CN115772228A

CN115772228A - 酵母表面展示的鸭干扰素融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN115772228A
Application number: CN202111053206.7A
Authority: CN
Inventors: 高小平; 付伟; 李晟; 代燕平
Original assignee: Chengdu Tongqien Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Tongqien Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2023-03-10

Abstract

本发明提供了酵母表面展示的鸭干扰素融合蛋白及其应用。本发明涉及将免疫调节肽或抗菌肽与鸭干扰素α(DuIFNα)串联并与酵母细胞壁GPI结构域融合，使DuIFNα与免疫调节肽或抗菌肽被展示到酵母细胞表面，形成GPI锚定的DuIFNα串联免疫调节肽或抗菌肽的融合蛋白。与现有技术相比，酵母细胞培养过程简单、培养时间短、原料成本低廉，是实现大规模生产DuIFNα融合蛋白的首选。本发明的GPI锚定DuIFNα融合蛋白可作为药物和饲料添加剂，口服用于预防和治疗水禽类动物病毒和细菌感染性疾病。

Description

酵母表面展示的鸭干扰素融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酵母表面展示的鸭干扰素融合蛋白，尤其涉及串联了乳铁蛋白水解肽、胸腺肽以及天蚕素的鸭干扰素α与毕赤酵母细胞壁GPI结构域的融合，以及该融合蛋白在用于预防和治疗水禽类动物感染性疾病，尤其鸭或鹅相关病毒或合并细菌感染性疾病中的应用。

背景技术

干扰素具有抗病毒和免疫调节的作用，其中，干扰素α(IFNα)和干扰素β(IFNβ)主要参与抗病毒、抗肿瘤过程。干扰素γ(IFNγ)则可诱导病毒感染的细胞表达病毒抗原，增加免疫系统识别和杀伤感染细胞的能力，还可作为免疫佐剂参与机体的免疫反应。干扰素的抗病毒和免疫调节作用促进了重组干扰素的发展，如重组鸭干扰素α作为注射液，在预防和治疗鸭、鹅病毒感染性疾病方面已显示良好的效果。但是，注射用重组鸭干扰素在应用上受到极大地限制，尤其在超大型鸭场，采用人工注射是一项非常耗时的工作。而且，单独鸭干扰素对治疗混合细菌感染如大肠杆菌、鸭里默氏杆菌与病毒混合感染性的水禽类疾病仍然十分有限。

天蚕素是一类主要从家蚕或家蝇中分离得到的抗菌肽，是最具潜力的抗生素替代品之一，对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌具有很强的抑制作用，我们的研究发现，天蚕素能显著抑制大肠杆菌和鸭里默氏杆菌的生长，推测其与干扰素α联合使用能有效防治细菌、病毒混合感染性鸭疾病。乳铁蛋白水解肽B与胸腺肽α1既有免疫调节作用，也兼具抗菌和抗病毒作用，若与鸭干扰素融合，在抗细菌、病毒混合感染性鸭疾病方面不失为一类理想的联合治疗方案。

酵母表面展示技术是继噬菌体展示技术之后发展的新的细胞表面展示系统，因具有和哺乳动物细胞相似的蛋白质合成和翻译后修饰功能，以及蛋白质的分泌功能，在外源蛋白的表达方面具有超越大肠杆菌的显著优势。酵母细胞表面提供了展示功能蛋白质的空间，外源蛋白可以通过与细胞壁锚定结构域融合而共价锚定到酵母细胞壁上。中国专利(林影等，2011)已公开系列酵母细胞壁蛋白，应用细胞壁蛋白成功地将碱性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B等外源蛋白展示在酵母表面(Zhang L等,2013；Li C等，2014；Wang P等，2016；Guo D等，2016)。此外，某些酵母如酿酒酵母和毕赤酵母的非致病性和天然佐剂特性，其表面展示外源蛋白已成为开发公共卫生和农畜牧养殖等疫苗的理想模式，应用其开发口服或食用疫苗取得了显著的成效。但迄今为止，在酵母细胞表面展示鸭干扰素以及鸭干扰素与其它小肽类分子的融合蛋白尚未见文献报道。

