CN113004424A - 猪白细胞介素17和22共表达替抗生物制剂的制备及应用 - Google Patents

猪白细胞介素17和22共表达替抗生物制剂的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪白细胞介素17和22共表达替抗生物制剂的制备及应用。本发明提供了一种融合蛋白，包括猪白细胞介素17和猪白细胞介素22。具体为序列1或序列3所示的蛋白质。编码蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。具有所述核酸分子的表达盒、重组载体、转染细胞或重组微生物均属于本发明的保护范围。本发明还保护所述转染细胞的培养产物或所述重组微生物的发酵产物。本发明还保护生物材料的应用：制备提高动物免疫能力的产品；提高动物免疫能力；制备疫苗；抗致病微生物感染；所述生物材料为所述蛋白质或所述核酸分子或所述表达盒或所述重组载体或所述转染细胞或所述重组微生物或所述培养产物或所述发酵产物。

Description

猪白细胞介素17和22共表达替抗生物制剂的制备及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及猪白细胞介素17和22共表达替抗生物制剂的制备及应用。
背景技术
我国人口占世界总人口约19％，猪肉消费量占全世界猪肉消费量的一半，我国生猪养殖规模占世界生猪总养殖量的56.6％，因此我国生猪养殖在全世界的地位十分重要。然而，近年来恶性动物传染性疾病的爆发和生产中的抗生素滥用严重制约了我国养殖业的发展，同时威胁着人类的食品安全和社会稳定。在我国的养殖业中，重要的动物传染性疾病多达30种，每年造成至少上千亿的直接经济损失。另外，我国畜禽养殖抗生素年使用量高达9.7万吨，占全国抗生素年消耗量近50％，导致了环境和食物链中严重的抗生素药物残留和细菌的耐药性。因此高效防治动物传染性疾病、降低抗生素药物残留和促进动物安全生长成为我国养殖业可持续发展的首要目标。
自2020年元旦起，我国饲料中全面禁止添加抗生素，减少滥用抗生素造成的危害，维护动物源食品安全和公共卫生安全。因此现代养殖业急需开发取代传统抗生素的无残留、无抗性诱导、安全无污染的新型生物饲料及其添加剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪白细胞介素17和22共表达替抗生物制剂的制备及应用。
本发明提供了一种蛋白质(融合蛋白)，包括猪白细胞介素17和猪白细胞介素22。
猪白细胞介素17具体如序列表的序列1中第16-145位氨基酸残基所示。
猪白细胞介素22具体如序列表的序列1中第182-370位氨基酸残基所示。
猪白细胞介素17具体如序列表的序列3中第24-153位氨基酸残基所示。
猪白细胞介素22具体如序列表的序列3中第199-387位氨基酸残基所示。
具体的，所述蛋白质为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)：
(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列3所示的蛋白质；
(a3)在(a1)或(a2)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a4)与(a1)或(a2)具有80％以上或85％以上或90％以上或95％以上或98％以上或99％以上同一性且具有提高动物免疫力功能的蛋白质；
(a5)将(a1)或(a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有提高动物免疫力功能的蛋白质。
编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子中，编码猪白细胞介素17的区段如序列表的序列2中第46-435位核苷酸所示。
所述核酸分子中，编码猪白细胞介素22的区段如序列表的序列2中第544-1110位核苷酸所示。
所述核酸分子中，编码猪白细胞介素17的区段如序列表的序列4中第76-465位核苷酸所示。
所述核酸分子中，编码猪白细胞介素22的区段如序列表的序列4中第601-1167位核苷酸所示。
具体的，所述核酸分子为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表的序列4所示的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b4)与(b1)或(b2)限定的DNA分子至少具有80％以上或85％以上或90％以上或95％以上或98％以上或99％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化、点突变和CRISPR基因编辑的方法，对所述核酸分子的核苷酸序列进行突变。
同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
具有所述核酸分子的表达盒、重组载体、转染细胞或重组微生物均属于本发明的保护范围。
所述表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述核酸分子的DNA，该DNA不但可包括启动所述核酸分子转录的启动子，还可包括终止所述核酸分子转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
所述重组载体具体可为：将pINA1297载体的多克隆位点(具体可为BamHⅠ和KpnⅠ识别序列)间的小片段替换为序列表的序列2所示的IL17/22_1基因，保持载体的其他序列不变，得到重组载体pINA1297-IL17/22。
所述重组载体具体可为：将pVAX1载体的多克隆位点(具体可为Asp718Ⅰ和NotⅠ识别序列)间的小片段替换为序列表的序列4所示的IL17/22_2基因，保持载体的其他序列不变，得到重组载体pVAX1-IL17/22。
所述转染细胞具体可为将所述重组载体转染哺乳动物得到的转染细胞。所述哺乳动物细胞具体可为HEK 293细胞。
所述重组微生物具体可为将所述重组载体或所述重组载体的线性化片段导入微生物得到的重组微生物。所述微生物可为为酵母、细菌、藻类或真菌。所述酵母具体可为解脂耶氏酵母Po1h。所述线性化片段具体可为：取重组载体pINA1297-IL17/22，用限制性内切酶NotⅠ进行酶切，回收约3279bp的线性化片段。
本发明还保护所述转染细胞的培养产物或所述重组微生物的发酵产物。
示例性的，转染细胞的培养产物可为转染细胞的表达上清液。
示例性的，转染细胞的表达上清液采用如下方法制备：在6孔板中培养HEK 293细胞至贴壁80％，然后借助Lipofectamine 3000脂质体转染重组载体pVAX1-IL17/22(每孔2.5mg重组载体pVAX1-IL17/22)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养6h，然后更换为293SFMⅡ培养基(2.5mL/孔)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，然后收集上清液。
示例性的，重组微生物的发酵产物可为重组微生物的发酵液上清。
示例性的，重组微生物的发酵液上清采用如下方法制备：(1)将重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22接种于2.5mL液体YPD培养基，28℃、200rpm空气浴震荡培养过夜；(2)取250μL步骤(1)得到的菌液，接种于装有25mL液体YPD培养基的250mL三角瓶中，28℃、200rpm空气浴震荡培养至OD600为20(约48h)；(3)取5mL步骤(2)得到的菌液，12000rpm离心5min，收集上清液。
示例性的，重组微生物的发酵产物采用如下方法制备：(1)将重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22接种于2.5mL液体YPD培养基，28℃、200rpm空气浴震荡培养过夜；(2)取250μL步骤(1)得到的菌液，接种于装有25mL液体YPD培养基的250mL三角瓶中，28℃、220rpm空气浴震荡培养至OD600为20(约24h)，得到整个发酵体系。
示例性的，重组微生物的发酵产物采用如下方法制备：(1)将重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22接种于2.5mL液体YPD培养基，28℃、200rpm空气浴震荡培养过夜；(2)取步骤(1)得到的菌液，接种于装有1L液体YPD培养基的2L摇瓶中，28℃、220rpm空气浴震荡培养至OD600为20(约24h)；(3)取步骤(2)得到的菌液，以10％的接种量接种至装有10L BSM发酵培养基的15L发酵罐中，28℃、400rpm搅拌培养至OD600为50(约48h)，得到整个发酵体系。
本发明还保护生物材料的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：
(c1)制备提高动物免疫能力的产品；
(c2)提高动物免疫能力；
