CN106834351A - 基于杆状病毒表达系统的鸭坦布苏病毒亚单位疫苗制备及应用 - Google Patents

基于杆状病毒表达系统的鸭坦布苏病毒亚单位疫苗制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于杆状病毒表达系统的鸭坦布苏病毒亚单位疫苗制备及应用。本发明采用杆状病毒表达系统表达坦布苏prME蛋白，WB表明prME蛋白在sf9细胞和上清中成功表达，并且加工成熟后部分被切割为M蛋白和E蛋白，通过电镜观察到在sf9细胞内和分泌上清中均有直径大小约为30‑50nm的坦布苏病毒样颗粒存在，表明该蛋白在sf9细胞中自组装形成了类病毒粒子，这种类病毒粒子具有较强的免疫原性。通过两种不同方式纯化蛋白或病毒样颗粒，将蛋白或病毒样颗粒与佐剂按比例混合，可制备成安全、稳定、高效的抗鸭坦布苏病毒亚单位疫苗。将该疫苗免疫樱桃谷鸭和产蛋麻鸭后可诱导机体产生特异性免疫反应，并能保护60％的产蛋麻鸭免受鸭坦布苏病毒的攻击。

Description

基于杆状病毒表达系统的鸭坦布苏病毒亚单位疫苗制备及 应用
技术领域
本发明涉及家畜基因工程疫苗领域，具体地指一种基于杆状病毒表达系统的鸭坦布苏病毒亚单位疫苗制备及应用。
背景技术
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)引起的一种传染病。该病毒属于黄病毒科，于2010年在我国首次爆发，迅速在整个养鸭密集的地区如福建，浙江，安徽等地扩散。仅2010年给我国的养鸭业造成高达50亿的经济损失。该病发病突然，传播迅速，肉用及蛋用家禽均易感，水禽比鸡更易受到感染，感染蛋/种禽发病率高达100％，产蛋由高峰期的90-95％下降至5-10％。水禽死淘率为5-15％，继发感染时死亡率可达30％。同时，有研究发现该病毒可能作为一种人畜共患病感染人群。坦布苏病毒具有典型的黄病毒属的基因结构组成，其基因组由衣壳蛋白C、M蛋白，囊膜E蛋白和7个非结构蛋白组成，黄病毒的囊膜蛋白E蛋白包含许多与宿主嗜性、宿主细胞膜融合及宿主细胞表面受体结合相关的抗原位点，且具有较高的保守性和免疫原性。研究表明黄病毒前体膜蛋白prM可促进保护性免疫力的诱导产生，prM蛋白在高尔基体上经蛋白酶水解为M蛋白，对E蛋白空间结构的稳定有非常重要的作用。
病毒样颗粒(VLPs)是指在体外高效表达某种病毒的一种或几种结构蛋白，使其自动装配成在形态和功能上类似于天然病毒的空心颗粒，该空心颗粒没有病毒核酸，不能自主复制，克服了疫苗生产的安全隐患。绝大多数病毒样颗粒的构建选择的都是真核细胞表达系统如杆状病毒表达系统。杆状病毒表达系统，其基因组大，可容纳大片段的目的基因，表达量高，可以对蛋白进行翻译后修饰，安全性好。杆状病毒表达系统表达产物的翻译后加工与高等生物相似，可使蛋白产物保持天然结构、生物活性和免疫活性，有利于形成VLPs。并且杆状病毒表达系统安全性好，因为杆状病毒具有明显的宿主界限，对脊柱动物无致病性。
现有的鸭坦布苏病毒商业化疫苗主要为弱毒疫苗。弱毒疫苗存在毒力返强的可能性，对免疫鸭群存在很大的风险，其免疫效果易受多种因素的影响，且运输和保存有一定的条件限制。而利用原核蛋白表达系统表达的蛋白生物活性欠佳，所制备的亚单位疫苗具有一定的局限性。
因此迫切需要开发新型亚单位疫苗有利于更好的防控鸭坦布苏病毒。
发明内容
本发明旨在针对现有疫苗的空白和原核蛋白亚单位疫苗的技术缺陷，进行一种基于杆状病毒表达系统的鸭坦布苏病毒亚单位疫苗制备及应用。本发明采用杆状病毒表达系统表达坦布苏prME蛋白，WB表明prME蛋白在sf9细胞和上清中成功表达，并且加工成熟后部分被切割为M蛋白和E蛋白，通过电镜观察到在sf9细胞内和分泌上清中均有直径大小约为30-50nm的坦布苏病毒样颗粒存在。表明该蛋白在sf9细胞中自组装形成了类病毒粒子，动物实验表明这种类病毒粒子具有较强的免疫原性，将蛋白与与佐剂按比例混合，可制备成安全、稳定、高效的抗鸭坦布苏病毒亚单位疫苗。
为实现上述目的，本发明提供的一种重组转移载体pFastBac1-prME，所述重组转移质粒pFastBac1-prME是在pFastBac1载体上插入prME基因片段构建而成，prME基因片段位于酶切位点NotI-PstI之间，prME基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
进一步地，所述prME基因片段由信号肽序列、prM基因和E基因组成，所述信号肽长度为90bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述prM基因长度为501bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述E基因(囊膜E蛋白基因名称)长度为1503bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。prME为主要免疫原性蛋白，研究表明黄病毒前体膜蛋白prM可促进保护性免疫力的诱导产生，prM蛋白在高尔基体上经蛋白酶水解为M蛋白，对E蛋白空间结构的稳定有非常重要的作用。
本发明提供了一种上述重组转移质粒pFastBac1-prME的制备方法，包括以下步骤：
1)prME基因的获得
设计引物对：
Forward：5’-AGGCGGCCGCATGCAGATGCTCGACGGACTGAAT-3’，
Reverse：5’-AGCTGCAGTTAGGCATTGACATTTACTGC-3’；
以重组质粒pUC-prME为模板用引物对进行PCR，扩增回收得到prME基因片段；
