CN113308487B

CN113308487B - 多种草鱼重组细胞因子及其制备方法和在协同增强草鱼免疫功能中的应用

Info

Publication number: CN113308487B
Application number: CN202110592248.1A
Authority: CN
Inventors: 许国晶; 王志忠; 张金路; 马汝芳; 冷春梅; 杜兴华; 巩俊霞; 李壮; 田功太
Original assignee: Shandong Freshwater Fisheries Research Institute
Current assignee: Shandong Freshwater Fisheries Research Institute
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2041-05-28
Also published as: CN113308487A

Abstract

本发明提供多种草鱼重组细胞因子及其制备方法和在协同增强草鱼免疫功能中的应用，属于鱼类分子免疫学技术领域。所述制备方法包括：(1)将草鱼细胞因子目的基因连入载体质粒中构建细胞因子的重组表达载体；(2)将上述重组表达载体导入宿主菌，获得含细胞因子目的基因的重组菌株，诱导重组菌株表达，获得草鱼重组细胞因子；其中，所述草鱼细胞因子包括IFNγ、IL‑4和IL‑1β。本发明通过研究发现，制备得到的IFNγ、IL‑4及IL‑1β重组蛋白可分别刺激草鱼肝脏细胞L8824细胞，同时还能协同促进草鱼pIgR基因表达及培养液上清中pIgR蛋白表达，从而协同增强草鱼免疫应答功能，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

多种草鱼重组细胞因子及其制备方法和在协同增强草鱼免疫功能中的应用

技术领域

本发明属于鱼类分子免疫学技术领域，具体涉及多种草鱼重组细胞因子及其制备方法和在协同增强草鱼免疫功能中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

IFNγ是是Th1细胞主要分泌的细胞因子，并能指导原初CD4细胞向Th1型细胞分化。IFNγ最大的特点是能够提高巨噬细胞的活性，增强其杀菌能力，达到保护宿宿主的目的。除此之外，它还能促进Ig的转换，增强机体免疫功能，抗肿瘤等多方面的作用。IL-4主要是由Th2细胞分泌，在各个组织中均有分布。IL-4的功能主要体现在维持体内稳态、抑制炎症的恶化以及对寄生虫有较强的抑制作用。IL-1β是一种多效的促炎细胞因子，具有调节代谢作用、造血和免疫学活性，IL-1β作为免疫调控细胞因子具有增强免疫反应的潜力。从已有的研究看来，鱼类IFNγ、IL-4及IL-1β的生物学功能分别和哺乳动物的IFNγ、IL-4及IL-1β存在相似之处。例如重组金鱼IFNγ能增强巨噬细胞的吞噬作用和呼吸爆发作用，还能刺激一些炎症因子和趋化因子的表达；重组斑马鱼IL-4对B细胞增殖有显著的刺激作用，并对抗体产生起到上调作用；重组虹鳟IL-1β体经腹腔注射可有效抵御杀鲑气单胞菌感染；以上研究表明，鱼类的IFNγ、IL-4及IL-1β在免疫调节反应中起到重要的作用。

草鱼具有饲料成本低、价格稳定、经济效益明显等特点，是我国水产养殖的一种优良主养或配养鱼种。为追求经济效益最大化，国内养殖户多采取高密度精养方式，但这一养殖方式却为鱼类的疾病传播，特别是病毒性疾病的暴发提供了便利条件。草鱼对应激反应敏感，在养殖过程中病害频发，死亡率较高，疾病防治成本日益增大。这些因素每年使得草鱼养殖业遭受巨大的经济损失。因此克隆、重组表达和分离纯化草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β，研究利用重组草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β防治草鱼疾病的方式方法，这种免疫制剂具有的非特异的广谱性抗病活性，使用后不产生有害残留等优点，最符合当今业界所倡导的自然生态、绿色环保的行业标准，同时对其他养殖鲤科鱼类疾病的防治也具有重要的参考价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供多种草鱼重组细胞因子及其制备方法和在协同增强草鱼免疫功能中的应用。本发明通过研究发现，制备得到的IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白可分别刺激草鱼肝脏细胞L8824细胞，同时还能协同促进草鱼pIgR基因表达及培养液上清中pIgR蛋白表达，从而协同增强草鱼免疫功能，因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供一种草鱼重组细胞因子的制备方法，所述制备方法包括：

