中的病毒表现出与核酸适配体的竞争性结合；初步确定了核酸适配体对于检测狂犬病毒的可行性。
实施例6：核适配体处理后狂犬病毒感染细胞的间接免疫荧光
将长势良好的N2a细胞按每孔5×104个细胞的密度接入6孔板中，37℃、5%的CO2过夜培养使细胞贴壁生长；将含200μmol/L Apta-RABV-Lcap-33、Apta-RABV-Lcap-49转染至细胞中后，每孔30μL HEP-Flury病毒（MOI=0.1）加入到孔中，加入病毒后2h后吸取上清换成新鲜的培养基；在感染后48h收集病毒检测病毒滴度；加入100μL含10μL Flury病毒不完全培养基作为阳性对照；加入100μL不完全培养基作为阴性对照；
1%的BSA封闭96孔培养板2 h；PBST洗涤三次；每孔加入100μL，以1% BSA 1:3000稀释的鼠抗RABV-N-1N1以及RABV-P-1P1单克隆抗体，37℃孵育2 h；PBST洗涤三次；每孔加入100μL1:3000稀释的Goat anti-mouse IgG FITC，37℃避光孵育1h；PBST避光洗涤5次，荧光倒置显微镜观察；
结果见图11，由图可观察到明亮的荧光灶说明狂犬病毒在该条件下能够进行复制；经过核酸适配体处理后感染狂犬病毒HEP-Flury毒株N2a细胞中病毒的增殖受到了抑制。
实施例7：核酸适配体处理后病毒滴度影响
将长势良好的N2a细胞以每孔5×104 个细胞的密度接入6孔板中；37℃、5%的CO2过夜培养使细胞贴壁生长；将含200μM RABV-Lcap-33、RABV-Lcap-49转染至细胞中后每孔30 μLFlury病毒（MOI=0.1）加入到孔中；加入病毒后2h后吸取上清换成新鲜的培养基；加入100μL含10μL Flury病毒不完全培养基作为阳性对照；加入100μL不完全培养基作为阴性对照；在感染后24 h、36 h及48 h收集病毒检测病毒滴度；
TCDI50法检测病毒滴度：96孔培养板中每孔接入100μL N2a细胞悬浮液，使细胞量达到2～3×105细胞量。过夜培养使N2a细胞贴壁生长。离心管中用RPMI 1640培养基将病毒液作连续的10倍稀释从10-1到10-6；将稀释好的Hep-Flury毒株接种至96孔培养板中，每一个梯度稀释以纵排，共8孔，每孔接种100μL；设置正常细胞对照，正常细胞对照作两纵列；接种病毒后细胞培养48h即可回收病毒，使用预冷的固定液（甲醇：丙酮=1:1）-20℃静置20 min；通风处风干96孔培养板；Reed-Muench 两氏法计算TCID50。
结果见图12，转染核酸适配体的实验组与阳性对照组相比，转染核酸适配体的实验组的滴度相较与阳性对照组下降了1～2数量级，说明经过核酸适配体处理后感染狂犬病毒HEP-Flury毒株N2a细胞上清中病毒滴度明显降低，说明病毒的增殖受到了一定程度的抑制。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 特异结合狂犬病毒L蛋白加帽区的核酸适配体及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
atccagagtg acgcagcacg gcggcatgac gggggctgat ctctgtgtgt ggttggggtg 60
gacacggtgg cttagt 76
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
atccagagtg acgcagcacg gggggcggta tcaggttacg gagttaggga cttggcggtg 60
gacacggtgg cttagt 76
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
ggaattctgc tcttcagaga gggc 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
ccgctcgaga tatcctcaat gggcc 25
<210> 5
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
atccagagtg acgcagcann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntg 60
gacacggtgg cttagt 76
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
atccagagtg acgcagca 18
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<211> 18
<212> DNA
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<400> 7
actaagccac cgtgtcca 18
<210> 8
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
atccagagtg acgcagcacg ggcggagtta tggcgtggta atgtgtgtgt cgcggtggtg 60
gacacggtgg cttagt 76
<210> 9
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
atccagagtg acgcagcacg acgggtggtg ttagagtgtg gtgtgtgtat ggtgggggtg 60
gacacggtgg cttagt 76
Claims (4)
1.特异结合狂犬病毒L蛋白加帽区的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的特异结合狂犬病毒L蛋白加帽区的核酸适配体在制备检测狂犬病毒的试剂或试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述的特异结合狂犬病毒L蛋白加帽区的核酸适配体在制备治疗狂犬病药物中的应用。
4.权利要求1所述的特异结合狂犬病毒L蛋白加帽区的核酸适配体在作为分子探针中的应用。
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