CN107254482A - 一种提高重组猪干扰素‑α融合蛋白抗病毒活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组猪干扰素‑α基因及其制备方法。其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所编码的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明将猪干扰素‑α基因与猪抗体CH3片段融合表达，既利于增加蛋白的稳定性、延长活性时间又可以通过原核表达系统进行高效制备，经实验证明，本发明所表达的重组猪干扰素‑α与天然猪干扰素‑α的半衰期相比有显著提高、生物活性也优于天然产物。

Description

一种提高重组猪干扰素-α融合蛋白抗病毒活性的方法

技术领域

本发明涉及一种重组的基因，尤其涉及重组猪干扰素-α基因，本发明还涉及含有该基因的表达载体以及工程菌株，本发明进一步涉及它们在制备猪干扰素-α中的用途，属于干扰素基因工程领域。

背景技术

近两年，由于畜禽免疫抑制性疾病的危害日趋严重，免疫增强剂在畜牧生产中被广泛应用。动物受到疫病威胁或处于应激状态，特别是畜禽处于免疫抑制时使用免疫增强剂是有显著成效的。随着科学技术的进步及现代畜牧业的需要，免疫增强剂的防治作用越来越受到重视，特性确定、高效、稳定、无毒的理想免疫增强剂将是未来防治畜禽疾病的主要物质。其中，最主要的猪用免疫增强剂就是干扰素。干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒药物，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。由于干扰素具有无毒、副作用和抗病毒范围广泛的优势，在发现之初就受到关注，经过多年的应用发展，干扰素已经成为一种广泛的免疫增强剂用于病毒病和肿瘤等疾病的防治领域。

我国是世界上最大的猪肉生产国和消费国，猪肉产量约占世界总产量的46%。病毒性传染病如猪瘟，蓝耳病等疾病一直是我国养猪业面临的重要问题。而干扰素已被证明是防止病毒性传染病的重要制剂。以往干扰素以野生型的形式生产，虽然与天然结构相近，但半衰期较短，无法保证药物的有效活性。而一般方法通过连接抗体的Fc片段增加半衰期，但由于连接Fc后分子量较大，无法通过原核系统进行表达，而只能通过真核表达系统，无形中增加了生产成本，造成养殖户使用成本较高。因此，运用基因工程操作，对原始序列进行改造，只连入抗体恒定区CH3片段，既可以延长半衰期，也可以是蛋白应用原核表达系统进行表达，获得效果更有益的重组猪干扰素是本专利的研究思路。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种重组猪干扰素-α基因，该基因可以在原核表达系统中稳定、高效的表达重组猪干扰素-α；

本发明目的之二是提供含有上述重组猪干扰素-α基因的表达载体；

本发明目的之三是提供由上述重组猪干扰素-α基因所转化的工程菌株；

本发明目的之四是提供一种制备重组猪干扰素-α的方法；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种重组猪干扰素基因-α，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明的重组猪干扰素-α基因是以猪干扰素-α和猪源抗体CH3区域加His标签连接而成，其中核酸序列通过优化改造为最适合原核表达宿主生产的核酸序列。

本发明的重组猪干扰素-α基因的结构由猪干扰素-α和猪抗体CH3区连接6个His串联而成，该基因由903个核苷酸构成编码300个氨基酸。

本发明还构建了含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达质粒及用该重组表达质粒转化得到的工程菌株。

本发明的重组表达质粒可通过本领域的常规方法构建而成，即将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为一个参考的实施方案，例如，可以将重组猪干扰素-α基因与大肠杆菌原核表达载体pET27b利用酶切位点BamHI和 HindIII相连，命名为pET-rIFN-α。

本发明所构建的重组表达质粒可通过各种常规的方法转化宿主细胞。作为参考，可以将含有重组猪干扰素-α基因的表达载体pET-rIFN转化大肠杆菌Rosetta(购自北京全式金生物技术有限公司，货号目录CD801)得到的菌株，命名为Escherichia coli Rosetta/pET-rIFN，简称Rosetta/pET-rIFN-α。

利用大肠杆菌重组菌株Rosetta/pET-rIFN-α生产重组蛋白的具体方法可以：

1、种子液的制备：将菌种划线培养后获得单菌落，挑取单菌落于10mL LB液体培养基中，同时加入100mg/L氨苄青霉素，37℃培养12h。

2、发酵：将获得的种子液按1：100接种于发酵培养基中，当培养至OD₆₀₀为0.4左右时，加入IPTG诱导，其终浓度为5mM，37℃培养3h左右收菌。

本发明还提供一种制备重组猪干扰素-α的方法，包括以下步骤：

构建含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组蛋白的表达，分离并纯化所表达的重组蛋白。

上述制备重组蛋白的方法中，所述的重组表达质粒优选是pET-rIFN-α；所述的宿主细胞是大肠杆菌（Escherichia coli）Rosetta （DE3），所述的重组菌株优选为Escherichia coli Rosetta/pET-rIFN。

