CN110437328A - 一种猪干扰素α突变体YNS及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于干扰素领域，涉及突变体干扰素的制备，特别是指一种猪干扰素α突变体YNS及其制备方法和应用。利用基因工程方法，将天然猪α干扰素基因进行改造，改造的氨基酸位点为H58→Y、E59→N及L61→S，将改造后的基因克隆到pET‑32a载体上构建重组质粒；然后分析猪α干扰素基因的密码子偏嗜性，将鉴定正确的重组质粒克隆到Rosetta表达菌中诱导表达和鉴定。重组蛋白以包涵体形式表达，经纯化和透析处理后，获得纯度较高的猪α干扰素。检测蛋白对Vero细胞的毒性和抗病毒活性，试验结果表明所得的YNS突变体蛋白的CC50为549.5ug/mL，其抗病毒活性为4.29×10⁶U/mg。

Description

一种猪干扰素α突变体YNS及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于干扰素领域，涉及突变体干扰素的制备，特别是指一种猪干扰素α突变体YNS及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，我国的养猪业迅速发展，养猪模式也从传统养殖向规模化、集约化模式转变，各种疾病不断频发，尤其是病毒性疾病对养猪业造成不可估量的经济损失，严重制约我国养猪业蓬勃发展。对于像蓝耳病、猪瘟、口蹄疫等疾病，由于免疫程序、疫苗本身、生长环境和不同动物个体等原因，使疫苗免疫效果往往不理想，加之病毒不断变异，接种预防作用越来越不明显，目前还没有高效疫苗来预防病毒的蔓延。另一方面疫苗预防也存在危险，不少弱毒疫苗在使用过程中出现毒力返祖现象，使预防效果大打折扣，而且还干扰疾病的诊断；不少地区存在抗生素滥用的现象，造成一些抗药菌株的产生，给疾病预防和人类健康造成极大危险。因此，一种有效且对环境无污染的生物制剂对于预防和治疗猪病毒病迫在眉睫。干扰素具有广谱的抗病毒活性，特别是α-干扰素效果最显著，可以有效抑制病毒的复制，在生产应用方面前景广阔。

猪α干扰素基因全长570bp，编码189个氨基酸，其中前23个氨基酸构成信号肽，剩余166个氨基酸构成其成熟蛋白。许多学者对猪干扰素α进行研究，许多的干扰素基因被克隆并在不同的表达系统中进行表达。对于哺乳动物细胞表达系统，其表达的干扰素能够正确的发挥其生物活性，但细胞转染效率低及筛选稳定表达的细胞系难度大等是其常见的难题，而且其蛋白产量低、成本高、耗时长等制约其大规模推广应用；迄今为止，许多学者表达猪α干扰素均采取原核表达系统，其遗传背景清楚、成本低及表达量高等优点被广泛应用。陈涛（2002）、谢海艳（2004）、曹瑞兵（2004）、曾翠萍（2008）、及陈雪梅（2009）等将猪α干扰素克隆到原核表达载体上，利用TPTG诱导表达猪α干扰素，蛋白均以包涵体的形式存在。包涵体蛋白没有生物活性，容易造成蛋白的错误折叠，需要通过强变性溶剂溶解及复性处理才能获得有活性的蛋白，而且会造成蛋白的大量损失；在原核表达系统中也有学者获得了可溶性的猪α干扰素：夏俊保（2009）、蔡家利（2013）等，然而运用诱导剂诱导的生产方法，成本高，易污染，无法大范围推广，因此基因工程方法表达猪α干扰素成为研究热点，对猪α干扰素的临床应用有重要意义。

发明内容

为提高猪干扰素α的生物活性，本发明提出一种猪干扰素α突变体YNS及其制备方法和应用，通过将天然猪α干扰素的第58位组氨酸H、59位谷氨酸E及61位亮氨酸L分别突变为酪氨酸Y、天冬氨酸N及丝氨酸S，克隆到pET-32a载体上，诱导表达后蛋白以包涵体形式存在，生物活性明显提高。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种猪干扰素α的突变体，所述突变体与天然猪干扰素α蛋白相比氨基酸突变位点为H₅₈→Y₅₈、E₅₉→N₅₈及L₆₁→S₅₈。

所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码猪干扰素α突变体YNS的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