(1)将草鱼细胞因子目的基因连入载体质粒中构建细胞因子的重组表达载体；

(2)将上述重组表达载体导入宿主菌，获得含细胞因子目的基因的重组菌株，诱导重组菌株表达，获得草鱼重组细胞因子。

其中，所述草鱼细胞因子包括IFNγ、IL-4和IL-1β。

所述步骤(1)其具体方法包括：

采用基于PCR的精确合成法(PCR-based Accurate Synthesis，PAS)，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因IFNγ(Genbank：FJ695519.1)、IL-4(Genbank：KP896505.1)和IL-1β(Genbank：JN705663.2)，并分别连入载体质粒中。

其中，所述载体质粒可以为pET-28a，相对应的，设计三对引物，核苷酸序列如SEQID NO.1-SEQ ID NO.6所示。

所述步骤(2)中，所述宿主菌可为真核菌类或原核菌类，例如，包括但不限于，农杆菌、酵母菌、大肠杆菌等；进一步优选为大肠杆菌，如大肠杆菌Arctic Express。

诱导重组菌株表达可采用IPTG作为诱导剂进行，优选的，所述诱导诱导重组菌株表达方法包括：诱导表达温度为30-40℃(进一步优选为37℃)，诱导表达时间为3-5h(进一步优选为4h)，诱导剂为IPTG，所述IPTG的添加终浓度为0.1-1.0mM，进一步优选为0.5mM。

由于制备得到的重组蛋白以包涵体形式存在，因此所述制备方法还包括对获得的细胞因子重组蛋白进行变复性，所述变复性包含洗涤和溶解包涵体的步骤。

所述洗涤步骤中采用包涵体洗涤液，其具体成分包括：20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH 8.0；

所述溶解步骤中采用溶解缓冲液，其具体成分包括：20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH 8.0。

所述制备方法还包括纯化步骤，所述纯化方法包括采用Ni柱进行纯化。

本发明的第二方面，提供上述制备方法获得的草鱼重组细胞因子。

其中，所述草鱼重组细胞因子包括IFNγ、IL-4和IL-1β。

本发明的第三方面，提供上述草鱼重组细胞因子中的任意一个或多个在如下任意一种或多种中的应用：

1)促进鱼类pIgR基因和/或蛋白表达；

2)提高鱼类免疫能力；

3)制备鱼类免疫增强剂；

4)防治鱼类疾病。

其中，所述鱼类为淡水鱼，优选为鲤科鱼类，更进一步优选为草鱼。

更具体的，所述应用包括：IFNγ与IL-4或IFNγ与L-1β在协同促进L8824细胞pIgR基因和/或蛋白表达中的应用。

其中，IFNγ与IL-4的质量比为0.1～2:1，优选为1:1；

所述IFNγ与L-1β的质量比为0.1～2:1，优选为1:1。

本发明研究意外发现，本发明的IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白可协同促进pIgR的基因和蛋白表达，从而更加有效地增强草鱼免疫功能。

与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：

上述技术方案中的制备技术路线设计新颖，其通过构建重组质粒转入表达菌株，使用IPTG诱导表达草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β，优化表达条件，通过上清纯化方式纯化目标蛋白IFNγ、IL-4及IL-1β，Ni柱亲和纯化获得高纯度的草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β蛋白；所得的IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白再经转印免疫印迹法验证其特性。这样的制备技术路线严密合理且可行，充分发挥了现有免疫学检测筛选方法的作用和效果。

IFNγ、IL-4及IL-1β都是先天免疫系统的重要细胞因子，在鱼类抗感染免疫调控中发挥重要的作用。制备的IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白可分别刺激草鱼肝脏细胞L8824细胞，同时可协同促进草鱼pIgR基因表达及培养液上清中pIgR蛋白表达。pIgR是由黏膜上皮细胞合成，是重要的免疫因子，能够与分泌型的免疫球蛋白(Ig)多聚体结合，介导其跨过上皮细胞进行转运和分泌，进而保证分泌型免疫球蛋白在黏膜防御屏障中发挥局部清除病原体及毒素的作用，因此，pIgR的有效分泌是保证分泌型免疫球蛋白发挥黏膜防御功能的必要条件。