本发明采用酵母细胞作为宿主，将串联了免疫调节肽或抗菌肽的鸭干扰素与酵母细胞壁GPI结构融合，并通过GPI锚定结构域将鸭干扰素融合蛋白展示在酵母细胞表面。

发明内容

本发明包括串联了免疫调节肽或抗菌肽的鸭干扰素α与酵母细胞壁GPI结构域的融合，DuIFNα与免疫调节肽或抗菌肽之间包含接头肽(Linker)，其组成为：A+Linker+B，其中，A为DuIFNα，B为免疫调节肽或抗菌肽，接头肽为(GGGGS)n；本发明还包括在A+Linker+B序列的N端或C端通过接头肽与细胞壁GPI结构域的融合，形成如下组成结构：

GPI+Linker+DuIFNα+Linker+Lfcin B

DuIFNα+Linker+Lfcin B+Linker+GPI

GPI+Linker+DuIFNα+Linker+Tα1

DuIFNα+Linker+Tα1+Linker+GPI

GPI+Linker+DuIFNα+Linker+Cecropins

DuIFNα+Linker+Cecropins+Linker+GPI

细胞壁GPI结构域选自毕赤酵母，包括Gcw12p、Gcw19p、Gcw21p、Gcw49p和Gcw61p等系列蛋白结构域。

优选地，Gcw61p通过接头肽被插入到A+接头肽+B序列的N端或C端，其中，A为DuIFNα，B为Lfcin B，接头肽为(GGGGS)n，如SEQ ID NO 1所示，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。

优选地，Gcw61p通过接头肽被插入到A+接头肽+B序列的N端或C端，其中，A为DuIFNα，B为Tα1，接头肽为(GGGGS)n，如SEQ ID NO 3所示；其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。

优选地，Gcw61p通过接头肽被插入到A+接头肽+B序列的N端或C端，其中，A为DuIFNα，B为Cecropin B，接头肽为(GGGGS)n，如SEQ ID NO 5所示；其对应的核苷酸序列如SEQ IDNO 6所示。

本发明还提供了预防和治疗水禽类病毒或合并细菌感染性疾病的方法，包括口服给鸭或鹅有效量的上述融合蛋白的方法。

本发明的有益效果包括：

(1)鸭干扰素-α与免疫调节肽或抗菌肽的融合蛋白可有效对抗多种病毒和致病微生物合并感染；

(2)GPI表面展示的DuIFNα融合蛋白可与饮水或饲料混合，以口服形式给予鸭或鹅等水禽类动物；

(3)GPI表面展示的DuIFNα融合蛋白可避免繁琐的下游过程，如分离和纯化等步骤。

附图说明

图1显示了pPICZα/DuIFNα-Lfcin B-GPI表达质粒酶切产物电泳结果

图2显示了DuIFNα-Lfcin B-GPI融合蛋白与His抗体的免疫印迹结果

图3显示了酵母表面展示的DuIFNα-Lfcin B诱导OAS基因的表达

具体实施方式

下面以DuIFNα+Lfcin B+GPI融合蛋白为例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1本发明的融合蛋白克隆构建

DuIFNα与Lfcin B的融合蛋白编码基因分别选自GenBank:AB302328.1和L19981.1，两者之间以Linker连接，再将融合蛋白末端通过Linker与Gcw61p蛋白相连，在其5′端和3′端分别引入内切酶位点XhoI和NotI，通过人工合成DuIFN-Lfcin B-GPI融合蛋白编码基因，并将其插入到pPICZα载体，构建了酵母展示的重组表达质粒pPICZα/DuIFNα-Lfcin B-GPI。pPICZα/DuIFNα-Lfcin B-GPI表达质粒经酶切鉴定，获得的产物在1％琼脂糖凝胶电泳上出现分子量与预期大小相符的DNA条带(图1)，表明pPICZα/DuIFNα-Lfcin B-GPI表达质粒构建成功。