含有所述的基因的重组表达载体。

所述的猪干扰素α突变体YNS的制备方法，步骤如下：

（1）设计突变体基因的引物组，扩增目的基因；

（2）构建目的基因的重组表达载体；

（3）重组表达载体的诱导表达及突变体蛋白的纯化收集。

所述步骤（1）中引物组包括F-1、R-1、W-1和W-2，其中F-1序列如SEQ ID NO.3所示、R-1序列如SEQ ID NO.4所示、W-1序列如SEQ ID NO.5所示、W-2序列如SEQ ID NO.6所示。

所述步骤（1）中目的基因为中编码猪干扰素α突变体YNS的基因。

所述步骤（1）中突变体蛋白以包涵体的形式存在；所述包涵体的纯化步骤为：将经过诱导表达的重组表达载体菌液通过超声波裂解后，离心沉淀并用无菌的PBS洗两遍，所得沉淀用4M尿素除去杂蛋白，然后再用8M尿素溶解去杂蛋白的沉淀得蛋白溶液，将蛋白溶液装入透析袋，依次分别用6M、5M、4M、3M、2M、1M的尿素溶液透析，每个阶段6h，最后用无菌的PH=7.2的PBS透析24 h，得包涵体。

所述4M尿素除去杂蛋白的操作为：用4M尿素溶液溶解蛋白后，在4℃、12000 rpm条件下离心10min，重复3-5次。

所述的猪干扰素α突变体YNS作为制备预防猪病毒性疾病的疫苗的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、与现有的方法相比，本申请也采用原核表达策略，但并没有进行后期的加工和修饰，因此表达量比较高，所得的突变体产量高，由于表达的蛋白大多是包涵体，需要复杂的复性过程，但本发明没有采取常规的镍柱纯化，发明人采用尿素除杂，然后运用不同浓度的尿素处理蛋白，然后透析到PBS溶液，使包涵体蛋白能够充分的复性，得到的蛋白有很好的生物活性。

2、本发明利用基因工程方法，将天然猪α干扰素基因进行改造，改造的氨基酸位点为H₅₈→Y、E₅₉→N及L₆₁→S，将改造后的基因克隆到pET-32a载体上构建重组质粒；运用生物信息学软件分析猪α干扰素基因的密码子偏嗜性，将鉴定正确的重组质粒克隆到Rosetta表达菌中诱导表达和鉴定，重组蛋白以包涵体形式表达，蛋白分子质量约32KDa，经纯化和透析处理后，获得纯度较高的猪α干扰素，运用MTT法检测纯化后的蛋白对Vero细胞的毒性；用细胞病变（CPE）抑制法在Vero/VSV系统上测定抗病毒活性；结果表明试验所得的YNS突变体蛋白的CC50为549.5ug/mL，其抗病毒活性为4.29×10⁶U/mg，其生物活性为2.833×106U/mg，相比野生型干扰素蛋白活性得到了提高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为猪α干扰素基因PCR扩增结果；M: DL 2000 DNA Marker；1: P1; 2: P2; 3:猪α干扰素；N:阴性对照。

图2为重组质粒pET-32a--IFN-α的双酶切鉴定；M: DL 5000 DNA Marker；1:pET-32a--IFN-α双酶切产物; 2: pET-32a 双酶切产物; 3: 猪α干扰素。

图3为重组蛋白的SDS-PAGE鉴定；M: 蛋白Marker；1: Rosetta；2: pET-32a空载体诱导；3: 重组质粒pET-32a--IFN-α诱导。

图4为处理重组蛋白；M: 蛋白Marker；1: 沉淀；2-7:不同尿素处理沉淀和上清。

图5为蛋白预测图；其中A为野生型蛋白结构预测、B为YNS突变体蛋白结构预测。

图6为重组蛋白的Westernblot鉴定图。

图7为蛋白的细胞毒性和生物活性检测图。

图8为蛋白抑制VSV复制的活性图，其中A为100ng/mL蛋白处理组，B为1ng/mL蛋白处理组。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请实施例所需要的材料为：

大肠杆菌DH5α和Rosetta(DE3)购自博迈德公司；重组质粒pMD18T-IFN-α、原核表达载体pET-32a(实验室保存)。

主要试剂：高保真酶、DNA Marker、5×SDS-PAGE Loading Buffer、蛋白酶抑制剂（PMSF）、His标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）、PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒抽提纯化试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自上海生工公司；限制性内切酶BamHI和Xho I、T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司；预染蛋白Marker、蛋白质Marker购自Solarbio公司；NC膜购自BIOSHARP公司；DAB显色试剂盒、凝胶配制试剂盒购自武汉博士德生物公司；HIS单抗及羊抗兔IgG（HRP标记）购自上海优宁维生物公司；其他试剂均为国产分析纯。