(c3)制备疫苗；
(c4)抗致病微生物感染；
所述生物材料为所述蛋白质或所述核酸分子或所述表达盒或所述重组载体或所述转染细胞或所述重组微生物或所述培养产物或所述发酵产物。
所述提高动物免疫能力为下述(d1)至(d6)中的至少一种：
(d1)促进效应靶细胞的细胞免疫和/或体液免疫；
(d2)促进效应靶细胞免疫屏障的建立；
(d3)促进动物发育和生长；
(d4)促进动物免疫细胞的增加；
(d5)同时促进动物细胞免疫和体液免疫；
(d6)促进动物粘膜免疫屏障的建立。
本发明还提供了一种产品，包括所述生物材料。
本发明还提供了一种提高动物免疫能力的方法，包括如下步骤：对动物施用所述生物材料，提高所述动物的免疫能力。
所述致病微生物具体为鼠伤寒沙门氏菌。
所述免疫细胞具体为淋巴细胞。
所述动物为猪或小鼠。
实验证明，本发明的共表达IL17/22分子及含有IL17/22基因的重组酵母的发酵产品具有以下作用：促进效应靶细胞肠粘膜上皮IPEC-J2和肝L02细胞抗感染的免疫应答；施用重组酵母菌(Po1h-pINA1297-IL17/22)的小鼠体内淋巴细胞显著增高；促进非特异性免疫球蛋白IgG及sIgA的分泌，施用重组酵母菌的小鼠体内非特异性抗体和sIgA的含量可提高10％-70％，进而促进了动物的体液免疫和动物肠道粘膜免疫屏障的建立；促进Th1型和Th2型细胞因子的分泌，施用重组酵母菌的小鼠体内Th1型和Th2型细胞因子的含量可提高10％以上，促进了动物细胞免疫和体液免疫；施用重组酵母菌的小鼠攻毒存活率明显提高60％，生长增重率10％以上。施用重组酵母菌(Po1h-pINA1297-IL17/22)的猪体内Th1型和Th2型细胞因子及免疫记忆相关细胞因子的含量均明显增加10％以上，促进了动物细胞免疫和体液免疫；并且重组酵母菌(Po1h-pINA1297-IL17/22)饲喂后实验组猪平均体重增加9.3％以上。本发明的共表达IL17/22分子及含有IL17/22基因的转基因细胞具有以下作用：增强效应靶细胞的先天免疫应答、促进免疫防御和改善免疫调节能力。
细胞因子具有微量高效调节机体抗感染、粘膜免疫及组织保护与再生等特点，所以细胞因子是一种在动物生产过程中具有替代抗生素潜能的抗感染制剂。本发明通过基因重组、融合猪白细胞介素17和22基因，将其连接到真核表达平台获得融合蛋白，进一步研究融合蛋白的免疫调节效应和其诱导小鼠抗感染活性及其在猪体内提高免疫调节和生长发育的生物学效应研究。发现融合表达的IL-17和IL-22具有显著的增强动物消化道粘膜的免疫屏障机能，增强其全身免疫水平和抗细菌感染能力，促进动物生长发育的良好生物学效应。
附图说明
图1为实施例1的步骤四中转录水平鉴定的结果。
图2为实施例1的步骤四中蛋白水平检测的结果。
图3为实施例1的步骤五中转录水平鉴定的结果。
图4为实施例1的步骤五中蛋白水平检测的结果。
图5为实施例2的步骤三的3中Th1型细胞因子IL8和IL12基因表达水平的动态变化的结果。
图6为实施例2的步骤三的3中Th2型细胞因子IL-6、IL-1β和TGF-β基因表达水平的动态变化的结果。
图7为实施例2的步骤三的3中抗菌肽基因BD1和S100A8基因表达水平的动态变化的结果。
图8为实施例2的步骤三的3中STAT1、STAT3和JAK1基因表达水平的动态变化的结果。
图9为实施例2的步骤三的4中L02细胞中Th1型细胞因子IL8和IL12基因表达水平的动态变化的结果。
图10为实施例2的步骤三的4中L02细胞中Th2型细胞因子IL-6和TGF-β基因表达水平的动态变化的结果。
图11为实施例2的步骤三的4中L02细胞中抗菌肽基因BD1和S100A8基因表达水平的动态变化的结果。
图12为实施例2的步骤三的4中L02细胞中STAT1和JAK1基因表达水平的动态变化的结果。
图13为实施例2的步骤三的4中IPEC-J2细胞中Th1和Th2型细胞因子IL8和TGF-β基因表达水平的动态变化的结果。
图14为实施例2的步骤三的4中IPEC-J2细胞中抗菌肽基因BD和S100A8基因表达水平的动态变化的结果。
图15为实施例2的步骤三的4中IPEC-J2细胞中STAT1和JAK1基因表达水平的动态变化的结果。
图16为实施例3中各组中小鼠体重的动态变化的结果。
图17为实施例3中流式细胞测定的结果。
图18为实施例3中各组中小鼠外周血血清中非特异性抗体IgG的动态变化的结果。
图19为实施例3中Th1型细胞因子IL2在小鼠外周血血清中含量的动态变化的结果。
图20为实施例3中Th1型细胞因子IFN-γ在小鼠外周血血清中含量的动态变化的结果。
图21为实施例3中Th2型细胞因子IL4在小鼠外周血血清中含量的动态变化的结果。
图22为实施例3中Th2型细胞因子IL10在小鼠外周血血清中含量的动态变化的结果。
图23为实施例3中攻毒前后小鼠粪便和小肠组织中分泌性IgA含量变化的结果。
图24为实施例3中存活率的结果。
图25为实施例4中猪在不同处理下平均增重的变化的结果。
图26为实施例4中Th1型细胞因子IL2在猪外周血血浆中含量的动态变化的结果。
图27为实施例4中Th2型细胞因子IL4在猪外周血血浆中含量的动态变化的结果。
图28为实施例4中Th2型细胞因子IL6在猪外周血血浆中含量的动态变化的结果。
图29为实施例4中免疫记忆相关细胞因子IL7在猪外周血血浆中含量的动态变化的结果。
图30为实施例4中免疫记忆相关细胞因子IL15在猪外周血血浆中含量的动态变化的结果。
图31为实施例4中免疫记忆相关细胞因子IL23在猪外周血血浆中含量的动态变化的结果。
图32为目的细胞因子IL17在猪外周血血浆中含量的动态变化的结果。
图33为目的细胞因子IL22在猪外周血血浆中含量的动态变化的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。重组质粒均已进行测序验证。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pVAX1载体为Invitrogen，Life technologies公司产品，目录号为Catalog No.V260-20。HEK 293细胞：人胚肾细胞。IPEC-J2细胞：猪肠粘膜上皮细胞。L02细胞：人肝细胞。BALB/c小鼠：四川大学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(川)2018-026。华芯豚猪：四川省畜牧科学院养猪研究所产品。100×青链霉素混合液：HyClone公司。pINA1297载体(vector pINA1297)和解脂耶氏酵母Po1h(Po1h strain)均为法国农业科学院Madzak教授惠赠，均记载于如下文献：Madzak C,Gaillardin C,BeckerichJM.Heterologous protein expression and secretion in the non-conventionalyeast Yarrowia lipolytica:a review.J Biotechnol.2004Apr 8；109(1-2):63-81.doi:10.1016/j.jbiotec.2003.10.027.PMID:15063615。
实施例1、融合蛋白IL17/22及其编码基因的设计以及重组酵母和转染细胞的构建
一、融合蛋白IL17/22及其编码基因的设计
融合蛋白IL17/22_1如序列表的序列1所示。序列表的序列1中，第1-15位为分泌信号肽，第16-145位为猪白细胞介素17，第146-148位为连接肽(GSG)，第149-166位为T2A自剪接肽，第167-181位为分泌信号肽，第182-370位为猪白细胞介素22。
序列表的序列2所示的DNA分子编码融合蛋白IL17/22_1，将该DNA分子命名为IL17/22_1基因。序列表的序列2中，第1-45位核苷酸编码分泌信号肽，第46-435位核苷酸编码猪白细胞介素17，第436-444位核苷酸编码连接肽，第445-498位核苷酸编码T2A自剪接肽，第499-543位核苷酸编码分泌信号肽，第544-1110位核苷酸编码猪白细胞介素22。
融合蛋白IL17/22_2如序列表的序列3所示。序列表的序列3中，第1-23位为TPA信号肽(分泌型)，第24-153位为猪白细胞介素17，第154-156位为连接肽(GSG)，第157-175位为P2A自剪接肽，第176-198位为TPA信号肽，第199-387位为猪白细胞介素22。
序列表的序列4所示的DNA分子编码融合蛋白IL17/22_2，将该DNA分子命名为IL17/22_2基因。序列表的序列4中，第1-6位为Kozak序列，第7-75位核苷酸编码TPA信号肽，第76-465位核苷酸编码猪白细胞介素17，第466-474位核苷酸编码连接肽，第475-531位核苷酸编码P2A自剪接肽，第532-600位核苷酸编码TPA分泌信号肽，第601-1167位核苷酸编码猪白细胞介素22。
二、表达融合蛋白IL17/22的重组载体的构建
将pINA1297载体的BamHⅠ和KpnⅠ识别序列间的小片段替换为序列表的序列2所示的IL17/22_1基因，保持载体的其他序列不变，得到重组载体pINA1297-IL17/22。重组载体pINA1297-IL17/22表达序列表的序列1所示的融合蛋白IL17/22_1。
