CN110734486A - 一种半滑舌鳎凝集素家族collectin抗病基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从半滑舌鳎中筛选的抗病和抗菌相关基因，该基因的序列为SEQ ID NO:1，编码的蛋白为SEQ ID NO:2，本发明提供的基因与免疫抗病相关，其表达量与病原菌刺激相关，其体外重组表达的蛋白能够明显抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的增殖，本发明还提供了一种具有重要用途的基因及由含有半滑舌鳎凝集素家族collectin完整肽基因，及由改基因构建的真核表达载体pcDNA3.1‑collectin；还提供了一种可生产蛋白的细胞系；还提供了一种半滑舌鳎凝集素家族collectin的制备方法。因此，在半滑舌鳎病害防治、饲料添加剂及杀菌剂等方面有应用价值。

Description

一种半滑舌鳎凝集素家族collectin抗病基因

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎凝集素家族collectin抗病基因。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)富含高质蛋白，因其肉质鲜美等广受消费者喜爱。为满足市场需求，近几年不断扩大养殖规模和养殖密度，但随着养殖规模的扩大和过高密度养殖，多种病害问题的突发又极大的降低了半滑舌鳎产量和质量。目前，对于鱼类细菌性病的防治手段还停留在传统技术上多度依赖于抗生素和其他杀菌类药物，但抗生素和其他药物的滥用产生大量的药物残留、诱导细菌产生了耐药性，同时残余抗生素的半滑舌鳎产品还可能继续危害消费者，照成人的细菌抗药性。近年来，如何获得安全、绿色、有效的抗生素的药物替代品，尤为重要。鱼类本身作为脊椎动物，已经获得了免疫系统的完善，其本身就具有会直接杀菌和抗病的能力，因此，研究鱼类是本身具有的抗菌蛋白在水产养殖业、医药行业和食品添加剂等领域受到广泛的重视。由于鱼类是低等的脊椎动物，其免疫系统不完善，因此非特异性免疫在免疫反应中起着更为重要的作用。鱼类的免疫蛋白功能更加多样化，除了参加免疫反应行使信号传递外，其可能具有直接的杀菌或抗细菌生长的功能。鱼类抗菌蛋白的结构模式和组成种类多种多样，其可能具有潜在的广谱抗菌功能，能够杀死入侵机体的微生物。

鱼类自身的抗菌蛋白来源其本身，在鱼体内合成和扩散速度比其它免疫细胞或大分子物质(如抗体)更快且灵活，这是鱼类抗菌蛋白所具备的优点。当病原微生物入侵鱼体时，鱼类的非特异性免疫系统能很快的产生免疫防御机制，产生抗菌蛋白直接防御或杀伤病原物。非特异性免疫(抗菌蛋白)是机体的第一道防御机制，对于水产动物非常重要。某些抗菌蛋白还可以通过提高水产动物的免疫细胞的吞噬能力、酶活性以及抗氧化能力，从而增强水产动物的免疫性能。抗菌蛋白主要在相关免疫细胞中表达，然后迁移到机体感染部位对抗病原体的入侵，在正常的水生动物体内，免疫基因和蛋白不仅具有直接的抑菌、杀菌作用，还可以与动物的免疫系统协同作用，共同增强动物对细菌等微生物的抵抗能力。大量研究表明，一些抗菌蛋白可以作为多种免疫细胞的行使功能必备的趋化因子，可以调节生物体的某些生长因子和其作用受体的表达水平，从而激活机体有关信号通路，与生物非特异性免疫系统相结合，提高机体的免疫力，从而对机体起到保护作用。

为解决各类病害对半滑舌鳎市场和产品质量的威胁，探究新型抗菌和抗病蛋白，对半滑舌鳎的分子水平和抗菌机制的研究不断深入，如对免疫组织不同状态或时间点的转录组的研究与分析，以及对半滑舌鳎体内的先天免疫系统中如补体系统、模式识别受体等免疫相关基因在免疫反应中的应答模式和功能分析等研究技术的应用发现了大量与半滑舌鳎抗菌和抗病相关的基因和蛋白。这些基因和蛋白在免疫反应中具有重要的功能，因此在直接的抗菌中可能也有其重要的作用。

