CN113476599B

CN113476599B - 疫苗免疫增强剂重组IFNγ、IL-1β及TNFα及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113476599B
Application number: CN202110758978.4A
Authority: CN
Inventors: 许国晶; 张金路; 王志忠; 马汝芳; 巩俊霞; 冷春梅; 杜兴华; 田功太; 李壮
Original assignee: Shandong Freshwater Fisheries Research Institute
Current assignee: Shandong Freshwater Fisheries Research Institute
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2041-07-05
Also published as: CN113476599A

Abstract

本发明提供疫苗免疫增强剂重组IFNγ、IL‑1β及TNFα及其制备方法和应用，属于鱼类分子免疫学技术领域。本发明通过研究发现，制备得到的IFNγ、IL‑1β重组蛋白联合灭活柱状黄杆菌(FC)可显著上调pIgR、IgM基因表达及蛋白表达，显著提高草鱼相对成活率，因此IFNγ及IL‑1β重组蛋白可作为草鱼疫苗免疫增强剂，并且使用后不产生有害残留等优点，非常符合当今业界所倡导的自然生态、绿色环保的行业标准，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治也具有重要的参考价值。

Description

疫苗免疫增强剂重组IFNγ、IL-1β及TNFα及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于鱼类分子免疫学技术领域，具体涉及疫苗免疫增强剂重组IFNγ、IL-1β及TNFα及其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

IFNγ是Th1细胞主要分泌的细胞因子，并能指导原初CD4细胞向Th1型细胞分化。IFNγ最大的特点是能够提高巨噬细胞的活性，增强其杀菌能力，达到保护宿主的作用。此外，IFNγ还能够有效促进Ig的转换，增强机体免疫功能，抗肿瘤等多方面的作用。而IL-1β是一种多效的促炎细胞因子，具有调节代谢作用、造血和免疫学活性，其作为免疫调控细胞因子具有增强免疫反应的潜力。TNF-α参与机体炎性反应和免疫应答的调节，具有促进细胞生长、分化、凋亡等重要作用。从已有的研究看来，鱼类IFNγ、IL-1β及TNFα的生物学功能分别和哺乳动物的IFNγ、IL-1β及TNFα存在相似之处。例如重组金鱼IFNγ能增强巨噬细胞的吞噬作用和呼吸爆发作用，还能刺激一些炎症因子和趋化因子的表达；重组虹鳟IL-1β经腹腔注射可以有效抵御杀鲑气单胞菌感染；重组金鱼TNF-α能诱导巨暖细胞的趋化反应、吞唾作用、呼吸爆发反应等。以上研究表明，鱼类的IFNγ、IL-1β及TNFα在免疫调节反应中起到重要的作用。

草鱼具有饲料成本低、价格稳定、经济效益明显等特点，是我国水产养殖的一种优良主养或配养鱼种。为追求经济效益最大化，国内养殖户多采取高密度精养方式，但这一养殖方式却为鱼类的疾病传播，特别是病毒性疾病的暴发提供了便利条件。发明人发现，草鱼对应激反应敏感，在养殖过程中病害频发，死亡率较高，其疾病防治成本较高，这些因素使得每年的草鱼养殖业都遭受巨大的经济损失。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供疫苗免疫增强剂重组IFNγ、IL-1β及TNFα及其制备方法和应用。本发明通过研究发现，制备得到的IFNγ、IL-1β重组蛋白联合灭活柱状黄杆菌(FC)可显著上调pIgR、IgM基因表达及蛋白表达，显著提高草鱼相对成活率，因此IFNγ及IL-1β重组蛋白可作为草鱼疫苗免疫增强剂，具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供一种草鱼重组细胞因子在作为疫苗免疫增强剂中的应用。

其中，所述草鱼细胞因子包括IFNγ、IL-1β和TNFα中的任意一种或多种；

优选的，所述草鱼细胞因子为IFNγ和IL-1β。本发明通过研究发现，尽管均为细胞因子，但是并非任意细胞因子均可作为灭活柱状黄杆菌的免疫增强剂施用，发挥协同免疫作用。

所述疫苗为灭活柱状黄杆菌疫苗。

本发明的第二个方面，提供草鱼重组细胞因子联合灭活柱状黄杆菌在制备疫苗中的应用。

其中，所述草鱼重组细胞因子包括IFNγ、IL-1β和TNFα中的任意一种或多种，优选的，所述草鱼细胞因子为IFNγ和IL-1β。

所述疫苗为鱼类免疫疫苗。

所述鱼类为淡水鱼，优选为鲤科鱼类，更进一步优选为草鱼。

其中，所述草鱼重组细胞因子与灭活柱状黄杆菌的用量比例为10～30μg：0.1～10.0×10⁷cfu，进一步优选为20μg：1.0×10⁷cfu。通过优化用量比例，从而有效提高免疫保护效果，产生协同效果，具体表现在：

FC+IFNγ、FC+IL-1β相对于FC单独免疫组显著上调pIgR、IgM基因及蛋白的表达；而pIgR的有效分泌是保证分泌型免疫球蛋白发挥黏膜防御功能的必要条件；FC+IFNγ、FC+IL-1β免疫后的草鱼再进行活性FC攻毒，显著提高草鱼相对免疫保护率(RPS)。

有鉴于此，本发明的第三个方面，提供一种产品，所述产品其活性成分包括：草鱼重组细胞因子和灭活柱状黄杆菌；

所述草鱼重组细胞因子包括IFNγ、IL-1β和TNFα中的任意一种或多种，优选的，所述草鱼细胞因子为IFNγ和IL-1β。

具体的，所述草鱼重组细胞因子可采用如下方法制备得到：

S1、将草鱼细胞因子目的基因连入载体质粒中构建细胞因子重组表达载体；

S2、将上述细胞因子重组表达载体导入宿主菌，获得含细胞因子目的基因的重组菌株，诱导重组菌株表达即获得草鱼重组细胞因子。

其中，所述草鱼细胞因子包括IFNγ、IL-1β和TNFα。

所述步骤S1中，其具体步骤包括：

采用基于PCR的精确合成法(PCR-based Accurate Synthesis，PAS)，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因IFNγ(Genbank：FJ695519.1)、IL-1β(Genbank：JN705663.2)和TNFα(Genbank：JQ040498.1)，并分别连入载体质粒中；

其中，所述载体质粒可以为pET-28a或pMAL-c5x，具体的，当目的基因为IFNγ和IL-1β时，选用载体质粒为pET-28a；当目的基因为TNFα时，选用载体质粒为pMAL-c5x；相对应的，设计三对引物，所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示。

所述步骤S2中，所述宿主菌可为真核菌类或原核菌类，包括，但不限于，农杆菌、酵母菌、大肠杆菌等；进一步优选为大肠杆菌，如大肠杆菌Arctic Express。

使用IPTG诱导表达目的蛋白。优化表达条件，将诱导条件调整至30-40℃(进一步优选为37℃)，经分析目标蛋白IFNγ及IL-1β主要呈包涵体形式表达。通过变复性的方式，重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白；而pMAL-c5x-TNFα表达的目标蛋白部分呈可溶形式表达，为方便后续研究及应用，通过上清纯化方式，纯化目标蛋白TNFα，Ni柱亲和纯化获得目标蛋白。

所述草鱼重组细胞因子与灭活柱状黄杆菌的用量比例为10～30μg：0.1～10.0×10⁷cfu，进一步优选为20μg：1.0×10⁷cfu。

所述产品具有对鱼类的免疫保护效果。因此，本发明的一个具体实施方式中，所述产品可以为鱼类疫苗。

所述产品还可以包括其他可增强鱼类免疫保护效果的成分和/或非活性成分。

其中，所述非活性成分包括但不限于防腐剂、稳定剂、灭活剂等，如乳糖、明胶、山梨醇、缓冲液、盐类等。

本发明的第四个方面，提供上述产品在如下任意一种或多种中的应用：

a)促进鱼类pIgR基因和/或蛋白表达；

b)促进鱼类IgM基因和/或蛋白表达；

c)提高鱼类免疫力；

d)提高鱼类相对成活率。

本发明的第五个方面，提供一种提高鱼类免疫力和/或鱼类相对成活率的方法，所述方法包括向鱼类施用上述草鱼重组细胞因子和灭活柱状黄杆菌或上述产品，从而更加有效地增强草鱼免疫功能。

与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：

上述技术方案通过构建重组质粒转入表达菌株，同时使用IPTG诱导表达草鱼IFNγ及IL-1β，优化表达条件，通过上清纯化方式纯化目标蛋白IFNγ及IL-1β，Ni柱亲和纯化获得高纯度的草鱼IFNγ及IL-1β蛋白；所得的IFNγ及IL-1β重组蛋白再经转印免疫印迹法验证其特性。制备技术路线严密合理且可行，充分发挥了现有免疫学检测筛选方法的作用和效果。

IFNγ、IL-1β及TNFα都是先天免疫系统的重要细胞因子，在鱼类抗感染免疫调控中发挥重要的作用。制备的IFNγ、IL-1β重组蛋白+FC可显著上调pIgR、IgM基因表达及蛋白表达；但TNFα+FC未显著上调pIgR、IgM基因表达及蛋白表达；FC+IFNγ、FC+IL-1β免疫后的草鱼再进行活性FC攻毒，显著提高草鱼相对成活率，但FC+TNFα未显著提高草鱼相对成活率，这也表明细胞因子与疫苗免疫之间作用关系的复杂性。

因此上述技术方案IFNγ及IL-1β重组蛋白可作为草鱼FC疫苗免疫增强剂，并且其在使用后还具有不产生有害残留等优点，因此非常符合当今业界倡导的自然生态、绿色环保的行业标准，从而对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，同时对其他养殖鱼类的疾病防治也具有重要的参考价值，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中IFNγ、IL-1β及TNFα重组表达图；其中，A是IFNγ诱导表达结果；B是IL-1β诱导表达结果；C是TNFα诱导表达结果；其中A-C中M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；1表示IPTG未诱导重组质粒结果；2表示IPTG诱导重组质粒表达结果；3表示IPTG诱导重组质粒破碎后上清结果；4表示IPTG诱导重组质粒破碎后沉淀结果。