将pVAX1载体的Asp718Ⅰ和NotⅠ识别序列间的小片段替换为序列表的序列4所示的IL17/22_2基因，保持载体的其他序列不变，得到重组载体pVAX1-IL17/22。重组载体pVAX1-IL17/22表达序列表的序列3所示的融合蛋白IL17/22_2。
三、表达融合蛋白IL17/22的重组酵母和转染细胞的制备
1、重组酵母的制备
(1)取重组载体pINA1297-IL17/22，用限制性内切酶NotⅠ进行酶切，回收约3279bp的线性化片段。
(2)将步骤(1)得到的线性化片段导入解脂耶氏酵母Po1h，得到重组酵母，命名为Po1h-pINA1297-IL17/22。
(3)取pINA1297载体，用限制性内切酶NotⅠ进行酶切，回收约2211bp的线性化片段。
(4)将步骤(3)得到的线性化片段导入解脂耶氏酵母Po1h，得到重组酵母，命名为Po1h-pINA1297。
2、转染细胞的制备
在6孔板中培养HEK 293细胞至贴壁80％，然后借助Lipofectamine 3000脂质体转染重组载体pVAX1-IL17/22(每孔2.5mg重组载体pVAX1-IL17/22)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养6h，得到转染细胞，命名为HEK293-pVAX1-IL17/22。
在6孔板中培养HEK 293细胞至贴壁80％，然后借助Lipofectamine 3000脂质体转染pVAX1载体(每孔2.5mg pVAX1载体)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养6h，得到转染细胞，命名为HEK293-pVAX1。
四、重组酵母菌的鉴定
1、转录水平鉴定
将重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22(或重组酵母Po1h-pINA1297)接种至液体YPD培养基，28℃、200rpm空气浴震荡培养48h，然后12000rpm离心5min，收集菌体。提取菌体总RNA，反转录得到cDNA，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，检测目的基因的表达量。F1：5’-AGGATGCCCAAAAACTGAGGA-3’；R1：5’-CTTCAGGGCCATAAACAGCAA-3’。
结果见图1(M：5000bp DNA Marker；1：Po1h-pINA1297-IL17/22)。重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22特异性扩增出一条大小为1000bp左右的目的条带，表明IL-17/22基因能在重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22中成功转录。重组酵母Po1h-pINA1297未检测到相应特征条带。
2、蛋白水平检测
将重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22(或重组酵母Po1h-pINA1297)接种至液体YPD培养基，28℃、200rpm空气浴震荡培养48h，然后12000rpm离心5min，收集上清液。采用猪白细胞介素22酶联免疫分析试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号CSB-E15847p)检测上清液中目的蛋白的表达。
结果见图2。重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22的发酵上清中检测到目的蛋白的表达。重组酵母Po1h-pINA1297的发酵上清中没有检测到目的蛋白表达。
五、转染细胞表达鉴定
1、转录水平检测
转染细胞HEK293-pVAX1-IL17/22(或转染细胞HEK293-pVAX1)，更换为293SFMⅡ培养基(Thermo Fisher公司，货号：11686029)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，然后收集细胞。提取细胞总RNA，反转录得到cDNA，采用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增以检测IL17基因的表达量，采用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增以检测IL22基因的表达量。F2：5’-CAGACGGCCCTCAGATTACTCCA-3’；R2：5’-AGCCCACTGTCACCATCACTTTCT-3’。F3：5’-CTACATCACCAACCGCACCT-3’；R3：5’-TCAGAGTTGGGGAACAGCAC-3’。
结果见图3。转染细胞HEK293-pVAX1-IL17/22培养48h后，IL17基因和IL22基因均能成功表达。转染细胞HEK293-pVAX1培养48h后，无目的基因表达。
2、蛋白水平检测
转染细胞HEK293-pVAX1-IL17/22(或转染细胞HEK293-pVAX1)，更换为无血清培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，分别于培养0时刻、培养24h后、培养48h后或培养72h后收集上清。采用猪白细胞介素22酶联免疫分析试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号CSB-E15847p)检测上清液中目的蛋白的表达。
结果见图4。转染细胞HEK293-pVAX1-IL17/22的培养上清中检测到目的蛋白的表达，且培养48h时表达量最高。转染细胞HEK293-pVAX1的培养上清中没有检测到目的蛋白表达。
实施例2、重组酵母和转染细胞分泌表达的目的蛋白对靶细胞的效应
一、重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵液上清的制备
1、将重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22接种于2.5mL液体YPD培养基，28℃、200rpm空气浴震荡培养过夜。
2、取250μL步骤1得到的菌液，接种于装有25mL液体YPD培养基的250mL三角瓶中，28℃、200rpm空气浴震荡培养至OD600为20(约48h)。
3、取5mL步骤2得到的菌液，12000rpm离心5min，收集上清液，即为pINA1297-IL17/22上清。
用重组酵母Po1h-pINA1297代替重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22进行上述步骤，得到的上清液，即为pINA1297上清。
二、转染细胞HEK293-pVAX1-IL17/22表达上清液的制备
在6孔板中培养HEK 293细胞至贴壁80％，然后借助Lipofectamine 3000脂质体转染重组载体pVAX1-IL17/22(每孔2.5mg重组载体pVAX1-IL17/22)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养6h，然后更换为293SFMⅡ培养基(2.5mL/孔)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，然后收集上清液，即为pVAX1-IL17/22上清。
用pVAX1载体代替重组载体pVAX1-IL17/22进行上述步骤，得到的上清液，即为pVAX1上清。
三、融合蛋白对效应靶细胞生物活性的影响
1、人肝细胞(L02细胞)的培养
(1)取在液氮中冻存的L02细胞，于37℃水浴锅中温浴，不断地颠倒混匀，使管中的细胞在1min之内解冻。
(2)将细胞冻存管内的细胞吹打混匀后吸入50mL离心管内，缓慢地加入9mL经37℃预热的含1×青链霉素的RPMI1640培养基。
(3)取步骤(2)得到的细胞悬液，4℃、1000rpm离心5min，弃上清，将细胞重悬于10mL 37℃预热的含1×青链霉素的RPMI1640培养基，然后转移到细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)步骤(3)中细胞培养至贴壁80％时，吸弃培养液，缓慢加入5mL PBS缓冲液洗一次，移除PBS缓冲液后，加入2mL胰蛋白酶，静置观察消化至细胞大部分变圆，然后加入4mLRPMI1640培养基，用移液器将细胞重悬，得到细胞悬液。
(5)取6孔板，每孔加入200μL步骤(4)得到的细胞悬液和1.8mL RPMI1640培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。初始培养体系中，L02细胞的密度为1.5×105个/mL。
2、猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)的培养
(1)取在液氮中冻存的IPEC-J2细胞，于37℃水浴锅中温浴，不断地颠倒混匀，使管中的细胞在1min之内解冻。