上述技术方案中，IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白可协同促进pIgR的基因和蛋白表达，增强草鱼免疫功能，使用后不产生有害残留等优点，最符合当今业界所倡导的自然生态、绿色环保的行业标准，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治也具有重要的参考价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中IFNγ、IL-4及IL-1β重组表达图；其中，A是IFNγ诱导表达结果；B是IL-4诱导表达结果；C是IL-1β诱导表达结果；其中A-B中M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；1表示IPTG未诱导重组质粒结果；2表示IPTG诱导重组质粒表达结果；3表示IPTG诱导重组质粒破碎后上清结果；4表示IPTG诱导重组质粒破碎后沉淀结果。

图2为本发明实施例中的Ni柱亲和纯化IFNγ、IL-4及IL-1β电泳图；其中，A是Ni柱亲和纯化IFNγ结果；B是Ni柱亲和纯化IL-4结果；C是Ni柱亲和纯化IL-1β结果；其中A-B中M是标准分子量蛋白；1-2表示超声波破碎处理后结果；3-5表示250mM咪唑洗脱结果。

图3为本发明实施例中的抗His单抗的转印免疫印迹检测IFNγ、IL-4及IL-1β结果图；其中，A是抗His单抗的转印免疫印迹检测IFNγ结果；B是抗His单抗的转印免疫印迹检测IL-4结果；C是抗His单抗的转印免疫印迹检测IL-1β结果；M是标准分子量蛋白；1表示重组蛋白与抗His单抗孵育结果。

图4为本发明实施例中的IFNγ、IL-4及IL-1β协同促进L8824细胞pIgR基因表达结果图。

图5为本发明实施例中的IFNγ、IL-4及IL-1β协同促进L8824细胞pIgR蛋白表达水平结果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，草鱼对应激反应敏感，在养殖过程中病害频发，死亡率较高，疾病防治成本日益增大。这些因素每年使得草鱼养殖业遭受巨大的经济损失。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种所述草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因IFNγ、IL-4及IL-1β，连入载体pET-28a的NdeI(CATATG)-XhoI(CTCGAG)位点之间；获得的重组质粒pET-28a-IFNγ、pET-28a-IL-4、pET-28a-IL-1β转入TOP10克隆菌株；使用IPTG诱导表达目的蛋白IFNγ、IL-4及IL-1β。优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，经分析目标蛋白主要呈包涵体形式表达。通过变复性的方式，重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。

所述的构建IFNγ、IL-4及IL-1β表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β基因，连入载体pET-28a的NdeI(CATATG)-XhoI(CTCGAG)位点之间，获得的重组质粒pET-28a-IFNγ、pET-28a-IL-4、pET-28a-IL-1β。

所述的免疫学检测筛选方法是转印免疫印迹法；其中所述的转印免疫印迹法是用抗His的单克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β蛋白反应，确定抗原决定簇分别是分子量为18.09KD的草鱼IFNγ重组蛋白、15.27KD的IL-4蛋白及31.61KD的IL-1β蛋白。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种所述草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白协同增强草鱼免疫应答中的应用，包括如下步骤：利用实时荧光定量PCR(qPCR)分析IFNγ、IL-4、IFNγ+IL-4、IFNγ+IL-1β重组蛋白处理草鱼肝脏细胞(L8824细胞)后多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的表达规律，阐明IFNγ+IL-4、IFNγ+IL-1β同时处理组对pIgR基因表达的调节作用；利用ELISA分析IFNγ、IL-4、IFNγ+IL-4、IFNγ+IL-1β重组蛋白处理草鱼肝脏细胞后培养液上清中pIgR蛋白量的动态变化，弄清IFNγ+IL-4、IFNγ+IL-1β同时处理组对pIgR蛋白表达的调节作用；

