CN101450961A - 人工合成的猪干扰素基因及制备猪干扰素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人工合成的猪干扰素基因、含该基因的载体和宿主细胞及制备猪干扰素的方法；人工合成的猪干扰素基因具有图1所示SEQ ID NO.1核苷酸序列；其制备为：先合成人工合成的猪α－IFN基因、含该基因的载体和宿主细胞；之后重组毕赤酵母发酵生产猪干扰素；再纯化所得猪α干扰素；表达系统具有高表达、高稳定、高分泌的特点；该宿主菌毕赤酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大，有利于下游的分离纯化操作，是一种适宜表达外源基因的真核表达系统，并且有利于大规模批量生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种人工合成的猪干扰素基因、含该基因的载体和宿主细胞及制备猪干扰素的方法。
背景技术
干扰素是由多种细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白。目前猪干扰素的批量生产主要有细胞诱导培养法和以大肠杆菌为表达系统的基因重组法。前一种方法以动物细胞为原料，生产工艺复杂、生产成本高，产品有携带外源病毒和其他病原微生物的危险。后一种方法虽较前一种先进，生产成本大大降低，但其工艺还是相对较复杂，基因工程阳性大肠杆菌的表达产物是以包涵体的形式存在，需要进行菌体的裂解、包涵体的复性等工艺，且复性率低，因而比活性也较低。另外，其产品纯度不高，含有其他杂蛋白，分离纯化较复杂，要用价格昂贵的单抗柱。
发明内容
本发明的目的是提供一种人工合成的猪干扰素基因；
本发明的另一目的是提供一种含上述人工合成的猪干扰素基因的DNA重组载体和宿主细胞；
本发明的再一目的是提供一种制备猪干扰素的方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的人工合成的猪干扰素基因，具有图1所示的SEQ ID NO.1核苷酸序列：
1 atg gcc cca acc tca gcc ttc ctc acg gcc
31 ctg gtg cta ctc agc tgc aat gcc atc tgc
61 tct ctg ggc tgt gac ctg cct cag acc cac
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本发明提供的含上述人工合成的猪干扰素基因的DNA重组载体，其为包含图1所示的SEQ ID NO.1核苷酸序列的重组载体。所述的重组载体为甲醇调节型重组载体。所述的重组载体为表达载体pPICz-IFN。
本发明提供的宿主细胞，其为包含图1所示的SEQ ID NO.1核苷酸序列基因的宿主细胞，或者为包含图1所示的SEQ ID NO.1核苷酸序列重组载体的宿主细胞。所述的宿主细胞为真核生物细胞或原核生物细胞。所述宿主细胞为甲醇营养型酵母细胞。所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。所述宿主细胞为毕赤酵母细胞Pichia Pastoris GS115。
本发明提供的制备猪干扰素的方法，其特征在于，通过发酵制备猪干扰素，其具体步骤如下：
(一)猪干扰素工程酵母菌种的构建
人工合成的猪α-IFN基因的合成
A)根据毕赤酵母菌对氨基酸密码子的喜好不同和密码子具有的兼并性，及根据密码偏爱统计表，将天然猪α干扰素核苷酸序列基因中第67、128、131氨基酸的三联体密码子的第三个碱基进行点突变，即将ggg突变为ggt；第127氨基酸的第三个碱基进行点突变，即将gcg变为gct；第141氨基酸密码子进行点突变，即将cgg变为aga；得到不改变天然猪α干扰素蛋白质的氨基酸序列，又为甲醇酵母所喜欢的密码子，在甲醇酵母中具有高表达效率的人工合成的猪α干扰素基因，即为人工合成的猪α-IFN基因；并将该人工合成的猪α-IFN基因克隆至质粒pUC18-ifn；该人工合成的猪α-IFN基因的氨基酸顺序为图1所示的SEQ ID NO.1核苷酸序列：
SEQ ID NO.1核苷酸序列为：
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以该人工合成的猪α-IFN基因为模板，针对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)委托上海生工公司合成优化设计的序列引物，再进行PCR扩增；
所述优化设计的序列引物为：
上游引物：5`-atggccccaacctcagcct-3`引入EcoRI位点；
下游引物：5`-ctccttcttcctgagtctg-3’引入XbaI位点；