(2)将细胞冻存管内的细胞吹打混匀后吸入50mL离心管内，缓慢地加入9mL经37℃预热的含1×青链霉素的DMEM/F12培养基。
(3)取步骤(2)得到的细胞悬液，4℃、1000rpm离心5min，弃上清，将细胞重悬于10mL 37℃预热的含1×青链霉素的DMEM/F12培养基，然后转移到细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)步骤(3)中细胞培养至贴壁80％时，吸弃培养液，缓慢加入5mL PBS缓冲液洗一次，移除PBS缓冲液后，加入1mL胰蛋白酶，静置观察消化至细胞大部分变圆，然后加入4mLDMEM/F12培养基，用移液器将细胞重悬，得到细胞悬液。
(5)取6孔板，每孔加入200μL步骤(4)得到的细胞悬液和1.8mL DMEM/F12培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。初始培养体系中，IPEC-J2细胞的密度为2×105个/mL。
3、重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵液上清体外生物学活性检测
待步骤1的(5)中的L02细胞培养至贴壁80％时，吸弃上清，每孔加入2.2mLRPMI1640培养基和300μL供试物，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，分别于24h、48h和72h后收集细胞，检测供试物对细胞的刺激效果。供试物为步骤一制备的pINA1297-IL17/22上清时，作为pINA1297-IL-17/22组。供试物为步骤一制备的pINA1297上清时，作为pINA1297组。供试物为YPD液体培养基时，作为空白对照组(Control组)。
采用荧光定量PCR检测细胞中各个目标基因的表达情况。用于检测人源细胞中各个目标基因的引物见表1。用于检测猪源细胞中各个目标基因的引物见表2。
表1
Figure BDA0002973869070000091
表2
Figure BDA0002973869070000092
图5为Th1型细胞因子IL8和IL12基因表达水平的动态变化，它们主要参与Th1型细胞的分化和细胞免疫。IL-12在连接先天免疫和后天获得性免疫功能中起到了重要作用；IL-8在肿瘤和炎症的发生和发展中具有重要作用。pINA1297-IL-17/22组在刺激24h、48h和72h时IL-8基因表达量显著高于pINA1297组和空白对照组(P<0.05)。pINA1297-IL-17/22组在刺激72h时IL-12基因表达水平均显著高于pINA1297组和对照组(P<0.05)。结果表明，重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵液上清能够促进细胞免疫。
图6为Th2型细胞因子IL-6、IL-1β和TGF-β基因表达水平的动态变化。IL-6和IL-1β参与免疫细胞的调节和肿瘤的发生发展；TGF-β参与组织和器官的生长发育，调控细胞周期。pINA1297-IL-17/22组在刺激48h和72h时IL-6和TGF-β基因表达量都显著高于pINA1297组和空白对照组(P<0.05)。在整个刺激过程中，pINA1297-IL-17/22组的IL-1β基因表达量都要显著高于pINA1297组和空白对照组(P<0.05)。结果表明，重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵液上清能够促进体液免疫。
图7为抗菌肽基因BD1和S100A8基因表达水平的动态变化。抗菌肽具有广谱的抗感染和抗菌活性，具有替代抗生素的潜能。β防御素(BD)是其中较为重要的一种，由于富含正电荷，所以容易被肠道吸收，几乎不会造成耐药性；钙结合蛋白S100A8密切参与炎症反应和先天免疫。pINA1297-IL-17/22组在刺激24h和72h时BD1基因表达量都显著高于pINA1297组和空白对照组(P<0.05)。pINA1297-IL-17/22组在刺激72h时S100A8基因表达量显著高于pINA1297组和空白组(P<0.05)。结果表明，重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵液上清能够促进靶细胞的先天免疫和免疫防御的建立。
图8为STAT1、STAT3和JAK1基因表达水平的动态变化。JAK-STAT信号通路属于Ⅱ型细胞因子受体家族，参与细胞增殖、分化和免疫调节等多种生物学过程。在刺激72h时，pINA1297-IL-17/22组中STAT1基因表达量显著高于pINA1297组和空白对照组(P<0.05)。pINA1297-IL-17/22组中STAT3基因表达水平在刺激24h、48h和72h都显著高于pINA1297组和空白对照组(P<0.05),并且在刺激72h时STAT3基因表达水平达到最高值。pINA1297-IL-17/22组在刺激24h时JAK1基因表达量显著高于pINA1297组和空白对照组(P<0.05)。
4、转染细胞HEK293-pVAX1-IL17/22表达上清液体外生物学活性检测
待步骤1的(5)中的L02细胞培养至贴壁80％时，吸弃上清，每孔加入2.2mLRPMI1640培养基和300μL供试物，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，分别于24h、48h和72h后收集细胞，检测供试物对细胞的刺激效果。供试物为步骤二制备的pVAX1-IL17/22上清时，作为pVAX1-IL-17/22组。供试物为步骤二制备的pVAX1上清时，作为pVAX1组。供试物为293SFMⅡ培养基时，作为空白对照组(Control组)。供试物为pVAX1-IL-17时(制备方法参照步骤二)，作为pVAX1-IL-17组。供试物为pVAX1-IL-22时(制备方法参照步骤二)，作为pVAX1-IL-22组。
待步骤2的(5)中的IPEC-J2细胞培养至贴壁80％时，吸弃上清，每孔加入2.2mLDMEM/F12培养基和300μL供试物，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，分别于24h、48h和72h后收集细胞，检测供试物对细胞的刺激效果。供试物为步骤二制备的pVAX1-IL17/22上清时，作为pVAX1-IL-17/22组。供试物为步骤二制备的pVAX1上清时，作为pVAX1组。供试物为293SFMⅡ培养基时，作为空白对照组(Control组)。
图9为L02细胞中Th1型细胞因子IL8和IL12基因表达水平的动态变化，它们主要参与Th1型细胞的分化和细胞免疫。IL-12在连接先天免疫和后天获得性免疫功能中起到了重要作用；IL-8在肿瘤和炎症的发生和发展中具有重要作用。pVAX1-IL-17/22组在刺激24h和48h时IL-8基因表达水平均显著高于pVAX1-IL-17组、pVAX1-IL-22组、pVAX1组和空白对照组(P<0.05)，并且在刺激48h时IL-8基因表达水平达到峰值。pVAX1-IL-17/22组在刺激24h、48h和72h时IL-12基因表达水平均显著高于pVAX1-IL-17组、pVAX1-IL-22组、pVAX1组和空白对照组(P<0.05)。结果表明，转染细胞HEK293-pVAX1-IL17/22表达上清液能够促进细胞免疫。
图10为L02细胞中Th2型细胞因子IL-6和TGF-β基因表达水平的动态变化。IL-6参与免疫细胞的调节和肿瘤的发生发展；TGF-β参与组织和器官的生长发育，调控细胞周期。pVAX1-IL-17/22组在刺激24h、48h和72h时IL-6和TGF-β基因表达水平均显著高于pVAX1-IL-17组、pVAX1-IL-22组、pVAX1组和空白对照组(P<0.05)。结果表明，转染细胞HEK293-pVAX1-IL17/22表达上清液能够促进体液免疫。
图11为L02细胞中抗菌肽基因BD1和S100A8基因表达水平的动态变化。抗菌肽具有广谱的抗感染和抗菌活性，具有替代抗生素的潜能。β防御素(BD)是其中较为重要的一种，由于富含正电荷，所以容易被肠道吸收，几乎不会造成耐药性；钙结合蛋白S100A8密切参与炎症反应和先天免疫。pVAX1-IL-17/22组在刺激24h、48h和72h时BD1和S100A8基因表达水平均显著高于pVAX1-IL-17组、pVAX1-IL-22组、pVAX1组和空白对照组(P<0.05)。结果表明，转染细胞HEK293-pVAX1-IL17/22表达上清液能够促进靶细胞的先天免疫和免疫防御的建立。
图12为L02细胞中STAT1和JAK1基因表达水平的动态变化。JAK-STAT信号通路属于Ⅱ型细胞因子受体家族，参与细胞增殖、分化和免疫调节等多种生物学过程。pVAX1-IL-17/22组在刺激24h时JAK1和JAK1基因表达水平均显著高于pVAX1-IL-17组、pVAX1-IL-22组、pVAX1组和空白对照组(P<0.05)。