上述制备重组蛋白的方法中，优选的，所述的重组蛋白的分离和纯化包括以下步骤：

1、将收集的菌体悬于磷酸盐缓冲液，破碎后低温离心收集上清，利用Ni亲和柱和ΑKTΑ蛋白纯化系统进行蛋白粗提纯；

2、将粗提纯的蛋白再利用ΑKTΑ系统进行分子筛的纯化，最终得到纯度达到90%以上的蛋白。

以天然猪干扰素基因-α（猪干扰素-α基因的原始序列）代替重组猪干扰素-α基因进行以上步骤，得到可用于后续实验的天然猪干扰素-α作为对照。

本发明将猪干扰素-α与猪抗体CH3区融合表达，增加了蛋白的稳定性和活性，同时本发明的蛋白表达和纯化方法具有生产时间短、表达效率高、表达量大、易于纯化的优点，并且经实验证明，本发明所表达的重组猪干扰素-α在半衰期上显著优于天然猪干扰素-α。

附图说明

图1 重组猪干扰素-α的纯化后 SDS-PΑGE凝胶电泳结果。

图2 重组猪干扰素-α对PK-15细胞增殖的抑制作用。

图3 重组猪干扰素-α刺激PK-15细胞p53表达的时间依赖性。

图4 重组猪干扰素-α刺激PK-15细胞p53表达的剂量依赖性。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

PK-15细胞：购自ATCC，CCL-33，由本实验室传代培养，培养基为含10%胎牛血清的DMEM。

实施例1 重组猪干扰素-α基因质粒的构建

1、通过化学合成的方法合成所需的重组猪干扰素-α基因。

2、重组猪干扰素-α基因与pET27b载体的构建

用限制性内切酶BamHI和HindIII将上述步骤1合成的重组猪干扰素-α基因切下，同时与被相同酶切割之后的pET27b载体相连接并转化大肠杆菌DH5ɑ感受态，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取、酶切鉴定、测序后证明重组猪干扰素-α基因已克隆至pET27b载体上，得到的重组质粒命名为pET-rIFN-α。

实施例2 高效表达重组猪干扰素-α基因的大肠杆菌菌株E.coli Rosetta/pET-rIFN的构建

用化学转化方法将pET-rIFN-α转化至E.coli Rosetta，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒提取、酶切鉴定、测序分析证明获得的重组子E.coli Rosetta/pET-rIFN-α和预期一致。

实施例3 利用大肠杆菌工程菌E.coliRosetta/pET-rIFN-α生产重组猪干扰素-α

1、菌种的培养发酵

挑取大肠杆菌工程菌E.coliRosetta/pET-rIFN-α，按1%接种量将工程菌接种于LB液体培养基中，37℃恒温培养12-14 h，次日1：100扩大培养至OD值为0.4，加IPTG至终浓度0.5mM，继续培养3h，4000 r/min，离心30 min收集菌体。

2、重组猪干扰素-α的纯化

将上述收集的菌体超声破碎离心后收集上清，将上清过滤后利用ΑKTΑ蛋白纯化系统进行纯化，先后进行亲和层析和分子筛层析得到纯化后的重组猪干扰素。

取少量纯化后的重组猪干扰素蛋白加入1/5体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸10分钟后进行SDS-PΑGE凝胶电泳。电泳结果见图1。

实施例4 MTT法检测猪重组猪干扰素-α蛋白对猪肾细胞PK-15增殖的抑制作用

将处于对数生长期的猪PK-15细胞经胰蛋白酶消化后进行收集，制备成细胞悬液，吹打均匀后接种于96孔板，在37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜。

完成步骤1后，去掉培养基，分为6组，每组实验孔各加入2、10、50、250、1250、6250ng的重组猪干扰素-α蛋白100 μL，对照孔加100 μL DMEM。37℃，5%CO₂的条件下培养48 h。

完成步骤2后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），4 h后，弃去培养液，每孔加入150 μL的DMSO，震荡10 min后，用酶联免疫分析仪于测定波长为570 nm测定OD值，计算细胞生长的抑制率。

抑制率%=（对照组OD均值-治疗组OD值）/对照组OD均值×100%

结果见图2。从图2中可以看出，与蛋白缓冲液对照组和天然猪干扰素-α蛋白对照组相比，纯化后的重组猪干扰素-α对PK-15细胞生长有明显的抑制作用，随着浓度的增加，对PK-15细胞抑制率逐渐增加(**p<0.01)。

实施例5 Real-time PCR检测重组猪干扰素-α蛋白上调PK-15细胞p53 mRNA的表达水平

1、将处于对数生长期的PK-15细胞接种于2个六孔板（每孔2 mL），取其中一个六孔板用纯化后的重组猪干扰素-α蛋白进行刺激，将蛋白进行100倍稀释后，分别进行2h、4 h、6 h刺激。同时取另一6孔板，分别将蛋白进行10倍、100倍、1000倍稀释，刺激4 h，其中天然干扰素-α蛋白作为对照。