所述PCR扩增条件为：95℃热变性，5分钟后，按94℃变性50秒，56℃退火50秒，72℃延伸50秒，进行30个循环，最后1个循环后于72℃保温20分钟。用设计合成的特异性引物进行PCR扩增，扩增得到500bp左右的DNA片段；
B)表达载体pPICz-ifn的构建
将含有人工合成的猪α-IFN基因的克隆质粒pUC18-ifn和pPICz用EcoRI和AvrII双酶切，并用1％琼脂糖胶电泳分别回收含IFN基因的片段和pPICz，然后将IFN基因片段与pPICz连接，得到表达载体pPICz-ifn；
C)毕赤酵母的电转化
以来源于TaKaRa公司限制性内切酶将重组质粒pPICz-IFN线性化后，与毕赤酵母GS115感受态混合，用BioRad Gene Pulser电转仪电击转化，转化参数为1.8kV、25uF、200Ω；电击后，立即加入1mL冰浴山梨醇，经温育，将转化菌液涂布于含抗生素ZeocinTM 100ml/L的YPDS平板上，28-30℃孵育2-3天，待平板上的单菌落长出后，将其分别依次点种在含抗生素ZeocinTM 500、1000、1500、2000mg/L的YPDS平板上，28-30℃孵育2-3天，然后将ZeocinTM 2000mg/L/r YPDS平板上的单菌落再分别依次点种在ZeocinTM 2500、3000mg/L的YPDS平板上，28-30℃孵育2-3天，得重组酵母菌株；该重组酵母菌株抵抗ZeocinTM的能力与其整合质粒拷贝数成正比，因此，作ZeocinTM 100-3000mg/L范围的不同质量浓度的琼脂平板可筛选到多拷贝的重组毕赤酵母电转化菌株GS115；
D)毕赤酵母电转化菌株的阳性鉴定
提取重组毕赤酵母电转化菌株GS115的基因DNA，同时提取转化空载体pPICz的GS115的基因组DNA作对照；以人工合成的猪α-IFN基因组为模板，用上述优化设计的上游引物和下游引物进行PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，证明所得毕赤酵母电转化菌株为阳性；
E)重组毕赤酵母电转化菌株GS115的诱导表达
用灭菌牙签挑取重组毕赤酵母电转化菌株GS115的单克隆菌株，接种于100ml
YPD培养基中培育到OD600值达到6.0，离心收菌；用表达培养基BMGY重悬沉淀，在28-30℃震荡培养过夜，离心收集菌体；在超净工作台中重新加入少量BMMY，并将离心盖换成4层无菌纱布；于28-30℃、30％溶氧、300-800rpm震荡培养24小时后每日补加纯甲醇至终浓度为1％(v/v)进行诱导，继续培养4天；离心收集上清液；用SDS-PAGE电泳法检测上清液中的干扰素；电泳后将产物转移到硝酸纤维素膜上，进行WB鉴定：一抗为兔抗人α干扰素抗体，二抗为羊抗兔IgG-AP抗体；
(二)重组毕赤酵母发酵生产猪干扰素
菌种：Pichia pastoris GS115(pPICz-ifn)；
发酵罐、电泳仪、分光光度仪；
培养基：YPD、富营养培养基、贫营养培养基、1％(W/V)甲醇贫营养培养基；
培养发酵：
先将保存菌株(Pichia pastoris GS115(pPICz-ifn)划线接种于YPD平板培养基上，28-30℃恒温培养24-32h；再从YPD平板培养基上挑出单菌落，接入250ml三角瓶装的30mlBMGY培养基中，于2，m00-300rpm，28-30℃振荡培养24h，作为摇瓶种子；摇瓶种子再以10％(V/V)接入10L发酵罐的BMGY培养基中，200-300rpm，28-30℃进行搅拌培养24h；然后，每日补加甲醇于培养基中至终浓度为1％(v/v)，用10％(v/v)NH4OH和10％(v/v)H3PO4调pH至5.5，DO>30％，连续培养4d；离心，收集含猪α干扰素的上清液；
(三)猪干扰素的纯化：
用HAc调所得猪α干扰素上清液的pH值，先用CM-shepharos层析柱纯化，收集目标蛋白洗脱液，用tris-cL缓冲液透析；然后用DEAE-shepharos层析柱纯化，收集目标蛋白洗脱液，用PB缓冲液透析，得到纯α猪干扰素。
本发明提供了猪α干扰素在毕赤酵母菌中高效表达、发酵及纯化的新技术方法，从而克服现有技术的不足；甲醇营养型酵母表达系统具有高表达、高稳定、高分泌的特点；该宿主菌毕赤酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大。这就有利于下游的分离纯化操作，是一种适宜表达外源基因的真核表达系统，有利于大规模批量生产。
附图说明
图1为本发明人工合成的猪α干扰素(猪α-IFN基因)基因序列。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明，而并不旨在以任何方式限制本发明。
实施例1
1、猪干扰素工程酵母菌种的构建
1)材料和方法