图13为IPEC-J2细胞中Th1和Th2型细胞因子IL8和TGF-β基因表达水平的动态变化，IL8主要参与Th1型细胞的分化和细胞免疫；且在肿瘤和炎症的发生和发展中具有重要作用。TGF-β参与组织和器官的生长发育，调控细胞周期。在刺激72h时，pVAX1-IL-17/22组中IL-8基因表达水平显著高于pVAX1组和空白对照组(P>0.05)，并且在72h时pVAX1-IL-17/22组中IL-8基因表达水平达到峰值。pVAX1-IL-17/22组在刺激24h和72h时TGF-β基因表达水平均显著高于pVAX1组和空白对照组(P<0.05)。结果表明，转染细胞HEK293-pVAX1-IL17/22表达上清液能够同时促进细胞免疫和体液免疫。
图14为IPEC-J2细胞中抗菌肽基因BD和S100A8基因表达水平的动态变化。抗菌肽具有广谱的抗感染和抗菌活性，具有替代抗生素的潜能。β防御素(BD)是其中较为重要的一种，由于富含正电荷，所以容易被肠道吸收，几乎不会造成耐药性；钙结合蛋白S100A8密切参与炎症反应和先天免疫。pVAX1-IL-17/22组在刺激72h时BD1基因表达水平均显著高于pVAX1组和空白对照组(P<0.05)。pVAX1-IL-17/22组在刺激48h和72h时BD2基因表达水平均显著高于pVAX1组和空白对照组(P<0.05),并在72h时达到峰值。pVAX1-IL-17/22组在刺激48h和72h时S100A8基因表达水平均显著高于pVAX1组和空白对照组(P<0.05)。结果表明，转染细胞HEK293-pVAX1-IL17/22表达上清液能够促进靶细胞的先天免疫和免疫防御的建立。
图15为IPEC-J2细胞中STAT1和JAK1基因表达水平的动态变化。JAK-STAT信号通路属于Ⅱ型细胞因子受体家族，参与细胞增殖、分化和免疫调节等多种生物学过程。pVAX1-IL-17/22组在刺激72h时STAT1和JAK1基因表达水平均显著高于pVAX1组和空白对照组(P<0.05),并在72h时达到峰值。
实施例3、融合蛋白IL17/22在小鼠体内的生物学活性研究
一、重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物的制备
1、将重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22接种于2.5mL液体YPD培养基，28℃、200rpm空气浴震荡培养过夜。
2、取250μL步骤1得到的菌液，接种于装有25mL液体YPD培养基的250mL三角瓶中，28℃、220rpm空气浴震荡培养至OD600为20(约24h)，得到的整个发酵体系命名为Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物。每次灌胃均为新鲜制备的。
用重组酵母Po1h-pINA1297代替重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22进行上述步骤，得到的整个发酵体系命名为Po1h-pINA1297发酵产物。每次灌胃均为新鲜制备的。
二、分组处理试验动物
36只4周龄健康雌性BALB/c小鼠，体重约19g，随机分成3组(每组12只)。
实验组(Po1h-pINA1297-IL17/22组)：从试验第1天开始，将Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物经灌胃饲喂小鼠，每3天灌胃一次(共灌胃12次)，灌胃量为4×108CFU/只/次(以发酵产物中的重组酵母含菌量计)；
空载组(Po1h-pINA1297组)：用Po1h-pINA1297发酵产物代替Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物。
空白对照组(PBS组)：用PBS缓冲液代替Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物。
三、攻毒
分组处理第36天开始进行攻毒。攻毒过程：取鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)菌体，用新鲜的液体LB培养基重悬，得到1.5×109CFU/mL的菌悬液，即为攻毒液；攻毒即灌胃给予攻毒液，每间隔一天灌胃一次，共灌胃3次，每次每只灌胃300μL，每次灌胃前小鼠禁食不禁水2h。灌胃当天即为攻毒后第0天。每24h观察一次小鼠的发病情况，并统计小鼠存活率，解剖观察死亡的小鼠内部器官的变化。
四、各个指标的检测
1、定期检测小鼠体重。
图16为各组中小鼠体重的动态变化。小鼠经35天灌胃后，Po1h-pINA1297-IL17/22组小鼠体重增重要显著高于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组小鼠体重增重(P<0.05)。结果表明，重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物能有效地促进了小鼠体重的增长。
2、血液免疫指标
分别在第一次灌胃前、第一次灌胃后第7天、第一次灌胃后第14天，第一次灌胃后第21天，第一次灌胃后第28天和第一次灌胃后第35天，采取每只小鼠尾静脉血。
(1)灌胃后第35天取样的全血进行流式细胞测定。参照流式细胞操作步骤处理样品，避光低温上机检测Th(CD4+淋巴细胞)和Tc(CD8+淋巴细胞)细胞数量。
流式细胞测定结果如图17所示，显示随机选取小鼠外周血每10000个细胞里CD4+和CD8+淋巴细胞的变化。经灌胃35天后Po1h-pINA1297-IL17/22组小鼠外周血中CD4+和CD8+淋巴细胞含量均显著高于空载组和空白对照组(P<0.05)。说明重组酵母Po1h-pINA1297-IL-17/22发酵产物具有刺激实验小鼠免疫应答的功能。
(2)各时间点取样的全血分离血清，检测抗体和相关细胞因子。将分离收集的血清按照ELISA试剂盒的操作步骤检测小鼠非特异性抗体IgG，细胞因子IL2、IFN-γ、IL4和IL10。采用的试剂盒分别为小鼠免疫球蛋白(IgG)ELISA试剂盒(上海优选生物技术有限公司，货号YX-090707M)、分泌性IgA(sIgA)ELISA试剂盒(上海优选生物技术有限公司，货号YX-090720M)、小鼠白细胞因子IL2 ELISA试剂盒(上海优选生物技术有限公司，货号YX-091202M)、小鼠白细胞因子IFN-γELISA试剂盒(上海优选生物技术有限公司，货号YX-091230M)、小鼠白细胞因子IL4 ELISA试剂盒(上海优选生物技术有限公司，货号YX-091204M)和小鼠白细胞因子IL10 ELISA试剂盒(上海优选生物技术有限公司，货号YX-091210M)。
图18为各组中小鼠外周血血清中非特异性抗体IgG的动态变化。在灌胃后第21天和第28天Po1h-pINA1297-IL17/22组小鼠外周血血清中非特异性抗体IgG的含量均要显著高于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组(PBS)小鼠IgG的含量(P<0.05)。结果表明，重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物可以刺激小鼠产生更多的非特异性抗体IgG，有效地增强小鼠的体液免疫能力。
图19和图20为Th1型细胞因子IL2和IFN-γ在小鼠外周血血清中含量的动态变化，Th1型细胞因子主要介导细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，辅助抗体产生，参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的发生。在灌胃后第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，Po1h-pINA1297-IL17/22组小鼠外周血血清中IL2和IFN-γ的含量均要显著高于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组(PBS)中IgG的含量(P<0.05)。结果表明，重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物可以增强小鼠的细胞免疫。
图21和图22为Th2型细胞因子IL4和IL10在小鼠外周血血清中含量的动态变化，Th2型细胞因子主要功能为刺激B细胞增殖并产生免疫球蛋白G，参与体液免疫。在灌胃后第7天和第21天，Po1h-pINA1297-IL17/22组小鼠外周血血清中IL4的含量均要显著高于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组(PBS)中IL4的含量(P<0.05)。在灌胃后第7天、第14天、第21天和第35天，Po1h-pINA1297-IL17/22组小鼠外周血血清中IL10的含量均要显著高于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组(PBS)中IL10的含量(P<0.05)。结果表明，重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物可以增强小鼠的体液免疫。
3、粪便/肠道免疫指标