目前，抗菌蛋白主要分离自鱼体内，但由于缺少相应抗体和分离手段，导致抗菌蛋白的产量和应用受到大大的限制。为了解决抗菌蛋白不足的问题，本发明采用了基因工程和细胞功能技术的结合，将半滑舌鳎体内存在的基因转移至外源真核表达系统中，通过利用细胞功能和发酵工程相结合，大量产生了可直接利用的抗菌蛋白。同时，本发明中涉及的基因在传统研究中仅被认为是一种简单的信号识别分子，未发现其重要的抗菌功能。本发明发现的该蛋白具有的重要功能具有重要的创新性，而对此类半滑舌鳎免疫基因的功能及其在抗病和抗菌方面的直接作用进行研究，不仅可以丰富免疫系统研究的成果，也可以为半滑舌鳎抗病和抗菌提供理论和技术支持。

发明内容

本发明提供了一种与半滑舌鳎免疫和抗细菌生长相关的蛋白及其作为抗病饲料添加剂的应用方法；为直接提供一种新型的抗菌蛋白和为半滑舌鳎绿色无药物添加的饲料添加剂和抗菌剂的研发提供技术方法。

本发明首先提供一种从半滑舌鳎中筛选的一种新型的凝集素家族基因作为抗病免疫蛋白，所述的蛋白包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:2的蛋白，

2)在1)中的蛋白上取代、缺失或添加一个或氨基，且具有1) 中蛋白性质的蛋白；

编码上述蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明还提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体中插入了用于编码上述抗病免疫蛋白的核苷酸片段；

本发明提供了用于重组表达上述蛋白的重组表达细胞株；其中转化/转染有上述的重组表达载体；

本发明的蛋白用于制备防治半滑舌鳎细菌病的制品；

所述的制品，优选为饲料添加剂。

本发明首次克隆了半滑舌鳎collectin 11基因，获得了其cDNA 序列全长，并进行了collectin 11重组蛋白抑菌活性分析。

附图说明

图1：半滑舌鳎collectin cDNA全长序列和开放阅读框编码的氨基酸序列:

SEQ ID NO:1:半滑舌鳎collectin cDNA全长序列。

SEQ ID NO:2:半滑舌鳎collectin开放阅读框编码的氨基酸序列。

图2：collectin基因在半滑舌鳎健康成鱼各个组织中的表达水平：

qRT-PCR检测collectin基因在半滑舌鳎健康成鱼各个组织中的表达水平。其中组织的英文缩写：L:肝脏；Sp:脾脏；K:肾脏；I:肠； Gi:鳃；H:肾脏；Br：脑；St:胃；Bl:血液；Hk:头肾；h:小时。其中横坐标表示半滑舌鳎不同的组织，纵坐标表示collectin在不同组织中的表达量。

图3：半滑舌鳎collectin基因在蔓弧菌感染后免疫相关组织中的表达分析。横坐标表示感染后不同时间点，纵坐标表示collectin在组织中的表达量，共检测了6个组织，包括：肝脏，脾脏，肾脏，肠，鳃，皮肤。

图4：半滑舌鳎PcDNA3.1-collectin重组蛋白的诱导表达、分离纯化及鉴定：重组蛋白诱导表达，M：蛋白marker，1：培养基未纯化，2：纯化后重组蛋白；

图5：PcDNA3.1-collectin重组蛋白体外抑菌活性分析图：

(A)PcDNA3.1-collectin蛋白抑制大肠杆菌(E.coli)效果示意图，0为阴性对照组加入PBS；2为10mg/L的氨苄青霉素作为阳性对照；2为0.5mg/ml重组蛋白

(B)PcDNA3.1-collectin蛋白抑制鳗弧菌(V.anguillarum)效果示意图，0为阴性对照组加入PBS；2为10mg/L的氨苄青霉素作为阳性对照；2为0.5mg/ml重组蛋白

(C)PcDNA3.1-collectin蛋白抑制副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)效果示意图，0为阴性对照组加入PBS；2为10mg/L 的氨苄青霉素作为阳性对照；2为0.5mg/ml重组蛋白