毕赤酵母菌Pichia pastoris GS115，pPICz表达质粒，均构自美国Invitrogen公司。TaqDNA聚合酶、限制性内切酶EcoRI、XhoI、XbaII、AvrII、Bg1II、SmaI、T1DNA连接酶，均购自TaKaRa公司。BMGY、BMMY、YPG培养基，见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。质粒抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒购自Promega。一抗为兔抗人α干扰素抗体，二抗为羊抗兔IgG-AP抗体，均为自制；
2)人工合成的猪α-IFN基因的合成
A)根据毕赤酵母菌对氨基酸密码子的喜好不同和密码子具有的兼并性，及根据密码偏爱统计表，将天然猪α干扰素核苷酸序列基因中第67、128、131氨基酸的三联体密码子的第三个碱基进行点突变(即将ggg突变为ggt)，将第127氨基酸的第三个碱基进行点突变(gcg变为gct)，将141氨基酸的密码子进行突变(cgg变为aga)，得到不改变天然猪α干扰素蛋白质的氨基酸序列，又为甲醇酵母所喜欢的密码子，在甲醇酵母中具有高表达效率的人工合成的猪α干扰素基因(也称：人工合成的猪α-IFN基因)；并将该人工合成的猪α-IFN基因克隆至质粒pUC18-ifn；该人工合成的猪α-IFN基因的氨基酸顺序为图1所示的SEQ ID NO.1的核苷酸序列：
SEQ ID NO.1的核苷酸序列为：
1 atg gcc cca acc tca gcc ttc ctc acg gcc
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61 tct ctg ggc tgt gac ctg cct cag acc cac
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以该人工合成的猪α-IFN基因为模板，针对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)委托上海生工公司合成优化设计的序列引物，再进行PCR扩增；
所述优化设计的序列引物为：
上游引物：5`-atggccccaacctcagcct-3`引入EcoRI位点；
下游引物：5`-ctccttcttcctgagtctg-3’引入XbaI位点；
所述PCR扩增条件为：95℃热变性，5分钟后，按94℃变性50秒，56℃退火50秒，72℃延伸50秒，进行30个循环，最后1个循环后于72℃保温20分钟。用设计合成的特异性引物进行PCR扩增，扩增得到500bp左右的DNA片段；
B)表达载体pPICz-ifn的构建
将含有人工合成的猪α-IFN基因的克隆质粒pUC18-ifn和pPICz用EcoRI和AvrII双酶切，并用1％琼脂糖胶电泳分别回收含IFN基因的片段和pPICz，然后将IFN基因片段与pPICz连接，得到表达载体pPICz-ifn；
C)毕赤酵母的电转化
以来源于TaKaRa公司限制性内切酶SacI将重组质粒pPICz-IFN线性化后，与毕赤酵母GS115感受态混合，用BioRad Gene Pulser电转仪电击转化，转化参数为1.8kV、25uF、200Ω；电击后，立即加入1mL冰浴山梨醇，经温育，将转化菌液涂布于含抗生素ZeocinTM100ml/L的YPDS平板上，28-30℃孵育2-3天，待平板上的单菌落长出后，将其分别依次点种在含抗生素ZeocinTM500、1000、1500、2000mg/L的YPDS平板上，28-30℃孵育2-3天，然后将ZeocinTM2000mg/L/r YPDS平板上的单菌落再分别依次点种在ZeocinTM 2500、3000mg/L的YPDS平板上，28-30℃孵育2-3天；该重组酵母菌株抵抗ZeocinTM的能力与其整合质粒拷贝数成正比，因此，作ZeocinTM 100-3000mg/L范围的不同质量浓度的琼脂平板筛选到多拷贝的重组毕赤酵母电转化菌株GS115；
D)毕赤酵母电转化菌株的阳性鉴定
提取重组毕赤酵母电转化菌株GS115的基因DNA，同时提取转化空载体pPICz的GS115的基因组DNA作对照；以人工合成的猪α-IFN基因组为模板，用上述优化设计的上游引物和下游引物进行PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，证明所得毕赤酵母电转化菌株为阳性；
E)重组毕赤酵母电转化菌株GS115的诱导表达
用灭菌牙签挑取重组毕赤酵母电转化菌株GS115的单克隆菌株，接种于100mlYPD培养基中培育到OD600值达到6.0，离心收菌；用表达培养基BMGY重悬沉淀，在28-30℃震荡培养过夜，离心收集菌体；在超净工作台中重新加入少量BMMY，并将离心盖换成4层无菌纱布；于28-30℃、30％溶氧、300-800rpm震荡培养24小时后每日补加纯甲醇至终浓度为1％(v/v)进行诱导，继续培养4天；离心收集上清液；用SDS-PAGE电泳法检测上清液中的干扰素：电泳后将产物转移到硝酸纤维素膜上，进行WB鉴定：一抗为兔抗人α干扰素抗体，二抗为羊抗兔IgG-AP抗体；