2)杆状病毒转移载体pFastBac1-prME的构建
以载体pFastBac1TM，如图为骨架，利用NotI+PstI同时酶切prME基因片段和转移载体pFastBac1，将prME基因片段插入转移载体pFastBac1的NotI与PstI酶切位点之间，得到正确的重组转移质粒pFastBac1-prME。
作为优选方案，所述步骤1)中，PCR体系：
PCR条件：按95℃作用2min；然后95℃作用20s，56℃退火20s，
72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸5min。
将扩增的PCR产物经1.0％(重量/体积,w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳，结果表明，能够扩增出2100bp的特异目的条带，大小与预期的一致。
本发明还提供了一种重组杆状病毒AC-prME，所述重组杆状病毒AC-prME的基因组中含有上述的重组转移质粒pFastBac1-prME。重组杆状病毒AC-prME中prME基因的位置都是由转移质粒pFastBac1-prME决定的。
上述重组杆状病毒AC-prME的制备方法，包括以下步骤：
1)prME基因的获得
设计引物对：
Forward：5’-TAGGCGGCCGCATGCAGATGCTCGACGGACTGAAT-3’，
Reverse：5’-AGCTGCAGTTAGGCATTGACATTTACTGC-3’；
以重组质粒pUC-prME为模板，进行PCR，扩增回收得到prME基因片段；
2)杆状病毒转移载体pFastBac1-prME的构建
以载体pFastBac1TM，(图谱如图1)为骨架，利用NotI+PstI同时酶切prME基因片段和转移载体pFastBac1，将prME基因片段插入转移载体pFastBac1的酶切位点NotI和PstI之间，得到正确的重组转移质粒pFastBac1-prME。
作为优选方案，所述步骤1)中，PCR体系：
PCR条件：按95℃作用2min；然后95℃作用20s，56℃退火20s，
72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸5min，将扩增的PCR产物经1.0％(重量/体积,w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳，结果表明，能够扩增出2100bp的特异目的条带，大小与预期的一致。
4)重组杆粒rBac-prME的获得
取4.0μl pFastBac-prME与100μl DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴30min后，42℃水浴热激90s，然后冰浴2min，加入600μlSOC液体培养基，37℃振荡培养4h，取少量培养液划线于含有三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)和IPTG、X-gal的高盐LB平板，使用浓度按Bac-to-Bac Baculovirus Expression System操作说明书(Invitrogen公司)，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-prME，通过两对引物扩增鉴定：M13上游引物(M13F)和prME下游引物(prME-R)鉴定结果如图2。
M13F：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'
M13R：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'
prME-R：
5'-AGCTGCAGTTAGGCATTGACATTTACTGC-3'
5)重组杆状病毒Ac-prME获得
将重组载体rBac-prME转染sf9细胞，4-7天后观察到细胞有明显病变，收集细胞培养液，3000rpm离心5min去除细胞碎片。收集上清即获得重组杆状病毒Ac-prME。
上述重组杆状病毒AC-prME的制备方法，所述步骤5)的具体步骤如下：
⑴取1μg rBac-prME加入100μl无血清Grace培养基中，混匀，得到溶液A；取6μl脂质体( Reagent)加入100μl无血清Grace培养基，得到溶液B。静置10min；
⑵将A加入B中混匀，每隔5min轻混，3-4次后静置10-15min；再将六孔板中长至90％的单层sf9细胞弃去细胞培养基，用无血清的Grace培养基轻轻洗两次后加入1ml无血清Grace培养基；
⑷在A+B混匀体系中补加800μl无血清Grace培养基，轻轻混匀后将其加入细胞培养皿中，27℃静置5h；
⑸弃去细胞培养上清，加2ml含10％FBS(Gibco)的Grace培养基，按照1：100的比例加入庆大霉素和链霉素，27℃静置培养；
⑹观察细胞病变情况，4-7天后观察到细胞有明显病变，收集细胞培养液，3000rpm离心5min去除细胞碎片。收集上清即获得重组杆状病毒Ac-prME，置于-80℃保存。
基于上述重组杆状病毒AC-prME制备鸭坦布苏病毒亚单位疫苗的方法，包括以下步骤：
1)将重组杆状病毒AC-prME接种悬浮培养的昆虫细胞sf9中，27℃培养，120rpm，三天后收集细胞。
2)用无菌PBS重悬细胞，破碎离心，以15％，35％，45％三个梯度进行蔗糖密度梯度离心，收集35％中的条带，加入无菌PBS，140000g离心1h，收集沉淀，即为纯化后的DTMUV-VLPs，