(D)PcDNA3.1-collectin蛋白抑制大假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)效果示意图，0为阴性对照组加入PBS；2为10mg/L的氨苄青霉素作为阳性对照；2为0.5mg/ml重组蛋白

(E)PcDNA3.1-collectin蛋白抑制金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)效果示意图，0为阴性对照组加入PBS；2 为10mg/L的氨苄青霉素作为阳性对照；2为0.5mg/ml重组蛋白

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术路线和优点更加清晰明确，下面结合附图对本发明举例进行详细描述。

实施例1：半滑舌鳎胶原凝集素collectin 11基因全长cDNA的克隆及其序列分析

申请人首先通过对半滑舌鳎注射鳗弧菌后出现感染症状和未出现感染症状的转录组结合基因组进行关联(GWAS)分析，筛选出来具有极大差异表达的新型凝集素家族基因collectin 11，通过进行 mRNA水平基因扩增获得了collectin 11基因的部分mRNA序列，而后通过RACE-PCR技术获得了目的基因的全长，获得了半滑舌鳎胶原凝集素collectin 11基因的全长cDNA序列。

(1)所用RACE引物和扩增引物序列如下：

(2)实验方法：包含Trizol法提取RNA、cDNA的合成、PCR扩增、载体构建，转染细胞、细胞培养、蛋白分离纯化和抑菌实验等；全部方法均为本实验中已经成熟的技术流程，采用TRIzol法提取半滑舌鳎总RNA。实验开始前，将所需实验仪器均用DEPC水清洗，或用高温高压灭菌消毒处理，(1)用镊子快速取出100-150mg组织样品放于研钵中，加入液氮研磨至粉状，向研磨好的组织中加入1mL TRIzol 试剂，进一步研磨至匀浆状。(2)冰盒上静止5min，使组织充分裂解。(3)用移液枪加入200μl的氯仿，上下颠倒15s后于冰盒中静置2-3min。(4)低温离心机4℃，12000rpm离心15min，离心后的样品有分层现象，RNA溶解于上层液体中。(5)收集上清，加入约400ul 的异丙醇，反复震荡，在冰盒中静止15min后，这时离心管底部会产生白色沉淀，即RNA。(6)同步骤(4)(7)向离心管中加入1mL75％乙醇，轻轻混匀。(8)同步骤(4)(9)4℃，12000rpm空离2min，彻底去除残留乙醇，然后将离心管置于超净工作台里的滤纸上风干 2min。(10)于离心管中加入适量RNase free ddH2O，室温放置2min。 (11)短暂离心后将RNA放于-80℃冰箱中短暂保存。(12)利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用移液枪吸取各组织3μLRNA 与1μL核酸上样Buffer混合后点样，用凝胶成像系统观察电泳结果。 (13)利用超微量仪器BD-2000检测RNA的浓度。

cDNA合成：将提取的RNA按照TaKaRa反转录试剂盒说明书操作进行反转录，合成的cDNA-20℃保存。

PCR扩增：以比对分析得到的部分mRNA序列为基础，通过 RT-PCR一次性扩增出较长的中间片段，再以RACE PCR技术扩增出 5’末端和3’末端序列。

(3)collectin的全长cDNA的获取及同源性分析

序列的拼接和比对分析：将测序拼接获得的collectin 11基因序列SEQ ID NO:1(图1)利用NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)Protein Blast进行CsLEAP-2氨基酸同源性比对，使用在线软件SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)预测collectin11蛋白质结构域；采用SignalP3.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测 collectin 11结构域信号肽，采用ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)、DNAstar (http://www.dnastar.com/)、和DNAMAN(http://www.lynnon.com/) 等生物软件查找半滑舌鳎collectin 11基因开放阅读框及氨基酸序列SEQ ID NO:2(图1)。最终得到该基因的cDNA全长为1835bp(SEQ ID NO:1)，包括180bp的5’非编译区，819bp的开放阅读框和218bp 的3’非编译区。该基因的开放阅读框编码一个273个氨基酸的蛋白 (SEQ ID NO:1)(图1)。