分泌性IgA(sIgA)是肠道免疫屏障的重要组成部分，sIgA通过抑制细菌和病毒粘附在肠上皮表面，阻止细菌穿过肠道屏障。小鼠粪便sIgA的采集：取攻毒前后(灌胃第35天和攻毒后第三天)小鼠的新鲜粪便，用含0.05M EDTA的0.01M PBS缓冲液悬浮(每g粪便配比4mL缓冲液)，冰上震荡15min，4℃、10000g离心5min，收集上清液，-80℃冻存备用。小鼠肠道sIgA的采集：取攻毒前后(灌胃第35天和攻毒后第三天)，取小鼠小肠3cm，剪碎后加400μL含0.05M EDTA的0.01M PBS缓冲液悬浮，冰上震荡10min，4℃、10000g离心5min，收集上清液，-80℃冻存备用。采用分泌性IgA(sIgA)ELISA试剂盒(上海优选生物技术有限公司，货号YX-090720M)检测小鼠分泌性IgA。
图23为攻毒前后小鼠粪便和小肠组织中分泌性IgA含量变化。重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物灌胃35天和灌胃攻毒鼠伤寒沙门氏菌3天，Po1h-pINA1297-IL17/22组小鼠粪便和小肠组织中分泌性IgA含量均要显著高于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组(PBS)中分泌性IgA的含量(P<0.05)。结果表明，重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物可以增强小鼠的粘膜免疫屏障。
4、存活率
结果见图24。攻毒后第6天，Po1h-pINA1297-IL-17/22组小鼠存活率显著高于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组(PBS)小鼠(P<0.05)。结果表明，重组酵母Po1h-pINA1297-IL-17/22发酵产物能够有效的保护小鼠，使其对鼠伤寒沙门氏菌的抵抗力显著增强。
实施例4、猪白细胞介素17和22融合蛋白在猪体内的生物学活性研究
一、重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物的制备
1、将重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22接种于2.5mL液体YPD培养基，28℃、200rpm空气浴震荡培养过夜。
2、取步骤1得到的菌液，接种于装有1L液体YPD培养基的2L摇瓶中，28℃、220rpm空气浴震荡培养至OD600为20(约24h)。
3、取步骤2得到的菌液，以10％的接种量接种至装有10L BSM发酵培养基的15L发酵罐中，28℃、400rpm搅拌培养至OD600为50(约48h)，得到的整个发酵体系命名为Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物。每次灌胃均为新鲜制备的。
BSM发酵培养基：85％磷酸(26.7ml)，硫酸钙0.93g，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g，氢氧化钾4.13g，甘油40.0g，蒸馏水补加至1L，然后加入40mL PTM1。PTM1：无水硫酸铜6.0g，碘化钠0.08g，一水硫酸锰3.0g，二水钼酸钠0.2g，硼酸0.02g，氯化钴0.5g，氯化锌20.0g，七水硫酸亚铁65.0g，生物素0.2g，浓硫酸5.0ml，蒸馏水补加至1L，0.22μm微孔过滤除菌。
用重组酵母Po1h-pINA1297代替重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22进行上述步骤，得到的整个发酵体系命名为Po1h-pINA1297发酵产物。每次灌胃均为新鲜制备的。
二、分组处理试验动物
45头健康华芯豚猪，出生一周时体重约为2.0kg左右，随机分成3组(每组15头)。
实验组(Po1h-IL-17/22组)：出生一周后开始在饲料中拌喂Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物，每2天拌喂一次，直至出生64天后停止拌喂；出生第8-21天，拌喂量为50mL/头/次(OD600约为50)，出生第22-64天，拌喂量为100mL/头/次(OD600约为50)；拌喂至64天停止，随后继续常规饲养管理。拌喂量为50mL/头/次(OD600约为50)的含义为将OD600为50的发酵产物饲喂试验动物，每只试验动物每次饲喂50ml发酵产物。其它拌喂量以此类推。
空载组(Po1h组)：用Po1h-pINA1297发酵产物代替Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物。
空白对照组(PBS组)：用PBS缓冲液代替Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物。
三、各个指标的检测
1、在出生后第56天和第91天称取各实验组猪的增重。
图25为猪在不同处理下平均增重的变化。在处理后56天和91天，Po1h-IL-17/22组猪体重净增重均显著高于空载组(Po1h)和空白对照组(PBS)中猪体重净增重(P<0.05)其净增重幅度均大20％。这些结果表明：重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物能有效地促进了猪生长发育和体重的增长。
2、分别在出生后第14天、第28天，第42天和第56天采集每头猪颈静脉血，进行如下实验内容：2.5mL抗凝血分离血浆检测相关细胞因子含量变化。
检测IL2的试剂盒：货号YX-091202P。检测IL4的试剂盒：货号YX-091204P。检测IL6的试剂盒：货号YX-091206P。检测IL7的试剂盒：货号YX-091207P。检测IL15的试剂盒：货号YX-091215P。检测IL23的试剂盒：货号YX-091223P。检测IL17的试剂盒：货号YX-091217P。检测IL22的试剂盒：货号YX-091222P。本段中的试剂盒均为ELISA试剂盒，均为上海优选生物技术有限公司产品。
图中的横坐标，2周指的是拌喂2周，4周指的是拌喂4周，8周指的是拌喂8周。
图26为Th1型细胞因子IL2在猪外周血血浆中含量的动态变化，Th1型细胞因子主要介导细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，辅助抗体产生，参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的发生。在拌喂后第14天和第42天，Po1h-IL-17/22组猪外周血血浆中IL2的含量均要显著高于空载组(Po1h)和空白对照组(PBS)中IL2的含量(P<0.05)。结果证明：重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物可以增强猪的细胞免疫。
图27和图28为Th2型细胞因子IL4和IL6在猪外周血血浆中含量的动态变化，Th2型细胞因子主要功能为刺激B细胞增殖并产生免疫球蛋白G，参与体液免疫。在拌喂后第28天、第42天和第56天，Po1h-IL-17/22组猪外周血血浆中IL4和IL6的含量均要显著高于空载组(Po1h)和空白对照组(PBS)中IL4和IL6的含量(P<0.05)。结果说明：重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物可以增强猪的体液免疫。
图29、图30和图31为免疫记忆相关细胞因子IL7、IL15和IL23在猪外周血血浆中含量的动态变化，免疫记忆相关因子能够促进免疫记忆相关细胞的分化发育促进机体免疫记忆的形成，增强机体的免疫反应。在拌喂后第28天、第42天和第56天，Po1h-IL-17/22组猪外周血血浆中IL7、IL15和IL23的含量均要显著高于空载组(Po1h)和空白对照组(PBS)中IL7、IL15和IL23的含量(P<0.05)。结果表明：重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物可以促进免疫记忆相关因子的生成从而提高猪的免疫力。
图32和图33为目的细胞因子IL17和IL22在猪外周血血浆中含量的动态变化，IL-17作为一种多功能促炎细胞因子，在炎症、自身免疫性疾病、肿瘤免疫和先天免疫等方面均具有重要作用，IL-22则在抗微生物感染，肠道的损伤保护以及黏膜免疫等方面起着重要作用。在拌喂后第28天、第42天和第56天，Po1h-IL-17/22组猪外周血血浆中IL17的含量均要显著高于空载组(Po1h)和空白对照组(PBS)中IL17的含量(P<0.05)。在拌喂后第14天和第42天，Po1h-IL-17/22组猪外周血血浆中IL22的含量均要显著高于空载组(Po1h)和空白对照组(PBS)中IL22的含量(P<0.05)。这些结果表明：重组酵母Po1h-pINA1297-IL17/22发酵产物可以提高猪肠道粘膜免疫和组织修复能力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 四川三优康生物技术有限公司