所述的qPCR分析是将使用IFNγ、IL-4、IFNγ+IL-4、IFNγ+IL-1β同时处理L8824细胞，分别提取细胞总RNA，反转录成cDNA，通过qPCR测定pIgR基因变化。

所述的ELISA法是将收集IFNγ、IL-4、IFNγ+IL-4、IFNγ+IL-1β处理的L8824细胞及培养液上清包被至96孔板，pIgR多克隆抗体孵育；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；分析IFNγ、IL-4、IFNγ+IL-4、IFNγ+IL-1β处理细胞后培养液上清中pIgR蛋白量的动态变化。

使用原核表达系统生产的哺乳动物重组IFNγ、IL-4、IL-1β已经达到商品化，并广泛用于研究和临床治疗工作。但是由于种属间的IFNγ、IL-4及IL-1β蛋白存在较大的差异，在鱼体中使用哺乳动物的重组IFNγ、IL-4及IL-1β蛋白具有一定的局限性，因此本发明制备草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β重组表达并用于后续协同增强草鱼免疫功能的研究。

本发明的制备技术路线设计新颖，其通过构建重组质粒转入表达菌株，使用IPTG诱导表达草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β，优化表达条件，通过上清纯化方式纯化目标蛋白IFNγ、IL-4及IL-1β，Ni柱亲和纯化获得高纯度的草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β蛋白；所得的IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白再经转印免疫印迹法验证其特性。这样的制备技术路线严密合理且可行，充分发挥了现有免疫学检测筛选方法的作用和效果。

因此，本发明的又一具体实施方式中，提供IFNγ与IL-4或IFNγ与L-1β在协同促进L8824细胞pIgR基因和/或蛋白表达中的应用。

其中，IFNγ与IL-4的质量比为0.1～2:1，优选为1:1；

所述IFNγ与L-1β的质量比为0.1～2:1，优选为1:1。

本发明的IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白可协同促进pIgR的基因和蛋白表达，从而更加有效地增强草鱼免疫应答功能。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白的制备方法。

1.草鱼IFNγ、IL-4及IL-1β表达引物的设计

根据草鱼IFNγ(Genbank：FJ695519.1)、IL-4(Genbank：KP896505.1)、IL-1β(Genbank：JN705663.2)开放阅读框cDNA序列和表达载体的多克隆位点序列，加入pET-28a的NdeI(CATATG)-XhoI(CTCGAG)位点之间，设计了特异引物。

IFNγF1：CATATGCGTCGTAGCAAAAGTGAAA(SEQ ID NO.1)

IFNγR1：CTCGAGTTACTGCACTTTTTTATGT(SEQ ID NO.2)

IL-4F1：CATATGAGTCAGCCGGATCTGCGCAAAACC(SEQ ID NO.3)

IL-4R1：CTCGAGTTATTTCACACGTTTCGGGCGGCT(SEQ ID NO.4)

IL-1βF1：CATATGGCCTGTGAACGTTATGAAAAAACC(SEQ ID NO.5)

IL-1βR1：CTCGAGTTATTTATTTTCCAGGGTGAAGTC(SEQ ID NO.6)

2.IFNγ、IL-4及IL-1β表达基因的扩增、纯化及双酶切

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA片段回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收。然后以内切酶对产物进行双酶切，37℃酶切6h，取出后直接利用PCR产物纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收。

3.双酶切体系如下

4.原核蛋白的表达鉴定

4.1IFNγ原核蛋白的表达鉴定

蛋白大小理论分子量为18.09KD(含标签)左右。氨基酸序列如下：

MNHKVHHHHHHMRRSKSEMTHLETNIHSLQEHYKTRGTEWVSKSVFVPHLNQLNSKASCTCQALLLERMLNIYEELFQDMKSEHKEGRKDLDHLMDEVKKLRGNYKEEHKVWKELQEMNSVKVKNGTIRGGALNDFLMVFDRASTEKHKKVQ(SEQ ID NO.7)