实施例2：半滑舌鳎collectin11基因在正常鱼各个组织中的表达模式分析

根据测序获得半滑舌鳎collectin11基因序列，设计qRT-PCR引物为。实验步骤详情见(SYBR Green)荧光定量试剂盒说明书，在 ABI-7500Fast实时定量扩增仪上进行qRT-PCR反应。用3组重复平均值±标准误(SE)表示qRT-PCR检测结果，使用2-ΔΔCt法计算相对表达量，利用Origin9.0绘制表达柱状图(图2)。

实施例3：半滑舌鳎collectin11基因在感染蔓弧菌后免疫相关组织中的相对表达量分析

对半滑舌鳎进行鳗弧菌感染实验，采用实验室保存的蔓弧菌，注射剂量为2×10⁷cfu/g，在注射后0h，6h，12h，24h，48h，72h的六个时间点，分别取肝脏、脾脏、肾脏、肠、鳃和血液6个组织。用荧光定量PCR的方法检测collectin 11基因在上述6个组织中的表达量。所用引物、试剂和实验方法均同实例2中所述。

结果显示，在注射鳗弧菌后各组织的collectin 11表达水平均有不同程度的上调：其中在肠和肝脏中，在12h至72h，collectin 11基因的表达量一直升高，均以72h时最高；在鳃和脾脏中，12h collectin 11 基因的表达量处于最高状态；在血液和头肾中，collectin 11基因的表达量从6h到24h几乎一直处于上升状态。这些结果表明，蔓弧菌刺激后，除了肝脏外，正常情况下collectin 11基因表达量极低的免疫相关组织中collectin11基因的表达量也明显升高，表明半滑舌鳎 collectin 11基因对蔓弧菌感染有强烈的免疫防御作用(图3)。

实施例4、半滑舌鳎collectin 11体外重组表达及其产物抑菌活性分析

(1)半滑舌鳎collectin基因重组表达载体的构建方法：

采用高保真性的Pfu酶，通过PCR反应扩增collectin 11基因的完整蛋白翻译区。对PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物经过限制性内切酶线性化，而后通过T4DNA连接酶处理，插入采用同样线性化酶处理后的PcDNA3.1表达载体。测序正确后，采用无内毒素质粒提取方法提取阳性克隆菌株中的质粒PcDNA3.1-collectin。将重组载体通过脂质体方法转化至HE293T胚肾细胞中。经诱导，纯化后，获得了重组表达产物PcDNA3.1-collectin重组蛋白，结果见图4。实现上述目标的具体方案如下：

1.PcDNA3.1-collectin重组表达载体的构建方法：

根据克隆测序得到的collectin 11的cDNA全长，设计特异性表达引物，以半滑舌鳎多组织混合cDNA为模板，采用高保真PFU酶进行collectin 11基因完整编码蛋白的区域进行序列克隆，获得 collectin 11基因的编码区完整序列。PCR产物经过纯化后，插入pEASY-T1载体中，进行测序。将获得的阳性结果载体与PcDNA3.1 表达载体通过双酶切线性化，通过T4DNA连接酶连接，获得真核表达的PcDNA3.1-collectin重组载体，再次经过转化至感受态细胞BL21 (DE3)中，超净工作台150ul涂板，过夜培养。次日挑取单菌落培养3～5h，然后利用菌液PCR检测，反应体系为20μL，阳性克隆送测序。测序确认阳性结果，提取目的质粒。将PcDNA3.1-collectin质粒通过脂质体介导转化至HE293T人胚肾细胞中，采用G418药物鉴定，备用。

2.重组蛋白的诱导表达与表达产物的分析

将包含PcDNA3.1-collectin的293T细胞系接种至3ml含有终浓度为1％的双抗，10％FBS的L15液体培养基中，37℃，5％CO₂培养 48h后，扩大培养(条件同上)。取5ml细胞生长的液体培养基，将细胞进行破碎，对蛋白表达情况进行SDS-PAGE电泳检测，结果表明，蛋白在22KD-25KD之间有差异表达的条带出现(图4)。SDS-PAGE 电泳检测表达结果，结果表明蛋白大量存在于培养基中，重组蛋白主要以分泌的形式存在于细胞培养基中。