<120> 猪白细胞介素17和22共表达替抗生物制剂的制备及应用
<130> GNCYX210430
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Leu Ala Thr Ala Phe Thr Ile Leu Thr Ala Val Leu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Met Ile Pro Gln Ser Pro Gly Cys Pro Lys Thr Glu Asp Lys Asn
20 25 30
Phe Pro Gln His Val Arg Val Asn Leu Asn Ile Leu Asn Arg Ser Thr
35 40 45
Pro Ala Arg Arg Pro Ser Asp Tyr Ser Lys Arg Phe Thr Ser Pro Trp
50 55 60
Thr Leu Gln Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Ser Ser Val Ile Trp
65 70 75 80
Glu Ala Lys Cys Ser His Ser Gly Cys Ile Asn Ala Glu Gly Lys Glu
85 90 95
Asp His His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu
100 105 110
Arg Arg Glu Pro Arg His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Val
115 120 125
Met Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val Arg His Ile
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
145 150 155 160
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Lys Leu Ala Thr Ala Phe Thr Ile Leu
165 170 175
Thr Ala Val Leu Ala Ala Ala Leu Arg Thr Ser Gly Ser Pro Phe Leu
180 185 190
Leu Glu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Trp Ala
195 200 205
Gln Gly Gly Val Ala Val Pro Ile Thr His His Cys Lys Leu Asp Gln
210 215 220
Ser Asn Phe Gln Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Thr Leu Ala
225 230 235 240
Gln Glu Ala Ser Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly
245 250 255
Asn Asn Leu Phe Gln Gly Val Asn Gln Met Arg Glu Arg Cys Tyr Leu
260 265 270
Val Lys Gln Val Leu Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Asn
275 280 285
Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Met Gln Glu Val Ala Ser Phe Leu Asp
290 295 300
Ser Leu Ser Lys Lys Leu Ser Gln Cys Arg Ile Lys Gly Asp Asp Gln
305 310 315 320
His Ile Gln Arg Asn Val Asn Asn Phe Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu
325 330 335
Gly Glu Ser Gly Glu Ile Lys Val Ile Gly Glu Leu Tyr Leu Leu Phe
340 345 350
Met Ala Leu Lys Asn Glu Cys Thr Leu Pro Gly His Ser Trp Lys Met
355 360 365
Asp Asn
370
<210> 2
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaagctcg ctaccgcctt tactattctc acggccgttc tggccggaat catgatccca 60
caaagtccag gatgcccaaa aactgaggac aagaacttcc ctcagcatgt aagggtcaac 120
ttgaacatct tgaaccggag cacacctgcc agacggccct cagattactc caaacgcttc 180
acctcaccat ggactctcca acgcaacgag gaccccgaga ggtactcctc cgtgatctgg 240
gaggccaagt gcagccactc gggctgtatc aatgctgaag ggaaggaaga tcatcacatg 300
aactctgtcc ccatccagca agagatcttg gtcctgcgaa gggagcctcg ccactgcccc 360
aactccttcc ggctggagaa agtgatggtg acagtgggct gcacctgtgt cacccccatc 420
gtccgccata tttctggaag cggagagggc aggggaagtc ttctaacatg cggggacgtg 480
gaggaaaatc ccgggccaat gaagctcgct accgccttta ctattctcac ggccgttctg 540
gccgctgccc tgcggacatc tgggagccct ttccttctgg agactctggc cgccagctgc 600
ctccttctcc tcgccctgtg ggcacaggga ggagtggctg tgcccatcac tcatcactgc 660
aagcttgacc agtccaactt ccagcagccc tacatcacca accgcacctt cacgcttgct 720
caggaggcta gtttggcaga taacaacaca gacgttcgtc tcattgggaa taatctgttc 780
cagggagtca atcagatgag agagcgctgc tacctggtga agcaggtcct gaacttcacc 840
cttgaagaag tgctgttccc caactctgat agattccacc cctacatgca ggaggtggcg 900
tccttcctgg acagcctcag caaaaagcta agccaatgcc gtattaaggg tgatgaccag 960
catatccaga gaaatgtgaa caactttaaa gacacagtga aaaagcttgg agagagtgga 1020
gagatcaaag taattggaga actgtatttg ctgtttatgg ccctgaagaa tgaatgcact 1080
cttccagggc acagctggaa aatggataac taa 1113
<210> 3
<211> 387
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gly Ile Met Ile Pro Gln Ser Pro Gly
20 25 30
Cys Pro Lys Thr Glu Asp Lys Asn Phe Pro Gln His Val Arg Val Asn
35 40 45
Leu Asn Ile Leu Asn Arg Ser Thr Pro Ala Arg Arg Pro Ser Asp Tyr
50 55 60
Ser Lys Arg Phe Thr Ser Pro Trp Thr Leu Gln Arg Asn Glu Asp Pro
65 70 75 80
Glu Arg Tyr Ser Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Ser His Ser Gly
85 90 95
Cys Ile Asn Ala Glu Gly Lys Glu Asp His His Met Asn Ser Val Pro
100 105 110
Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Arg His Cys Pro
