CN114984189B - 一种白细胞介素16蛋白的新用途 - Google Patents
一种白细胞介素16蛋白的新用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114984189B CN114984189B CN202210586970.9A CN202210586970A CN114984189B CN 114984189 B CN114984189 B CN 114984189B CN 202210586970 A CN202210586970 A CN 202210586970A CN 114984189 B CN114984189 B CN 114984189B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- interleukin
- rabies virus
- cells
- rabies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 102000049772 Interleukin-16 Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 4
- 101500025788 Mus musculus Interleukin-16 Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 19
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 17
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 101100179556 Mus musculus Il16 gene Proteins 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- DDLIGBOFAVUZHB-UHFFFAOYSA-N midazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NC=C2CN=C1C1=CC=CC=C1F DDLIGBOFAVUZHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003793 midazolam Drugs 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 2
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 206010039897 Sedation Diseases 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 241000053227 Themus Species 0.000 description 1
- DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N amantadine Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(N)C3 DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003805 amantadine Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000036280 sedation Effects 0.000 description 1
- 239000000932 sedative agent Substances 0.000 description 1
- 230000001624 sedative effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2086—IL-13 to IL-16
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5446—IL-16
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种白细胞介素16蛋白的新用途，即其在制备抗狂犬病毒感染药物中的应用，所述白细胞介素16蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，本发明解决现有技术中对狂犬病毒感染的治疗效果不佳等问题，高效表达得到的重组大肠杆菌表达的小鼠白介素16在细胞和动物体内能够抑制狂犬病毒的增殖，为保护机体免受狂犬病毒的伤害提供了一种新的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术基因工程领域；具体涉及一种白细胞介素16蛋白在制备抗狂犬病毒感染药物中的新用途。
背景技术