实施例2本发明融合蛋白的表达

pPICZα/DuIFNα-Lfcin B-GPI表达质粒经Pme I内切酶线性化后，用化学转染法将其导入酵母GS115感受态，涂于含Zeocin的固体YPD培养板上，于30℃培养72h。挑选阳性克隆于10mL的YPD培养基，置于摇床，在250rpm、30℃条件下震荡培养24h，收集菌体，加入10mL的BMMY培养基，转移至50mL摇瓶中，加入甲醇并置于摇床，在250rpm、30℃条件下震荡培养24-48h。收集甲醇诱导表达24h的菌体，经裂解处理后进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。结果显示，在分子量大约20KDa条带位置，菌体裂解液与His抗体发生明显的免疫印迹反应(图2)，表明酵母菌体具有融合蛋白表达，也间接证实了本发明的融合蛋白在酵母表面的展示。

实施例3本发明融合蛋白的生物活性检测

干扰素不具有直接作用病毒的能力，而是通过与细胞表面受体结合，快速地将信号传递至细胞内部，诱导干扰素刺激基因(ISGs)的表达，进而发挥抗病毒功能。ISGs蛋白数量极多，其中抗黏病毒蛋白(Mx)和2′-5′寡腺苷酸合成酶(OAS)是最具代表性的，它们主要通过干扰病毒入侵和病毒复制及转录过程而发挥抗病毒功能。酵母表面展示的干扰素通常具有结合受体的能力，因而可快速诱导Mx和OAS的表达。

为了获得本发明融合蛋白在酵母表面展示的直接证据，收集甲醇诱导表达24h的酵母菌体，计算菌落形成单位(CFU)。菌体经洗涤后以不同稀释度加入培养的鸭胚细胞(鸭干扰素受体表达阳性)，检测酵母菌体是否能快速诱导鸭胚细胞OAS的表达。加入不同浓度(CFU)的酵母菌体于37℃、5％CO2处理2h，收集菌体制备RNA，采用半定量PCR检测OAS1基因mRNA表达水平，β-actin作为内参对照。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30sec、60℃30sec、72℃30sec，30Cycle；72℃5min，4℃10min。PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。

OAS1引物为5'AGAACTGCCCGCCAAATACG 3'

5'CCCAGTAGATGCAGATGTCCC 3'

β-actin引物为5'CTATGTCGCCCTGGATTTCG 3'

5'TTTAGAAGCATTTGCGGTGG 3'

以纯化的重组DuIFNα(rDuIFNα，CHO细胞表达)作为对照，观察不同浓度(CFU)的酵母菌体对OAS1的诱导作用，参比rDuIFNα的活性单位，计算酵母展示的DuIFNα-Lfcin B-GPI诱导抗病毒蛋白基因表达的生物活性。实验结果如图3所示：与对照相比，DuIFNα-Lfcin B-GPI作用鸭胚胎细胞2h时OAS1基因表达水平显著增加，且具有浓度依赖性。参比rDuIFNα计算DuIFNα-Lfcin B-GPI的活性单位大约为15000IU/10⁸CFU。此结果证实DuIFNα-Lfcin B-GPI可快速作用鸭胚细胞干扰素受体，进而诱导干扰素刺激基因OAS1的表达，表明DuIFNα-Lfcin B成功锚定在酵母表面，且具有良好的生物活性。

实施例4本发明融合蛋白对番鸭呼肠孤病毒感染的治疗

感染呼肠孤病毒的番鸭800只(8-12日龄)，随机分为2组,每组400只。给药组1以饮水方式给予本发明，以每10升(公斤)饮用水加入酵母菌体活性单位为1×10⁶IU的本发明，充分混匀后给予番鸭饮用，连续饮用3天；给药组2采用单次注射卵黄抗体(1mL/羽)作为对照组。饮用本发明前后称取体重，用药前后及过程中记录番鸭的饮食量、体重、精神状态、软脚数以及死亡数。与单次注射卵黄抗体的对照组番鸭比较，饮用本发明后的番鸭精神状态逐渐恢复，饮食量也逐渐增加至正常，软脚番鸭数量明显减少。软脚番鸭总数为12只，番鸭死亡总数为2只，治愈率达到95.25％；而单次注射卵黄抗体的软脚番鸭总数为81只，番鸭死亡总数为29只，治愈率为72.5％。此结果表明，本发明可快速改善呼肠孤病毒感染番鸭的临床症状，显著降低死亡率，治疗效果明显优于卵黄抗体注射液。