4.2IL-4原核蛋白的表达鉴定

蛋白大小理论分子量为15.27KD(含标签)左右。氨基酸序列如下：

MNHKVHHHHHHMSQPDLRKTLLKDIIVFVNQTLHNHSEKNLKQFVRDIFQSVRCSGEALCQAAKVLNGVHLNTDPNNMIYRNLFTYADLTVHRNCSVTASEEHPVKDFLKKIKDCCQLLYSKPVSRPKRVK(SEQ ID NO.8)

4.3IL-1β原核蛋白的表达鉴定

蛋白大小理论分子量为31.61KD(含标签)左右。氨基酸序列如下：

MNHKVHHHHHHMMACERYEKTLASDDACETDSAIYSDSADSDEMDCSDLPAMSCRCNMHEGIKLEMWRHSTSMKQVVNIIIALERMKNIKPKSSEL8824EEEVLNIIMENVIQARRVTAAEATPSYYKTSKTLQCSICDQFKKFLVKSSGSPRLLGVTLRDGNSDSKVRFNLSMYASPSATPNASQPVCLAISKSNLYLACTESDGSSPHLVLEEVTETLNTIKAGDQHANLLFFRKETGVANNTFESVKYPGWFISTAFKDMEQVEVCQVPSSRITDFTLENK(SEQ IDNO.9)

5.载体转化至大肠杆菌Arctic Express

(1)将质粒1μl加入100μl感受态细菌中，置冰上20min；

(2)42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μl LB培养液；

(3)37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。

6.IPTG诱导载体融合蛋白的表达

(1)挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml Amp的3ml LB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜；

(2)次日按1:100接种于50μg/ml Amp的30ml LB培养液中，37℃220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8；

(3)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；

(4)向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达；

(5)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。

7.包涵体蛋白的变复性

(1)将菌体沉淀重悬于20mL裂解液(20mM Tris-HCl containing 1mM PMSF andbacteria protease inhibitor cocktail，pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)。

(2)将超声破碎的细胞裂解液4℃10000r/min离心20min，收集沉淀。

(3)使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH 8.0)洗涤包涵体3次。

(4)用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH 8.0)，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000r/min离心15min。

(5)将上述溶液滴加20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH 8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH 8.0溶液中透析过夜。

8.Ni柱纯化

(1)利用低压层析系统，上清溶液以0.5mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱。

(2)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。

(3)用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，30mM咪唑，0.15M NaCl，pH 8.0)以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。

(4)用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH 8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。

(5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS进行透析过夜。

(6)进行12％SDS-PAGE分析。

8.结果分析

如图1A-C所示，IFNγ、IL-4及IL-1β分别构建到pET28a呈包涵体形式表达，目标蛋白主要存在于沉淀中，包涵体经过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过Ni柱亲和纯化目标蛋白，IFNγ、IL-4及IL-1β分子量为18.09KD、15.27KD及31.61KD(图2所示)。

二、免疫学检测筛选

1.转印免疫印迹法检测

(1)取样品上样5μL。

(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束。

(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h，恒流250mA。

(4)电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min。

(5)将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。

(6)用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。

(7)次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min。

(8)用含5％牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1h。

(9)反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。

(10)ECL显影，曝光。

2.结果分析

抗His标签蛋白单抗能分别与分子量为18.09KD的IFNγ、15.27KD IL-4及31.61KDIL-1β重组蛋白发生特异性结合。

实施例2：qPCR检测本发明IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白协同促进L8824细胞pIgR基因表达变化。

1.L8824细胞复苏

(1)开启紫外灯对细胞培养室和超净工作台进行灭菌处理，恒温水浴锅调至37℃。

(2)从-80℃冰箱中取出冻存的L8824细胞，立即置于水浴锅中，其间不断摇晃冻存管加速其解冻。

(3)于超净工作台将冻存管内的细胞悬液转移至一新的离心管中，离心5min。

(4)吸弃上清，加入新鲜培养基，用微量移液器反复吹打，使细胞分散均匀。

(5)将细胞悬液转入无菌的细胞培养瓶中，再加入适量新鲜培养基，于28℃精密恒温培养箱中培养，次日更换一次培养基后继续培养。

2.L8824细胞培养

使用含胎牛血清的培养基传代培养L8824细胞。

(1)细胞贴壁长满单层后，倾去培养基，用PBS清洗细胞2-3遍。

(2)加入1mL胰消化液作用5-10min。

(3)待消化完全后，吸弃消化液，加入3mL M199培养基将细胞从培养瓶内壁吹打下来，然后转入离心管中，用微量移液器小心反复吹打，使细胞充分散开成单个细胞。

(4)确定所需细胞密度，接种于无菌培养瓶中，再加入适量新鲜培养基，于28℃精密恒温培养箱中继续培养。

3.IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白协同促进L8824细胞pIgR基因的表达水平影响