3)测定蛋白浓度后，水相由蛋白与吐温80按照体积比97：3～96：4配制构成，水相与油相按1：2体积比混合乳化制备成亚单位疫苗，
或者，1)将重组杆状病毒AC-prME接种悬浮培养的昆虫细胞sf9中，培养收集细胞；加入无菌PBS，将细胞冻融2次后，压力破碎后，10000rpm离心10min，除去细胞碎片
2)测定蛋白浓度后，水相由蛋白与吐温80按照体积比97：3～96：4配制构成，水相与油相按1：2体积比混合乳化制备成亚单位疫苗，
本发明提供了一种基于上述方法制备鸭坦布苏病毒亚单位疫苗在防治鸭坦布苏病毒病中应用。该疫苗免疫樱桃谷鸭和产蛋麻鸭后可诱导机体产生特异性免疫反应，并能保护60％的产蛋麻鸭免受鸭坦布苏病毒的攻击。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供了一种重组杆状病毒AC-prME，首次采用杆状病毒表达系统表达鸭坦布苏prM-E基因蛋白，与单独采用E基因蛋白不同的是，文献表明prM对E蛋白空间结构的稳定有非常重要的作用。电镜中也可观察到该prM-E蛋白在在sf9细胞内和分泌上清中形成了病毒样颗粒，提供了一种可形成鸭坦布苏病毒样颗粒(DTMUV-VLPs)的蛋白，与原核表达系统所表达的蛋白相比，具有更好的免疫原性，可应用于制备亚单位疫苗。
2、本发明的重组杆状病毒所表达prM-E蛋白制备亚单位疫苗，免疫樱桃谷鸭和产蛋麻鸭后，可诱导机体产生特异性免疫反应，动物实验表明提供的亚单位疫苗具有较好的保护效果，生物安全性高。
附图说明
图1为载体pFastBac1TM图谱；
图2为重组杆状病毒基因组PCR鉴定图：
图中，图2A为目的基因成功插入杆状病毒基因组的验证PCR图；
图2B为鉴定重组杆状病毒的示意图；
图3为上清和细胞中prME蛋白检测示意：
图中，图3A为sf9细胞中prME蛋白Western-blot图，
图3B为表达上清中prME蛋白Western-blot图；
图4为prME蛋白间接免疫荧光鉴定图；
图5为sf9细胞中鸭坦布苏病毒样颗粒(DTMUV-VLPs)的观察图：
图中，图5A为放大7800倍视野，图5B为放大19000倍视野；
图6为利用蔗糖梯度离心纯化sf9细胞中鸭坦布苏病毒样颗粒(DTMUV-VLPs)鉴定图；
图中，图6A为Western blot鉴定图，图6B为电镜鉴定图；
图7为抗体检测图；
图中，图7A为一月龄樱桃谷鸭免疫后抗体检测图，
图7B为产蛋麻鸭免疫后抗体检测图；
图8为攻毒后产蛋麻鸭卵巢对比图：
图中，图8A为免疫组产蛋麻鸭卵巢，
图8B为对照组产蛋麻鸭卵巢。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规实验方案，所述实际，如未特别说明，均为商业化或是已公开的试剂材料。
实施例1：表达鸭坦布苏PrM-E基因重组杆状病毒AC-prME的构建
一、重组杆状病毒AC-prME的构建
1、prME基因的获得
参照坦布苏病毒DF2株(Duck Tembusu virus DF2)prME基因及其信号肽序列人工合成2100bp的prME基因及其信号肽序列(GenBank ID:KJ489355)，该序列克隆入载体pUC-18(Invitrogen公司)中获得重组质粒pUC-prME。以该质粒为模板用引物对
Forward：5’-TAGGCGGCCGCATGCAGATGCTCGACGGACTGAAT-3’，
Reverse：5’-AGCTGCAGTTAGGCATTGACATTTACTGC-3’；
进行PCR扩增，回收大小为2100bp的prME基因片段。
2、杆状病毒转移载体pFastBac1-prME的构建
以杆状病毒通用载体pFastBac1TM(Invitrogen公司)为骨架，利用NotI+PstI(购自宝生物(大连)有限公司)同时酶切prME基因片段和转移载体pFastBac1，将prME基因片段插入pFastBac1载体的NotI与PstI酶切位点之间，得到正确的重组转移质粒。
3、重组杆粒rBac-prME的获得与鉴定
取4.0μl pFastBac1-prME与100μl DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴30min后，42℃水浴热激90s，然后冰浴2min，加入600μlSOC液体培养基，37℃振荡培养4h，取少量培养液划线于含有三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)和IPTG、X-gal的高盐LB平板，使用浓度按Bac-to-Bac Baculovirus Expression System操作说明书(Invitrogen公司)，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-prME，通过两对引物扩增鉴定：M13上游引物(M13F)和prME下游引物(prME-R)，M13上游引物(M13F)和M13下游引物(M13R)。
M13F：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'
M13R：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'
prME-R：5'-agctgcagTTAGGCATTGACATTTACTGC-3'
重组杆状病毒rBac-prME PCR鉴定如图2所示。
4、提取rBac-prME重组杆粒备用，步骤如下：
1)挑取含重组杆粒rBac-prME的阳性菌落于5ml高盐LB液体培养基中，培养至细菌对数生长时期，8000rpm，2min收集菌体，尽可能去除培养基；