2、重组毕赤酵母发酵生产猪干扰素
菌种：Pichia pastoris GS115(pPICz-ifn)；
发酵罐、电泳仪、分光光度仪；
培养基：YPD、富营养培养基、贫营养培养基、1％甲醇(W/V)贫营养培养基；
培养发酵：
先将保存菌株(Pichia pastoris GS115(pPICz-ifn)划线接种于YPD平板培养基上，28-30℃恒温培养24-32h；再从YPD平板培养基上挑出单菌落，接入250ml三角瓶装的30mlBMGY培养基中，于200-300rpm，28-30℃振荡培养24h，作为摇瓶种子；摇瓶种子再以10％(V/V)接入10L发酵罐的BMGY培养基中，200-300rpm，28-30℃进行搅拌培养24h；然后，每日补加甲醇于培养基中至终浓度为1％(v/v)，用10％(v/v)NaOH和10％H3PO4(v/v)调pH至5.5，DO>30％，连续培养4d；离心，收集含猪α干扰素的上清液；
3、猪α干扰素的纯化：
用HAc调所得猪α干扰素上清液的pH值，先用CM-shepharos层析柱纯化，收集目标蛋白洗脱液，用tris-cL缓冲液透析；然后用DEAE-shepharos层析柱纯化，收集目标蛋白洗脱液，用PB缓冲液透析，得纯α猪干扰素。
所得纯α猪干扰素的检测
用以上方法法生产的三批次纯α猪干扰素，经检测结果如下：
纯度：用SDS-PAGE电泳法检测纯α猪干扰素纯度，结果均大于96％；
活性：用常规的细胞病变抑制法WISH/VSV测定该纯α猪干扰素活性大于1.03×109IU/mg；
比活性：生物学活性与蛋白质含量之比；
活性蛋白：用Lowry法，经测定其蛋白含量大于976mg/L。
序列表
<110>成都乾盛昌生物科技有限公司
<120>人工合成的猪干扰素基因及制备猪干扰素的方法
<160>1
<210>1
<211>570
<212>DNA
<213>猪
<400>1
Claims (9)
1、一种人工合成的猪干扰素基因，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列：
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2、一种重组载体，其特征在于，为包含权利要求1所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组载体。
3、如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体为甲醇调节型重组载体。
4、如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体为表达载体pPICz-IFN。
5、一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为包含权利要求1所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列基因的宿主细胞，或者为包含权利要求2所述的包含所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组载体的宿主细胞。
6、如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为真核生物细胞。
7、如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为甲醇营养型酵母细胞。
8、如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞Pichia Pastoris GS115。
9、一种制备猪干扰素的方法，其特征在于，通过发酵制备猪干扰素，其具体步骤如下：
(一)猪干扰素工程酵母菌种的构建
人工合成的猪α-IFN基因的合成
A)根据毕赤酵母菌对氨基酸密码子的喜好不同和密码子具有的兼并性，及根据密码偏爱统计表，将天然猪α干扰素核苷酸序列基因中第67、128、131氨基酸的三联体密码子的第三个碱基进行点突变，即将ggg突变为ggt；将第127氨基酸的第三个碱基进行点突变，即将gcg变为gct；将141氨基酸的密码子进行突变，即将cgg变为aga；得到不改变天然猪α干扰素蛋白质的氨基酸序列，又为甲醇酵母所喜欢的密码子，在甲醇酵母中具有高表达效率的人工合成的猪α干扰素基因，即为人工合成的猪α-IFN基因；并将该人工合成的猪α-IFN基因克隆至质粒pUC18-ifn；该人工合成的猪α-IFN基因的氨基酸顺序为图1所示的SEQ IDNO.1的核苷酸序列：