2、完成步骤1后，取细胞，提取细胞总RNA，反转录成cDNA。

3、以步骤2得到的cDNΑ为模板，使用实时荧光定量PCR技术检测p53 mRNA的相对表达情况，以β-actin基因作为内参基因。

用于检测p53基因的引物对如下：

上游：5ˊ-TTGΑGGTGCGTGTTTGTG-3ˊ

下游：5ˊ-GCΑGGCTGGGCATCCTTC-3ˊ

用于检测β-actin基因的引物对如下：

上游：5ˊ-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3ˊ

下游：5ˊ-GCACCGTGTTGGCGTAGAGG-3ˊ

结果见图3。由图3可以看出，在相同量的重组猪干扰素-α蛋白的刺激下，重组猪干扰素-α蛋白刺激PK-15细胞的内源p53的表达水平显著高于天然猪干扰素-α蛋白(*p<0.05)。且重组猪干扰素-α蛋白刺激PK-15细胞的内源p53的表达水平在4h时达到最高。

结果见图4。由图4可以看出，并且随着天然干扰素-α和重组干扰素-α蛋白剂量的不断增加，p53 mRNA水平也具有逐渐增加的趋势，呈剂量依赖性关系，差异显著(**p<0.01)。

综上所述，本发明将猪干扰素-α与猪抗体CH3区融合表达，增加了蛋白的稳定性和活性，同时本发明的蛋白表达和纯化方法具有生产时间短、表达效率高、表达量大、易于纯化的优点，并且经实验证明，本发明所表达的重组猪干扰素-α在半衰期上显著优于天然猪干扰素-α。

<110> 哈尔滨紫霞生物科技有限公司

<120> 一种提高重组猪干扰素-α融合蛋白抗病毒活性的方法

<160> 2

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> SEQ ID NO:1

1 ATGGGCTGTG ATCTGCCGCA GACCCATAGC CTGGCCCATA CACGTGCACT GCGCCTGTTA

61 GCCCAGATGC GCCGCATTAG CCCGTTTAGC TGCCTGGATC ATCGCCGCGA TTTCGGTAGC

121 CCGCATGAGG CCTTTGGCGG CAACCAGGTT CAGAAAGCCC AGGCAATGGC CCTGGTTCAT

181 GAAATGCTGC AGCAGACCTT CCAGCTGTTT AGCACCGAAG GTAGCGCAGC CGCATGGAAT

241 GAGAGCCTGC TGCACCAGTT TTGCACAGGC CTGGATCAGC AGCTGCGTGA TCTGGAGGCC

301 TGTGTGATGC AGGAAGCCGG TCTGGAAGGC ACCCCGCTGC TGGAAGAAGA CAGCATCCTG

361 GCCGTTCGCA AGTATTTTCA CCGTCTGACC CTGTACCTGC AGGAGAAGAG CTATAGTCCG

421 TGTGCCTGGG AAATTGTGCG CGCCGAAGTT ATGCGCAGCT TTAGCAGCAG CCGTAATCTG

481 CAGGATCGCC TGCGCAAAAA AGAAGGTGGT GGCGGTAGCG GTGGTGGTGG TAGTGGTGGT

541 GGTGGTAGTG CAAAAGGCCA GACCCGCGAA CCGCAGGTGT ACACCCTGCC GCCTCATGCC

601 GAAGAACTGA GCCGCAGCAA GGTTAGCATC ACCTGCCTGG TGATCGGTTT CTATCCGCCG

661 GATATCGACG TGGAATGGCA GCGTAATGGT CAGCCGGAAC CGGAAGGTAA CTATCGCACA

721 ACCCCGCCGC AGCAGGATGT GGATGGTACC TACTTTCTGT ATAGCAAATT TAGCGTTGAC

781 AAAGCCAGCT GGCAGGGCGG TGGCATTTTC CAGTGCGCCG TTATGCATGA AGCCCTGCAC

841 AATCACTATA CTCAGAAAAG TATTAGTAAA ACCCCGGGCA AACATCATCA CCACCATCAT

901 TAA

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 300

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> SEQ ID NO: 2

1 Met Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu

21 Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His Arg Arg Asp Phe Gly Ser

41 Pro His Glu Ala Phe Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His

61 Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asn

81 Glu Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala

101 Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu

121 Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro

141 Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu

161 Gln Asp Arg Leu Arg Lys Lys Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

181 Gly Gly Ser Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala

201 Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro

221 Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr

241 Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val Asp

261 Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His

281 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys His His His His His His

Claims (7)

1.一种重组猪干扰素-α基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1的重组猪干扰素-α基因所编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述重组猪干扰素-α基因的重组表达载体。

4.按照权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：其为原核表达载体。

5.由权利要求3或4的重组表达载体所转化得到的重组菌株。

6.一种制备重组猪干扰素-α的方法，包括以下步骤：

构建含有权利要求1所述重组猪干扰素-α基因的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组蛋白的表达，分离并纯化所表达的重组蛋白。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的重组蛋白的分离和纯化包括以下步骤：

（1）将收集的菌体用磷酸盐缓冲液悬浮，破碎后0-4℃低温离心收集上清，利用Ni亲和柱和ΑKTΑ蛋白纯化系统进行蛋白粗提纯；

（2）将粗提纯的蛋白再利用AKTA系统进行分子筛的纯化，即得。