表1本发明对呼肠孤病毒感染番鸭的治疗效果

实施例5本发明融合蛋白对病毒合并细菌感染鹅的治疗

病毒合并细菌感染初期的总鹅数量450只(体重大约1.8-2.5公斤)，将其随机分为3组：给药组1、给药组2和未给药组。给药组1以饮水方式给予本发明，以每30升(公斤)饮用水加入酵母菌体活性单位为1.5×10⁵IU的本发明，充分混匀后给予感染鹅饮用，连续饮用3天；给药组2以饮水方式给予DuIFNα-GPI(未串联Lfcin B)，用法和用量与本发明相同；正常饮水的感染鹅作为未给药对照组。饮用本发明过程记录各组感染鹅的饮食量、体重、精神状态和死亡数。于第4天统计感染鹅的死亡总数，计算死亡率。饮用本发明后，给药组1感染鹅的精神状态逐渐恢复，饮食量增加，3天内体重增加大约150克，平均日增重约为50克。而且，饮用本发明后，感染鹅未再出现死亡现象。与饮用本发明的感染鹅比较，给药组2的感染鹅在精神状态和饮食量方面也有明显改善，虽然发生感染鹅死亡，但主要发生在给药当日和第2日，而且与未给药对照组比较，死亡数显著下降(见表2)。此结果表明，本发明的融合蛋白对初期病毒合并细菌感染病鹅的治疗效果非常显著。

表2本发明对初期病毒合并细菌感染病鹅的治疗效果

序列表

<110> 成都彤琦恩生物科技有限公司

<120> 酵母表面展示的鸭干扰素融合蛋白及其应用

<130> 0

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Arg Glu Ala Glu Ala Cys Ser Pro Leu Arg Leu His Asp Ser Ala

1 5 10 15

Phe Ala Trp Asp Ser Leu Gln Leu Leu Arg Asn Met Ala Pro Ser Pro

20 25 30

Thr Gln Pro Cys Pro Gln Gln His Ala Pro Cys Ser Phe Pro Asp Thr

35 40 45

Leu Leu Asp Thr Asn Asp Thr Gln Gln Ala Ala His Thr Ala Leu His

50 55 60

Leu Leu Gln His Leu Phe Asp Thr Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala

65 70 75 80

His Trp Leu His Thr Ala Arg His Asp Leu Leu Asn Gln Leu Gln His

85 90 95

His Ile His His Leu Glu Arg Cys Phe Pro Ala Asp Ala Ala Arg Leu

100 105 110

His Arg Arg Gly Pro Arg Asn Leu His Leu Ser Ile Asn Lys Tyr Phe

115 120 125

Gly Cys Ile Gln His Phe Leu Gln Asn His Thr Tyr Ser Pro Cys Ala

130 135 140

Trp Asp His Val Arg Leu Glu Ala His Ala Cys Phe Gln Arg Ile His

145 150 155 160

Arg Leu Thr Arg Thr Met Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Ser Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala

180 185 190

Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly

195 200 205

Gly Gly Gly Ser Asn Asn Leu Ser Asn Glu Ser Asn Gly Thr Asn His

210 215 220

Ser Asn His Thr Ser Ser Val Pro Thr Gly Ala Ala Val Arg Ala Ser

225 230 235 240

Gly Met Gly Ala Gly Leu Leu Gly Ala Gly Val Val Ala Gly Val Ala

245 250 255

Leu Leu Ile

<210> 2

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaagagaag ctgaagcttg ttctccattg agattgcatg atagtgcttt tgcttgggat 60

tctttgcaat tgttgagaaa tatggctcct tctccaactc aaccatgtcc acaacaacat 120

gctccttgtt cctttccaga tactttattg gatactaacg atactcaaca agctgctcac 180

actgcattgc atttgttgca acatttgttt gatactttga gttctccttc tactcctgct 240

cattggttgc acactgctag acatgatctt ttgaaccaat tgcaacatca tattcatcac 300

ttagaaagat gttttcctgc tgacgctgct agattgcaca gaagaggtcc tagaaactta 360

catttgtcta ttaacaagta ttttggttgt atccagcact ttttgcaaaa tcatacttac 420

tctccatgtg cttgggatca tgttagattg gaagctcatg cttgctttca aagaatccat 480

agattgacta gaactatgag aggtggaggt ggttctggtg gtggtggttc cttcaaatgc 540

cgccgatggc agtggaggat gaagaagctg ggtgctccct ctatcacctg tgtgaggagg 600

gcctttggtg gaggtggttc tggtggtggt ggttccaaca acttgtctaa cgaatctaac 660

ggtactaacc actctaacca cacttcttct gttccaactg gtgctgctgt tagagcttct 720

ggtatgggtg ctggtttgtt gggtgctggt gttgttgctg gtgttgcttt gttgatt 777

<210> 3

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Lys Arg Glu Ala Glu Ala Cys Ser Pro Leu Arg Leu His Asp Ser Ala