待草鱼L8824稳定过夜后，每孔中分别使用IFNγ(100ng/mL)、IL-4(100ng/mL)、IL-1β(100ng/mL)、IFNγ+IL-4、IFNγ+IL-1β重组蛋白处理L8824细胞，同时用PBS组为空白对照组，刺激48h后，使用Trizol法提取细胞中总RNA，经RT-PCR合成cDNA第一链。放入-20℃保存，用于实时荧光定量PCR分析。

4.qPCR检测

以β-actin基因作为内参，C-ActinF、C-ActinR为内参引物，CF、CR为特异性引物(表1)，每个样品做3个平行。根据测得的Ct值，利用2^-ΔΔCt法计算免疫刺激后pIgR基因的相对表达量，采用SPSS 16.0统计软件中的单因素方差(one-way ANOVA)分析基因表达量的差异，显著性水平为0.05。

表1 qPCR实验所用引物

5.结果分析

分别使用IFNγ(100ng/mL)、IL-4(100ng/mL)、IL-1β(100ng/mL)、IFNγ+IL-4、IFNγ+IL-1β同时处理L8824细胞48h，通过qPCR测定pIgR基因变化，结果显示，与对照组相比，IFNγ、IL-4、IL-1β单独处理后，L8824细胞中pIgR基因相对表达量高于对照组，差异不显著(P<0.05)；IFNγ+IL-4、IFNγ+IL-1β同时处理组pIgR相对表达量显著高于IFNγ、IL-4单独处理组及对照组，为IFNγ单独处理组2.27倍、IL-4单独处理组的3.17倍(P<0.05)；IFNγ+IL-1β同时处理组pIgR相对表达量显著高于IFNγ、IL-1β单独处理组及对照组，为IFNγ单独处理组3.43倍、IL-1β单独处理组的4.0倍(P<0.05)，说明IFNγ+IL-4、IFNγ+IL-1β同时处理L8824细胞对pIgR基因表达水平的上调具有协同促进作用。

实施例3:ELISA检测本发明IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白协同促进L8824细胞pIgR蛋白表达变化。

1.L8824细胞处理

同实施例2。

2.IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白协同促进L8824细胞pIgR基因的表达水平影响

待草鱼L8824稳定过夜后，每孔中使用IFNγ(0，10，100，200ng/mL)，分别分别加入IL-4(100ng/mL)、IL-1β(100ng/mL)重组蛋白处理L8824细胞，刺激48h后，收集细胞培养液上清，用于ELISA检测分析。

3.ELISA检测

(1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。

(2)用PBS包被液将L8824细胞或细胞培养液上清稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100ul，4℃冰箱过夜。

包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)

(3)包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

(4)抗血清按1/500，3倍稀释，每孔100μl，37℃恒温箱1h。

(5)取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μl稀释好的酶标二抗，酶标二抗：山羊抗兔-HRP，1/5000。37℃恒温箱1h。

(6)取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μl TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。

(7)每孔加入100μl 1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

3.结果分析

使用IFNγ(0，10，100，200ng/mL)，同时分别加入IL-4(100ng/mL)、IL-1β(100ng/mL)处理细胞48h，通过ELISA检测分泌至培养液上清中pIgR蛋白量的动态变化。结果显示分泌至培养液上清中pIgR蛋白量随着IFNγ浓度的升高呈现上升趋势，100ng/mL IFNγ+IL-4处理组培养液上清中pIgR蛋白量水平显著高于IFNγ单独处理组2.86倍(P<0.05)，显著高于100ng/mL IL-4单独处理组3.19倍(数据图中未显示)(P<0.05)；200ng/mL IFNγ+IL-4处理组培养液上清中pIgR蛋白量水平成略微下降趋势，但仍显著高于200ng/mL IFNγ单独处理组及IL-4单独处理组(P<0.05)；100ng/mL IFNγ+IL-1β处理组培养液上清中pIgR蛋白量水平显著高于IFNγ单独处理组3.52倍(P<0.05)，显著高于IL-1β单独处理组3.77倍(数据图中未显示)(P<0.05)。