2)加入300μl溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)重悬；
3)加入300μl溶液II(0.2mol/LNaOH,1％SDS,现配现用)轻微混匀，室温静置5min；
4)加入300μl预冷的溶液III(3m/L乙酸钾，PH5.5)混匀，冰浴10min，4℃，12000rpm，12min，取出上清；
5)重复上一步；
6)将上清按照1：1的比例加入酚仿，混匀，冰浴15min，4℃，12000rpm离心15min，小心取出上清；
7)将取出的上清加入800μl预冷的异丙醇中，混匀，-20℃沉淀20min 12000rpm，离心12min，弃去上清，加入1ml 70％预冷的乙醇，洗两遍。
8)尽量弃掉乙醇，晾干沉淀，加入30μl RNA酶水(含RNA酶10μg/ml)，37℃，放置30min；得到重组杆粒rBac-prME，保存于-80℃备用。
5、重组杆状病毒Ac-prME获得
⑴取1μg rBac-prME加入100μl无血清Grace培养基中，混匀，得到溶液A；取6μl脂质体( Reagent)加入100μl无血清Grace培养基，得到溶液B；静置10min。
⑵将A加入B中混匀，每隔5min轻混，3-4次后静置10-15min。
⑶将六孔板中长至90％的单层sf9细胞弃去细胞培养基，用无血清的Grace培养基轻轻洗两次后加入1ml无血清Grace培养基。
⑷在A+B混匀体系中补加800μl无血清Grace培养基，轻轻混匀后将其加入细胞培养皿中，27℃静置5h。
⑸弃去细胞培养上清，加2ml含10％FBS(Gibco)的Grace培养基，按照1：100的比例加入庆大霉素和链霉素，27度静置培养。
⑹观察细胞病变情况，4-7天后观察到细胞有明显病变，收集细胞培养液，3000rpm离心5min去除细胞碎片。收集上清即获得重组杆状病毒Ac-prME，置于-80℃保存。
二、重组杆状病毒Ac-prME外源基因表达的检测
1、Western blot分析检测外源基因的表达
将第三代重组杆状病毒Ac-prME以0.1MOI，0.5MOI，1MOI，2MOI，5MOI,10MOI分别感染健康的sf9细胞，并设野生杆状病毒和健康sf9做对照，72h后收取感染的细胞和上清。细胞经PBS洗两遍后用PBS重悬进行Western blot鉴定。上清用10％PEG8000沉淀过夜，次日，10000rpm，30min离心，取沉淀，加入PBS重悬。进行Western blot鉴定。一抗分别为1：1000稀释的E片段兔多抗，和1：1000稀释的prM片段兔多抗，二抗为AP标记的1：1000稀释的羊抗兔IgG，利用NBT/BCIP系统显色。Western blot结果如图3所示。
2、间接免疫荧光鉴定外源基因的表达
将第三代重组杆状病毒Ac-prME和野生型杆状病毒Ac-Bac按照2MOI感染复数的剂量分别感染sf9细胞，同时设空白细胞对照，72h之后，以4％多聚甲醛固定15min，然后用pbs洗三遍，加入1％Triton透化10min，再以1：500加入抗E蛋白兔多抗，37℃，2h，PBS洗三遍，以1：500加入FITC标记的羊抗兔IgG，37℃，1h，PBS洗三遍后，加入Hoechst33342染核10min；观察结果。免疫荧光结果如图4所示。
3、电镜观察鸭坦布苏病毒样颗粒(DTMUV-VLPs)的形成。
将重组杆状病毒Ac-prME以2MOI的剂量感染健康的sf9细胞，72h后以2.5％戊二醛固定30min，电镜下观察到有30-50nm大小的病毒样颗粒。表明prME蛋白成功包装成了病毒样颗粒。如图5所示。
4、细胞中DTMUV-VLPs的纯化和观察。
将重组杆状病毒Ac-prME以2MOI接种到200ml密度为2×106个/ml的细胞中，72h后收取感染的细胞上清。用PBS重悬细胞，破碎之后9000g，离心15min收集上清，以15％，35％，45％三个梯度进行蔗糖密度梯度离心，140000g离心2-3h，收集35％中的条带，加入PBS，140000g离心1h，收集沉淀，即为纯化后的DTMUV-VLPs，WB和电镜对纯化后DTMUV-VLPs进行验证，可观察到55kd条带和大小约为30-50nm的病毒样颗粒，结果如图6所示。
实施例2：重组杆状病毒Ac-prME制备的亚单位疫苗
1、重组杆状病毒Ac-prME制备的亚单位疫苗。
以实施例1获得的重组杆状病毒Ac-prME，按照2.0MOI的感染复数剂量接种悬浮培养的昆虫细胞sf9，72小时后收集细胞及上清，按照实施例1中4所述的方式纯化细胞中的DTMUV-VLPs，测定蛋白浓度后，水相由蛋白与吐温80按照体积比97：3配制构成，水相与油相按1：2体积比混合乳化制备成亚疫苗，使每毫升中总蛋白含量为0.5mg/ml，用于以下实施例3、实施例4，放置4度储存。
2、重组杆状病毒Ac-prME制备的亚单位疫苗。
以实施例1获得的重组杆状病毒Ac-prME，按照2.0MOI的感染复数剂量接种悬浮培养的昆虫细胞sf9，72小时后收集细胞，加入无菌PBS，将细胞冻融2次后，通过细胞破碎仪处理，10000rpm离心15min，除去细胞碎片。测定蛋白浓度后，水相由蛋白与吐温80按照体积比97：3配制构成，水相与油相按1：2体积比混合乳化制备成亚疫苗，使其每毫升中prME蛋白含量为0.1mg/ml，用于以下实施例3、实施例5，放置4度储存。
实施例3：亚单位疫苗成分及常规检验
剂型：油包水型(W/O)
佐剂组成：白矿油(Marcol52)
吐温80(CRILLET4)
