CN109055411B - 抑制WSSV增殖的半胱天冬氨酸酶基因Cq-caspase及其蛋白抗病毒活性应用 - Google Patents

抑制WSSV增殖的半胱天冬氨酸酶基因Cq-caspase及其蛋白抗病毒活性应用 Download PDF

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Abstract

抑制WSSV增殖的半胱天冬氨酸酶基因Cq‑caspase及其蛋白抗病毒活性应用。提供红螯螯虾caspase的基因序列、氨基酸序列、重组蛋白的制备方法和红螯螯虾caspase重组蛋白在制备抗WSSV类新药和动物抗病饲料添加剂中应用。依据Cq‑caspase基因序列特征成功构建重组表达载体，在大肠杆菌原核表达系统中诱导表达并纯化获得Cq‑caspase重组蛋白。基于得到的rCq‑caspase，探究其抗WSSV活性。结果表明，rCq‑caspase能够抑制WSSV在红螯螯虾Hpt细胞中的增殖。因此重组基因工程产品rCq‑caspase在制备抗WSSV类新药开发应用中显示出非常诱人的应用前景。

Description

抑制WSSV增殖的半胱天冬氨酸酶基因Cq-caspase及其蛋白抗 病毒活性应用
技术领域
本发明涉及螯螯虾(Cherax quadricarinatus)一种半胱天冬氨酸酶基因及其蛋白在白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)感染中的应用。
背景技术
白斑综合征病毒属于杆状的双链DNA病毒，无包涵体包被，具有囊膜，一端有尾巴[1]，是严重危害世界对虾养殖的病原之一，对养殖渔业造成巨大的经济损失。因此，提高虾类抵抗WSSV感染能力，寻找抵御WSSV的方法尤为重要。但是，迄今为止，依然缺乏预防和治疗WSSV病害的有效药物。
与脊椎动物不同，无脊椎动物缺乏完善的获得性免疫系统，只能依靠先天性免疫系统来抵御外界微生物的侵染。甲壳动物的先天性免疫可以分为细胞免疫和体液免疫两种。细胞凋亡属于细胞免疫的一种，由半胱天冬氨酸酶(cysteinyl aspartatespecificproteinase，caspase)介导。Caspase蛋白可以依靠自身的激活位点切割靶蛋白，其切割位点位于靶蛋白的天冬氨酸残基处[2]。caspase包含有caspase结构域(CASc)[3]，具有两个酶活性中心，可识别特异性的四肽底物[4]。一般情况下，caspase在细胞中以无活性的酶原形式存在，当其被激活后，可以介导细胞凋亡的发生，而凋亡可以参与细胞的抗病毒免疫应答过程。当宿主感染病毒后，细胞凋亡启动，清除已被病毒感染的细胞，从而阻止病毒蔓延至相邻细胞。
目前，已在部分甲壳动物中鉴定出了caspase。例如，较早在日本囊对虾中发现了Mjcaspse[5]，随后在斑节对虾[6]和南美白对虾[7]中均发现了caspase。研究表明，甲壳动物中的caspase在细胞凋亡中显示出重要的作用。在日本囊对虾中，Mjcaspase在感染WSSV后表达量上调，且该基因沉默后抑制了由WSSV引起的细胞凋亡[5]。另外，研究认为，虾类感染WSSV后，caspase基因在转录水平的表达量会发生变化。例如，在南美白对虾中，Lvcaspase2-5表达量受WSSV的影响，推测Lvcaspase在抵御WSSV过程中显示出一定作用[7]。而在斑节对虾中，Pmcaspase3在体内外均显示了对WSSV感染的免疫应答响应[6]。然而，已有研究仅聚焦于WSSV感染后caspase基因转录水平的表达变化，而针对caspase蛋白对WSSV感染的功能研究甚少，特别是红螯螯虾caspase蛋白是否具有抗WSSV病毒的活性仍然是未知的，因此，开展红螯螯虾caspase蛋白的表达纯化以及功能研究对WSSV防治有重要意义。
红螯螯虾Cq-caspase基因与甲壳动物现有的caspase基因在序列上同源性低，有着较大的差异性，说明其具有一定的独特的生物学功能。在感染WSSV后的红螯螯虾造血组织(Hpt)细胞中，Cq-caspase基因转录水平显著上调，表明该基因具有响应WSSV感染的功能。为此，本发明获得了caspase基因工程产品——来源于红螯螯虾的Cq-caspase重组蛋白，首次发现该基因工程产品能够在Hpt细胞中抑制WSSV的增殖，这对于探究防治WSSV感染的方法具有重要应用前景。
参考文献：
[1]Escobendo-Bonilla C M,Alday-Sanz V,Wille M,et al.A review on themorphology,molecular characterization,morphogenesis and pathogenesis of whitespot syndrome virus[J].Journal of fish diseases,2008,31(1):1-18.
[2]Alnemri E S,Livingston D J,NicholsonN D W,et al.Human ICE/CED-3protease nomenclature[J].Cell,1996,87(2):171.
[3]FanT J,Han L H,Cong R S,et al.Caspase family proteases andapoptosis[J].Acta biochimica et biophysica Sinica,2005,37(11):719-27.
[4]Earnshaw W C,Martins L M,Kaufmann S H.Mammalian caspases:structure,activation,substrates,and functions during apoptosis[J].Annualreview of biochemistry,1999,68:383-424.
[5]Wang L,Zhi B,Wu W L,et al.Requirement for shrimp caspase inapoptosis against virus infection[J].Developmental and ComparativeImmunology,2008,32(6):706-15.
[6]Wongprasert K,Sangsuruya P,Phongdara A,et al.Cloning andcharacterization of a caspase gene from black tiger shrimp(Penaeus monodon)-infected with white spot syndrome virus(WSSV)[J].J Biotechnol,2007,131(1):9-19.
[7]Wang P H,Wan D H,Chen Y G,et al.Characterization of four novelcaspases from Litopenaeus vannamei(Lvcaspase2-5)and their role in WSSVinfection through dsRNA-mediated gene silencing[J].PLoS One,2013,8(12):e80418.
发明内容
本发明的第一目的在于提供红螯螯虾caspase的基因序列。
本发明的第二目的在于提供红螯螯虾caspase的氨基酸序列。
本发明的第三目的在于提供红螯螯虾caspase重组蛋白的制备方法。
本发明的第四目的在于提供红螯螯虾caspase重组蛋白在制备抗WSSV类新药和动物抗病饲料添加剂中应用。
所述红螯螯虾caspase的基因序列为：
Figure BDA0001804076100000031
所述红螯螯虾caspase的氨基酸序列为：
Figure BDA0001804076100000032
Figure BDA0001804076100000041
所述红螯螯虾caspase重组蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)将Cq-caspase基因连接到原核表达载体pET28a中，构建pET28a-Cq-caspase重组表达载体；
2)将步骤1)所得pET28a-Cq-caspase重组表达载体导入宿主细胞Escherichiacoli(BL21:DE3)，并用硫代半乳糖苷(IPTG)对其进行诱导表达，获得表达产物；
在步骤2)中，所述诱导表达的条件可为0.1mM IPTG、诱导温度为16℃、诱导时间为20h。
3)分离纯化步骤2)得到的表达产物，超声破碎后通过亲和层析获得较高纯度的红螯螯虾caspase重组蛋白(rCq-caspase)。
所述rCq-caspase对WSSV的感染具有明显的抑制作用，对于虾类感染WSSV机制的研究具有借鉴价值，为虾类抗病毒免疫研究提供新的思路，因此红螯螯虾caspase重组蛋白可在制备抗WSSV类新药和动物抗病饲料添加剂中应用。
本发明依据Cq-caspase基因序列特征成功构建重组表达载体，在大肠杆菌原核表达系统中诱导表达并纯化获得Cq-caspase重组蛋白。基于得到的rCq-caspase，探究其抗WSSV活性。研究结果表明，rCq-caspase能够抑制WSSV在红螯螯虾Hpt细胞中的增殖。因此，重组基因工程产品rCq-caspase在制备抗WSSV类新药开发应用中显示出非常诱人的应用前景。
附图说明
图1为pET28a-Cq-caspase原核表达载体构建图。
图2为SDS-PAGE分析pET28a-Cq-caspase重组载体诱导表达的电泳图谱。在图2中，M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker，1为导入重组载体的表达菌添加诱导剂前的菌液，2为导入重组载体的表达菌添加诱导剂后的菌液，3为诱导后的表达菌超声破碎后的上清，4为诱导后的表达菌超声破碎后的沉淀。在加入诱导剂后可见约41kDa的诱导重组表达蛋白条带，并且该蛋白在上清和沉淀中均可以表达。
图3为SDS-PAGE分析pET28a-Cq-caspase重组载体表达产物纯化的电泳图谱。在图3中，M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker，1为纯化的Cq-caspase重组蛋白，可见约为41kDa的蛋白条带。
图4为Western blotting分析Cq-caspase重组蛋白转入Hpt细胞的图谱。在图4中，Cq-caspase重组蛋白可以成功转入Hpt细胞中。
图5为半定量PCR分析rCq-caspase对WSSV极早期基因IE1的影响。在图5中，rCq-caspase处理抑制了WSSV的极早期基因IE1在红螯螯虾Hpt细胞中的转录水平，使其降低了40％左右。
图6为半定量PCR分析rCq-caspase对WSSV晚期囊膜蛋白基因VP28的影响。在图6中，rCq-caspase处理抑制了WSSV的晚期囊膜蛋白基因VP28在红螯螯虾Hpt细胞中的转录水平，使其降低了50％左右。
具体实施方式
以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。
实施例1红螯螯虾caspase原核表达载体的构建
根据pET28a载体的多克隆位点，设计特异性扩增Cq-caspase基因开放阅读框(ORF)的上游引物F1和下游引物R1。并在上游引物F1的5’端添加EcoR I酶切位点，在下游引物R1的5’端添加Not I酶切位点和终止密码子，将Cq-caspase的ORF区克隆至pET28a载体中。
上游引物F1：5’-CCGGAATTCATGATTCACATGTGTGATAGTTTGA-3’；
下游引物R1：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTACTGTTTCTTTTTACCCACTGGA-3’。
扩增Cq-caspase的编码区片段，PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，重复30个循环；72℃延伸10min。
利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收PCR产物，回收的PCR产物经EcoR I和Not I酶切后纯化回收，与EcoRI和Not I双酶切线性化的pET28a载体连接，构建好重组表达载体pET28a-Cq-caspase，测序确定读码框准确无误后用于后续重组蛋白表达。
pET28a-Cq-caspase载体构建图参见图1。
实施例2重组表达载体pET28a-Cq-caspase在大肠杆菌E.coli(BL21:DE3)中的诱导表达
1.将测序正确的重组表达载体pET28a-Cq-caspase转化至E.coli BL21中，并涂布于含卡那霉素(Kana+)抗性的LB平板。
2.挑取单克隆菌落，接种于10mL含Kana+的LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养12h。
3.以1︰100的比例接种至200mL含Kana+的LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养至菌液OD600为0.3～0.5。
4.加入IPTG至终浓度0.1mM，16℃，160rpm诱导20h。
结果显示，IPTG诱导后在菌体中可检测到明显的Cq-caspase重组蛋白条带，大小为41kDa左右(图2)，说明该条件可以获得较高比例的表达产物。
实施例3pET28a-Cq-caspase重组质粒在大肠杆菌中IPTG诱导后的表达产物纯化
1.收集菌体：诱导后菌液8000g离心10min，重悬于PBS；超声破碎，并于4℃，12000g离心30min，收集上清。
2.取400μL含镍琼脂糖珠子，超纯水清洗3遍以除去乙醇，再用PBS清洗3遍以平衡珠子，加入到过滤好的上清中，于4℃旋转孵育2h。
4.洗杂：用20mM浓度的咪唑溶液清洗珠子以除去非特异结合的杂蛋白。
5.洗脱：利用50～250mM咪唑溶液进行梯度洗脱。
6.收集：分别收集不同浓度咪唑溶液洗脱的蛋白，取少量进行SDS-PAGE电泳鉴定。
7.透析：鉴定后的蛋白溶液于PBS缓冲液(pH7.4)中4℃透析48h，期间换液4～5次，透析后的蛋白溶液分装后于-80℃保存以备后续实验使用。
结果显示，纯化透析后的蛋白条带较为单一(图3)，说明经亲和层析纯化后可以得到纯度较高的重组蛋白。
实施例4蛋白转染实验验证Cq-caspase重组蛋白抑制WSSV的增殖
Cq-caspase重组蛋白抑制WSSV增殖鉴定：取螯虾Hpt细胞培养于96孔板中，每孔取300ng rCq-caspase蛋白或等量的对照蛋白绿色荧光蛋白GFP，1μL pulsin转染试剂，20mMHepes溶液补足至20μL，室温孵育15min后加入到96孔板Hpt细胞中，20℃培养箱孵育4h后用SDS收集样品，用于rCq-caspase转染效果的确定。同时，取螯虾Hpt细胞培养于24孔板中，每孔取1μg rCq-caspase或等量的对照重组蛋白GFP，2μL pulsin转染试剂，20mM Hepes溶液补足至100μL，室温孵育15min后加入到24孔板Hpt细胞中，20℃培养箱孵育4h后换掉所有改良的L-15培养基，加入新的培养基，并感染WSSV(MOI＝1)。WSSV感染6h后用RNA裂解液收集培养孔中的细胞并提取RNA，逆转录合成cDNA。
将收集的96孔细胞样品在12％SDS-PAGE电泳并电转到PVDF膜(GE Healthcare)上。将膜置于用TBST缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，0.1％Tween 20，pH 7.6)溶解的5％脱脂奶粉中室温封闭1h，随后与抗His(1︰3000)和抗β-actin(内参)的抗体(TransGenBiotech，1︰3000)室温孵育1h。用TBST缓冲液洗涤膜5次后，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠二抗(1︰5000)室温孵育1h。最后使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法显影。Western blot结果(图4)显示：rCq-caspase和GFP重组蛋白均可以成功转入Hpt细胞中。
以逆转录合成的cDNA为模板，半定量PCR检测WSSV极早期基因IE1和晚期囊膜蛋白基因VP28的转录水平表达，其中16S rRNA作为内参基因。检测IE1和VP28以及16S rRNA的引物序列如下：
IE1上游引物IE1-F：5’-CTGGCACAACAACAGACCCTACC-3’，
IE1下游引物IE1-R：5’-GGCTAGCGAAGTAAAATATCCCCC-3’；
VP28上游引物VP28-F：5’-AAACCTCCGCATTCCTGT-3’，
VP28下游引物VP28-R：5’-GTGCCAACTTCATCCTCATC-3’；
16S rRNA上游引物16S-F：5’-AATGGTTGGACGAGAAGGAA-3’，
16S rRNA下游引物16S-R：5’-CCAACTAAACACCCTGCTGATA-3’。
半定量PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃延伸10min。
PCR反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。IE1和VP28相较于16S rRNA的mRNA水平的表达量用Gel Image System ID 4.2软件分析。
结果(图5)显示，rCq-caspase转染处理组的Hpt细胞中WSSV的IE1转录水平较对照组降低40％左右，表明rCq-caspase处理组中WSSV的极早期基因IE1的基因表达明显减弱。图6结果显示，rCq-caspase转入Hpt细胞后，WSSV的晚期囊膜蛋白基因mRNA转录水平较对照组降低了50％左右，说明rCq-caspase能够抑制WSSV的VP28基因的转录水平。以上结果说明rCq-caspase对WSSV的增殖有抑制作用。
本发明旨在获得红螯螯虾caspase基因及氨基酸序列，并对其基因工程产品抗WSSV病毒活性进行了鉴定，以期用于高效抗WSSV新药物的开发。本发明获得了红螯螯虾caspase的基因序列，成功构建了Cq-caspase基因工程表达重组质粒pET28a-Cq-caspase，在获得Cq-caspase重组表达蛋白纯品后，进一步确认了rCq-caspase抗WSSV病毒活性，确定该基因工程产品能够抑制WSSV的增殖，为其作为抗WSSV病害防治新药物的开发奠定了良好基础。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 抑制WSSV增殖的半胱天冬氨酸酶基因Cq-caspase及其蛋白抗病毒活性应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1062
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 1
atgattcaca tgtgtgatag tttgacacct acacttgttt ttaaattgtt aaatataatg 60
aaaactaaca aaagtttttc tagtggcatt gacaaggact tacttgccag cattacaata 120
gaccaactga cacatgaagg actgaaagaa gcactgttct tcttcataat taggttgatg 180
gaagacggta atatgctgaa ccgtttgtac acagataaac tgaaagacgc tttcaaagaa 240
cttaatcaaa acagcaccaa ggaagagaaa cagataatca ccagtttgtt atacaagcta 300
agaaactatc caggagaatg ccatccttct ggattatgca ttgtcttttg tgttagtgaa 360
aacagagaag gagctagcag tgaaatagcc aagataaaaa aattatttga aaatattctt 420
ggtttcacag tcaaaattga ggaaaatcct agtgtgaaga ccattgaatc ttacgaatta 480
gaactacaga agccaaagta tcgttattat gactccattg tgtactggtt tgttagtcat 540
ggcaatgaaa ctgaactaaa acttcctaat gatgagatat acttaaggga agaatttatt 600
gataattttt caaagccagc caacttcatc aaaaaaccta aaattttctt catggcagct 660
tgccgaggag aaaagaccat tcctgtagtt aaaaaaggtg gccgtccatc aagtgcagat 720
gcaaaacatc gcgcaaatat aaaaattcca gactcttctc tggacattga gaatgtccac 780
tatgaggttg accgtcttgt tgttaatgca actcttccta caagatattc ctttcgaagc 840
aaagatgaag gttcagtgtt tgtggatgtt gtatgctctc ttctggaaga atattgtgga 900
gaaaacatca ctgaagcact agtagaagca tcccggataa tacaccagat tatttttaaa 960
agtaatgata attcatttga agggttttcc aaacaagcat gttcctatga tagcacactc 1020
caaaaaactt ttattattcc agtgggtaaa aagaaacagt aa 1062
<210> 2
<211> 353
<212> PRT
<213> 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)
<400> 2
Met Ile His Met Cys Asp Ser Leu Thr Pro Thr Leu Val Phe Lys Leu
1 5 10 15
Leu Asn Ile Met Lys Thr Asn Lys Ser Phe Ser Ser Gly Ile Asp Lys
20 25 30
Asp Leu Leu Ala Ser Ile Thr Ile Asp Gln Leu Thr His Glu Gly Leu
35 40 45
Lys Glu Ala Leu Phe Phe Phe Ile Ile Arg Leu Met Glu Asp Gly Asn
50 55 60
Met Leu Asn Arg Leu Tyr Thr Asp Lys Leu Lys Asp Ala Phe Lys Glu
65 70 75 80
Leu Asn Gln Asn Ser Thr Lys Glu Glu Lys Gln Ile Ile Thr Ser Leu
85 90 95
Leu Tyr Lys Leu Arg Asn Tyr Pro Gly Glu Cys His Pro Ser Gly Leu
100 105 110
Cys Ile Val Phe Cys Val Ser Glu Asn Arg Glu Gly Ala Ser Ser Glu
115 120 125
Ile Ala Lys Ile Lys Lys Leu Phe Glu Asn Ile Leu Gly Phe Thr Val
130 135 140
Lys Ile Glu Glu Asn Pro Ser Val Lys Thr Ile Glu Ser Tyr Glu Leu
145 150 155 160
Glu Leu Gln Lys Pro Lys Tyr Arg Tyr Tyr Asp Ser Ile Val Tyr Trp
165 170 175
Phe Val Ser His Gly Asn Glu Thr Glu Leu Lys Leu Pro Asn Asp Glu
180 185 190
Ile Tyr Leu Arg Glu Glu Phe Ile Asp Asn Phe Ser Lys Pro Ala Asn
195 200 205
Phe Ile Lys Lys Pro Lys Ile Phe Phe Met Ala Ala Cys Arg Gly Glu
210 215 220
Lys Thr Ile Pro Val Val Lys Lys Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ala Asp
225 230 235 240
Ala Lys His Arg Ala Asn Ile Lys Ile Pro Asp Ser Ser Leu Asp Ile
245 250 255
Glu Asn Val His Tyr Glu Val Asp Arg Leu Val Val Asn Ala Thr Leu
260 265 270
Pro Thr Arg Tyr Ser Phe Arg Ser Lys Asp Glu Gly Ser Val Phe Val
275 280 285
Asp Val Val Cys Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Cys Gly Glu Asn Ile Thr
290 295 300
Glu Ala Leu Val Glu Ala Ser Arg Ile Ile His Gln Ile Ile Phe Lys
305 310 315 320
Ser Asn Asp Asn Ser Phe Glu Gly Phe Ser Lys Gln Ala Cys Ser Tyr
325 330 335
Asp Ser Thr Leu Gln Lys Thr Phe Ile Ile Pro Val Gly Lys Lys Lys
340 345 350
Gln

Claims (4)

1.红螯螯虾caspase的基因序列为：
Figure FDA0003416607610000011
2.红螯螯虾caspase的氨基酸序列为：
Figure FDA0003416607610000012
Figure FDA0003416607610000021
3.红螯螯虾caspase重组蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将如权利要求1所述红螯螯虾caspase的基因序列连接到原核表达载体pET28a中，构建pET28a-Cq-caspase重组表达载体；
2)将步骤1)所得pET28a-Cq-caspase重组表达载体导入宿主细胞Escherichia coliBL21(DE3)，并用硫代半乳糖苷对其进行诱导表达，获得表达产物；所述诱导表达的条件为0.1mM IPTG、诱导温度为16℃、诱导时间为20h；
3)分离纯化步骤2)得到的表达产物，超声破碎后通过亲和层析获得较高纯度的红螯螯虾caspase重组蛋白。
4.如权利要求3所述红螯螯虾caspase重组蛋白的制备方法，其特征在于所述红螯螯虾caspase重组蛋白在制备抗WSSV类新药和动物抗病饲料添加剂中应用。
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