本发明制备的IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白刺激草鱼肝脏细胞L8824细胞，结果证实在草鱼肝脏细胞中，本发明制备的IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白可协同促进草鱼pIgR基因表达及培养液上清中pIgR蛋白表达，pIgR的有效分泌是保证分泌型免疫球蛋白发挥黏膜防御功能的必要条件。因此本发明IFNγ、IL-4及IL-1β重组蛋白可作为草鱼免疫增强剂，并且使用后不产生有害残留等优点，最符合当今业界所倡导的自然生态、绿色环保的行业标准，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治也具有重要的参考价值。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省淡水渔业研究院(山东省淡水渔业监测中心)

<120> 多种草鱼重组细胞因子及其制备方法和在协同增强草鱼免疫功能中的应用

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catatgcgtc gtagcaaaag tgaaa 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcgagttac tgcacttttt tatgt 25

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catatgagtc agccggatct gcgcaaaacc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcgagttat ttcacacgtt tcgggcggct 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catatggcct gtgaacgtta tgaaaaaacc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcgagttat ttattttcca gggtgaagtc 30

<210> 7

<211> 152

<212> PRT

<213> IFN γ原核蛋白

<400> 7

Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Arg Arg Ser Lys

1 5 10 15

Ser Glu Met Thr His Leu Glu Thr Asn Ile His Ser Leu Gln Glu His

20 25 30

Tyr Lys Thr Arg Gly Thr Glu Trp Val Ser Lys Ser Val Phe Val Pro

35 40 45

His Leu Asn Gln Leu Asn Ser Lys Ala Ser Cys Thr Cys Gln Ala Leu

50 55 60

Leu Leu Glu Arg Met Leu Asn Ile Tyr Glu Glu Leu Phe Gln Asp Met

65 70 75 80

Lys Ser Glu His Lys Glu Gly Arg Lys Asp Leu Asp His Leu Met Asp

85 90 95

Glu Val Lys Lys Leu Arg Gly Asn Tyr Lys Glu Glu His Lys Val Trp

100 105 110

Lys Glu Leu Gln Glu Met Asn Ser Val Lys Val Lys Asn Gly Thr Ile

115 120 125

Arg Gly Gly Ala Leu Asn Asp Phe Leu Met Val Phe Asp Arg Ala Ser

130 135 140

Thr Glu Lys His Lys Lys Val Gln

145 150

<210> 8

<211> 131

<212> PRT

<213> IL-4原核蛋白

<400> 8

Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Ser Gln Pro Asp

1 5 10 15

Leu Arg Lys Thr Leu Leu Lys Asp Ile Ile Val Phe Val Asn Gln Thr

20 25 30

Leu His Asn His Ser Glu Lys Asn Leu Lys Gln Phe Val Arg Asp Ile

35 40 45

Phe Gln Ser Val Arg Cys Ser Gly Glu Ala Leu Cys Gln Ala Ala Lys

50 55 60

Val Leu Asn Gly Val His Leu Asn Thr Asp Pro Asn Asn Met Ile Tyr

65 70 75 80

Arg Asn Leu Phe Thr Tyr Ala Asp Leu Thr Val His Arg Asn Cys Ser

85 90 95

Val Thr Ala Ser Glu Glu His Pro Val Lys Asp Phe Leu Lys Lys Ile

100 105 110

Lys Asp Cys Cys Gln Leu Leu Tyr Ser Lys Pro Val Ser Arg Pro Lys

115 120 125

Arg Val Lys

130

<210> 9

<211> 281

<212> PRT

<213> 原核蛋白

<400> 9

Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Met Ala Cys Glu

1 5 10 15

Arg Tyr Glu Lys Thr Leu Ala Ser Asp Asp Ala Cys Glu Thr Asp Ser

20 25 30

Ala Ile Tyr Ser Asp Ser Ala Asp Ser Asp Glu Met Asp Cys Ser Asp

35 40 45

Leu Pro Ala Met Ser Cys Arg Cys Asn Met His Glu Gly Ile Lys Leu

50 55 60

Glu Met Trp Arg His Ser Thr Ser Met Lys Gln Val Val Asn Ile Ile

65 70 75 80

Ile Ala Leu Glu Arg Met Lys Asn Ile Lys Pro Lys Ser Ser Glu Leu

85 90 95

Glu Glu Glu Val Leu Asn Ile Ile Met Glu Asn Val Ile Gln Ala Arg

100 105 110

Arg Val Thr Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ser Tyr Tyr Lys Thr Ser Lys

115 120 125

Thr Leu Gln Cys Ser Ile Cys Asp Gln Phe Lys Lys Phe Leu Val Lys

130 135 140

Ser Ser Gly Ser Pro Arg Leu Leu Gly Val Thr Leu Arg Asp Gly Asn

145 150 155 160

Ser Asp Ser Lys Val Arg Phe Asn Leu Ser Met Tyr Ala Ser Pro Ser

165 170 175

Ala Thr Pro Asn Ala Ser Gln Pro Val Cys Leu Ala Ile Ser Lys Ser

180 185 190

Asn Leu Tyr Leu Ala Cys Thr Glu Ser Asp Gly Ser Ser Pro His Leu

195 200 205

Val Leu Glu Glu Val Thr Glu Thr Leu Asn Thr Ile Lys Ala Gly Asp

210 215 220

Gln His Ala Asn Leu Leu Phe Phe Arg Lys Glu Thr Gly Val Ala Asn

225 230 235 240

Asn Thr Phe Glu Ser Val Lys Tyr Pro Gly Trp Phe Ile Ser Thr Ala

245 250 255

Phe Lys Asp Met Glu Gln Val Glu Val Cys Gln Val Pro Ser Ser Arg

260 265 270

Ile Thr Asp Phe Thr Leu Glu Asn Lys

275 280

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcaaggcagg atgataga 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cacgcaggag ttccagtt 18

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agagcaagag aggcatcctg ac 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgatgggtga tgacctgtcc 20

Claims

1.草鱼重组细胞因子IFN γ与IL-4或IFN γ与IL-1β在协同制备促进L8824细胞pIgR基因和/或蛋白表达的药物中的应用；

所述草鱼重组细胞因子IFN γ、IL-4和IL-1β制备方法包括：

（1）将草鱼细胞因子目的基因连入载体质粒中构建细胞因子的重组表达载体；

（2）将上述重组表达载体导入宿主菌，获得含细胞因子目的基因的重组菌株，诱导重组菌株表达，获得草鱼重组细胞因子；

所述步骤（1）具体方法包括：

采用基于PCR 的精确合成法，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因IFN γGenbank：FJ695519.1、IL-4Genbank：KP896505.1和IL-1βGenbank：JN705663.2，并分别连入载体质粒中；

所述载体质粒为pET-28a，扩展引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.6所示；

所述步骤（2）中，所述宿主菌为大肠杆菌Arctic Express；

诱导重组菌株表达采用IPTG作为诱导剂进行，诱导诱导重组菌株表达方法为：诱导表达温度为37℃，诱导表达时间为4h诱导剂为IPTG，所述IPTG的添加终浓度为0.5mM；

所述制备方法还包括对获得的细胞因子重组蛋白进行变复性，所述变复性包含洗涤和溶解包涵体的步骤；

所述制备方法还包括纯化步骤，所述纯化方法包括采用Ni柱进行纯化；

IFN γ与IL-4的质量比为0.1~2:1；

IFN γ与IL-1β的质量比为0.1~2:1。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，IFN γ与IL-4的质量比为为1:1。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，IFN γ与IL-1β的质量比为1:1。