图2为本发明实施例中的Ni柱亲和纯化IFNγ、IL-1β及TNFα电泳图。其中，A是Ni柱亲和纯化IFNγ结果；B是Ni柱亲和纯化IL-1β结果；C是Ni柱亲和纯化TNFα结果；其中A-C中M是标准分子量蛋白；1-2表示超声波破碎处理后结果；3-5表示250mM咪唑洗脱结果。

图3为本发明实施例中的抗His单抗的转印免疫印迹检测IFNγ、IL-1β及TNFα结果图。其中，A是抗His单抗的转印免疫印迹检测IFNγ结果；B是抗His单抗的转印免疫印迹检测IL-1β结果；C是抗His单抗的转印免疫印迹检测TNFα结果；其中A-C中M是标准分子量蛋白；1表示重组蛋白与抗His单抗孵育结果。

图4为本发明实施例中的灭活FC+IFNγ、FC+IL-1β、FC+TNFα重组蛋白免疫草鱼后pIgR基因(A)及IgM基因(B)的表达水平变化。

图5为本发明实施例中的灭活FC+IFNγ、FC+IL-1β、FC+TNFα重组蛋白免疫草鱼后pIgR蛋白(A)及IgM蛋白(B)的表达水平变化。

图6为本发明实施例中的灭活FC+IFNγ、FC+IL-1β、FC+TNFα免疫草鱼进行攻毒后免疫保护效果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，草鱼对应激反应敏感，在养殖过程中病害频发，死亡率较高，疾病防治成本日益增大。这些因素每年使得草鱼养殖业遭受巨大的经济损失。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种草鱼重组细胞因子在作为疫苗免疫增强剂中的应用。

优选的，所述草鱼细胞因子为IFNγ和IL-1β。本发明通过研究发现，尽管均为细胞因子，但是并非任意细胞因子均可作为灭活柱状黄杆菌的免疫增强剂施用发挥协同免疫作用。

本发明的又一具体实施方式中，所述疫苗为灭活柱状黄杆菌疫苗。

具体实验方式包括：制备柱状黄杆菌灭活疫苗(FC)，分别采用空白对照组、疫苗单独处理组、FC+IFNγ、FC+IL-1β、FC+TNFα五组免疫草鱼，免疫后利用实时荧光定量PCR(qPCR)分析不同处理组脾中多聚免疫球蛋白受体(pIgR)及免疫球蛋白(IgM)基因的表达规律，阐明相对于疫苗单独处理组FC+IFNγ、FC+IL-1β、FC+TNFα对免疫因子基因表达的调节作用；利用ELISA分析不同处理组血清中pIgR及IgM的表达规律；在免疫后5周，采用活性柱状黄杆菌对草鱼进行攻毒，计算累计死亡率和相对免疫保护率(RPS)，弄清细胞因子+FC的免疫保护效果。

所述的qPCR分析是采用PBS对照组、FC单独处理组、FC+IFNγ、FC+IL-1β、FC+TNFα五组免疫草鱼，分别提取草鱼脾总RNA，反转录成cDNA，通过qPCR测定pIgR及IgM基因变化。

所述的ELISA法是采用PBS对照组、FC单独处理组、FC+IFNγ、FC+IL-1β、FC+TNFα五组免疫草鱼，采集不同处理组中黏液包被至96孔板，pIgR及IgM多克隆抗体孵育；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；分析不同处理组中pIgR及IgM的动态变化。

所述的RPS计算是攻毒草鱼后观察20d，及时清除死亡鱼并统计死亡情况，按下列公式计算RPS：RPS(％)＝(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率×100％。

需要说明的是，使用原核表达系统生产的哺乳动物重组IFNγ、IL-1β、TNFα已经达到商品化，并广泛用于研究和临床治疗工作。但是由于种属间的IFNγ及IL-1β、TNFα蛋白存在较大的差异，在鱼体中使用哺乳动物的重组IFNγ及IL-1β、TNFα蛋白具有一定的局限性，因此本发明发明制备了草鱼IFNγ及IL-1β、TNFα重组表达并用于增强草鱼免疫功能的研究。

因此，本发明的又一具体实施方式中，提供草鱼重组细胞因子联合灭活柱状黄杆菌在制备疫苗中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，所述草鱼重组细胞因子包括IFNγ、IL-1β和TNFα中的任意一种或多种，优选的，所述草鱼细胞因子为IFNγ和IL-1β。

本发明的又一具体实施方式中，所述疫苗为鱼类免疫疫苗。

本发明的又一具体实施方式中，所述草鱼重组细胞因子与灭活柱状黄杆菌的用量比例为10～30μg：0.1～10.0×10⁷cfu，进一步优选为20μg：1.0×10⁷cfu。通过优化用量比例，从而有效提高免疫保护效果，产生协同效果，具体表现在：

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品其活性成分包括：草鱼重组细胞因子和灭活柱状黄杆菌；

具体的，所述草鱼重组细胞因子可采用如下方法制备得到：

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因IFNγ及IL-1β，连入载体pET-28a的NdeI(CATATG)-XhoI(CTCGAG)位点、pMAL-c5x的NdeI(CATATG)-HindIII(AAGCTT)位点之间；获得的重组质粒pET-28a-IFNγ、pET-28a-IL-1β、pMAL-c5x-TNFα转入Arctic-Express；使用IPTG诱导表达目的蛋白。优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，经分析目标蛋白IFNγ及IL-1β主要呈包涵体形式表达。通过变复性的方式，重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白；pMAL-c5x-TNFα表达的目标蛋白部分呈可溶形式表达，为方便后续研究及应用，通过上清纯化方式，纯化目标蛋白TNFα，Ni柱亲和纯化获得目标蛋白。

所述的构建IFNγ、IL-1β及TNFα表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼IFNγ、IL-1β，连入载体pET-28a的NdeI(CATATG)-XhoI(CTCGAG)位点之间，获得的重组质粒pET-28a-IFNγ、pET-28a-IL-1β；获得草鱼TNFα基因，连入载体pMAL-c5x的NdeI(CATATG)-HindIII(AAGCTT)位点之间，构建重组质粒pMAL-c5x-TNFα。

所述的免疫学检测筛选方法是转印免疫印迹法；其中所述的转印免疫印迹法是用抗His的单克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的草鱼IFNγ、IL-1β及TNFα蛋白反应，确定抗原决定簇分别是分子量为18.09KD的草鱼IFNγ重组蛋白蛋白、31.61KD的IL-1β蛋白、62.83KD的草鱼TNFα重组蛋白。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述产品在如下任意一种或多种中的应用：

a)促进鱼类pIgR基因和/或蛋白表达；

b)促进鱼类IgM基因和/或蛋白表达；

c)提高鱼类免疫力；

d)提高鱼类相对成活率。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种提高鱼类免疫力和/或鱼类相对成活率的方法，所述方法包括向鱼类施用上述草鱼重组细胞因子和灭活柱状黄杆菌或上述产品.从而更加有效地增强草鱼免疫功能。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：IFNγ、IL-1β及TNFα重组蛋白的制备方法

1.草鱼IFNγ、IL-1β及TNFα表达引物的设计

根据草鱼IFNγ(Genbank：FJ695519.1)、IL-1β(Genbank：JN705663.2)、开放阅读框cDNA序列和表达载体的多克隆位点序列，加入pET-28a的NdeI(CATATG)-XhoI(CTCGAG)位点之间，设计了特异引物。

IFNγF1：CATATGCGTCGTAGCAAAAGTGAAA(SEQ ID NO.1)

IFNγR1：CTCGAGTTACTGCACTTTTTTATGT(SEQ ID NO.2)

IL-1βF1：CATATGGCCTGTGAACGTTATGAAAAAACC(SEQ ID NO.3)

IL-1βR1：CTCGAGTTATTTATTTTCCAGGGTGAAGTC(SEQ ID NO.4)

根据草鱼TNFα(Genbank：JQ040498.1)开放阅读框cDNA序列和表达载体的多克隆位点序列，加入pMAL-c5x的NdeI(CATATG)-HindIII(AAGCTT)，设计了特异引物。

TNFα-F1：CATATGAACAAGAGCCAGAGTAATCAGGAAAGC(SEQ ID NO.5)

TNFα-R1：AAGCTTTTAGTGATGATGATGATGATGCAGGGCGA(SEQ ID NO.6)

2.IFNγ、IL-1β及TNFα表达基因的扩增、纯化及双酶切

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA片段回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收。然后以内切酶对产物进行双酶切，37℃酶切6h，取出后直接利用PCR产物纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收。

3.双酶切体系如下

4.原核蛋白的表达鉴定

4.1IFNγ原核蛋白的表达鉴定

蛋白大小理论分子量为18.09KD(含标签)左右。氨基酸序列如下：

MNHKVHHHHHHMRRSKSEMTHLETNIHSLQEHYKTRGTEWVSKSVFVPHLNQLNSKASCTCQALLLERMLNIYEELFQDMKSEHKEGRKDLDHLMDEVKKLRGNYKEEHKVWKELQEMNSVKVKNGTIRGGALNDFLMVFDRASTEKHKKVQ(SEQ ID NO.7)

4.2IL-1β原核蛋白的表达鉴定

蛋白大小理论分子量为31.61KD(含标签)左右。氨基酸序列如下：

MNHKVHHHHHHMMACERYEKTLASDDACETDSAIYSDSADSDEMDCSDLPAMSCRCNMHEGIKLEMWRHSTSMKQVVNIIIALERMKNIKPKSSELEEEVLNIIMENVIQARRVTAAEATPSYYKTSKTLQCSICDQFKKFLVKSSGSPRLLGVTLRDGNSDSKVRFNLSMYASPSATPNASQPVCLAISKSNLYLACTESDGSSPHLVLEEVTETLNTIKAGDQHANLLFFRKETGVANNTFESVKYPGWFISTAFKDMEQVEVCQVPSSRITDFTLENK(SEQ ID NO.8)

4.3TNFα原核蛋白的表达鉴定

TNFα蛋白大小理论分子量为19.87kd(不含标签)，氨基酸序列翻译如下：

NKSQSNQESATGLKLTMRDHFSKANFTSKAAIHLTGAYDPEVSNKTLDWRVNQDQAFSSGGLKLVNREIIIPDDGIYFVYSQVSFHICCASDRGADQDIVHMSHAVMRISDSYGGKKALFSAIRSACVHASDSDDLSYNTIYLGAAFQLQAGDKLLTETTPLLLPRVENENGKTFFGVFAL(SEQ ID NO.9)

构建至pMAL-c5x载体，C-his标签融合表达。蛋白分子量为62.83kd(含标签)。

MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISHMNKSQSNQESATGLKLTMRDHFSKANFTSKAAIHLTGAYDPEVSNKTLDWRVNQDQAFSSGGLKLVNREIIIPDDGIYFVYSQVSFHICCASDRGADQDIVHMSHAVMRISDSYGGKKALFSAIRSACVHASDSDDLSYNTIYLGAAFQLQAGDKLLTETTPLLLPRVENENGKTFFGVFAL(SEQ ID NO.10)

5.载体转化至大肠杆菌Arctic Express

(1)将质粒1μl加入100μl感受态细菌中，置冰上20min；

(2)42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μl LB培养液；

(3)37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。

6.IPTG诱导载体融合蛋白的表达

(1)挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml Amp的3ml LB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜；

(2)次日按1:100接种于50μg/ml Amp的30ml LB培养液中，37℃ 220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8；

(3)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；

(4)向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达；

(5)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。

7.包涵体蛋白的变复性

(1)将菌体沉淀重悬于20mL裂解液(20mM Tris-HCl containing 1mM PMSF andbacteria protease inhibitor cocktail，pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)。

(2)将超声破碎的细胞裂解液4℃10000r/min离心20min，收集沉淀。

(3)使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH 8.0)洗涤包涵体3次。

(4)用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH 8.0)，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000r/min离心15min。

(5)将上述溶液滴加20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH 8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH 8.0溶液中透析过夜。

8.Ni柱纯化

(1)利用低压层析系统，上清溶液以0.5mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱。

(2)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。

(3)用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，30mM咪唑，0.15M NaCl，pH 8.0)以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。

(4)用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH 8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。

(5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS进行透析过夜。

(6)进行12％SDS-PAGE分析。

9.结果分析

如图1所示，IFNγ及IL-1β分别构建到pET28a呈包涵体形式表达，目标蛋白主要存在于沉淀中，包涵体经过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过Ni柱亲和纯化目标蛋白，IFNγ及IL-1β分子量为18.09KD及31.61KD。TNFα构建到pMAL-c5x以上清形式表达，对pMAL-c5x破碎后的上清进行Ni亲和纯化，获得纯度很高的目的表达蛋白，无其他明显杂带存在，目标蛋白分子量为62.83KD。

二、免疫学检测筛选

1.转印免疫印迹法检测

(1)取样品上样5μL。

(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束。

(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h，恒流250mA。

(4)电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min。

(5)将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。

(6)用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。

(7)次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min。

(8)用含5％牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1h。

(9)反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。

(10)ECL显影，曝光。

2.结果分析

抗His标签蛋白单抗能分别与分子量为18.09KD的IFNγ及31.61KD IL-1β、62.83KD的TNFα重组蛋白发生特异性结合。

实施例2：qPCR检测本发明IFNγ、IL-1β及TNFα重组蛋白免疫草鱼后pIgR及IgM基因的表达水平变化。

1.灭活柱状黄杆菌制备

柱状黄杆菌由广州仲恺农业工程学院提供。细菌在25℃条件下于Shieh培养基(1L培养液中含蛋白胨5g，酵母粉0.5g，0.01g CH₃COONa·3H₂O，0.01g BaCl₂·2H₂O，0.1gK₂HPO₄，0.05g KH₂PO₄，0.3g MgSO₄·7H₂O，0.0067g CaCl₂·2H₂O，0.001gFeSO₄·7H₂O，0.05gNaHCO₃，pH7.2)中振荡培养48h后，经10000r/min离心10min，收集菌体用灭菌磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)洗涤3次；用福尔马林调至终浓度1.0％，室温下放置24h灭活。随后再次离心细菌悬浮液，收集菌体用PBS清洗3次以去除福尔马林；取100μL菌悬液涂平板以验证细菌是否完全灭活；将完全灭活后的柱状黄杆菌菌苗置于4℃冰箱备用。

2.注射免疫

用于本试验的草鱼取自山东省淡水渔业研究院基地，所有草鱼在自动水循环养殖箱中暂养一周，水温保持水温27℃±1℃。适应环境后，选取体表健康、体长为13-18cm的草鱼，草鱼随机分成三个免疫组与PBS对照组，每组含有草鱼150尾。分别腹腔注射0.1ml FC(1.0×10⁸cfu ml^-1)、(1.0×10⁸cfu ml^-1)FC+IFNγ(20μg)、(1.0×10⁸cfu ml^-1)FC+IL-1β(20μg)、(1.0×10⁸cfu ml^-1)FC+TNFα(20μg)与PBS(0.1ml)，并以红霉素软膏涂抹入针处。

3样品采集

分别于免疫后12h(pIgR基因)、7d(IgM基因)取样。每次每组随机取草鱼5尾，分别混合这5尾草鱼的脾组织，提取总RNA，反转录成cDNA；保存于-20℃备用。

4.qPCR检测

以18s rRNA基因作为内参，特异性引物见表1，每个样品做3个平行。根据测得的Ct值，利用2^-ΔΔCt法计算免疫刺激后pIgR及IgM基因的相对表达量，采用SPSS 16.0统计软件中的单因素方差(one-way ANOVA)分析基因表达量的差异，显著性水平为0.05。

表1 qPCR实验所用引物

5.结果分析

使用FC、FC+IFNγ、FC+IL-1β、FC+TNFα免疫草鱼，PBS作为对照，通过qPCR测定pIgR及IgM基因变化，结果显示，与对照组相比，FC、FC+IFNγ、FC+IL-1β及FC+TNFα免疫草鱼后，脾中pIgR及IgM基因相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，FC+IFNγ、FC+IL-1β组pIgR及IgM基因相对表达量显著高于FC组(P<0.05)，而FC+TNFα组pIgR相对表达量略高于FC组表达量，差异不显著(P>0.05)，FC+TNFα组IgM相对表达量略低于FC组，但差异不显著(P>0.05)。

实施例3:ELISA检测本发明IFNγ、IL-1β及TNFα重组蛋白免疫草鱼后pIgR及IgM蛋白的表达水平变化。

1.细菌制备及草鱼免疫处理

同实施例2。

2.样品采集

分别于免疫后7d(pIgR蛋白)、21d(IgM抗体)，每组随机取鱼5尾，用玻片轻轻刮取鱼体表面的黏液装于离心管中，加等体积磷酸缓冲液(PBS，0.01mol/L pH 7.4)，15000g、4℃离心30min，取上清，-80℃下冻存备用。用于pIgR及IgM抗体水平测定。

3.ELISA检测

(1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。

(2)抗原FC(1.0×10⁹CFU·mL^-1)加入96孔酶标板(Costar)4℃包被过夜，100μL/孔。

(3)包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

(4)将收集的免疫草鱼黏液100μL(1：50稀释)，混匀后加入板条中，每孔100ul，37℃恒温箱1h。

(4)抗草鱼pIgR及IgM多抗分别按1/500，3倍稀释，每孔100μl，37℃恒温箱1h。

(5)取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μl稀释好的酶标二抗，酶标二抗：山羊抗兔-HRP，1/5000。37℃恒温箱1h。

(6)取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μl TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。

(7)每孔加入100μl 1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

4.结果分析

使用FC、FC+IFNγ、FC+IL-1β、FC+TNFα免疫草鱼，PBS作为对照，通过ELISA测定pIgR及IgM蛋白变化，结果显示，与对照组相比，FC、FC+IFNγ、FC+IL-1β、FC+TNFα免疫草鱼后，脾中pIgR及IgM蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05)，FC+IFNγ、FC+IL-1β组pIgR及IgM蛋白表达量显著高于FC组(P<0.05)，而FC+TNFα组pIgR蛋白表达量略高于FC组表达量，差异不显著(P>0.05)，FC+TNFα组IgM蛋白表达量略低于FC组IgM表达量，但差异不显著(P>0.05)。

实施例4:本发明IFNγ、IL-1β及TNFα重组蛋白免疫草鱼后进行攻毒的免疫保护效果分析。

1.细菌制备

同实施例2。

2.免疫与攻毒

设三个免疫组与PBS对照组，每组草鱼150尾，分别腹腔注射0.1mlFC(1.0×10⁸cfuml^-1)、(1.0×10⁸cfu ml^-1)FC+IFNγ(20μg)、(1.0×10⁸cfu ml^-1)FC+IL-1β(20μg)、(1.0×10⁸cfu ml^-1)FC+TNFα(20μg)与PBS(0.1ml)，并以红霉素软膏涂抹入针处。在免疫后第35d，每组随机取鱼60尾，腹腔注射FC菌液0.1mL进行攻毒，观察20d，及时清除死亡鱼并统计死亡情况，按下列公式计算相对免疫保护率(RPS)：RPS(％)＝(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率×100％。

3.结果分析

在免疫后第35d以菌株FC分别攻毒，部分草鱼表现出典型柱状黄杆菌感染症状，即体色发黑，反应迟钝，游动缓慢，鳍条有蛀鳍烂尾的现象，鳃丝肿胀，黏液多，鳃丝末端腐烂缺损，软骨外露，有的鳃丝还带有污泥，偶尔在鳃上还可发现有血斑，鳃中可分离到柱状黄杆菌。PBS组为第2d开始出现死亡，在第11d死亡率达到100％；四个免疫组在攻毒后出现死亡的时间均迟于PBS组，其中FC+IFNγ组出现死亡的时间最晚。FC、FC+IFNγ、FC+IL-1β及FC+TNFα四组均表现出一定免疫保护效果，对菌株FC的RPS分别为47％、67％、76％及51％，FC+IFNγ、FC+IL-1β显著高于空白对照组及FC组(P<0.05)，FC+TNFα组RPS与FC组RPS差异不显著(P>0.05)。

本发明制备的IFNγ、IL-1β及TNFα重组蛋白免疫草鱼，结果证实FC+IFNγ、FC+IL-1β相对于FC单独免疫组显著上调pIgR及IgM基因表达；FC+TNFα组pIgR及IgM基因表达与FC组相近，未显著上调；与FC组相比较，FC+IFNγ、FC+IL-1β免疫组显著上调pIgR及IgM蛋白表达，pIgR的有效分泌是保证分泌型免疫球蛋白发挥黏膜防御功能的必要条件；FC+IFNγ、FC+IL-1β免疫后的草鱼再进行活性FC攻毒，显著提高草鱼RPS，而FC+TNFα免疫后的草鱼再进行活性FC攻毒，未显著提高草鱼RPS。因此本发明IFNγ及IL-1β重组蛋白可作为草鱼免疫增强剂，并且使用后不产生有害残留等优点，最符合当今业界所倡导的自然生态、绿色环保的行业标准，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治也具有重要的参考价值。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心）

<120> 疫苗免疫增强剂重组IFN γ、IL-1β及TNF α及其制备方法和应用

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catatgcgtc gtagcaaaag tgaaa 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcgagttac tgcacttttt tatgt 25

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catatggcct gtgaacgtta tgaaaaaacc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcgagttat ttattttcca gggtgaagtc 30

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catatgaaca agagccagag taatcaggaa agc 33

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagcttttag tgatgatgat gatgatgcag ggcga 35

<210> 7

<211> 152

<212> PRT

<213> IFN γ原核蛋白氨基酸序列

<400> 7

Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Arg Arg Ser Lys

1 5 10 15

Ser Glu Met Thr His Leu Glu Thr Asn Ile His Ser Leu Gln Glu His

20 25 30

Tyr Lys Thr Arg Gly Thr Glu Trp Val Ser Lys Ser Val Phe Val Pro

35 40 45

His Leu Asn Gln Leu Asn Ser Lys Ala Ser Cys Thr Cys Gln Ala Leu

50 55 60

Leu Leu Glu Arg Met Leu Asn Ile Tyr Glu Glu Leu Phe Gln Asp Met

65 70 75 80

Lys Ser Glu His Lys Glu Gly Arg Lys Asp Leu Asp His Leu Met Asp

85 90 95

Glu Val Lys Lys Leu Arg Gly Asn Tyr Lys Glu Glu His Lys Val Trp

100 105 110

Lys Glu Leu Gln Glu Met Asn Ser Val Lys Val Lys Asn Gly Thr Ile

115 120 125

Arg Gly Gly Ala Leu Asn Asp Phe Leu Met Val Phe Asp Arg Ala Ser

130 135 140

Thr Glu Lys His Lys Lys Val Gln

145 150

<210> 8

<211> 281

<212> PRT

<213> IL-1β原核蛋白氨基酸序列

<400> 8

Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Met Ala Cys Glu

1 5 10 15

Arg Tyr Glu Lys Thr Leu Ala Ser Asp Asp Ala Cys Glu Thr Asp Ser

20 25 30

Ala Ile Tyr Ser Asp Ser Ala Asp Ser Asp Glu Met Asp Cys Ser Asp

35 40 45

Leu Pro Ala Met Ser Cys Arg Cys Asn Met His Glu Gly Ile Lys Leu

50 55 60

Glu Met Trp Arg His Ser Thr Ser Met Lys Gln Val Val Asn Ile Ile

65 70 75 80

Ile Ala Leu Glu Arg Met Lys Asn Ile Lys Pro Lys Ser Ser Glu Leu

85 90 95

Glu Glu Glu Val Leu Asn Ile Ile Met Glu Asn Val Ile Gln Ala Arg

100 105 110

Arg Val Thr Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ser Tyr Tyr Lys Thr Ser Lys

115 120 125

Thr Leu Gln Cys Ser Ile Cys Asp Gln Phe Lys Lys Phe Leu Val Lys

130 135 140

Ser Ser Gly Ser Pro Arg Leu Leu Gly Val Thr Leu Arg Asp Gly Asn

145 150 155 160

Ser Asp Ser Lys Val Arg Phe Asn Leu Ser Met Tyr Ala Ser Pro Ser

165 170 175

Ala Thr Pro Asn Ala Ser Gln Pro Val Cys Leu Ala Ile Ser Lys Ser

180 185 190

Asn Leu Tyr Leu Ala Cys Thr Glu Ser Asp Gly Ser Ser Pro His Leu

195 200 205

Val Leu Glu Glu Val Thr Glu Thr Leu Asn Thr Ile Lys Ala Gly Asp

210 215 220

Gln His Ala Asn Leu Leu Phe Phe Arg Lys Glu Thr Gly Val Ala Asn

225 230 235 240

Asn Thr Phe Glu Ser Val Lys Tyr Pro Gly Trp Phe Ile Ser Thr Ala

245 250 255

Phe Lys Asp Met Glu Gln Val Glu Val Cys Gln Val Pro Ser Ser Arg

260 265 270

Ile Thr Asp Phe Thr Leu Glu Asn Lys

275 280

<210> 9

<211> 181

<212> PRT

<213> TNF α原核蛋白氨基酸序列

<400> 9

Asn Lys Ser Gln Ser Asn Gln Glu Ser Ala Thr Gly Leu Lys Leu Thr

1 5 10 15

Met Arg Asp His Phe Ser Lys Ala Asn Phe Thr Ser Lys Ala Ala Ile

20 25 30

His Leu Thr Gly Ala Tyr Asp Pro Glu Val Ser Asn Lys Thr Leu Asp

35 40 45

Trp Arg Val Asn Gln Asp Gln Ala Phe Ser Ser Gly Gly Leu Lys Leu

50 55 60

Val Asn Arg Glu Ile Ile Ile Pro Asp Asp Gly Ile Tyr Phe Val Tyr

65 70 75 80

Ser Gln Val Ser Phe His Ile Cys Cys Ala Ser Asp Arg Gly Ala Asp

85 90 95

Gln Asp Ile Val His Met Ser His Ala Val Met Arg Ile Ser Asp Ser

100 105 110

Tyr Gly Gly Lys Lys Ala Leu Phe Ser Ala Ile Arg Ser Ala Cys Val

115 120 125

His Ala Ser Asp Ser Asp Asp Leu Ser Tyr Asn Thr Ile Tyr Leu Gly

130 135 140

Ala Ala Phe Gln Leu Gln Ala Gly Asp Lys Leu Leu Thr Glu Thr Thr

145 150 155 160

Pro Leu Leu Leu Pro Arg Val Glu Asn Glu Asn Gly Lys Thr Phe Phe

165 170 175

Gly Val Phe Ala Leu

180

<210> 10

<211> 572

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys

1 5 10 15

Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

20 25 30

Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

35 40 45

Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

50 55 60

His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile

65 70 75 80

Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

85 90 95

Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

100 105 110

Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

115 120 125

Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

145 150 155 160

Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

180 185 190

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

195 200 205

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

210 215 220

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser

245 250 255

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

260 265 270

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

275 280 285

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

290 295 300

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

305 310 315 320

Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln

325 330 335

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

340 345 350

Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn

355 360 365

Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile

370 375 380

Glu Gly Arg Ile Ser His Met Asn Lys Ser Gln Ser Asn Gln Glu Ser

385 390 395 400

Ala Thr Gly Leu Lys Leu Thr Met Arg Asp His Phe Ser Lys Ala Asn

405 410 415

Phe Thr Ser Lys Ala Ala Ile His Leu Thr Gly Ala Tyr Asp Pro Glu

420 425 430

Val Ser Asn Lys Thr Leu Asp Trp Arg Val Asn Gln Asp Gln Ala Phe

435 440 445

Ser Ser Gly Gly Leu Lys Leu Val Asn Arg Glu Ile Ile Ile Pro Asp

450 455 460

Asp Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln Val Ser Phe His Ile Cys Cys

465 470 475 480

Ala Ser Asp Arg Gly Ala Asp Gln Asp Ile Val His Met Ser His Ala

485 490 495

Val Met Arg Ile Ser Asp Ser Tyr Gly Gly Lys Lys Ala Leu Phe Ser

500 505 510

Ala Ile Arg Ser Ala Cys Val His Ala Ser Asp Ser Asp Asp Leu Ser

515 520 525

Tyr Asn Thr Ile Tyr Leu Gly Ala Ala Phe Gln Leu Gln Ala Gly Asp

530 535 540

Lys Leu Leu Thr Glu Thr Thr Pro Leu Leu Leu Pro Arg Val Glu Asn

545 550 555 560

Glu Asn Gly Lys Thr Phe Phe Gly Val Phe Ala Leu

565 570

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcaaggcagg atgataga 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cacgcaggag ttccagtt 18

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgtctacctc caactccacc ac 22

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

taccgctctt ccactcagaa taac 24

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggaatgagcg tatcctaaac cc 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctcccgagat ccaactacaa gc 22

Claims

1.草鱼重组细胞因子联合灭活柱状黄杆菌在制备鱼类免疫疫苗中的应用；

所述草鱼重组细胞因子为IFN γ和/或IL-1β；

其中，所述IFN γ的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述IL-1β的氨基酸序列如SEQID NO.8所示。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述鱼类为淡水鱼。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述鱼类为鲤科鱼类。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述鱼类为草鱼。

5.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述草鱼重组细胞因子与灭活柱状黄杆菌的用量比例为10~30μg：0.1~10.0×10⁷ cfu。

6.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述鱼类免疫疫苗具有如下任意一种或多种作用：

a）促进鱼类pIgR基因和/或蛋白表达；

b）促进鱼类IgM基因和/或蛋白表达；

c）提高鱼类免疫力；

d）提高鱼类相对成活率。

7.一种鱼类疫苗，其特征在于，所述鱼类疫苗的活性成分包括：草鱼重组细胞因子和灭活柱状黄杆菌；

所述草鱼重组细胞因子为IFN γ和/或IL-1β；

其中，所述IFN γ的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述IL-1β的氨基酸序列如SEQID NO.8所示；

所述草鱼重组细胞因子与灭活柱状黄杆菌的用量比例为10~30μg：0.1~10.0×10⁷ cfu。

8.如权利要求7所述鱼类疫苗，其特征在于，所述草鱼重组细胞因子采用如下方法制备得到：