狂犬病是由狂犬病毒感染神经系统引起的一种人畜共患的传染病，一旦出现临床症状，死亡率几乎可达到100%，其传播是通过快速突触转送发生的，可由已感染的家畜或野生动物，通过咬伤或抓伤经由唾液传播至人。由于目前未存在有效的针对狂犬病的暴露后治疗方法，使得每年有不少人死于狂犬病，因此，开发针对狂犬病毒的治疗方法尤为重要。
目前针对狂犬病的治疗主要包括密尔沃基疗法以及狂犬病毒免疫球蛋白（RIG）与广谱抗病毒药物联合疗法。密尔沃基疗法是以氯胺酮进行诱导昏迷，之后给予抗病毒药物利巴韦林和金刚烷胺辅助治疗，最后给予患者镇静剂咪达唑仑和防止脑痉挛的苯巴比妥镇静。虽然密尔沃基疗法救活了一名15岁患狂犬病的女孩，但是后续鲜少有人被治疗成功。与此同时，咪达唑仑、氯胺酮和利巴韦林等药物被证实具有免疫抑制等副作用，因此，最新的在线临床治疗中已不建议使用密尔沃基疗法。由于狂犬病毒免疫球蛋白（RIG）与广谱抗病毒药物联合疗法存在供应不足、成本较高、批次不同影响稳定性等缺点，人们逐渐将焦点放在了单克隆抗体上，单克隆抗体具有特异性高，适用于大规模生产并且可以避免血液传播等优点，越来越成为抗病毒治疗上的有效生物制剂，但单克隆抗体产品要获得批准伦理上仍然充满挑战。综上所述，目前使用的狂犬病的治疗方法在攻毒动物模型以及临床运用中并未表现出良好的保护性，急需开发针对狂犬病的治疗方法。
发明内容
本发明提供了一种白细胞介素16的新用途，即其在制备抗狂犬病毒感染药物中的应用，用于解决现有技术中对狂犬病毒感染的治疗效果不佳等问题，白细胞介素16蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
为实现本发明目的采用如下技术方案：
1、用Trizol法提取小鼠脾脏的总RNA，以RNA为模板进行RT-PCR得到cDNA；
2、以cDNA为模版，根据小鼠（Mus musculus）IL-16蛋白的基因编码序列（序列号：AF006001.1）设计带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物扩增，获得小鼠IL-16基因；
3、将步骤2所得基因构建到pET-28a载体上，获得能够完整表达小鼠IL-16蛋白的质粒；
4、将步骤3所得质粒转化到Rosetta（DE3）感受态细胞中，挑取阳性单克隆，测序验证；
5、将步骤4所得的阳性单克隆进行扩大培养，经IPTG诱导纯化即得小鼠白细胞介素16（IL-16）蛋白；
所述纯化具体为采用Ni-NTA亲和层析介质进行纯化，用平衡缓冲液pH 8.0 Lysisbuffer平衡，随后将用0.45μm滤膜过滤后的上清液上样至平衡好的亲和柱，并控制流速为0.5mL/min；上样完毕后用洗涤缓冲液去除杂蛋白；随后用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集得到Mus musculus IL-16蛋白；
6、检测步骤5所得蛋白与狂犬病毒（RABV）的相互作用
将IL-16重组蛋白与RABV-CVS病毒进行免疫共沉淀得到的复合物用Trizol 法提取其总RNA，以RNA为模板进行RT-PCR得到cDNA，以逆转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增RABV-CVS的N、M以及G基因，观察是否扩增出条带。
7、检测步骤5所得蛋白在细胞上抗狂犬病毒感染的效果；
所述小鼠IL-16蛋白在细胞上抗狂犬病毒感染的应用具体为：IL-16蛋白与病毒共同孵育组、先加入IL-16蛋白到细胞中培养2 h后再加病毒孵育组、先用病毒感染细胞2 h后再加入IL-16蛋白组以及只加入病毒组，比较各组的病毒滴度；
8、检测步骤5所得蛋白的动物体内抗狂犬病毒感染的效果；
所述小鼠IL-16蛋白动物体内抗狂犬病毒感染的应用具体为：先通过腹腔或者滴鼻方式对小鼠进行IL-16蛋白给药，确定该蛋白对小鼠无伤害；然后选取体重约为20g的雄性Balb/c小鼠12只，分为CVS攻毒对照组、PBS组、CVS攻毒24 h后腹腔给药组、CVS攻毒24 h后滴鼻给药组，观察小鼠的生存状况。
本发明的有益效果是：
1、本发明中采用分子克隆的方法构建质粒，能够保证质粒的正确性；
2、本发明的方法产量大，可达到200mg/100mL小鼠IL-16蛋白，且所得蛋白安全可靠具有生物活性，对小鼠无明显的副作用；
3、本发明高效表达得到的重组大肠杆菌表达的白介素16在细胞和动物体内能够抑制狂犬病毒的增殖，为保护机体免受狂犬病毒的伤害提供了一种新的途径，因此本发明为白介素16在狂犬病治疗方面的应用提供了新的方法和思路。
附图说明
图1为本发明所获IL-16蛋白基因的电泳检测结果图；
图2为本发明构建质粒的菌液PCR电泳检测结果图；
图3为本发明IL-16蛋白纯化的SDS-PAGE分析结果图；
图4为本发明所获IL-16蛋白在细胞上抗狂犬病毒感染的效果图；
图5 为本发明所获IL-16蛋白在动物体内抗狂犬病毒感染的效果图；
图6 为本发明所获IL-16蛋白与狂犬病毒相互作用验证的免疫PCR结果图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1、重组IL-16蛋白的制备