1 5 10 15

Phe Ala Trp Asp Ser Leu Gln Leu Leu Arg Asn Met Ala Pro Ser Pro

20 25 30

Thr Gln Pro Cys Pro Gln Gln His Ala Pro Cys Ser Phe Pro Asp Thr

35 40 45

Leu Leu Asp Thr Asn Asp Thr Gln Gln Ala Ala His Thr Ala Leu His

50 55 60

Leu Leu Gln His Leu Phe Asp Thr Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala

65 70 75 80

His Trp Leu His Thr Ala Arg His Asp Leu Leu Asn Gln Leu Gln His

85 90 95

His Ile His His Leu Glu Arg Cys Phe Pro Ala Asp Ala Ala Arg Leu

100 105 110

His Arg Arg Gly Pro Arg Asn Leu His Leu Ser Ile Asn Lys Tyr Phe

115 120 125

Gly Cys Ile Gln His Phe Leu Gln Asn His Thr Tyr Ser Pro Cys Ala

130 135 140

Trp Asp His Val Arg Leu Glu Ala His Ala Cys Phe Gln Arg Ile His

145 150 155 160

Arg Leu Thr Arg Thr Met Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Ser Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp

180 185 190

Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Gly Gly

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Asn Leu Ser Asn Glu Ser Asn Gly

210 215 220

Thr Asn His Ser Asn His Thr Ser Ser Val Pro Thr Gly Ala Ala Val

225 230 235 240

Arg Ala Ser Gly Met Gly Ala Gly Leu Leu Gly Ala Gly Val Val Ala

245 250 255

Gly Val Ala Leu Leu Ile

260

<210> 4

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaagagaag ctgaagcttg ttctccattg agattgcatg atagtgcttt tgcttgggat 60

tctttgcaat tgttgagaaa tatggctcct tctccaactc aaccatgtcc acaacaacat 120

gctccttgtt cctttccaga tactttattg gatactaacg atactcaaca agctgctcac 180

actgcattgc atttgttgca acatttgttt gatactttga gttctccttc tactcctgct 240

cattggttgc acactgctag acatgatctt ttgaaccaat tgcaacatca tattcatcac 300

ttagaaagat gttttcctgc tgacgctgct agattgcaca gaagaggtcc tagaaactta 360

catttgtcta ttaacaagta ttttggttgt atccagcact ttttgcaaaa tcatacttac 420

tctccatgtg cttgggatca tgttagattg gaagctcatg cttgctttca aagaatccat 480

agattgacta gaactatgag aggtggaggt ggttctggtg gtggtggttc ctcagacgca 540

gccgtagaca ccagctccga aatcaccacc aaggacttaa aggagaagaa ggaagttgtg 600

gaagaggcag aaaatggtgg aggtggttct ggtggtggtg gttccaacaa cttgtctaac 660

gaatctaacg gtactaacca ctctaaccac acttcttctg ttccaactgg tgctgctgtt 720

agagcttctg gtatgggtgc tggtttgttg ggtgctggtg ttgttgctgg tgttgctttg 780

ttgatt 786

<210> 5

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Lys Arg Glu Ala Glu Ala Cys Ser Pro Leu Arg Leu His Asp Ser Ala

1 5 10 15

Phe Ala Trp Asp Ser Leu Gln Leu Leu Arg Asn Met Ala Pro Ser Pro

20 25 30

Thr Gln Pro Cys Pro Gln Gln His Ala Pro Cys Ser Phe Pro Asp Thr

35 40 45

Leu Leu Asp Thr Asn Asp Thr Gln Gln Ala Ala His Thr Ala Leu His

50 55 60

Leu Leu Gln His Leu Phe Asp Thr Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala

65 70 75 80

His Trp Leu His Thr Ala Arg His Asp Leu Leu Asn Gln Leu Gln His

85 90 95

His Ile His His Leu Glu Arg Cys Phe Pro Ala Asp Ala Ala Arg Leu

100 105 110

His Arg Arg Gly Pro Arg Asn Leu His Leu Ser Ile Asn Lys Tyr Phe

115 120 125

Gly Cys Ile Gln His Phe Leu Gln Asn His Thr Tyr Ser Pro Cys Ala

130 135 140

Trp Asp His Val Arg Leu Glu Ala His Ala Cys Phe Gln Arg Ile His

145 150 155 160

Arg Leu Thr Arg Thr Met Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Ser Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile

180 185 190

Arg Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly Glu

195 200 205

Ala Lys Ala Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Asn

210 215 220

Leu Ser Asn Glu Ser Asn Gly Thr Asn His Ser Asn His Thr Ser Ser

225 230 235 240

Val Pro Thr Gly Ala Ala Val Arg Ala Ser Gly Met Gly Ala Gly Leu

245 250 255

Leu Gly Ala Gly Val Val Ala Gly Val Ala Leu Leu Ile

260 265

<210> 6

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaaagagaag ctgaagcttg ttctccattg agattgcatg atagtgcttt tgcttgggat 60

tctttgcaat tgttgagaaa tatggctcct tctccaactc aaccatgtcc acaacaacat 120

gctccttgtt cctttccaga tactttattg gatactaacg atactcaaca agctgctcac 180

actgcattgc atttgttgca acatttgttt gatactttga gttctccttc tactcctgct 240

cattggttgc acactgctag acatgatctt ttgaaccaat tgcaacatca tattcatcac 300

ttagaaagat gttttcctgc tgacgctgct agattgcaca gaagaggtcc tagaaactta 360

catttgtcta ttaacaagta ttttggttgt atccagcact ttttgcaaaa tcatacttac 420

tctccatgtg cttgggatca tgttagattg gaagctcatg cttgctttca aagaatccat 480

agattgacta gaactatgag aggtggaggt ggttctggtg gtggtggttc caaatggaaa 540

gtcttcaaga aaattgaaaa aatgggtcgc aacattcgaa acggtattgt caaggctgga 600

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ggttccaaca acttgtctaa cgaatctaac ggtactaacc actctaacca cacttcttct 720

gttccaactg gtgctgctgt tagagcttct ggtatgggtg ctggtttgtt gggtgctggt 780

gttgttgctg gtgttgcttt gttgatt 807

Claims

1.酵母表面展示的鸭干扰素融合蛋白，其包含串联了免疫调节肽或抗菌肽的鸭干扰素α(DuIFNα)与酵母细胞壁GPI结构域的融合，形成GPI锚定的DuIFNα/免疫调节肽或抗菌肽融合蛋白。

2.如权利要求1的融合蛋白，其中所述的免疫调节肽或抗菌肽为乳铁蛋白水解肽(Lfcin B)；胸腺肽α1(Tα1)和天蚕素(Cecropins)。

3.如权利要求1的融合蛋白，其中所述酵母细胞壁GPI结构域选自毕赤酵母，包括Gcw12p、Gcw19p、Gcw21p、Gcw49p和Gcw61p等。

4.如权利要求1的融合蛋白，其中免疫调节肽或抗菌肽与DuIFNα串联融合，以及与细胞壁GPI结构域的融合是通过连接肽(Linker)来实现。

5.编码权利要求1-4所述的融合蛋白的核酸分子。

6.包含权利要求5所述核酸分子的载体。

7.包含权利要求5和6所述核酸分子和载体的宿主细胞。

8.权利要求7的宿主细胞，所述细胞为毕赤酵母细胞。

9.预防和治疗水禽类动物感染性疾病的方法，包括口服给水禽类动物有效量的权利要求1-4所述的融合蛋白。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述水禽类动物主要是鸭和鹅。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述水禽类动物感染性疾病是病毒感染性疾病。

12.如权利要求9所述的方法，其中所述水禽类动物感染性疾病是细菌感染性疾病。