疫苗乳化：水相由蛋白与吐温80按照体积比97：3配制构成，水相与油相按1：2体积比混合乳化制备成亚疫苗。
疫苗性状检测：乳化后疫苗滴入清水中，第一滴散开，第二滴油珠状，晃动液面油珠不破乳。
无菌检测：取少许疫苗涂布TSA平皿，37℃温箱培养18小时无菌落长出。
稳定性检验：3000rpm/min离心15分钟，离心后乳化疫苗未分层。
实施例4：用重组亚单位疫苗免疫樱桃谷鸭。
实验方案：
实验动物：樱桃谷鸭(鸭坦布苏病毒抗体检测为阴性)。
实验分组：樱桃谷鸭分为2组：免疫组、对照组，如表1所示。
表1樱桃谷鸭免疫分组
免疫方式：腿部肌肉注射，免疫剂量为免疫组500μg/只，每2周免疫1次，共2次，对照组免疫同等剂量健康sf9细胞裂解上清。
亚单位疫苗对樱桃谷鸭的生物安全性评价:
首次免疫后连续7天观察免疫后鸭的采食及精神情况。免疫后鸭没有明显应激症状。
免疫1组、免疫2组、佐剂对照组每周翼下静脉采血，用于血清特异性抗体的检测。采集的血液凝集后，3000rpm/min离心，分离血清，保存于-80℃冰箱备用。将纯化的重组蛋白E加入包被液(1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3，加ddH3O定容至1L)中调整蛋白浓度，包被ELISA板(蛋白浓度为100ng/ml/孔)，4℃过夜；去掉包被液，PBST洗涤3次后每孔加入120μl封闭液(含有5％脱脂乳的PBST溶液)，PBST洗涤3次；加入待检血清，用封闭液按1:200倍稀释，37℃温育1h后PBST洗涤3次；每孔加入100μl按1:10000稀释的鸭二抗，37℃温育30min后PBST洗涤5次；加入底物A、B显色10min后加入终止液，酶标仪读取OD630nm。每孔测定值OD630nm≥0.28，判定为阳性；每孔测定值OD630nm＜0.28，判定为阴性。抗体检测结果如图7A所示。
实施例5：重组亚单位疫苗对产蛋麻鸭免疫保护力试验
实验方案
实验动物：产蛋麻鸭(鸭坦布苏病毒抗体检测为阴性)。
攻毒病毒：鸭坦布苏病毒DF2。
攻毒剂量：2.5×100.3EID50
实验分组：产蛋麻鸭分为3组：免疫1组、免疫2组、佐剂对照组，免疫3组、免疫4组，每组5只。免疫1组、免疫2组、佐剂对照组用于攻毒，免疫3组、免疫4组用于检测抗体水平，如表2所示。
表2产蛋麻鸭免疫分组
免疫方式：腿部肌肉注射，免疫剂量为免疫1组、免疫3组50μg/只，免疫2组、免疫4组100μg/只，对照组免疫健康sf9细胞裂解上清。两周后加强免疫一次，免疫剂量及部位与首免一致。
1)亚单位疫苗对产蛋鸭的生物安全性评价:
首次免疫后连续7天观察免疫后产蛋鸭的采食及精神情况。免疫后蛋鸭没有明显应激症状，免疫后第二天免疫1组、免疫2组、佐剂组采食稍有下降，第三天基本恢复正常。
2)免疫后产蛋麻鸭抗体水平检测
免疫1组、免疫2组、佐剂对照组每周翼下静脉采血，用于血清特异性抗体的检测；免疫3组、免疫4组每个月采血一次，用于血清特异性抗体的长期检测。采集的血液凝集后，3000rpm/min离心，分离血清，保存于-80℃冰箱备用。将纯化的重组蛋白E加入包被液(1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，加ddH2O定容至1L)中调整蛋白浓度，包被ELISA板(蛋白浓度为100ng/ml/孔)，4℃过夜；去掉包被液，PBST洗涤3次后每孔加入120μl封闭液(含有5％脱脂乳的PBST溶液)，PBST洗涤3次；加入待检血清，用封闭液按1:200倍稀释，37℃温育1h后PBST洗涤3次；每孔加入100μl按1:10000稀释的鸭二抗，37℃温育30min后PBST洗涤5次；加入底物A、B显色10min后加入终止液，酶标仪读取OD630nm。每孔测定值OD630nm≥0.28，判定为阳性；每孔测定值OD630nm＜0.28，判定为阴性。抗体检测结果如图7B所示。
3)免疫后疗效实验。
免疫后28天各组肌肉注射DF2株鸭坦布苏病毒进行攻毒，攻毒后第9天统计保护率，其中发病标准为：剖检观察到卵巢卵萎缩，或出现出血性病变，如图8所示。实验结果如表三所示。结果表明100μg免疫剂量可诱导产蛋鸭产生特异性免疫反应，并能保护60％的产蛋麻鸭免受鸭坦布苏病毒的攻击。
表3产蛋麻鸭攻毒结果
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 基于杆状病毒表达系统的鸭坦布苏病毒亚单位疫苗制备及应用
<210> 1
<211> 2100
<212> DNA
<213> prME基因片段
<400> 1
atgcagatgctcgacggactgaataagcggaaggcgaaacgtcggggggggagttgctcttggatcattatgttactcccgatagttgctgggctgaagcttggaaactataatggtagagttttggccactttaaataagactgatgtatcagacttgctagtcattccaacaacggctggcagcaatggatgcgtcgtacgtgctctagatgtgggactaatgtgtcaggatgacataacgtatctgtgcccaaagttggagtacggctacgaacctgaagacatagactgctggtgcaatgagactgagatatacattcattatgggagatgcaccccttcacggcatggacggaggtctaggagatcggtgaacgtgcatcaccatggagagagtctacttgaggccaagaacacgccgtggatggattcgaccaaagccactaaatatctcacgaaggttgagaactgggcgttgagaaatcctgggtatgctcttgctgccatttttataggctggaatctgggaacgacgagaagtcaaaagataattttcacaattatgttaatgttaattgccccagcgtacagcttcagctgtctggggatgcagaaccgagactttgttgagggagtgaatggtgttgagtggatcgatgtcgttctggaaggaggctcatgtgtgaccatcacggcaaaagacaggccgaccatagacgtcaagatgatgaacatggaggccacggaattagcggttgtgagatcttactgctatgagccgaaagtgtcggacgtgacgacagaatccagatgcccaaccatgggagaggctcataatcccaaggcaacttatgctgaatacatatgcaaaaaagattttgtggacaggggttggggcaatggctgtggcttgtttggaaaggggagcatacagacatgtgccaagtttgactgcacaaagaaagcagaaggcaggattgtgcagaaggaaaacgtccagtttgaagttgtagttttcatacatggttccacggaagcgagcacctaccacaattattcagcccagcagtcgctgaaacatgccgctagattcgttataacgcccaaaagtcccgtctacaccgctgagatggaggattatggtaccgtcacactcgaatgtgaaccccgatctggggttgacatggggcaattctatgtctttaccatgaacacaaaaagctggcttgttaacagagactggtttcatgatctcaacttaccatggacagggtcatcagcggggacgtggcaaaacaaagagtcattgatagaatttgaggaggcccacgccaccaaacaatcagtggtggctttggcatcacaagaaggagccctccatgcagcattggcgggagctattccagtgaagtactctggaggcaaattggaaatgacctcaggtcatcttaaatgcagggttaaaatgcagggtttgaagctgaaaggaatgacctacccgatgtgtagcaatacattttccctagtgaagaatcctaccgacactgggcatggcactgtcgtggtggaattgtcttatgcaggtaccgatgggccctgtagagttcccatatccatgtcggcagatctgaatgacatgacaccagttggacgcttgataacagtcaacccatacgtgtcgacctcctccacgggtgccaagataatggtggaagtggaacctccattcggggattcattcatcttagtaggaagtggaaaaggacagatcaggtaccagtggcatagaagtgggagcacaattggaaaagcttttacgtcaacactcaaaggagcacaaaggatggttgctttgggtgacactgcatgggattttggctcagttgggggtgtactcacttccattgggaaaggcattcatcaggttttcggctcagcatttaaaagcttatttggaggaatgtcatggattactcaaggcatgttgggggcactgctattgtggatggggctgaatgcaagggacagatccatttctatgacttttctagccgtaggaggaattttagtcttcctggcagtaaatgtcaatgcc taa
<210> 2
<211> 90
<212> DNA
<213> 信号肽序列
<400> 2
cagatgctcgacggactgaataagcggaaggcgaaacgtcggggggggagttgctcttggatcattatgttactcccgatagttgctggg
<210> 3
<211> 501
<212> DNA
<213> prM基因
<400> 3
ctgaagcttggaaactataatggtagagttttggccactttaaataagactgatgtatcagacttgctagtcattccaacaacggctggcagcaatggatgcgtcgtacgtgctctagatgtgggactaatgtgtcaggatgacataacgtatctgtgcccaaagttggagtacggctacgaacctgaagacatagactgctggtgcaatgagactgagatatacattcattatgggagatgcaccccttcacggcatggacggaggtctaggagatcggtgaacgtgcatcaccatggagagagtctacttgaggccaagaacacgccgtggatggattcgaccaaagccactaaatatctcacgaaggttgagaactgggcgttgagaaatcctgggtatgctcttgctgccatttttataggctggaatctgggaacgacgagaagtcaaaagataattttcacaattatgttaatgttaattgccccagcgtacagc
<210> 4
<211> 1501
<212> DNA
<213> E基因
<400> 4