115 120 125
Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Val Met Val Thr Val Gly Cys Thr Cys
130 135 140
Val Thr Pro Ile Val Arg His Ile Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
145 150 155 160
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
165 170 175
Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly Ala
180 185 190
Val Phe Val Ser Pro Ser Ala Ala Leu Arg Thr Ser Gly Ser Pro Phe
195 200 205
Leu Leu Glu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Trp
210 215 220
Ala Gln Gly Gly Val Ala Val Pro Ile Thr His His Cys Lys Leu Asp
225 230 235 240
Gln Ser Asn Phe Gln Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Thr Leu
245 250 255
Ala Gln Glu Ala Ser Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile
260 265 270
Gly Asn Asn Leu Phe Gln Gly Val Asn Gln Met Arg Glu Arg Cys Tyr
275 280 285
Leu Val Lys Gln Val Leu Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro
290 295 300
Asn Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Met Gln Glu Val Ala Ser Phe Leu
305 310 315 320
Asp Ser Leu Ser Lys Lys Leu Ser Gln Cys Arg Ile Lys Gly Asp Asp
325 330 335
Gln His Ile Gln Arg Asn Val Asn Asn Phe Lys Asp Thr Val Lys Lys
340 345 350
Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile Lys Val Ile Gly Glu Leu Tyr Leu Leu
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Phe Met Ala Leu Lys Asn Glu Cys Thr Leu Pro Gly His Ser Trp Lys
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<210> 4
<211> 1170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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agacggccct cagattactc caaacgcttc acctcaccat ggactctcca acgcaacgag 240
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acagtgggct gcacctgtgt cacccccatc gtccgccata tttctggaag cggagctact 480
aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga accctggacc tatggatgca 540
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gctgccctgc ggacatctgg gagccctttc cttctggaga ctctggccgc cagctgcctc 660
cttctcctcg ccctgtgggc acagggagga gtggctgtgc ccatcactca tcactgcaag 720
cttgaccagt ccaacttcca gcagccctac atcaccaacc gcaccttcac gcttgctcag 780
gaggctagtt tggcagataa caacacagac gttcgtctca ttgggaataa tctgttccag 840
ggagtcaatc agatgagaga gcgctgctac ctggtgaagc aggtcctgaa cttcaccctt 900
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ccagggcaca gctggaaaat ggataactaa 1170

Claims (10)

1.一种蛋白质，包括猪白细胞介素17和猪白细胞介素22。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)：
(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列3所示的蛋白质；
(a3)在(a1)或(a2)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a4)与(a1)或(a2)具有80％以上或85％以上或90％以上或95％以上或98％以上或99％以上同一性且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；
(a5)将(a1)或(a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。
4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表的序列4所示的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b4)与(b1)或(b2)限定的DNA分子至少具有80％以上或85％以上或90％以上或95％以上或98％以上或99％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
5.具有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体、转染细胞或重组微生物。
6.权利要求5所述转染细胞的培养产物或权利要求5所述重组微生物的发酵产物。
7.生物材料的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：
(c1)制备提高动物免疫能力的产品；
(c2)提高动物免疫能力；
(c3)制备疫苗；
(c4)抗致病微生物感染；
所述生物材料为权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3或4所述核酸分子或权利要求5所述表达盒或权利要求5所述重组载体或权利要求5所述转染细胞或权利要求5所述重组微生物或权利要求6所述培养产物或权利要求6所述发酵产物。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于：
所述提高动物免疫能力为下述(d1)至(d6)中的至少一种：
(d1)促进效应靶细胞的细胞免疫和/或体液免疫；
(d2)促进效应靶细胞免疫屏障的建立；
(d3)促进动物发育和生长；
(d4)促进动物免疫细胞的增加；
(d5)同时促进动物细胞免疫和体液免疫；
(d6)促进动物粘膜免疫屏障的建立。
9.一种产品，包括生物材料；
所述生物材料为权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3或4所述核酸分子或权利要求5所述表达盒或权利要求5所述重组载体或权利要求5所述转染细胞或权利要求5所述重组微生物或权利要求6所述培养产物或权利要求6所述发酵产物。
10.一种提高动物免疫能力的方法，包括如下步骤：对动物施用生物材料，提高所述动物的免疫能力；所述生物材料为权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3或4所述核酸分子或权利要求5所述表达盒或权利要求5所述重组载体或权利要求5所述转染细胞或权利要求5所述重组微生物或权利要求6所述培养产物或权利要求6所述发酵产物。
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