1、IL-16基因的获取
（1）从NCBI数据库中检索Mus musculus IL-16蛋白的基因编码序列，用primer5设计IL-16基因的引物，同时引入EcoRI、XhoI酶切位点(下划线部分)以及它们所对应的保护碱基；引物是在北京硕擎生物科技有限公司合成的，引物序列具体如下：
Forward primer：5'- CGGAATTCTCCGCAGCCTCAGCTTCAGC-3'，
Reverse primer：5'- CCGCTCGAGCTATGAGTCTGCAGAAGCTG -3'；
（2）用Trizol法提取小鼠脾脏的总RNA，按照天根生物科技有限公司的TRNzolUniversal（DP424）试剂的说明书进行操作，提取出来的RNA放到-80℃冰箱中保存备用；
（3）采用康为世纪逆转录试剂盒（CW2569M）对步骤（2）中提取的小鼠脾脏总RNA进行RT-PCR得到cDNA，实验步骤按试剂盒使用说明进行；
（4）步骤（3）中的cDNA用于鼠源IL-16基因的扩增
表1 目的基因扩增体系
；
PCR反应程序为：95℃变性3 min；其中35个循环包括95℃变性15 s，61℃退火15s，72℃延伸60 s；最终72℃延伸5 min；16℃终止反应。
PCR反应结束后，在2% Agarose Gel Electrophoresis上鉴定PCR产物，并根据说明书使用庄盟小容量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（ZP202）切割和回收目标基因大小的条带，结果见图1，从图中可以看出在250～500bp之间出现了一条特异条带，与目的基因IL-16的理论值357bp一致，序列见SEQ ID NO:1所示。
2、重组表达载体的构建及转化
（1）pET-28a质粒及基因的双酶切
从-80℃冰箱中取出冻存的转化pET-28a的大肠杆菌，蘸取少量菌液于LB（卡那霉素）固体培养基上划线，37℃培养14 h；挑取一个单克隆菌落于LB（卡那霉素）液体培养基中培养至对数生长期，取部分菌液使用天根质粒小提试剂盒（DP103）按照说明书上的操作步骤进行质粒的提取。
将提取出来的pET-28a质粒和目的基因配制如下表的双酶切反应体系，在37℃下反应5 h进行双酶切；
表2 pET-28a质粒及基因双酶切反应体系
双酶切结束后得到的产物用2% Agarose Gel Electrophoresis鉴定，根据说明书使用庄盟小容量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（ZP202）切割和回收目标基因大小的条带，回收后得到的DNA，用微量分光光度计测定浓度。
（2）重组表达载体的构建及转化
使用T4 DNA Ligase连接双酶切纯化后的载体和目的基因片段，按照下表体系添加试剂，16℃连接反应8 h；
表3 IL-16 蛋白原核表达载体构建体系
；
将反应结束后得到的连接产物转化至DH5α感受态细胞中，具体步骤为：
1）将感受态细胞从-80℃冰箱取出放冰上20 min；
2）将连接产物用移液枪缓慢加入到感受态细胞中混匀，在冰上反应30 min；
3）42℃水浴锅中放置60s，轻拿轻放，再与冰上放置2min，加入1mL的LB培养基；
4）37℃、200rpm摇菌1h后，使用离心机3000rpm离心5min弃掉900μL上清；
5）将剩余的液体吹打混匀后涂布于LB（卡那霉素）固体培养基平板上，在37℃恒温培养箱中倒置培养14 h。
（3）pET-28a-IL-16重组表达载体的菌液PCR鉴定
待步骤（2）菌斑长至合适大小时，在LB平板随机挑取5个单菌落置于LB（氨苄霉素）液体培养基中，200rpm、37℃培养5h至菌液变得浑浊。在无菌操作台中，以菌液为模板进行菌液PCR鉴定，PCR的体系如下所示，引物同实施例1；
表4菌液PCR鉴定体系
PCR反应程序为：95℃变性3 min；其中35个循环包括95℃变性15 s，61℃退火15s，72℃延伸60 s；最终72℃延伸5 min；16℃终止反应；反应结束后，将菌液PCR产物用2%Agarose Gel Electrophoresis进行检测，挑选出PCR结果为阳性的单克隆菌落，送至北京硕擎生物科技有限公司进行DNA测序。
结果见图2，可以看出，菌液PCR得到与IL-16蛋白基因大小一致的片段；测序结果经过NCBI以及手工对比后显示，发现载体里插入的片段与目的基因100%相似，插入的序列无突变，表明重组质粒pET-28a-IL-16成功构建。
3、重组IL-16蛋白的诱导表达及纯化
（1）pET-28a-IL-16重组载体在大肠杆菌中的表达