实施例1

1、目的基因的获取

设计引物：根据GenBank数据库里收录的猪α干扰素成熟核苷酸基因序列（登录号：AB369102.1），利用生物信息学软件分析目的基因的密码子，利用Primmer5.0软件设计两对引物扩增猪α干扰素，F-1和R-1扩增完整的猪α干扰素，W-1和W-2反向互补且包含突变位点.引物由郑州尚亚生物工程有限公司合成；其中F-1序列如SEQ ID NO.3所示、R-1序列如SEQID NO.4所示、W-1序列如SEQ ID NO.5所示、W-2序列如SEQ ID NO.6所示。

目的基因PCR扩增和纯化：以重组质粒pMD18T-IFN-α为模板，利用F-1, W-1和W-2,R-1这两对引物对其进行PCR扩增，扩增目的片段命名为P1,P2。反应总体积为25μL。反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，扩增35个循环，72℃延伸10min，4℃降温10min。反应结束后，取5μL PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。分别对上面两对引物扩增的目的片段进行纯化，然后以F-1,R-1为引物，以P1,P2为模板进行扩增，反应程序如上。反应结束后，取5μL PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR反应体系如下：

参照PCR纯化试剂盒纯化扩增的猪α干扰素目的基因。

目的基因和载体的双酶切：

双酶切反应体系如下：

按照上述反应体系，混匀后37℃水浴3 h。酶切反应结束后，产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，运用胶回收试剂盒回收纯化。

2、重组载体的构建与鉴定

目的基因片段与载体的连接：将上述基因片段和pET-32a双酶切胶回收产物用T4连接酶连接，构建重组表达质粒pET-32a-IFN-α，在连接槽16 ℃连接过夜，连接体系如下：

重组质粒的转化：

① 从-80℃冰箱取100μL感受态细胞DH5α于冰盒中融化。

② 将10μL连接产物加入DH5α中，轻轻吹打混匀后冰浴30min。

③ 42℃水浴热激90s，再迅速冰浴15min。

④ 无菌加入900μL无抗性LB液体培养基，37℃摇床中振荡培养1h。

⑤ 8000rpm离心5min，弃掉900μL上清，剩余约100μL重悬菌体沉淀。

⑥ 向含50μg/mL Kana+的LB固体培养基平板上加入50μL重悬液，三角棒将其涂布均匀。

⑦ 将平板放在37℃培养箱中，正放30min再倒置培养14-16h。

重组质粒的筛选和提取：从长满菌落的平板上挑取4-5个单个菌落接种于10 mL含50μg/mL氨苄⁺的LB液体培养基中，在空气摇床中37 ℃振摇12-14 h，分别用F-1, R-1和T7，T7ter两对引物对菌液进行菌液PCR初步筛选后，选取阳性菌液参照小提质粒试剂盒说明书提取重组质粒。

重组质粒的双酶切鉴定及测序：

双酶切体系如下：

按照上述反应体系，混匀后37 ℃水浴3 h。酶切反应结束后，产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。将菌液PCR和双酶切鉴定均为阳性的重组质粒送郑州尚亚公司测序并比对分析测序结果。

将重组质粒转化到表达菌中：将空载体pET-32a和测序正确的重组阳性质粒转化到Rosetta（DE3）中，并挑取鉴定阳性质粒。

3、重组质粒的诱导表达、WB及可溶性鉴定：

重组质粒的诱导表达：将空载体pET-32a和测序正确的重组阳性质粒菌液100μL（1:100）经菌液PCR鉴定正确的新鲜菌液加入10mL含50μg/mL Kana⁺的LB培养基中，并在37℃空气摇床中180rpm振荡培养，在菌液培养中不间断检测菌液的OD值，当OD₆₀₀为0.6-0.8时，分别取出1mL菌液作为阴性对照，剩下的菌液加入终浓度为0.5mM的IPTG，在25℃过夜诱导。取1mL诱导后的菌液，8000rpm离心5min, 弃去上清液，加入1mL细菌裂解液重悬，离心弃上清，40μL无菌PBS重悬菌体，加入10μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min, 冷却后取10μL样品上样，运用SDS-PAGE电泳检测阳性菌液是否表达猪α干扰素。