SEQ ID NO.1的核苷酸序列为：
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以该人工合成的猪α-IFN基因为模板，针对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)委托上海生工公司合成优化设计的序列引物，再进行PCR扩增；
所述优化设计的序列引物为：
上游引物：5`-atggccccaacctcagcct-3`引入EcoRI位点；
下游引物：5`-ctccttcttcctgagtctg-3’引入XbaI位点；
所述PCR扩增条件为：95℃热变性，5分钟后，按94℃变性50秒，56℃退火50秒，72℃延伸50秒，进行30个循环，最后1个循环后于72℃保温20分钟。用设计合成的特异性引物进行PCR扩增，扩增得到500bp左右的DNA片段；
B)表达载体pPICz-ifn的构建
将含有人工合成的猪α-IFN基因的克隆质粒pUC18-ifn和pPICz用EcoRI和AvrII双酶切，并用1％(v/v)琼脂糖胶电泳分别回收含IFN基因的片段和pPICz，然后将IFN基因片段与pPICz连接，得到表达载体pPICz-ifn；
C)毕赤酵母的电转化
以来源于TaKaRa公司限制性内切酶SacI将重组质粒pPICz-IFN线性化后，与毕赤酵母GS115感受态混合，用BioRad Gene Pulser电转仪电击转化，转化参数为1.8kV、25uF、200Ω；电击后，立即加入1mL冰浴山梨醇，经温育，将转化菌液涂布于含抗生素ZeocinTM 100ml/L的YPDS平板上，28-30℃孵育2-3天，待平板上的单菌落长出后，将其分别依次点种在含抗生素ZeocinTM 500、1000、1500、2000mg/L的YPDS平板上，28-30℃孵育2-3天，然后将ZeocinTM 2000mg/L/r YPDS平板上的单菌落再分别依次点种在ZeocinTM 2500、3000mg/L的YPDS平板上，28-30℃孵育2-3天，得重组酵母菌株；该重组酵母菌株抵抗ZeocinTM的能力与其整合质粒拷贝数成正比，因此，作ZeocinTM 100-3000mg/L范围内的不同质量浓度的琼脂平板筛选到多拷贝的重组毕赤酵母电转化菌株GS115；
D)毕赤酵母电转化菌株的阳性鉴定
提取重组毕赤酵母电转化菌株GS115的基因DNA，同时提取转化空载体pPICz的GS115的基因组DNA作对照；以人工合成的猪α-IFN基因组为模板，用上述优化设计的上游引物和下游引物进行PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，证明所得毕赤酵母电转化菌株为阳性；
E)重组毕赤酵母电转化菌株GS115的诱导表达
用灭菌牙签挑取重组毕赤酵母电转化菌株GS115的单克隆菌株，接种于100mlYPD培养基中培育到OD600值达到6.0，离心收菌；用表达培养基BMGY重悬沉淀，在28-30℃震荡培养过夜，离心收集菌体；在超净工作台中重新加入少量BMMY，并将离心盖换成4层无菌纱布；于28-30℃、30％溶氧、300-800rpm震荡培养24小时后每日补加纯甲醇至终浓度为1％(v/v)进行诱导，继续培养4天；离心收集上清液；用SDS-PAGE电泳法检测上清液中的干扰素；电泳后将产物转移到硝酸纤维素膜上，进行WB鉴定：一抗为兔抗人α干扰素抗体，二抗为羊抗兔IgG-AP抗体；
(二)重组毕赤酵母发酵生产猪干扰素
菌种：Pichia pastoris GS115(pPICz-ifn)；
发酵罐、电泳仪、分光光度仪；
培养基：YPD、富营养培养基、贫营养培养基、1％(W/V)甲醇贫营养培养基；
培养发酵：
先将保存菌株(Pichia pastoris GS115(pPICz-ifn)划线接种于YPD平板培养基上，28-30℃恒温培养24-32h；再从YPD平板培养基上挑出单菌落，接入250ml三角瓶装的30mlBMGY培养基中，于200-300rpm，28-30℃振荡培养24h，作为摇瓶种子；摇瓶种子再以10％(V/V)接入10L发酵罐的BMGY培养基中，200-300rpm，28-30℃进行搅拌培养24h；然后，每日补加甲醇于培养基中至终浓度为1％(v/v)，用10％(v/v)NaOH和10％(v/v)H3PO4调pH至5.5，DO>30％，连续培养4d；离心，收集含猪α干扰素的上清液；
(三)猪α干扰素的纯化：
用HAc调所得猪α干扰素上清液的pH值，先用CM-shepharos层析柱纯化，收集目标蛋白洗脱液，用tris-cL缓冲液透析；然后用DEAE-shepharos层析柱纯化，收集目标蛋白洗脱液，用PB缓冲液透析，得到纯α猪干扰素。
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