取少量冻存的pET-28a-IL-16-Rosetta(DE3)菌液划线到LB（卡那霉素）固体平板上，在37℃恒温培养箱中倒置培养。待菌斑长至合适大小时，随机挑取几个单克隆于1mL LB（卡那霉素）液体培养基中37℃、200rpm培养5h，转移至300mL含20μg/mL 卡那抗性 LB 液体培养基中37˚C、200 rpm培养；当菌液的OD 600 在0.4-0.6之间时，向液体培养基中加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L，26℃、120rpm/min诱导表达12h，收集菌液，同时设诱导前的菌体为对照，使用SDS-PAGE去验证。
（2）重组IL-16蛋白的纯化
将诱导结束后的菌液10000rpm离心10min，弃掉上清，收集沉淀并用30mL PBS悬浮菌体；将得到的溶液置于冰上，使用超声波破碎仪进行破碎至液体变得清澈，4℃、8000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，使用金斯瑞生物科技的Ni-NTA亲和层析介质对上清进行纯化，按照其说明书的步骤纯化，纯化后得到的蛋白使用SDS-PAGE进行检测。
结果见图3，重组表达质粒pET-28a-IL-16成功转入Rosetta（DE3）后，经过扩大培养与IPTG诱导目的蛋白的表达；对于诱导前后的菌液进行SDS-PAGE检测，重组表达菌在IPTG诱导下，大量表达相对分子量为14 kDa的目的蛋白（图3泳道2），未进行诱导菌体内只产生了少量的目的蛋白，并且主要是可溶性表达的IL-16重组蛋白；用Ni-NTA亲和层析介质纯化出来的蛋白，条带比较单一，且条带大小与预期相符。
实验例2：IL-16蛋白的抗狂犬病毒效果及作用机制评价
1、IL-16重组蛋白的体外抗RABV活性验证
从细胞培养箱中取出一瓶N2a细胞，弃掉细胞培养上清，用PBS洗一遍，再加入1mL胰蛋白酶，室温下静置消化1min，把胰蛋白酶吸出，用适量的10% DMEM完全培养基将细胞悬浮起来并均匀铺板于24孔板中，在37℃、5% CO2培养至密度60%-70%左右；实验分为三组，一组是先加入IL-16重组蛋白到细胞中反应2h后再加入RABV-CVS，另一组是IL-16重组蛋白与RABV-CVS共同孵育2h后再加入到细胞中，最后一组是先加入RABV-CVS到细胞中感染 2h后再加入IL-16重组蛋白，对照设置为只加病毒，每组做三个重复；每个孔里的IL-16重组蛋白的量1μg，RABV-CVS的MOI为0.1。
N2a细胞被病毒感染48h后 ，将每个孔里的细胞培养上清用无菌的1.5mL离心管中收集起来，收集起来的细胞培养上清用TCID50实验去验证纯化出来的蛋白是否有抗RABV生物活性。
结果见图4，IL-16重组蛋白与病毒共同孵育组、先加入IL-16重组蛋白到细胞中培养2 h后再被病毒孵育组以及先病毒感染细胞2 h后再加入IL-16重组蛋白组与只加入病毒组相比，病毒滴度都有所下降，其中病毒与IL-16重组蛋白共同孵育组的病毒滴度下降最为明显，说明IL-16蛋白抑制狂犬病毒增殖。
2、IL-16重组蛋白的体内抗RABV生物活性验证
先通过腹腔或者滴鼻方式对小鼠进行IL-16蛋白给药，确定该蛋白对小鼠无副作用。然后选取体重约为20g的雄性Balb/c小鼠12只，分为四组；这四组分别为CVS对照组、PBS组、攻毒24 h后腹腔给药组、攻毒24 h后滴鼻给药组。小鼠以250μg/（kg×d）的IL-16重组蛋白剂量治疗7天，攻毒方式为滴鼻攻毒，同时每天观察小鼠状态及存活情况。
结果见图5，从图中可以看出，PBS缓冲液对小鼠生存率无任何影响，并且给药的小鼠生存时间均所延长，攻毒24 h后滴鼻给药组有一只老鼠死亡，其余老鼠都存活下来，说明IL-16蛋白在体内可以抑制狂犬病毒增殖。
3、IL-16蛋白的抗狂犬病作用机制
1）取2个1.5mL离心管，每个离心管中加入2μg纯化后的IL-16重组蛋白，然后向一个管中加入20μL RABV-CVS病毒液（105 TCID50/0.1mL），另一个管中加入20μL正常N2a细胞的培养上清，吹打混匀，4℃缓慢摇晃孵育2h；
2）取20μL protein A/G PLUS-Agarose，用1mL PBS缓冲液洗涤3次，每次4℃、3000rpm离心1min；
3）将预处理过的20μL protein A/G PLUS-Agarose加入到病毒与重组蛋白共同孵育的离心管中，4℃缓慢摇晃孵育过夜；
4）反应结束后，4℃、3000rpm离心1min，弃掉上清，用1mL PBS缓冲液洗涤4次，每次4℃、3000rpm离心1min；
5）用Trizol 法提取上一步清洗后的琼脂糖珠的总RNA，提取出来的RNA采用康为世纪逆转录试剂盒（CW2569M）进行RT-PCR得到cDNA；
6）步骤（5）中的cDNA用于RABV-CVS的N、M以及G基因的扩增，引物见表5，PCR的体系见表6；
表5 RABV-CVS的N、M以及G基因扩增的引物
表6 RABV-CVS的N、M以及G基因扩增体系
按照上表所述方案配置好PCR体系后，95℃变性3 min；其中35个循环包括95℃变性15 s，50℃退火15 s，72℃延伸30 s；最终72℃延伸5 min；16℃终止反应；反应结束后，将菌液PCR产物用2% Agarose Gel Electrophoresis进行检测。
结果见图6，PCR扩增出来的RABV-CVS的N、M以及G基因的条带大小与预期大小（100～200 bp）符合，说明通过与狂犬病毒粒子的直接相互作用是IL-16重组蛋白发挥抗RABV疗效的作用机制之一。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种白细胞介素16蛋白在制备抗狂犬病毒感染药物中的应用；
所述白细胞介素16蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210586970.9A CN114984189B (zh) | 2022-05-27 | 2022-05-27 | 一种白细胞介素16蛋白的新用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210586970.9A CN114984189B (zh) | 2022-05-27 | 2022-05-27 | 一种白细胞介素16蛋白的新用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114984189A CN114984189A (zh) | 2022-09-02 |
| CN114984189B true CN114984189B (zh) | 2024-06-04 |
Family
ID=83028357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210586970.9A Active CN114984189B (zh) | 2022-05-27 | 2022-05-27 | 一种白细胞介素16蛋白的新用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114984189B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5643565A (en) * | 1985-09-20 | 1997-07-01 | Chiron Corporation | Human IL-2 as a vaccine adjuvant |
| CN1217025A (zh) * | 1996-04-30 | 1999-05-19 | 联邦德国卫生部 | 具有il－16活性的加工的多肽,其生产方法及其用途 |
| JP2005065596A (ja) * | 2003-08-25 | 2005-03-17 | Japan Science & Technology Agency | 増殖能欠損狂犬病ウイルス |
| CN106701687A (zh) * | 2016-12-15 | 2017-05-24 | 昆明理工大学 | 一种杂交瘤细胞株及其产生的狂犬病毒磷蛋白单克隆抗体 |
| CN106967691A (zh) * | 2017-02-17 | 2017-07-21 | 华南农业大学 | 一种携带白介素6基因的重组狂犬病病毒及其应用 |
| CN111500586A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-08-07 | 昆明理工大学 | 特异结合狂犬病毒l蛋白加帽区的核酸适配体及其应用 |
| CN113747913A (zh) * | 2019-04-05 | 2021-12-03 | 生物技术公司 | 涉及白介素-2(il2)和干扰素(ifn)的治疗 |
-
2022
- 2022-05-27 CN CN202210586970.9A patent/CN114984189B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5643565A (en) * | 1985-09-20 | 1997-07-01 | Chiron Corporation | Human IL-2 as a vaccine adjuvant |
| CN1217025A (zh) * | 1996-04-30 | 1999-05-19 | 联邦德国卫生部 | 具有il－16活性的加工的多肽,其生产方法及其用途 |
| JP2005065596A (ja) * | 2003-08-25 | 2005-03-17 | Japan Science & Technology Agency | 増殖能欠損狂犬病ウイルス |
| CN106701687A (zh) * | 2016-12-15 | 2017-05-24 | 昆明理工大学 | 一种杂交瘤细胞株及其产生的狂犬病毒磷蛋白单克隆抗体 |
| CN106967691A (zh) * | 2017-02-17 | 2017-07-21 | 华南农业大学 | 一种携带白介素6基因的重组狂犬病病毒及其应用 |
| CN113747913A (zh) * | 2019-04-05 | 2021-12-03 | 生物技术公司 | 涉及白介素-2(il2)和干扰素(ifn)的治疗 |