表达产物的免疫印迹（westen-blotting）：SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至NC膜上，用5%的脱脂奶封闭，以HIS单抗（1：5000）作为一抗孵育，再用HRP标记的羊抗兔二抗（1：4000）孵育，最后用DAB试剂盒显色。

蛋白的可溶性鉴定：取诱导表达后菌液，离心，用PBS重悬，再次离心，加入适量的溶菌酶（50mg/mL）、PMSF、吐温100，4℃放置半小时，超声波破碎，离心后取上清40μL，沉淀用等体积PBS溶解，分别加入10μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min, 冷却后取10μL样品上样，运用SDS-PAGE电泳检测，用考马斯亮蓝染色40min，脱色液过夜脱色后观察。

4、蛋白的纯化收集

菌液通过超声波裂解后，离心沉淀用高压过的PBS洗两遍，沉淀用4M尿素除去杂蛋白，每次10min，4℃离心除杂3-5次；用适量的8M尿素溶解沉淀，将蛋白溶液装入透析袋，分别用6M-1M的尿素溶液依次透析，每个阶段6h，最后用高压过的PBS（PH=7.2）透析24 h。将透析好的蛋白溶液用蔗糖进行浓缩，分装放入-40℃保存。

用不同的尿素筛选合适的除杂蛋白的尿素浓度结果见图4。

破碎前处理：富集诱导好的菌液，4℃ 8000rpm离心15min，PBS重悬菌体（1：10比

例），分别加入终浓度为1mg/mL的溶菌酶，1mM的蛋白酶抑制剂，1%（V/V）的Triton X-100，充分混匀后，于4℃冰箱内放置30min。

破碎菌体：在冰浴的环境中，超声破碎菌体。工作2s，休息9s，共15min。每3min摇晃一下菌液以防菌体下沉影响破碎效率，破碎两组共30min。

变性与复性：变性用8M尿素溶液，复性用低于4M尿素溶液和PBS（PH=7.2）。

5、 重组蛋白的活性测定

VSV的半数细胞感染量(TCID50)测定：将Vero细胞接种到96孔板中，待其在96孔培养板上长成单层后，倾去营养液，每孔加入用细胞维持液10倍倍比稀释的VSV病毒0.1mL，每1稀释度加6孔。将细胞培养板置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中继续培养72h后，测定VSV在Vero细胞上的TCID₅₀，按Reed—Muench法计算TCID₅₀。

细胞毒性实验：将Vero细胞接种到96孔板中，待其在96孔培养板上长成单层后，倾去营养液，每孔加入用细胞维持液2倍倍比稀释的猪α干扰素0.1mL，每稀释度加6孔。将细胞培养板置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中继续培养5h后，弃去混合液，每孔加入10ul MTT溶液，继续培养1-4h。吸去孔内培养液。每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

抗病毒活性的测定：将Vero细胞接种到96孔板中，待其在96孔培养板上长成单层后，倾去营养液，每孔加入用细胞维持液2倍系列稀释的干扰素0.1 mL，每稀释度加6孔。将细胞培养板置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中继续培养5h后，倾去干扰素液，用维持液洗1次，然后每孔按100 TCID50/0.1 mL加入VSV。同时，设不加干扰素的对照和不加病毒的对照。继续培养至不加干扰素对照孔有75％细胞出现病变时，在倒置显微镜下观察并记录结果。将抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素单位。

蛋白抑制VSV病毒复制的活性：将Vero细胞接种到6孔板中，待其长成单层后，倾去营养液，每孔加入用细胞维持液稀释的干扰素0.1 mL，干扰素浓度设置为100ng/mL和1ng/mL。将细胞培养板置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中继续培养24h后，倾去干扰素液，用维持液洗1次，然后每孔按100 TCID₅₀/0.1 mL加入VSV。同时，设病毒的对照。继续培养至不加干扰素的对照孔有75％细胞出现病变时，分别收取上清检测病毒的TCID₅₀。

结果与分析

基因的PCR扩增：以本实验保存的测序正确的重组质粒pMD18-T-IFN-α为模板，以上述三对引物PCR扩增猪α干扰素，经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果与预期结果一致，如图1所示，扩增出大小约501bp的目的基因片段。