3.半滑舌鳎PcDNA3.1-collectin重组蛋白的纯化和验证

将培养基收集后，离心收集上清液，采用0.45μm微孔滤膜过滤后采用HisTrap FFcrude纯化柱纯化分析，具体操作如下：

首先，用20mL缓冲液A(50mmol/L Tris-HCl，2mol/L尿素， 0.5mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，1％Triton X-100；pH 8.0)洗涤离心后收集的包涵体，洗涤2～3次，每次洗涤后在4℃，12000rpm离心30min，去上清，收集沉淀。再用缓冲液B(50mmol/L Tris-HCl，2mol/L尿素，0.5mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl；pH 8.0)多次洗涤并离心，收集沉淀。在洗涤结束后的沉淀中加入预冷的溶解液 (100mmol/L Tris，8mmol/L尿素，10mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl； pH 7.4)低温条件下磁力搅拌溶解2h至溶液透明，离心30min，收集上清。将上清用0.22μm微孔过滤器过滤除菌后，使用HisTrap FF crude 1mL纯化柱进行纯化。收集纯化后的目的蛋白，采用12％浓度的SDS-PAGE电泳进行蛋白检测。采用BCA蛋白定量试剂盒对透析后的蛋白进行定量分析(图4)。

4.纯化的半滑舌鳎PcDNA3.1-collectin重组蛋白抑菌活性分析

采用牛津杯抑菌圈的方法进行蛋白抑菌活性的检测。选用革兰氏阴性菌：大肠杆菌(E.coli)，鳗弧菌(V.anguillarum)，副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus),假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等五种致病性病原菌进行抑菌效果检测，将上述病原菌培养至对数期，用PBS溶液稀释菌液至浓度为10⁷～10⁸个/ml备用。制作普通的培养基，厚度为1cm左右，放入5个灭菌后的牛津杯备用。将病原菌菌液与温度降到40度左右未凝固的固体培养基混合，倒入已经包含0.5ml深度的固体平板上，制作成为夹层培养基。在牛津杯中分别加入10mg/L的氨苄青霉素， 0.5mg/ml的蛋白。28℃或者37℃(细菌最适生长温度)培养箱培养 12h后观察并测量抑菌圈的大小。重组蛋白对爱德华氏菌大肠杆菌(E. coli)，鳗弧菌(V.anguillarum)，副溶血性弧菌(VibrioParahemolyticus), 假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表现出明显抑菌活性。出现明显的抑菌的透明圈，说明重组蛋白对细菌生长存在抑制作用(图5)，结果重组 collectin 11完整肽对阳性菌和阴性菌均有较强的抑菌作用，且有剂量依赖性。而对照组则并未观察到抑菌圈，说明抑菌活性主要归功于重组蛋白。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 青岛大学

中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种半滑舌鳎凝集素家族collectin的抗病基因

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1222

<212> DNA

<213> 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)

<400> 1

aaaatgttta tgaaagtgct atcacacaca ttctgcagcg ccggcagaga gtcgtgaaat 60

gtgtctgcgg gagcagcact gttcaaagct cctgcacgtc tttgcgagct gacaaaactt 120

tctccctttc gctctggaac gtttctctgc agtacagccc attatctgcc ccatgtagaa 180

gaatgagagg ccaaaagctg ttgctccctg tggtgctaat gtctgtgatg ctgagtttct 240

caacaataca gacgtctcat ggacacaact tggcagacga gccgtgcact gttcagatcc 300

tcgtccctgg actcaaagga gaaccaggag acaaaggaca aaaagaagca ccggggagac 360

caggacgagt tggacctccc ggacagatgg gtcaaacagg atttaaaggg gaaaaaggaa 420

tcatgggacg ttacggaaaa gtgggtccga gtggaatgaa aggtgttaaa ggtgaaatgg 480

gagacccagg tccacagggt ccagatggag agccaggtgt cccctgtgag tgcaccccca 540

tcaggaacat gattggagag atggacatca tggtggccca gctgtcgtct gaactgaagt 600

tcattaaaaa tgctgttgct ggcattaaag agacagagag taaagtctat ctgttggtga 660

aggaggagaa acgctacttt gatgctgagc tccactgtca gatgagggga gggcacctgg 720

ccatgcccaa ggacgaggga gccaacgccg ccatcgccgg ctacataacg gcggcgggtc 780

tgagccgcgt ctatataggc atccacgacc tggaccagga gggtgtgttc atctacgtgg 840

atcagtctcc gatgacgacc ttcagcagat ggagggaagg agagcccaac gatgcctacg 900

atgatgagga ctgtgccgag atgttgtcct ctggagagtg gacagatgtg gcctgtcatc 960

ccaccatgta ctttgtctgt gaatttgata aggacagcgt ctgagtccca agtgtcccca 1020

cttagtcgta gctgacacag tctgtgcata taaacacaaa atgatgaatg ttgagcaaag 1080

ccatatgttt ctgctgaatc ctgtagtttt agggcaggag tctcagactc taatgagctg 1140

agggtctctg ctgccactgt cagggtcacg acactgttaa ggcagttcaa aacaaacaaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1222

<210> 2

<211> 273

<212> PRT

<213> 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)

<400> 2

Met Arg Gly Gln Lys Leu Leu Leu Pro Val Val Leu Met Ser Val Met

1 5 10 15

Leu Ser Phe Ser Thr Ile Gln Thr Ser His Gly His Asn Leu Ala Asp

20 25 30

Glu Pro Cys Thr Val Gln Ile Leu Val Pro Gly Leu Lys Gly Glu Pro

35 40 45

Gly Asp Lys Gly Gln Lys Glu Ala Pro Gly Arg Pro Gly Arg Val Gly

50 55 60

Pro Pro Gly Gln Met Gly Gln Thr Gly Phe Lys Gly Glu Lys Gly Ile

65 70 75 80

Met Gly Arg Tyr Gly Lys Val Gly Pro Ser Gly Met Lys Gly Val Lys

85 90 95

Gly Glu Met Gly Asp Pro Gly Pro Gln Gly Pro Asp Gly Glu Pro Gly

100 105 110

Val Pro Cys Glu Cys Thr Pro Ile Arg Asn Met Ile Gly Glu Met Asp

115 120 125

Ile Met Val Ala Gln Leu Ser Ser Glu Leu Lys Phe Ile Lys Asn Ala

130 135 140

Val Ala Gly Ile Lys Glu Thr Glu Ser Lys Val Tyr Leu Leu Val Lys

145 150 155 160

Glu Glu Lys Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Leu His Cys Gln Met Arg Gly

165 170 175

Gly His Leu Ala Met Pro Lys Asp Glu Gly Ala Asn Ala Ala Ile Ala

180 185 190

Gly Tyr Ile Thr Ala Ala Gly Leu Ser Arg Val Tyr Ile Gly Ile His

195 200 205

Asp Leu Asp Gln Glu Gly Val Phe Ile Tyr Val Asp Gln Ser Pro Met

210 215 220

Thr Thr Phe Ser Arg Trp Arg Glu Gly Glu Pro Asn Asp Ala Tyr Asp

225 230 235 240

Asp Glu Asp Cys Ala Glu Met Leu Ser Ser Gly Glu Trp Thr Asp Val

245 250 255

Ala Cys His Pro Thr Met Tyr Phe Val Cys Glu Phe Asp Lys Asp Ser

260 265 270

Val

Claims (8)

1.一种凝集素家族的抗病免疫蛋白，其特征在于，所述的蛋白包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:2的蛋白，

2)在1)中的蛋白上取代、缺失或添加一个或氨基，且具有1)中蛋白性质的蛋白。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的蛋白。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体中插入了用于编码权利要求1所述的蛋白的核苷酸片段。

5.一种重组表达细胞株，其特征在于，所述的其中转化/转染有权利要求4所述的重组表达载体。

6.权利要求1所述的蛋白在制备用于防治半滑舌鳎细菌病的制品中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制品为饲料添加剂。

8.一种饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂包含有权利要求1所述的蛋白。

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