ttcagctgtctggggatgcagaaccgagactttgttgagggagtgaatggtgttgagtggatcgatgtcgttctggaaggaggctcatgtgtgaccatcacggcaaaagacaggccgaccatagacgtcaagatgatgaacatggaggccacggaattagcggttgtgagatcttactgctatgagccgaaagtgtcggacgtgacgacagaatccagatgcccaaccatgggagaggctcataatcccaaggcaacttatgctgaatacatatgcaaaaaagattttgtggacaggggttggggcaatggctgtggcttgtttggaaaggggagcatacagacatgtgccaagtttgactgcacaaagaaagcagaaggcaggattgtgcagaaggaaaacgtccagtttgaagttgtagttttcatacatggttccacggaagcgagcacctaccacaattattcagcccagcagtcgctgaaacatgccgctagattcgttataacgcccaaaagtcccgtctacaccgctgagatggaggattatggtaccgtcacactcgaatgtgaaccccgatctggggttgacatggggcaattctatgtctttaccatgaacacaaaaagctggcttgttaacagagactggtttcatgatctcaacttaccatggacagggtcatcagcggggacgtggcaaaacaaagagtcattgatagaatttgaggaggcccacgccaccaaacaatcagtggtggctttggcatcacaagaaggagccctccatgcagcattggcgggagctattccagtgaagtactctggaggcaaattggaaatgacctcaggtcatcttaaatgcagggttaaaatgcagggtttgaagctgaaaggaatgacctacccgatgtgtagcaatacattttccctagtgaagaatcctaccgacactgggcatggcactgtcgtggtggaattgtcttatgcaggtaccgatgggccctgtagagttcccatatccatgtcggcagatctgaatgacatgacaccagttggacgcttgataacagtcaacccatacgtgtcgacctcctccacgggtgccaagataatggtggaagtggaacctccattcggggattcattcatcttagtaggaagtggaaaaggacagatcaggtaccagtggcatagaagtgggagcacaattggaaaagcttttacgtcaacactcaaaggagcacaaaggatggttgctttgggtgacactgcatgggattttggctcagttgggggtgtactcacttccattgggaaaggcattcatcaggttttcggctcagcatttaaaagcttatttggaggaatgtcatggattactcaaggcatgttgggggcactgctattgtggatggggctgaatgcaagggacagatccatttctatgacttttctagccgtaggaggaattttagtcttcctggcagtaaatgtcaatgcctaa

Claims (10)

1.一种重组转移质粒pFastBac1-prME，其特征在于：所述重组转移质粒pFastBac1-prME是在pFastBac1载体上插入prME基因片段构建而成，其中prME基因片段位于酶切位点NotI-PstI之间，prME基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述重组转移质粒pFastBac1-prME，其特征在于：prME基因片段由信号肽序列、prM基因和E基因组成，所述信号肽长度为90bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述prM基因长度为501bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述E基因长度为1503bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.一种权利要求1所述重组转移质粒pFastBac1-prME的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)prME基因的获得
设计引物对：
Forward:5’-TAGGCGGCCGCATGCAGATGCTCGACGGACTGAAT-3’，
Reverse:5’-AGCTGCAGTTAGGCATTGACATTTACTGC-3’；
以重组质粒pUC-prME为模板，进行PCR，扩增回收得到prME基因片段；
2)杆状病毒转移载体pFastBac1-prME的构建
以载体pFastBac1TM为骨架，利用NotI+PstI同时酶切prME基因片段和转移载体pFastBac1，将prME基因片段插入转移载体pFastBac1的酶切位点NotI和PstI之间，得到正确的重组转移质粒pFastBac1-prME。
4.根据权利要求3所述重组转移质粒pFastBac1-prME的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，PCR体系：
PCR条件：按95℃作用2min；然后95℃作用20s，56℃退火20s，
72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸5min，将扩增的PCR产物经的琼脂糖凝胶进行电泳，结果表明，能够扩增出2100bp的特异目的条带，大小与预期的一致。
5.一种重组杆状病毒AC-prME，其特征在于：所述重组杆状病毒AC-prME的基因组中含有权利要求1所述的重组转移质粒pFastBac1-prME。
6.一种权利要求5所述重组杆状病毒AC-prME的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)prME基因的获得
设计引物对：
Forward：5’-AGGCGGCCGCATGCAGATGCTCGACGGACTGAAT-3’，
Reverse：5’-AGCTGCAGTTAGGCATTGACATTTACTGC-3’；
以重组质粒pUC-prME为模板，进行PCR，扩增回收得到prME基因片段；
2)杆状病毒转移载体pFastBac1-prME的构建
以载体pFastBac1TM为骨架，利用NotI+PstI同时酶切prME基因片段和转移载体pFastBac1，将prME基因片段插入转移载体pFastBac1的酶切位点NotI和PstI之间，得到正确的重组转移质粒pFastBac1-prME；
4)重组杆粒rBac-prME的获得
取4.0μl pFastBac1-prME与100μl DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴30min后，42℃水浴热激90s，然后冰浴2min，加入600μl SOC液体培养基，37℃振荡培养4h，取少量培养液划线于含有三抗和IPTG、X-gal的高盐LB平板，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-prME，通过两对引物扩增鉴定：M13上游引物和prME下游引物：
M13F：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'，
M13R：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'，
prME-R：5'-AGCTGCAGTTAGGCATTGACATTTACTGC-3'；
5)重组杆状病毒Ac-prME获得
将重组载体rBac-prME转染sf9细胞，4-7天后观察到细胞有明显病变，收集细胞培养液，3000rpm离心5min去除细胞碎片，收集上清即获得重组杆状病毒Ac-prME。
7.根据权利要求6所述重组杆状病毒AC-prME的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中，重组杆状病毒Ac-prME获得具体步骤如下：
⑴取1μg rBac-prME加入100μl无血清Grace培养基中，混匀，得到溶液A；取6μl脂质体加入100μl无血清Grace培养基，得到溶液B，静置10min；
⑵将A加入B中混匀，每隔5min轻混，3-4次后静置10-15min；再将六孔板中长至90％的单层sf9细胞弃去细胞培养基，用无血清的Grace培养基轻轻洗两次后加入1ml无血清Grace培养基；
⑷在A+B混匀体系中补加800μl无血清Grace培养基，轻轻混匀后将其加入细胞培养皿中，27℃静置5h；
⑸弃去细胞培养上清，加2ml含10％FBS的Grace培养基，按照1：100的比例加入庆大霉素和链霉素，27℃静置培养；
⑹观察细胞病变情况，4-7天后观察到细胞有明显病变，收集细胞培养液，3000rpm离心5min去除细胞碎片，收集上清即获得重组杆状病毒Ac-prME，置于-80℃保存。
8.根据权利要求6所述重组杆状病毒AC-prME的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，扩增鉴定的引物为：
M13F：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'，
M13R：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'，
prME-R：5'-AGCTGCAGTTAGGCATTGACATTTACTGC-3'。
9.基于重组杆状病毒AC-prME制备鸭坦布苏病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将重组杆状病毒AC-prME接种悬浮培养的昆虫细胞sf9中，培养收集细胞；
2)用无菌PBS重悬细胞，破碎离心，以15％，35％，45％三个梯度进行蔗糖密度梯度离心，收集35％中的条带，加入无菌PBS，140000g离心1h，收集沉淀，即为纯化后的鸭坦布苏病毒样颗粒DTMUV-VLPs，
3)测定蛋白浓度后，水相由蛋白与吐温80按照体积比97：3配制构成，水相与油相按1：2体积比混合乳化制备成亚疫苗；
或者，1)将重组杆状病毒AC-prME接种悬浮培养的昆虫细胞sf9中，培养收集细胞；加入无菌PBS，将细胞冻融2次后，破碎离心，除去细胞碎片；
2)测定蛋白浓度后，水相由蛋白与吐温80按照体积比97：3～96：4，配制构成，水相与油相按1：2体积比混合乳化制备成亚疫苗。
10.基于权利要求9制备鸭坦布苏病毒亚单位疫苗在防治鸭坦布苏病毒病中应用。
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