双酶切鉴定：参照（重组质粒的筛选和提取方法）筛选并提取的重组质粒pET-32a-IFN-α进行双酶切鉴定，如图2所示，切出预期的两条带，说明目的基因和空载体已成功连接。

重组质粒的序列分析：将鉴定正确的重组质粒送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序，用DNAStar软件将测序结果与参考序列(GenBank登录号：AB369102.1)进行比对分析，结合pET-32a质粒图谱分析，证明重组质粒构建正确。预测其编码的蛋白氨基酸序列与预期氨基酸序列完全一致。运用生物系信息学软件分析其三级结构和氨基酸的构象变化见图5：红色、黄色、紫色标注的氨基酸分别对应蛋白58位、59位、61位氨基酸，我们可以看到氨基酸的突变导致蛋白局部构向发生改变，可能对蛋白活性产生影响。

重组蛋白的诱导表达：将空载体pET-32a和测序正确的重组质粒pET-32a--IFN-α分别转入Rosetta(DE3)进行诱导表达，诱导后的菌液经处理后进行SDS-PAGE电泳，结果如图3所示，经IPTG诱导后的重组质粒在Rosetta(DE3)中表达，蛋白分子量与DNAStar软件预测的蛋白大小一致，约33kDa.

Westernblot鉴定重组蛋白反应原性：经SDS-PAGE电泳的SDS-PAGE胶不经过考马斯亮蓝染色，直接半干转到NC膜上，经过HIS单抗和羊抗兔IgG(HRP标记)先后孵育，DAB显色，结果如图6显示，IPTG诱导的重组质粒在预期位置上出现一条与目的蛋白大小相同的棕色条带，而IPTG诱导的pET-32a空载体没有条带出现，证明重组蛋白在Rosetta中正确表达，且表达蛋白具有良好的反应原性。

蛋白细胞毒性和生物活性检测：采用Vero/VSV系统检测蛋白的细胞毒性和活性，用两倍倍比稀释的YNS（1.2mg/mL）处理Vero细胞24h后，用MTT法检测其抑制Vero细胞增值的能力；其中所用VSV病毒的TCID₅₀为10^-7/0.1mL，结果如图7所示，显示野生猪干扰素蛋白的CC₅₀为177.8ug/mL，猪干扰素YNS突变体蛋白的CC₅₀为549.5ug/mL，；野生猪干扰素蛋白活性为3.22×10⁶U/mg，YNS突变体蛋白活性为4.29×10⁶U/mg；表明突变体的生物活性优于野生型干扰素。

蛋白抑制VSV复制的活性：分别用100ng/mL和1ng/mL的蛋白处理Vero细胞24h，然后再用VSV感染细胞，通过滴定感染VSV的Vero的细胞培养液测定蛋白抑制VSV复制的活性。结果表明，用野生型蛋白（100ng/mL）预处理后再感染VSV的Vero细胞上清液中VSV的滴度比YNS突变体蛋白（100ng/mL）预处理组高约2个滴度，用参照序列蛋白（1ng/mL）预处理后再感染VSV的Vero细胞上清液中VSV的滴度比YNS突变体蛋白（1ng/mL）预处理组高约1个滴度；如图8所示。

讨论

目前，虽然许多疫苗和抗病毒药物不断涌现，但是随着病毒基因不断变异，病毒的耐药性也不断增强，使许多疫苗和药物发挥的作用不断消弱；干扰素的广谱抗病毒性使其发挥的作用不容忽视，而且它还可以激发宿主细胞中的抗病毒蛋白表达，这些都使其在宿主抗病毒防御过程中举足轻重。许多学者对猪干扰素α进行研究，许多的干扰素基因被克隆并在不同的表达系统中进行表达。对于哺乳动物细胞表达系统，其表达的干扰素能够正确的发挥其生物活性，但细胞转染效率低及筛选稳定表达的细胞系难度大等是其常见的难题，而且其蛋白产量低、成本高、耗时长等制约其大规模推广应用；本发明采取原核表达策略，虽然其表达的蛋白缺乏后期的加工和修饰，但其表达量高，成本低；而且其表达的蛋白大多是包涵体，需要复杂的复性过程，但本发明没有采取常规的镍柱纯化，笔者采用尿素除杂，然后运用合适的尿素处理蛋白，进而透析到PBS溶液，使包涵体蛋白能够充分的复性，等到的蛋白有很好的生物活性。本申请将猪干扰素α的H58、E59、L61 突变成Y58、N59、S61，并进行表达，经过验证其生物活性为2.833×10⁶U/mg，活性得到了提高，为下一步研究奠定基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 安阳工学院

<120> 一种猪干扰素α突变体YNS及其制备方法和应用

<160> 6

<210> 1

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(501)

<400> 1

tgtgacctgc ctcagaccca cagcctggct cacaccaggg ccctgaggct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctctccctt ctcctgcctg gaccacagaa gggactttgg atcccctcat 120

gaggcttttg ggggcaacca ggtccagaag gctcaagcca tggctctggt gtacaacatg 180

agccagcaga ccttccagct cttcagcaca gagggctcgg ctgctgcctg gaatgagagc 240

ctcctgcacc agttctgcac tggactggat cagcagctca gggacctgga agcctgtgtc 300

atgcaggagg cggggctgga agggaccccc ctgctggagg aggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccacagact caccctctat ctgcaagaga agagctacag cccctgtgcc 420

tgggagatcg tcagggcaga agtcatgaga tccttctctt cctccacaaa cctgcaagac 480

agactcagga agaaggagtg a 501

<210> 2

<211> 166

<212> PRT

<213> 猪（Sus）

<220>

<221> MUTAGEN

<222> 58、59、61

<400> 2

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His

20 25 30

Arg Arg Asp Phe Gly Ser Pro His Glu Ala Phe Gly Gly Asn Gln Val

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val Tyr Asn Met Ser Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asn Glu Ser

65 70 75 80

Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu

100 105 110

Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val

130 135 140

Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Gln Asp

145 150 155 160

Arg Leu Arg Lys Lys Glu

166

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（26）

<400> 3

cgcggatcct gcgacctgcc tcagac 26

<210> 4

<211>27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（27）

<400> 4

ccgctcgagt cactccttct tcctgag 27

<210> 5

<211>27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（25）

<400> 5

ctgctggctc atgttgtaca ccaga 25

<210> 6

<211>27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（25）

<400> 6

tctggtgtac aacatgagcc agcag 25

Claims (10)

1.一种猪干扰素α突变体YNS，其特征在于：所述突变体与天然猪干扰素α蛋白相比氨基酸突变位点为H₅₈→Y₅₈、E₅₉→N₅₈及L₆₁→S₅₈。

2.根据权利要求1所述的猪干扰素α突变体YNS，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.编码猪干扰素α突变体YNS的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

4.含有权利要求3所述的基因的重组表达载体。

5.权利要求1或2所述的猪干扰素α突变体YNS的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）设计突变体基因的引物组，扩增目的基因；

（2）构建目的基因的重组表达载体；

（3）重组表达载体的诱导表达及突变体蛋白的纯化收集。

6.根据权利要求5所述的猪干扰素α突变体YNS的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中引物组包括F-1、R-1、W-1和W-2，其中F-1序列如SEQ ID NO.3所示、R-1序列如SEQ IDNO.4所示、W-1序列如SEQ ID NO.5所示、W-2序列如SEQ ID NO.6所示。

7.根据权利要求5所述的猪干扰素α突变体YNS的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中目的基因为权利要求2中编码猪干扰素α突变体YNS的基因。

8.根据权利要求5所述的猪干扰素α突变体YNS的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中突变体蛋白以包涵体的形式存在；所述包涵体的纯化步骤为：将经过诱导表达的重组表达载体菌液通过超声波裂解后，离心沉淀并用无菌的PBS洗两遍，所得沉淀用4M尿素除去杂蛋白，然后再用8M尿素溶解去杂蛋白的沉淀得蛋白溶液，将蛋白溶液装入透析袋，依次分别用6M、5M、4M、3M、2M、1M的尿素溶液透析，每个阶段6h，最后用无菌的PH=7.2的PBS透析24 h，得包涵体。

9.根据权利要求8所述的猪干扰素α突变体YNS的制备方法，其特征在于，所述4M尿素除去杂蛋白的操作为：用4M尿素溶液溶解蛋白后，在4℃、12000 rpm条件下离心10min，重复3-5次。

10.权利要求1所述的猪干扰素α突变体YNS作为制备预防猪病毒性疾病的疫苗的应用。