| CN111500586A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-08-07 | 昆明理工大学 | 特异结合狂犬病毒l蛋白加帽区的核酸适配体及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Luo Jun.Recombinant rabies virus expressing interleukin-6 enhances the immune response in mouse brain.《Archives of Virology》.第163卷(第7期),第1889-1895页. * |
| 白介素-2佐剂狂犬病疫苗的免疫学效果;袁彦宝;《中国生物制品杂志》;20071031;第20卷(第10期);第741-743页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114984189A (zh) | 2022-09-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114480438B (zh) | 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用 | |
| CN111500586B (zh) | 特异结合狂犬病毒l蛋白加帽区的核酸适配体及其应用 | |
| CN111856006B (zh) | 牛支原体分泌蛋白MbovP274的应用 | |
| CN110551732A (zh) | 一种卵形鲳鲹抗菌肽leap-2基因及应用 | |
| CN111850002B (zh) | 牛支原体分泌蛋白MbovP570的应用 | |
| CN108753798B (zh) | 一种嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白的制备方法及应用 | |
| CN107759677B (zh) | 一种美洲大蠊过敏原蛋白ba2及其表达方法 | |
| CN114015698B (zh) | 一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用 | |
| CN113150086B (zh) | 幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用 | |
| CN117838890A (zh) | 一种c型副鸡禽杆菌亚单位疫苗及其应用 | |
| CN114984189B (zh) | 一种白细胞介素16蛋白的新用途 | |
| CN114437237B (zh) | 金黄色葡萄球菌trap靶向重组蛋白抗原及其用途 | |
| CN111518180B (zh) | 一种结核病候选疫苗融合蛋白 | |
| CN104402974B (zh) | 一种具有粘膜免疫佐剂活性的多肽及其在制备粘膜免疫佐剂中的用途 | |
| CN111840529B (zh) | 一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗vkvq的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法 | |
| CN114480433B (zh) | 一种毒害艾美耳球虫亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN112661835B (zh) | 一种水貂IFN-ε成熟肽的制备方法 | |
| CN111303302A (zh) | 一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| US7223412B1 (en) | Staphylococcal enterotoxin SEC-SER, expression vector and host cell, production method thereof, and manufacturing method of vaccine | |
| CN113476599B (zh) | 疫苗免疫增强剂重组IFNγ、IL-1β及TNFα及其制备方法和应用 | |
| CN113289010A (zh) | 一种鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗及制备方法 | |
| CN117820464A (zh) | 多房棘球蚴丝氨酸蛋白酶抑制剂及其制备方法和在制备肠道炎症的药物中的应用 | |
| CN117257926A (zh) | 一种重组亚单位胶质瘤疫苗及其应用 | |
| CN115785264A (zh) | 抗sars-cov-2纳米抗体、制备方法及其应用 | |
| CN116327911A (zh) | 一种鲤疱疹病毒ii型dna疫苗及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |