CN105907766B - 表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母及其构建方法和应用 - Google Patents

表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105907766B
CN105907766B CN201610269580.3A CN201610269580A CN105907766B CN 105907766 B CN105907766 B CN 105907766B CN 201610269580 A CN201610269580 A CN 201610269580A CN 105907766 B CN105907766 B CN 105907766B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pichia pastoris
expression
goifn
goat
alpha interferon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610269580.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105907766A (zh
Inventor
于力
王芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harbin Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN201610269580.3A priority Critical patent/CN105907766B/zh
Publication of CN105907766A publication Critical patent/CN105907766A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105907766B publication Critical patent/CN105907766B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一株表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母及其构建方法和应用。本发明首先公开了根据毕赤酵母的密码子偏嗜性进行优化的山羊α干扰素基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明进一步公开了一株表达优化的山羊α干扰素基因的重组毕赤酵母，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9088。本发明所构建的重组毕赤酵母能够稳定的表达山羊α干扰素，不仅表达量大，而且抗病毒活性高。本发明重组毕赤酵母表达的山羊α干扰素在牛源细胞和羊源细胞上均具有高度抗病毒活性，能够作为抗病毒感染的药物或疫苗佐剂使用，用于预防或治疗牛和羊等反刍动物病毒性传染病。

Description

表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及优化的山羊α干扰素基因，本发明还涉及一株稳定高效表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母及其构建方法，本发明进一步涉及该优化的山羊α干扰素基因以及重组毕赤酵母在制备预防或治疗牛羊等反刍动物病毒性传染病药物中的应用，属于表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母的构建及应用领域。
背景技术
由病毒引起的动物传染性疾病严重制约了各个国家和地区养殖业的健康发展，同时也对人类健康构成严重的威胁。中国羊产业规模巨大，是畜牧业的支柱性产业。对养羊业的最大威胁是病毒性传染病，例如羊痘、蓝舌病和羊传染性脓疱等。小反刍兽疫是养羊业的头号威胁，2007年从西藏阿里地区传入中国内地，虽然及时控制没有蔓延，然而2014年初该病从新疆传入中国内地，先后扩散到甘肃、宁夏、内蒙西部，进入4月已传入辽宁、湖南、江苏、安徽等许多省区，给中国羊产业造成巨大的经济损失。烈性病毒病的紧急应对策略是使用α干扰素，因此干扰素对于急性烈性动物病毒性传染病的防治具有极其重要的经济价值。
干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子，主要是由动物细胞在病毒等诱生剂的作用下诱导产生的。许多动物，包括人、哺乳动物、鸟类等细胞均能产生干扰素。目前已知的干扰素分为三大类：I型、II型和III型。I型干扰素主要包括人体内发现的α、β、ω、ε和κ干扰素，以及在反刍动物中发现的τ以及小鼠中发现的ζ等几个亚类，其中IFN-α至少有17个亚群。Ⅱ型干扰素只有一种γ干扰素。最近发现的λ干扰素(IFN-λ)被认为是新的一类干扰素，国际 最新分类标准里将它命名为Ⅲ型干扰素，共有3个亚群，分别为IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3。Ⅰ型干扰素是天然免疫的关键成员，是组成抗病毒感染的第一道防线。其中α干扰素在机体内发挥广谱、高效抗病毒作用的机制是抑制病毒蛋白质的合成，并能选择性地作用于受感染细胞，而对正常宿主细胞无作用或作用轻微。
巴斯德毕赤酵母表达系统是一种真核表达系统，具有发酵工艺成熟、易于扩大工业化、培养成本低廉、又具有真核表达系统可进行蛋白翻译后修饰、加工和折叠等优点，因此毕赤酵母系统是表达功能蛋白的一种理想的选择。由于该表达系统的诸多优点，人们越来越多地利用它作为外源基因的表达系统来生产目的蛋白。自l987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HbsAg)以来，国内外利用毕赤酵母已成功地表达了多种有价值的药用或疫苗用蛋白，显示其在基因工程疫苗开发中的潜力。
因此，利用毕赤酵母系统高效的表达具有高度抗病毒活性的山羊α干扰素，对于有效地预防和治疗牛羊等反刍动物病毒性传染病，将具有广泛的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供优化的山羊α干扰素基因；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供表达所述优化的山羊α干扰素基因的重组毕赤酵母；
本发明所要解决的第三个技术问题是将所述优化的山羊α干扰素基因及表达该优化的山羊α干扰素的重组毕赤酵母应用于制备预防或治疗反刍动物病毒性传染病的药物或疫苗佐剂。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了优化的山羊α干扰素基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明参考GenBank发表的山羊α干扰素(GoIFN-α)基因序列(FJ959074)，根据毕赤酵母密码子偏嗜性进行密码子优化得到了多条优化的山羊α干扰素基因；其中，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在毕赤酵母中的表达效率以及稳定性远远优于其它优化的山羊α干扰素基因。
本发明进一步公开了含有所述优化的山羊α干扰素基因的重组表达载体及含有该重组表达载体的宿主细胞。将优化的山羊α干扰素基因与表达载体进行可操作的连接，即得到表达山羊α干扰素的重组表达载体。可以采用任何转化方法将本发明所构建的重组表达载体导入到目标细胞中，得到转化体；所述的转化方法包括：电转化法、脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法等；所述的目标细胞包括原核细胞或真核细胞，例如包括但不限于：大肠杆菌细胞或毕赤酵母细胞等。
本发明进一步公开了表达所述优化的山羊α干扰素基因的重组毕赤酵母。
本发明将密码子优化的山羊α干扰素成熟蛋白编码基因插入pPIC9K载体的EcoR I和Not I位点间，获得重组载体pPIC9K-GoIFN-α，然后转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得了43个重组酵母菌阳性克隆。Dot-ELISA鉴定结果显示，阳性克隆7-18、19、20、24-28、33、35、36、38、40、42、43经诱导后均能够分泌表达GoIFN-α蛋白，而其他克隆不能分泌表达GoIFN-α蛋白。本发明进一步将上述能够分泌表达GoIFN-α蛋白的阳性克隆在相同条件下进行诱导，Dot-ELISA鉴定表明，阳性克隆18#表达GoIFN-α蛋白的量最大，上清中表达的重组蛋白浓度约为61μg/mL，而其余阳性克隆的表达量均低于50μg/mL。因此，本发明选择阳性克隆18#进行后续鉴定和优化。将克隆18#分泌表达的可溶性GoIFN-α蛋白经镍柱纯化后获得纯化的重组蛋白，测定蛋白浓度为0.2mg/mL。
本发明将表达量最高的阳性克隆18#进行连续传代，不同代次的重组菌诱导表达后取上清进行Western blot分析，结果表明从F2代到F10代 重组菌表达的GoIFN-α蛋白表达量没有明显差异，证明本发明筛选的重组毕赤酵母菌能够稳定携带GoIFN-α基因，并且稳定地表达。
本发明将稳定高效表达所述优化的山羊α干扰素基因的重组毕赤酵母阳性克隆18#(即rGS115/GoIFN-α)提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.9088；分类命名为：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年04月24日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明进一步公开了所述优化的山羊α干扰素基因及所构建的重组毕赤酵母在制备预防或治疗反刍动物病毒性传染病的药物或疫苗佐剂中的应用。将本发明所述优化的山羊α干扰素基因与表达载体进行可操作的连接并导入宿主细胞，表达重组的山羊α干扰素；或者，培养本发明所构建的重组毕赤酵母rGS115/GoIFN-α，诱导表达重组山羊α干扰素。该重组的山羊α干扰素具有高度抗病毒活性，可以用于制备预防或治疗牛羊等反刍动物的病毒性传染病药物或疫苗佐剂。本发明所述的反刍动物病毒性传染病包括但不限于：羊痘、蓝舌病或羊传染性脓疱中的任意一种或多种。
本发明采用目前国际公认的细胞病变抑制法测定毕赤酵母表达的山羊干扰素GoIFN-α的抗病毒活性，结果表明，毕赤酵母表达上清中的GoIFN-α和纯化的GoIFN-α均表现出较高的抗病毒活性，能有效地抑制VSV在细胞上产生CPE，而且在不同的细胞上表现出的活性不同。将抑制50％细胞病变(CPE)的干扰素的最高稀释度确定为1个干扰素单位，结果表明，上清中GoIFN-α的抗病毒活性为1.78～3.16×107U/mL，而纯化的GoIFN-α抗病毒活性为3.16～5.62×109U/mg。本发明还对山羊α干扰素抗口蹄疫病毒(FMDV)、牛肠道病毒(BEV)和山羊痘病毒(GPV)活性进行了测定，结果表明，上清中GoIFN-α的抗病毒活性为3.16～5.62×107U/mL，而纯化GoIFN-α的抗病毒活性为5.62×109U/mg。不同剂量干扰素 的抗病毒实验结果表明，无论何种病毒和细胞，干扰素GoIFN-α的抗病毒活性均呈现剂量依赖性：干扰素的含量越高，抗病毒活性越强，反之则越弱，这与已报道的其他干扰素的特性相一致。
α干扰素具有抑制细胞增殖的活性，但是对不同的细胞抑制效果不同。本发明使用原代胎羊皮肤细胞、MDBK和IBRS2细胞测定表达的GoIFN-α蛋白对细胞增殖的抑制活性，结果表明，在干扰素GoIFN-α作用下，三种细胞的增殖程度没有显著差异；不管细胞种类的不同，山羊α干扰素对细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，随着干扰素稀释倍数增加，对细胞的抑制作用减弱，这与报道的其他干扰素特性相一致。
重组山羊α干扰素的临床应用结果表明，本发明毕赤酵母表达的山羊α干扰素对牛羊的重要传染病口蹄疫，羊的重要传染病羊痘等均具有显著的预防和治疗效果。
本发明还公开了一种构建所述重组毕赤酵母的方法，包括以下步骤：(1)将SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列克隆至pPIC9K载体，获得重组质粒pPIC9K-GoIFN-α；(2)将重组质粒pPIC9K-GoIFN-α线性化，转化毕赤酵母感受态细胞，筛选鉴定，即得。
其中，步骤(1)克隆时删除了优化的山羊α干扰素(GoIFN-α)基因的信号肽序列(1-69bp)；另外，为了便于后期蛋白纯化，本发明在GoIFN-α基因3’末端加入6×His标签；将优化的山羊α干扰素基因用EcoR I和Not I双酶切，插入pPIC9K载体的EcoR I和Not I位点间，获得重组质粒pPIC9K-GoIFN-α；步骤(2)用限制性内切酶Sal I对重组质粒pPIC9K-GoIFN-α进行线性化。
本发明进一步公开了一种诱导所述重组毕赤酵母表达山羊α干扰素的方法，包括以下步骤：(1)培养所述重组毕赤酵母，诱导山羊α干扰素表达；(2)纯化所表达的山羊α干扰素，即得。其中，步骤(1)所述诱导的条件包括：诱导温度为22℃-30℃，诱导时间为6h-48h，菌密度OD600nm 值为0.2-1.0，甲醇浓度为0.2％-1％(v/v)；优选的，步骤(1)所述诱导的条件包括：诱导温度为22℃，诱导时间为24h，菌密度OD600nm值为0.2-1.0，甲醇浓度为0.2％-1％(v/v)。
本发明对诱导重组毕赤酵母表达山羊α干扰素的诱导条件，包括温度、时间、菌密度和甲醇浓度进行优化。不同诱导时间的诱导表达结果表明，诱导后6h即可见GoIFN-α表达，到24h后表达量达到最高峰，并且持续到48h。不同诱导温度进行诱导表达的结果表明，在22℃条件下GoIFN-α表达量相对较高，24℃-30℃条件下蛋白表达量差异不大。不同菌密度转接后可见，OD600nm值0.2-1.0均可诱导GoIFN-α表达，并且表达量差异不大，说明不同菌密度对GoIFN-α表达量的影响不大。不同甲醇浓度诱导的结果表明，甲醇浓度对GoIFN-α表达量的影响不大，0.2％-1％均可为适合浓度。综上，本发明确定重组毕赤酵母表达山羊α干扰素的最佳诱导条件为22℃诱导24h，菌密度和甲醇浓度对表达量影响不大。最佳诱导条件下，重组毕赤酵母rGS115/GoIFN-α上清中表达的重组GoIFN-α浓度约为0.1mg/mL。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明利用毕赤酵母系统表达山羊α干扰素，属于中国首次报道。毕赤酵母表达系统表达山羊α干扰素，具有表达量高、安全性好、成本低等优点。本发明构建的重组毕赤酵母表达山羊α干扰素，不仅表达量大，而且比活性高，摇瓶培养条件下表达量约为100mg/L，上清中分泌的重组GoIFN-α抗病毒活性3.16×107U/mL，而纯化的GoIFN-α抗病毒活性为5.62×109U/mg，对牛和羊的病毒性传染病具有明显的预防和治疗作用，可作为抗病毒感染药物和疫苗佐剂使用，具有广泛的应用价值。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明 所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“核苷酸”或“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。
可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。
术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。
附图说明
图1为重组质粒酶切鉴定；其中，M:DL 10000DNA Ladder；Lane 1-2:pPIC9K-GoIFN-α2个克隆EcoR I和Not I酶切；Lane 3；pPIC9K EcoR I和Not I酶切；
图2为重组酵母菌的Dot-ELISA鉴定；其中，1-18、19-28、29-43分别为三个批次不同克隆的编号，9k为空载体转化后作为阴性对照；
图3为重组酵母菌SDS-PAGE及Western blot分析；其中，(A)重组酵母菌的SDS-PAGE电泳；(B)重组酵母菌Western blot分析；(C)纯化GoIFN-α蛋白的SDS-PAGE电泳；M：蛋白Marker；Lane 1：重组酵母菌诱导前上清；Lane 2:重组酵母菌诱导后上清；Lane 3：纯化的GoIFN-α。
图4为Western blot分析重组酵母菌遗传稳定性；其中，M：蛋白Marker；Lane 1：重组酵母菌18#诱导前上清；F2、F4、F6、F8和F10：不同代次的重组酵母菌的诱导后上清；
图5为不同剂量纯化GoIFN-α的抗病毒活性；
图6为纯化GoIFN-α抑制细胞增殖的活性；
图7为重组酵母菌诱导条件优化的Western blot分析；其中，(A)不同诱导时间；(B)不同诱导温度；(C)不同菌密度(OD600)；(D)不同甲醇浓度(％)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母的构建及鉴定
1、实验方法
1.1实验材料
1.1.1载体、菌株、细胞和病毒
毕赤酵母GS115菌株、表达载体pPIC9K及抗生素G418购自Invitrogen公司；YPD、BMGY、BMMY等培养基均按照Invitrogen公司毕赤酵母表达说明书配制；山羊干扰素单克隆抗体由本发明人实验室制备。山羊痘疫苗株(GPV AV41)购自中国兽医药品监察所；口蹄疫病毒(FMDV)为本发明人实验室用反向遗传技术拯救的病毒(中国发明专利申请公布号CN101724636 A)；牛肠道病毒(BEV)(中国发明专利申请公布号CN 102776155 A)为本发明人实验室分离并保存。抗山羊干扰素鼠阳性血清由本发明人实验室制备及保存。原代胎羊皮肤细胞由本发明人实验室制备；MDBK和IBRS2细胞为本发明人实验室保存。
1.1.2主要试剂
限制性内切酶Sal I、EcoR I、Not I、PRIMSTAR DNA Polymerase，DNA Marker，T4DNA连接酶、大肠杆菌DH5α感受态细胞均购自大连宝生物工程有限公司，小量质量提取试剂盒、核酸凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。
1.1.3仪器设备
各种规格移液器及5415R、5810R高速台式低温离心机(德国Eppendorf公司)；MCO-15AC二氧化碳培养箱、MDF-U32V超低温冰箱(日本SANYO公司)；IX51倒置显微镜(OLYMPUS公司)；生物二级安全柜(美国LABCONCO公司)；DK-8D电热恒温水槽(上海精宏)；空气浴恒温摇床(KYC100B，上海福玛实验设备有限公司)；旋涡混合器(QL-901，江苏海门麒麟医用仪器厂)；GIS-2020全自动凝胶成像系统(上海天能)；YDS60/210液氮罐(新乡豫新航空低温容器)；ASTACUS小型超纯水仪(德国MEMBRAPURE公司)。
1.1.4主要溶液的配制
10×YNB：将134g YNB加入到1000mL水中，使其完全融解，过滤除菌，4℃保存。
500×B：将20mg biotin加入至100mL水中，使其完全融解，过滤除菌，4℃保存。
10×D：将200g D-葡萄糖加入到1000mL水中，使其完全融解，过滤除菌，或者高压灭菌。
10×M：将5mL甲醇和95mL水混合均匀，过滤除菌，4℃保存。
10×GY：将100mL甘油和900mL水混合均匀，过滤除菌，或者高压灭菌，室温保存。
1M potassium phosphate buffer(pH 6.0)：将132mL 1M K2HPO4和868mL 1MKH2PO4混合均匀，调整pH＝6.0±0.1(用KOH或者H3PO4)，室温保存。
YPD(1L)：将10g酵母提取物和20g酵母用蛋白胨加入到900mL水中，若是配制YPD平板，则需要加入20g琼脂，高压灭菌，加入100mL 10×D，4℃保存。
MGY(1L)：将800mL灭菌水和100mL 10×YNB、2mL 500×B、100mL 10×GY混合均匀，4℃保存。
BMGY(1L)：将10g酵母提取物和20g酵母用蛋白胨加入到700mL水中，高压灭菌，冷却至室温，加入100mL 1M PPB(pH 6.0)、100mL 10×YNB、2mL 500×B、100mL 10×GY混合均匀，4℃保存。
BMMY(1L)：将10g酵母提取物和20g酵母用蛋白胨加入到700mL水中，高压灭菌，冷却，4℃保存。
1.2实验方法
1.2.1羊α干扰素基因密码子的优化
参考GenBank发表的山羊α干扰素(GoIFN-α)基因序列(FJ959074)，根据毕赤酵母密码子偏嗜性进行密码子优化并人工合成该优化的基因，克隆时删除了信号肽序列(1-69bp)。核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
1.2.2表达载体的构建
将pPIC9K载体与合成基因GoIFN-α分别用EcoR I和Not I双酶切、胶回收，凝胶回收操作按试剂盒说明书进行。将载体与外源片段以摩尔比1:3的比例混合，用T4DNA连接酶于16℃连接2-3h，然后转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，经EcoR I和Not I双酶切及PCR鉴定，测序验证后，获得阳性重组质粒pPIC9K-GoIFN-α。
1.2.3酵母细胞的电转化
用限制性内切酶Sal I对制备的重组表达质粒进行线性化，酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀回收后，与毕赤酵母GS115感受态细胞混合，用BIO-RAD(Serial NO.411BR 3336)电转仪进行电转化(2.0kV、25μF、200Ω)，然后立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，温浴后将内容物分别 涂布于含0.25mg/mL、0.50mg/mL、0.75mg/mL、1mg/mLG418抗性的YPD平板，30℃培养3-7d。
1.2.4重组酵母菌的诱导表达
挑取单克隆重组酵母菌落接种于5mL BMGY培养基中，30℃250rpm培养至OD600为2-6时，取1mL菌液经2500rpm离心5min收集菌体，转接至5mL BMMY培养基继续培养3d，每隔24h取样并同时加入0.5％的甲醇。
1.2.5重组蛋白的Dot-ELISA检测
取诱导后的酵母培养液上清10μl，滴在NC膜上，待膜干燥后，用5％脱脂乳室温封闭1h，加入GoIFN-α单克隆抗体(1:2500×)，室温孵育1h，PBST洗3次，5min/次，加入的HRP标记的兔抗鼠IgG(1:5000×)，室温孵育1h，PBST洗3次，5min/次，最后用二氨基联苯胺(DAB)显色。
1.2.6重组蛋白的Western blot鉴定
挑选Dot-ELISA初筛的阳性克隆进行Western blot鉴定。取酵母表达上清进行SDS-PAGE后，转至硝酸纤维素膜(NC)上，用5％脱脂乳封闭，加入GoIFN-α单克隆抗体(1:2500×)，于37℃孵育1h，PBS洗3次，5min/次，加入的HRP标记的兔抗鼠IgG(1:5000×)，室温孵育1h，PBS洗3次，5min/次，最后用二氨基联苯胺(DAB)显色。
1.2.7重组蛋白的纯化及浓度测定
为了便于后期蛋白纯化，本发明设计在GoIFN-α基因3’末端加入6×His标签。将诱导后的培养上清4℃12000rpm离心30min，进行镍柱纯化(Ni-NTA agarose，Qiagen)，具体步骤参见Qiagen Ni-NTA操作手册。将纯化后的GoIFN-α进行Western blot鉴定。为了准确测定蛋白浓度，采用天根BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白含量，同时将SDS-PAGE进行红外扫描，用AlphaView SA软件(Cell Biosciences,Inc.)分析目标蛋白浓 度。
1.2.8重组毕赤酵母的遗传稳定性
挑取表达量高的阳性克隆，进行连续传代。将单菌落接种YPD，30℃250rpm摇菌，待OD600nm＝1-2时，再次转接YPD进行下一代次摇菌，连续传10代。每代收取上清进行蛋白表达量鉴定。
1.2.9重组山羊α干扰素的抗病毒活性
诱导后的酵母上清与纯化的rGoIFN-α蛋白均具有抗病毒活性。分别用原代胎羊皮肤细胞、IBRS2和MDBK细胞进行测定，采用水泡性口炎病毒(VSV)微量细胞病变抑制法，具体方法如下：
在96孔板按常规方法培养细胞，待细胞长成单层后，去除生长液，用维持液清洗两遍。每孔加入连续10倍稀释的酵母上清和纯化rGoIFN-α0.lmL，每个稀释度接4孔，37℃孵育过夜。去除干扰素稀释液，用维持液清洗两遍后，加入0.lmL 100TCID50VSV病毒进行攻毒。设只用GoIFN-α处理不攻毒的对照组、正常细胞对照组和攻毒对照组，每个稀释度接4管。37℃培养24h后，在倒置显微镜下观察结果。另外，酵母上清和纯化rGoIFN-α抗其他病毒(GPV、BEV、FMDV)活性进行测定，接毒剂量为1000TCID50的GPV、BEV和FMDV，方法同上。结果判定：将抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素单位。由于羊源干扰素没有国家标准品，只能根据100TCID50VSV接毒条件下测得的干扰素效价。待对照孔细胞全部发生明显的细胞病变时，倾去维持液，用PBS洗涤，5％甲醛固定I0min，加入结晶紫染色液染色30min，PBS洗涤后，加入100ul甲醇洗脱，OD595nm读值。
原代胎羊皮肤细胞制备方法：去流产母羊的胎儿，取皮肤组织，在无菌状态下用PBS洗3遍，剪碎，胰酶消化后，吹打成单个细胞接到细胞瓶中培养，待细胞长成后传到96孔板，进行干扰素活性测定。
1.2.10重组羊α干扰素抑制细胞增殖活性
在96孔板按常规方法培养原代胎羊皮肤细胞、MDBK和IBRS2细胞，待细胞长成单层后，去除生长液，用维持液清洗两遍。每孔加入连续10倍稀释的酵母上清中rGoIFN-α和纯化rGoIFN-α0.l mL，每个稀释度接4孔。37℃孵育72h后，每孔加入10μl CCK-8试剂，37℃孵育1h后测定OD450nm值。
2、实验结果
2.1重组质粒的鉴定
将密码子优化并人工合成的山羊α干扰素成熟蛋白编码基因，用EcoR I和Not I双酶切，插入pPIC9K载体的EcoR I和Not I位点间，获得重组载体pPIC9K-GoIFN-α，酶切鉴定可见9kb和0.5kb的片段(图1)，与预期相符。
2.2重组GoIFN-α的表达及鉴定
挑取G418抗性平板上的单菌落，进行诱导表达，72h后收获上清，进行Dot-ELISA初步鉴定。共做了三批，第一批挑菌标号为1-18，第二批挑菌标号19-28，第三批挑菌标号为29-43。Dot-ELISA结果显示(图2)，标号7-18、19、20、24-28、33、35、36、38、40、42、43的克隆诱导72h后均能够与GoIFN-α单克隆抗体发生特异性反应，而其他克隆以及转化空载体9k的毕赤酵母菌株没有反应，表明这些克隆均能分泌表达GoIFN-α蛋白。将这些阳性克隆在相同条件下进行诱导，Dot-ELISA鉴定，克隆18#的表达量为61μg/mL，其余克隆的表达量均低于50μg/mL，因此选择克隆18#进行后续鉴定和优化。
SDS-PAGE(图3A)和Western blot鉴定(图3B)，结果可见，在17kDa附近有2条特异性条带，推测较小的条带为降解的GoIFN-α蛋白。对SDS-PAGE胶进行红外扫描，软件分析，18#上清中表达的重组蛋白浓度约为61μg/mL。由于分泌表达的可溶性GoIFN-α蛋白带6个组氨酸标签，经镍柱纯化后获得纯化的重组蛋白(图3C)，测定蛋白浓度为 0.2mg/mL。
2.3重组酵母菌的遗传稳定性
将表达量较高的阳性克隆18#进行连续传代，不同代次的重组菌诱导表达后取上清进行Western blot分析(图4)，结果表明，从F2代到F10代重组菌表达的GoIFN-α蛋白表达量没有明显差异，证明本发明克隆筛选的重组毕赤酵母菌能够稳定携带GoIFN-α基因、并且稳定地表达。
本发明将稳定高效的表达山羊干扰素GoIFN-α蛋白的重组毕赤酵母阳性克隆18#命名为rGS115/GoIFN-α，并提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9088。
2.4重组GoIFN-α的抗病毒活性
采用目前国际公认的细胞病变抑制法测定毕赤酵母阳性克隆18#表达的山羊干扰素GoIFN-α的抗病毒活性，分别在原代羊皮肤细胞、MDBK和IBRS2细胞上测定GoIFN-α的抵抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性。连续三次的检测结果表明，毕赤酵母表达上清中的GoIFN-α和纯化的GoIFN-α均表现出较高的抗病毒活性，能有效地抑制VSV在细胞上产生CPE，而且在不同的细胞上表现出的活性不同。正常细胞对照组、单用GoIFN-α蛋白不攻毒对照组的细胞均无CPE，而病毒对照组的细胞均出现CPE。将抑制50％细胞病变(CPE)的干扰素的最高稀释度确定为1个干扰素单位，结果见表1。上清中GoIFN-α的抗病毒活性为1.78～3.16×107U/mL，而纯化的GoIFN-α抗病毒活性为3.16～5.62×109U/mg。除此之外，对山羊α干扰素抗口蹄疫病毒(FMDV)、牛肠道病毒(BEV)和山羊痘病毒(GPV)活性也进行了测定，结果如图5和表1所示，上清中GoIFN-α的抗病毒活性为3.16～5.62×107U/mL，而纯化GoIFN-α的抗病毒活性为5.62×109U/mg。不同剂量干扰素的抗病毒实验结果见图5，无论何种病毒和细胞，干扰素GoIFN-α的抗病毒活性均呈现剂量依赖性：干扰素的含量越高，抗病毒活性越强，反之则越弱，这与已报道的其他干扰素的特性 相一致。
表1重组GoIFN-α抗不同病毒活性的测定
注：a)上清中GoIFN-α的活性单位为U/mL；
b)纯化的GoIFN-α的活性单位为U/mg。
2.5重组GoIFN-α的抑制细胞活性
α干扰素具有抑制细胞增殖的活性，但是对不同的细胞抑制效果不同。本发明使用原代胎羊皮肤细胞、MDBK和IBRS2细胞测定表达的GoIFN-α蛋白对细胞增殖的抑制活性，结果见图6。在干扰素GoIFN-α作用下，三种细胞的增殖程度没有显著差异；不管细胞种类的不同，山羊α干扰素对细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，随着干扰素稀释倍数增加，对细胞的抑制作用减弱，这与报道的其他干扰素特性相一致。
实验例1表达山羊α干扰素的重组酵母诱导条件的优化
1、实验方法
对实施例1筛选获得的表达量高的重组酵母菌株rGS115/GoIFN-α(微生物保藏编号为：CGMCC No.9088)进行诱导条件优化，在BMGY中培养菌体至OD600nm约为1时，转接至50mLBMMY中，在250mL的三角瓶内进行诱导表达及条件优化。
1.1不同诱导时间
30℃250rpm诱导，每6h取1.5mL上清液，并补加甲醇至终浓度为0.5％。将0h～48h的表达上清4℃12000rpm离心30min，各取100μl与等体积2×上样缓冲液混合，100℃煮沸变性3min后，进行Western Blot鉴 定。
1.2不同菌体密度
在BMGY中培养菌体至OD600约为1时，用BMMY重悬至不同OD值，分别于OD值＝0.2、0.4、0.6、0.8和1进行诱导表达，24h后取上清，进行Western Blot鉴定。
1.3不同温度条件
在BMGY中培养菌体至OD600约为1时，转接至BMMY，分别在22℃、24℃、26℃、28℃和30℃进行诱导表达，方法同前，24h后取上清，进行Western Blot鉴定。
1.4不同甲醇浓度
分别配制含0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1％(v/v)甲醇的BMMY培养基。在BMGY中培养菌体至OD600约为1时，分别转接到不同甲醇含量的BMMY中诱导表达，24h后取上清，进行Western blot鉴定。
2、实验结果
将表达量最高的阳性重组菌18#(微生物保藏编号为：CGMCC No.9088)转接到250mL三角瓶进行诱导表达，对诱导条件，如温度、时间、菌密度和甲醇浓度进行优化，Western blot鉴定分析蛋白表达情况。不同诱导时间的诱导表达结果(如图7A)显示，诱导后6h即可见GoIFN-α表达，到24h后表达量达到最高峰，并且持续到48h。不同诱导温度进行的诱导表达，结果(如图7B)所示，可见在22℃条件下GoIFN-α表达量相对较高，24℃-30℃条件下蛋白表达量差异不大。不同菌密度转接后可见(图7C)，OD值0.2-1.0均可诱导GoIFN-α表达，并且表达量差异不大，说明不同菌密度对GoIFN-α表达量的影响不大。不同甲醇浓度甲醇诱导的结果(如图7D)可见，甲醇浓度对GoIFN-α表达量的影响不大，0.2％-1％均可为适合浓度。综合以上结果，确定最佳诱导条件为22℃诱导24h，菌密度和甲醇浓度对表达量影响不大。最佳诱导条件下，阳性重组 菌18#上清中表达的重组GoIFN-α浓度约为0.1mg/mL。
实验例2重组山羊α干扰素的临床应用
山羊α干扰素对牛羊的多种疾病有较好的预防和治疗效果，例如口蹄疫、羊痘等。将实施例1构建的重组毕赤酵母(微生物保藏编号为：CGMCC No.9088)表达上清冷冻保存后，分别在疾病流行的牛场和羊场使用，使用方法：肌肉注射，每天一次，幼畜剂量1ml/头；育成牛或羊2ml/头，成年牛羊剂量3ml/头，连续注射3天，观察使用效果。
实例一：某肉牛场(60头)发现并经RT-PCR确诊为口蹄疫感染，对发病早期的牛肌肉注射重组山羊α干扰素，连续注射三天后发现口蹄疫症状减轻或痊愈；同群未发病(后来的观察表明有些已经感染)的牛注射重组山羊α干扰素，结果已经感染牛随后所表现的症状明显减轻，几天后痊愈；同群未发病也未感染的牛，注射干扰素后均未发生口蹄疫。
实例二：一般认为羊对口蹄疫不易感，感染后症状不明显。但是近年来羔羊对口蹄疫呈现高度易感，感染后常引起急性心肌炎突然死亡，羊群中羔羊一般死亡率5-10％，最高可到40-60％，剖检可见虎斑心。某绵羊场(120只)发现两只成年羊腿瘸，一些羔羊不明原因死亡，剖检可见虎斑心，经RT-PCR诊断是口蹄疫感染。对发病羊群中的羔羊注射重组山羊α干扰素，羔羊死亡率明显降低，证明干扰素具有明显的治疗和预防效果。
实例三：羊痘是感染山羊和绵羊的重要接触性传染病。某山羊场(110只)突然发生疫情，经实验室诊断确诊为羊痘感染，对发病早期的山羊和同群未感染的山羊进行紧急接种重组山羊α干扰素，结果已感染的山羊症状明显减轻、逐渐痊愈，同群未感染的山羊始终没有感染。
以上实验表明，本发明毕赤酵母表达的山羊α干扰素对牛羊的重要传染病口蹄疫、羊的重要传染病羊痘具有显著的预防和治疗效果。

Claims (6)

1.表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母，其特征在于，其微生物保藏号为：CGMCCNo.9088。
2.一种构建权利要求1所述重组毕赤酵母的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列克隆至pPIC9K载体，获得重组质粒pPIC9K-GoIFN-α；(2)将重组质粒pPIC9K-GoIFN-α线性化，转化毕赤酵母感受态细胞，筛选鉴定，即得。
3.一种诱导权利要求1所述重组毕赤酵母表达山羊α干扰素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养权利要求1所述重组毕赤酵母，诱导山羊α干扰素表达；(2)纯化所表达的山羊α干扰素，即得；
其中，步骤(1)所述诱导的条件包括：诱导温度为22℃-30℃，诱导时间为6h-48h，菌密度OD600nm值为0.2-1.0，甲醇浓度按体积比计为0.2％-1％。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述诱导的条件包括：诱导温度为22℃，诱导时间为24h，菌密度OD600nm值为0.2-1.0，甲醇浓度按体积比计为0.2％-1％。
5.权利要求1所述的重组毕赤酵母在制备预防或治疗反刍动物病毒性传染病的药物或疫苗佐剂中的应用。
6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的反刍动物病毒性传染病包括：羊痘、蓝舌病或羊传染性脓疱中的任意一种或多种。
CN201610269580.3A 2016-04-27 2016-04-27 表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母及其构建方法和应用 Active CN105907766B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610269580.3A CN105907766B (zh) 2016-04-27 2016-04-27 表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610269580.3A CN105907766B (zh) 2016-04-27 2016-04-27 表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105907766A CN105907766A (zh) 2016-08-31
CN105907766B true CN105907766B (zh) 2019-11-05

Family

ID=56751850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610269580.3A Active CN105907766B (zh) 2016-04-27 2016-04-27 表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105907766B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107233568A (zh) * 2017-06-20 2017-10-10 上海赛伦生物技术股份有限公司 一种免疫马用的免疫佐剂
CN109776669A (zh) * 2018-12-29 2019-05-21 广州动物园 虎γ干扰素及其表达基因、制备方法和应用
CN110013545A (zh) * 2019-03-12 2019-07-16 西北农林科技大学 一种细胞因子药物的制备方法及其应用
CN113322223B (zh) * 2021-06-03 2023-09-12 重庆市畜牧科学院 富硒酵母基因工程菌及其表面展示系统及其构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101450961A (zh) * 2007-11-28 2009-06-10 成都乾盛昌生物科技有限公司 人工合成的猪干扰素基因及制备猪干扰素的方法
CN103981192A (zh) * 2014-04-14 2014-08-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达山羊α干扰素的重组腺病毒及其构建方法和应用
CN104878017A (zh) * 2015-05-22 2015-09-02 江苏恒丰强生物技术有限公司 猪α干扰素基因及其合成方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101450961A (zh) * 2007-11-28 2009-06-10 成都乾盛昌生物科技有限公司 人工合成的猪干扰素基因及制备猪干扰素的方法
CN103981192A (zh) * 2014-04-14 2014-08-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达山羊α干扰素的重组腺病毒及其构建方法和应用
CN104878017A (zh) * 2015-05-22 2015-09-02 江苏恒丰强生物技术有限公司 猪α干扰素基因及其合成方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FJ959074;Ramesh，D.et al;《GENBANK》;20090608;1 *
复合干扰素在毕赤酵母中的表达与纯化;张守涛，等;《郑州大学学报（理学版）》;20110630;第43卷(第2期);115-124 *
猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达;刘健 等;《华南农业大学学报》;20110115;93-97 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105907766A (zh) 2016-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105907766B (zh) 表达山羊α干扰素的重组毕赤酵母及其构建方法和应用
CN103194472B (zh) 猪流行性腹泻s1蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用
CN104593397B (zh) 一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用
CN113337478B (zh) 一株猫细小病毒毒株及其应用
CN107899008B (zh) 一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗
CN102335421B (zh) 一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统及其应用
CN104693310B (zh) 一种嵌合蛋白、病毒样颗粒及其应用
CN102221618B (zh) 猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建及疫苗的制备方法
CN114908029B (zh) 一种ii型草鱼呼肠孤病毒vp6重组乳酸菌的构建和应用
CN106754594A (zh) 一种猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌及其构建方法
CN103981192B (zh) 表达山羊α干扰素的重组腺病毒及其构建方法和应用
CN104988107B (zh) 一种高效表达口蹄疫病毒抗原基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用
CN106834351A (zh) 基于杆状病毒表达系统的鸭坦布苏病毒亚单位疫苗制备及应用
CN104894045B (zh) 一种共表达口蹄疫病毒vp1基因与免疫佐剂牛il-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用
CN103614387B (zh) 优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因及其重组质粒和应用
CN109021115A (zh) 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗
CN108558998A (zh) 猪白细胞介素4/6与融合猪抗菌肽共表达重组酵母菌制剂的制备及应用
CN107868131A (zh) 一种猪细小病毒病亚单位疫苗及其制备方法
CN101638661B (zh) 新城疫病毒hn基因和f基因重组乳酸菌的构建
CN105535957A (zh) 一种口蹄疫o、a型双价灭活标记疫苗及其制备方法
CN103194471B (zh) 猪传染性胃肠炎s/n蛋白融合基因及重组乳酸乳球菌和应用
CN110358741A (zh) 一种表达猪塞内卡病毒vp2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用
CN102363770A (zh) 融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的重组杆状病毒及其亚单位疫苗
CN103421817B (zh) 人工合成的猪繁殖与呼吸综合征病毒多表位基因及应用
CN106397602B (zh) 一种分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant