CN101687024A - 锥虫抗原、疫苗组合物和相关方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫学和蛋白质工程领域的交叉部分，且尤其涉及可用于防止原生动物锥虫(Trypanosoma protozoa)感染的抗原和疫苗。本发明提供重组蛋白质抗原、组合物、和产生及使用所述抗原和疫苗组合物的方法。

Description

锥虫抗原、疫苗组合物和相关方法

相关申请案交叉参考

本申请案根据35U.S.C.§119(e)主张优先于2007年4月28日提出申请的U.S.S.N.60/914,734(“′734申请案”)和2007年11月2日提出申请的U.S.S.N.60/984,945(“′945申请案”)等美国临时专利申请案。所述′734申请案和所述′945申请案每一者的整体内容均以引用的方式并入本文中。

背景技术

非洲锥虫病(在人类中还称为“昏睡症”且在动物中称为“那加那病(nagana)”)是一种严重的寄生虫病，如果不加以治疗通常致命。这种由采采蝇(tsetse flies)叮咬传播的疾病在撒哈拉以南非洲的36个国家中发生且已达到疫情比例。根据世界卫生组织(World Health Organization)(WHO)，估计每年有40,000例新的受感染人群，其中死亡人数达到66,000以上且正在增加。由于这种疾病对人类和动物同样具有致命性，因此其对社会和经济的影响更具破坏性。在非洲，人类和家畜中广泛发生的锥虫病是发展的极大约束，尤其在农村地区。在撒哈拉以南的非洲中由于那加那病对农业和食品供应的直接影响，所述情况变得更糟。数百万公顷的土地由于人类和动物的非洲锥虫病而不能经济地加以利用。在牛中的高死亡率对牛奶和牛肉生产具有重大影响。例如，无采采蝇的地区每单位土地比采采蝇感染的地区多生产83％牛奶和97％牛肉。仅牛生产中每年的经济损失就在US$1.2万亿的范围内，其中总农业国内生产总值损失估计达US$5万亿。在已经经济贫困且几乎没有现用医疗基础设施的地区中，这种疾病的负担变得更具毁灭性，同时具有重大局部和区域影响。目前还没有可用于预防这种疾病的疫苗。

因此，业内需要提供疫苗源和用于生产疫苗的抗原。需要经改进的疫苗设计和开发、以及制造和使用物质的所述组合物的方法，其提供所述治疗性和/或预防性组合物的廉价且高度可获得源。

发明内容

本发明提供在植物中产生的锥虫(例如，布氏锥虫(T.brucei))抗原和疫苗组分。本发明提供作为具有苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AlMV CP)的融合物生成的一种或一种以上的锥虫抗原。本发明提供作为与热稳定蛋白(例如，地衣多糖酶)的融合物生成的一种或一种以上的锥虫抗原。本发明提供含有锥虫抗原的疫苗组合物。另外，本发明提供包含至少两种不同锥虫抗原的布氏锥虫疫苗。在一些实施例中，本发明组合物包括一种或一种以上的植物组分。本发明还进一步提供生产和使用本发明抗原和疫苗组合物的方法。

附图说明

图1.α和β微管蛋白的比对(A，B)四种不同的锥虫物种(克氏锥虫(T.cruzi)、布氏锥虫、戴维斯克锥虫(T.danilewskyi)和格氏锥虫(T.grayi))中的α微管蛋白(A)和β微管蛋白(B)的CLUSTAL W(1.82)多序列比对。(C，D)母牛、人和锥虫中的α微管蛋白(C)和β微管蛋白(C)的CLUSTAL W(1.82)多序列比对。表1和2中所展示的微管蛋白肽序列加粗并加下划线。

图2.候选疫苗开发的方法：基于AlMV颗粒的途径。将布氏锥虫的α和β微管蛋白氨基酸序列与智人(Homo sapiens)(人类)和欧洲牛(Bos taurus)(母牛)的α和β微管蛋白氨基酸序列进行比对。选择与智人和欧洲牛的α和β微管蛋白序列具有低同源性的α和β微管蛋白序列作为靶肽。布氏锥虫微管相关蛋白p15(MAP15)氨基酸序列由5个氨基酸的16个几乎一致的串联重复序列构成，其中5个氨基酸为一个周期。因此，从包含此蛋白质主要结构元件的MAP15序列中选择5个靶肽。合成靶肽的DNA序列并以与苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AlMV CP)的框架内N末端融合物形式进行克隆，所述外壳蛋白由基于AlMV的RNA 3载体表达。所述基于AlMV的RNA 3载体需要复制酶蛋白P1和P2来复制RNA3。重组AlMV CP是通过次基因组信使RNA4自RNA3表达。AlMV系统在烟草植株中倍增期间，重组AlMV CP组装成在表面上展示靶肽的多个拷贝的病毒体。

图3.含嵌合AlMV CP的靶肽的表达。(A)受感染烟草植株的表型。(B)嵌合AlMV CP的西方印迹分析(Western blot analysis)。将烟草植株用基于AlMV的RNA 3载体接种。在不同的经接种烟草植株的叶子中观察到嵌合AlMV CP的稳定表达。将样品制成5x SDS加样缓冲液，使其沸腾8分钟并以13,000rpm离心，之后将10μl装载到10％SDS PAGE凝胶上。分离出病毒蛋白之后，将凝胶点样于硝酸纤维素膜。使用抗AlMV外壳蛋白的多克隆抗血清作为一级抗体且碱性磷酸酶标记的抗体作为二级抗体来处理膜。CP：野生型AlMV外壳蛋白。经接种的叶子1-3：具有靶肽的AlMV CP。

图4.通过西方印迹分析经纯化的重组病毒颗粒。为在下游处理期间监测重组病毒颗粒纯化，从去除植物碎屑后的上清液中和超离心之后的上清液中取样品并与最终经纯化样品进行比较。将样品制成5x SDS加样缓冲液，使其沸腾8分钟并以13,000rpm离心，之后将10μl装载到10％SDS PAGE凝胶上。分离出病毒蛋白之后，直接通过考玛斯染色(coomassie staining)肉眼观察重组病毒蛋白。对于西方印迹分析，将凝胶点样于硝酸纤维素膜。使用抗AIMV外壳蛋白的多克隆抗血清作为一级抗体且碱性磷酸酶标记的抗体作为二级抗体来处理膜。UD：未经稀释的病毒制剂。UC：超离心上清液。

图5.识别布氏锥虫抗原的抗体的血清分析：小鼠研究1。实施ELISA分析来确定经免疫的小鼠是否已产生识别布氏锥虫抗原的抗体。在第三次免疫后获得的小鼠血清中检测微管蛋白肽特异性IgG。α-微管蛋白(Atub(1-4)、Atub(5-8))或β-微管蛋白(Btub(1-4)、Btub(5-8))测试组的总IgG效价高于对照组(佐剂或野生型病毒颗粒)的总IgG效价，虽然并不明显。利用经纯化布氏锥虫布氏亚种(T.b.brucei)微管蛋白免疫的小鼠具有显著IgG效价(图5A)。IgG亚型的分析揭示，与对照组相比，所有测试组均具有升高的IgG1效价，此对于Atub(1-4)、Atub(5-8)、Btub(1-4)、全长微管蛋白组而言明显，但Btub(5-8)较不明显。除针对全长微管蛋白所诱导的IgG2a和IgG2b效价以外，其它所有测试组的IgG2a和IgG2b效价与对照组之间并无明显差异(图5B)。

^*表示统计上显著的结果(p＜0.05)。

图6.识别布氏锥虫抗原的抗体的血清分析：小鼠研究2。实施ELISA分析来确定经免疫的小鼠是否已产生识别布氏锥虫抗原的抗体。与相应的免疫前血清相比，在第三次免疫后获得的所有血清均具有升高的总IgG效价，只是来自Atub(5-8)的血清除外。与对照组(例如，佐剂或野生型病毒颗粒)相比，Atub(1-4)、重组全长α-微管蛋白、Btub(1-4)、Btub(5-8)、Btub 3、Btub 11、纯化微管蛋白和重组全长β-微管蛋白的总IgG效价显著(图6A)。Atub(1-4)、Btub(1-4)、Btub(5-8)、和微管蛋白的IgG亚型模式与在小鼠研究1中所观察到的类似，这是因为IgG1为主要亚型。除具有高IgG1、及较高IgG2a和IgG2b的Btub 11-31以外，测试个别微管蛋白肽(Btub 2-4、Btub 3-24、Btub 5-14)的组的亚型抗体效价均没有统计显著性(图6B)。^*表示统计上显著的结果(p＜0.05)。

图7：与AlMV免疫的牛相比微管蛋白抗原免疫的牛的存活。(A)所有3头经AlMV免疫的牛在61与64天之间死亡。相反，4头经Btub 5-14免疫的牛活的时间比AlMV对照长9到11天。(B)2头经Btub 2-4+5-14+11-31免疫的牛活的时间比AlMV对照牛长7到10天。(C)1头经Btub 11-31免疫的牛活的时间比AlMV对照牛长10天。(D)2头经Atub 3-17免疫的牛活的时间比AlMV对照牛长10和11天。

具体实施方式

定义

氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”在最广泛的意义上是指可纳入多肽链的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有通用结构H₂N-C(H)(R)-COOH。在一些实施例中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指在天然存在的肽中通常所发现的12种标准L-氨基酸中的任一者。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论其是以合成方式制得还是从天然源获得的。如本文所用，“合成氨基酸”涵盖经化学修饰的氨基酸，其包括(但不限于)盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)、和/或取代物。肽中的氨基酸(包括羧基和/或氨基末端氨基酸)可通过甲基化、酰胺化、乙酰化、和/或经可改变肽的循环半衰期而不会不利地影响其活性的其它化学基团取代来修饰。氨基酸可参与二硫键。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”互换使用，且可指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用所述术语的上下文将容易地看出其是指游离氨基酸还是肽的残基。

动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指在任何发育阶段的人。在一些实施例中，“动物”是指在任何发育阶段的非人类动物。在某些实施例中，非人类动物为哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括(但不限于)哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可为转基因动物、基因工程动物、和/或克隆。

抗体：如本文所用，术语“抗体”指任何免疫球蛋白，无论其是天然的还是以完全或部分合成方式产生的。所述术语还包括其所有保留特异性结合能力的衍生物。所述术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源或在很大程度上同源的结合结构域的任何蛋白质。所述蛋白质可源自天然源，或部分或完全以合成方式产生。抗体可为单克隆或多克隆。抗体可为任何免疫球蛋白类别中的一个成员，其包括任何人类类别中的任一者：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。如本文所用，术语“抗体片段”或“抗体的特征部分”互换使用且是指小于全长的抗体的任何衍生物。通常，抗体片段至少保留全长抗体特异性结合能力的一大部分。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv双特异抗体、和Fd片段。抗体片段可通过任何方式产生。例如，抗体片段可通过完整抗体的片段化以酶方式或化学方式产生和/或其可从编码部分抗体序列的基因以重组方式产生。或者或另外，抗体片段可完全或部分地以合成方式产生。抗体片段可任选地包含单链抗体片段。或者或另外，抗体片段可包含通过(例如)二硫键结连接在一起的多个链。抗体片段可任选包含多分子复合物。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸且更通常包含至少约200个氨基酸。

大约：如本文所用，术语“大约”或“约”当应用于一个或一个以上的所关注值时，是指与所述参考值近似的值。在某些实施例中，除非上下文中另有明确说明或其它证据(不包括所述数值将超过可能值的100％的情况)，否则术语“大约”或“约”包括在任一方向上(大于或小于)在所述参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、、1％、或更小内的数值范围。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或一个以上：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的处理(例如，通过剪接、编辑、和/或3′端形成)；(3)RNA转译到多肽或蛋白质中；(4)多肽或蛋白质的转译后修饰。

基因：如本文所用，术语“基因”具有此项技术中所理解的含义。所属领域的技术人员应了解，术语“基因”可包括基因调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列。进一步应了解，基因的定义包括提及并不编码蛋白质而是编码功能RNA分子(例如tRNA)的核酸。出于清晰的目的，应注意，如本申请案中所用，术语“基因”通常指编码蛋白质的核酸的一部分；所述术语可任选地涵盖调控序列，如所属领域的技术人员根据上下文所了解。所述定义并不想排除术语“基因”应用于非蛋白质编码表达单元的情况，相反，在大多数情况下，本文件中所用的术语是指蛋白质编码核酸。

基因产物：如本文所用，术语“基因产物”或“表达产物”通常是指从基因(加工之前和/或加工之后)转录的RNA或由从所述基因转录的RNA编码的多肽(修饰之前和/或修饰之后)。

同源性：如本文所用，术语“同源性”指聚合分子之间(例如，核酸分子之间(例如，DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子之间)的总体相关性。在一些实施例中，若聚合分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％的一致性，则认为其彼此“同源”。在一些实施例中，若聚合分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％的相似性，则认为其彼此“同源”。

一致性：如本文所用，术语“一致性”是指聚合分子之间(例如，核酸分子之间(例如，DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子之间)的总体相关性。出于最佳比较的目的，两个核酸序列的％一致性的计算可(例如)通过将所述两个序列进行比对来实施(例如，出于最佳比对的目的，可将间隔引入第一和第二核酸序列中的一者或两者，且出于比较目的对不一致序列可不予理会)。在某些实施例中，出于比较目的所比对的序列长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后将相应核苷酸位置处的核苷酸进行比较。当第一序列中的位置与第二序列中的相应位置由相同核苷酸占据时，则在此位置处的分子一致。两个序列间的％一致性是所述序列共有的等同位置的数目的函数，应考虑用于引入用于两个序列最佳比对所需间隔数目和每一间隔的长度。序列比较及两个序列间％一致性的测定可用数学算法完成。例如，两个核苷酸序列的％一致性可使用已纳入ALIGN程序(2.0版)中的梅尔斯(Meyers)和米勒(Miller)算法(CABIOS，1989，4：11-17)测定，所述算法使用PAM120加权余数表、12的间隔长度罚分和4的间隔罚分。另一方面，两个核苷酸序列的％一致性可使用GCG软件包中的GAP程序使用NWSgapdna.CMP矩阵来确定。

分离的：如本文所用，术语“分离的”是指物质和/或实体(1)已经与最初产生(无论是在自然界和/或在试验装置中)时伴随其的至少一些组分分开、和/或(2)是通过人工方法产生、制备和/或制造的。分离的物质和/或实体可与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、大体上100％、或100％的最初伴随的其它组分分开。在一些实施例中，分离的试剂为大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、大体上100％、或100％纯。如本文所用，若一种物质大体上不含其它组分，则所述物质是“纯的”。如本文所用，术语“分离的细胞”是指不包含在多细胞有机体中的细胞。

核酸：如本文所用，术语“核酸”在最广泛的意义上是指已经或可以纳入寡核苷酸链的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是已经或可以通过磷酸二酯键结纳入寡核苷酸链的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是指个别核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，“核酸”是指不含个别核酸残基的寡核苷酸链。如本文所用，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用。在一些实施例中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即，没有磷酸二酯骨架的类似物。例如，所属领域中已知且骨架中具有肽键而非磷酸二酯键的所谓“肽核酸”视为在本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为彼此的简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可包括内含子。核酸可从天然源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学合成等。在适当时，例如在化学合成分子的情况下，核酸可包含核苷类似物，例如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另有说明，否则核酸序列在5′到3′方向上呈现。本文所用术语“核酸区段”是指为较长核酸序列的一部分的核酸序列。在许多实施例中，核酸区段包含至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、或更多个残基。在一些实施例中，核酸为或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；插入的碱基；经修饰的糖(例如，2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖、和己糖)；和/或经修饰的磷酸酯基团(例如，硫代磷酸酯和5′-N-亚磷酰胺键结)。在一些实施例中，本发明可特定指“未经修饰的核酸”，即，未经化学修饰以有利于或实现递送的核酸(例如，多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。

以可操作方式连接：如本文所用，术语“以可操作方式连接”是指两个核酸序列之间的关系，其中一个核酸序列的表达受到另一核酸序列的控制、调控、调节等。例如，核酸序列的转录由以可操作方式连接的启动子序列引导；核酸序列的转录后加工由以可操作方式连接的加工序列引导；核酸序列的转译由以可操作方式连接的转译调控序列引导；核酸或多肽的转运或定位由以可操作方式连接的转运或定位序列引导；且多肽的转译后加工由以可操作方式连接的加工序列引导。以可操作方式连接到第二核酸序列的核酸序列可直接或间接共价连接到这一序列上，但任何有效的三维结合也是可接受的。

部分：如本文所用，词语物质的“一部分”或“片段”在最广泛意义上是与相关完整物质分享一定程度的序列和/或结构一致性和/或至少一种功能特性者。例如，蛋白质或多肽的“一部分”是含有能共同体现蛋白质或多肽的特征的一段连续氨基酸、或很多段连续氨基酸的部分。在一些实施例中，每一所述连续段通常将含有至少2、5、10、15、20或更多个氨基酸。通常，一部分是除上述规定的序列一致性以外还与相关完整蛋白共有至少一种功能特性的部分。在一些实施例中，所述部分可具有生物活性。

蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽(即，通过肽键彼此连接的一串至少两个氨基酸)。蛋白质可包括除氨基酸以外的部分(例如，可为糖蛋白、粘蛋白等)和/或可另外经加工或修饰。所属领域的技术人员应了解，“蛋白质“可为由细胞产生的完整多肽链(有或没有信号序列)，或可为其特征部分。所属领域的技术人员应了解，蛋白质有时可包括多于一个的多肽链，例如通过一个或一个以上的二硫键连接或通过其它方式结合。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或二者，且可含有所属领域已知的各种氨基酸修饰或类似物中的任一者。有用修饰包括(例如)末端乙酰化、酰胺化等。在一些实施例中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其组合。术语“肽”通常用于指长度小于约100个氨基酸的多肽。

相似性：如本文所用，术语“相似性”是指聚合分子之间(例如，核酸分子之间(例如，DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子之间)的总体相关性。聚合分子彼此的％相关性的计算可以与％一致性的计算相同的方式来实施，只是％相似性的计算考虑保守置换，如所属领域中所理解。

个体：如本文所用，术语“个体”或“患者“是指出于(例如)试验、诊断、预防和/或治疗目的可投与给本发明组合物的任何有机体。典型个体包括动物(例如，哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类和人类；昆虫；蠕虫等)。

大体上：如本文所用，术语“大体上”是指展示所关注特征或性质的总体或接近总体的范围或程度的质的条件。生物技术领域的技术人员应了解，生物和化学现象很少(如果有的话)能彻底完成和/或进行完全或获得或避免绝对结果。因此本文所用的术语“大体上”描述许多生物和化学现象中固有的潜在缺乏完整性。

遭受：“遭受”疾病、病症、和/或病状的个体已经诊断具有或展示所述疾病、病症、和/或病状的一个或一个以上的症状。

易感：“易感”疾病、病症、和/或病状的个体还未诊断出患有所述疾病、病症、和/或病状。在一些实施例中，易感疾病、病症、和/或病状的个体可能还未展示所述疾病、病症、和/或病状的症状。在一些实施例中，易感疾病、病症和/或病状的个体将患所述疾病、病症和/或病状。在一些实施例中，易感疾病、病症和/或病状的个体将不会患所述疾病、病症和/或病状。

治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”是指当投与给遭受或易感疾病、病症和/或病状的个体时足以治疗、诊断、预防所述疾病、病症和/或病状的症状和/或延迟所述疾病、病症和/或病状症状的发作的量。

治疗剂：如本文所用，词语“治疗剂”是指当投与给个体时具有治疗效果和/或诱导想要的生物和/或药理效果的药剂。

治疗：如本文所用，术语“治疗”(“treatment”，也为“treat”或“treating”)是指达到以下目的的生物活性剂的任何投与：部分或完全缓解、改善、减轻、抑制特定疾病、病症和/或病状的一个或一个以上的症状或特征、延迟所述特定疾病、病症和/或病状的发作、预防所述特定疾病、病症和/或病状、降低其严重性和/或降低其发病率。所述治疗可为并未展示相关疾病、病症和/或病状的征兆的个体和/或仅展示所述疾病、病症和/或病状的早期征兆的个体。或者或另外，所述治疗可为展示相关疾病、病症和/或病状的一种或一种以上的已确立征兆的个体。

载体：如本文所用，“载体”是指可转运其所连接的另一核酸的核酸分子。在一些实施例中，载体可在宿主细胞(例如真核生物和/或原核生物细胞)中完成其所连接的核酸的染色体外复制和/或表达。能够引导以可操作方式连接基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。

本发明涉及用于制备抗锥虫感染的疫苗的锥虫(例如，布氏锥虫)抗原、和包含以可操作方式连接到苜蓿花叶病毒(AlMV)外壳蛋白(CP)和/或热稳定蛋白(例如，地衣多糖酶)的所述锥虫抗原的融合蛋白。本发明涉及产生所提供抗原的方法，其包括(但不限于)在植物系统中产生。此外，本发明涉及载体、融合蛋白、植物细胞、植物和包含本发明抗原和融合蛋白的疫苗组合物。再进一步提供在个体中诱导抗锥虫感染的免疫反应的方法，其包含将本发明的疫苗组合物投与给个体。

布氏锥虫抗原

锥虫是通过舌蝇属(genus Glossina)的采采蝇传播的血管内、细胞外原生动物寄生虫。动物中的主要致病锥虫物种是刚果锥虫(T.congolense)、活动锥虫(T.vivax)、猴锥虫(T.simiae)、和布氏锥虫。有三种主要布氏锥虫亚型。在动物中导致那家那病的布氏锥虫布氏亚种在形态学上与人类寄生虫布氏冈比亚锥虫(T.brucei gambiense)和布氏罗得西亚锥虫(T.brucei rhodesiense)无法区分，其分别导致慢性冈比亚型和急性罗得西亚型昏睡症。仅举几个例子，其它锥虫物种包括鸟锥虫(T.avium)，其在鸟类中导致锥虫病；软骨鱼锥虫(T.boissoni)，其板鳃类(elasmobranch)(软骨鱼类(cartilaginous fish))中导致疾病；淡水产硬骨鱼锥虫(T.carassii)，其在淡水硬骨鱼(条鳍鱼类)中导致疾病；克氏锥虫，其在人类中导致查加斯病(Chagas disease)；刚果锥虫，其在牛、马和骆驼中导致那加那病；马锥虫(T.equinum)，其在马中导致疾病；马媾疫锥虫(T.equiperdum)，其在马和马科动物中导致媾疫或交配病(covering sickness)；依凡氏锥虫(T.evansi)，其在某些动物(包括人类)中导致一种形式的苏拉病(surra)；鲁易希氏锥虫(T.lewisi)，其在大鼠中导致疾病；羊锥虫(T.melophagium)，其在绵羊中导致疾病；T.percae，其在鱼中导致疾病；旋转锥虫(T.rotatorium)，其在两栖动物中导致疾病；猴锥虫(T.simiae)，其导致那加那病；猪锥虫(T.suis)，其导致一种形式的苏拉病；提氏锥虫(T.theileri)，其在反刍动物中导致疾病；T.triglae，其在硬骨鱼中导致疾病；和活动锥虫，其导致那加那病。

本发明的锥虫(例如，布氏锥虫)抗原蛋白包括能够诱导抗原生动物锥虫的免疫反应的任何免疫原性蛋白或肽。通常，所关注免疫原性蛋白包括锥虫抗原(例如，锥虫蛋白、融合蛋白等)、其免疫原性部分、或其免疫原性变体和以上任何的组合。

根据本发明，可产生任何锥虫蛋白并用作抗原。典型地，可用作抗原的锥虫蛋白(即，全长蛋白质、其多个部分、片段、和/或结构域、肽等)大体上与由正预防接种的动物所表达的蛋白质不一致和/或同源。在一些实施例中，锥虫蛋白与由正预防接种的动物所表达的蛋白质具有小于90％、小于80％、小于70％、小于60％o、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、或小于10％的一致性和/或同源性。在一些实施例中，特定锥虫蛋白可具有与由正预防接种的动物所表达的蛋白质大体上一致和/或同源的部分和/或结构域以及与由正预防接种的动物所表达的蛋白质大体上不一致和/或同源的部分和/或结构域。在一些实施例中，根据本发明所用蛋白质和/或肽是与由正预防接种的动物所表达的蛋白质大体上不一致和/或同源的蛋白质部分和/或结构域，所述蛋白质部分和/或结构域已经与由正预防接种的动物所表达的蛋白质大体上一致和/或同源的蛋白质部分和/或结构域分开和/或分离。

根据本发明使用的锥虫(例如，布氏锥虫)抗原可包括全长锥虫蛋白或锥虫蛋白的多个部分(即，片段、结构域等)和/或包含全长锥虫蛋白或锥虫蛋白的多个部分的融合蛋白。当利用锥虫蛋白的多个部分时，无论其是单独还是在融合蛋白中，所述部分保持免疫活性(例如，与抗锥虫抗体的交叉反应性)。基于α微管蛋白和β微管蛋白诱导免疫保护反应对抗原生动物感染的能力，其均是生成疫苗中所关注的抗原。低级真核生物(包括原生动物，例如锥虫物种)的微管蛋白的性质不同于哺乳动物微管蛋白的性质，此使得其能够选择性靶向低级真核生物微管蛋白用于疫苗开发。另外的抗原(例如微管相关蛋白p15(MAP15)和p52(MAP52))可用于生产疫苗(例如，联合疫苗)以提高免疫保护的效能。

因此，本发明提供表达诸如锥虫抗原(例如，锥虫蛋白或其片段、包含锥虫蛋白或其部分的融合蛋白)的异源蛋白的植物细胞和/或植物。本发明的异源蛋白可包含任何所关注锥虫抗原，其包括(但不限于)α微管蛋白、β微管蛋白、MAP15和MAP52、或α微管蛋白、β微管蛋白、MAP15和MAP52的融合蛋白、部分或组合、α微管蛋白的一部分、β微管蛋白的一部分、MAP15的一部分和/或MAP52的一部分。在一些实施例中，本发明提供表达全长异源蛋白的植物细胞和/或植物。在一些实施例中，本发明提供表达异源蛋白的一部分的植物细胞和/或植物。在一些实施例中，本发明提供表达异源蛋白的多个部分的植物细胞和/或植物。在一些实施例中，所述多个部分各自从个别载体产生。在一些实施例中，所述多个蛋白质部分是从同一载体串联表达(即，“多胞形”)。在一些实施例中，多胞形的所有多个蛋白质部分彼此一致。在一些实施例中，所有多个蛋白质部分彼此不一致。

所属领域已知来自布氏锥虫蛋白的许多种不同锥虫蛋白(例如，α微管蛋白、β微管蛋白、MAP15、和MAP52)的氨基酸序列且可在公用数据库(例如，基因库(GenBank))中获得。α微管蛋白、β微管蛋白、和MAP15的实例性全长蛋白质序列提供于以下：

全长布氏锥虫α微管蛋白(SEQ ID NO.：1)：

MREAICIHIGQAGCQVGNACWELFCLEHGIQPDGAMPSDKTIGVEDDAFNTFFSETGAGKHVPRAVFLDLEPTVVDEVRTGTYRQLFHPEQLISGKEDAANNYARGHYTIGKEIVDLCLDRIRKLADNCTGLQGFLVYHAVGGGTGSGLGALLLERLSVDYGKKSKLGYTVYPSPQVSTAVVEPYNSVLSTHSLLEHTDVAAMLDNEAIYDLTRRNLDIERPTYTNLNRLIGQVVSSLTASLRFDGALNVDLTEFQTNLVPYPRIHFVLTSYAPVISAEKAYHEQLSVSEISNAVFEPASMMTKCDPRHGKYMACCLMYRGDVVPKDVNAAVATIKTKRTIQFVDWSPTGFKCGINYQPPTVVPGGDLAKVQRAVCMIANSTAIAEVFARIDHKFDLMYSKRAFVHWYVGEGMEEGEFSEAREDLAALEKDYEEVGAESADMDGEEDVEEY

全长布氏锥虫β微管蛋白(SEQ ID NO.：2)：

MREIVCVQAGQCGNQIGSKFWEVISDEHGVDPTGTYQGDSDLQLERINVYFDEATGGRYVPRSVLIDLEPGTMDSVRAGPYGQIFRPDNFIFGQSGAGNNWAKGHYTEGAELIDSVLDVCCKEAESCDCLQGFQICHSLGGGTGSGMGTLLISKLREQYPDRIMMTFSIIPSPKVSDTVVEPYNTTLSVHQLVENSDESMCIDNEALYDICFRTLKLTTPTFGDLNHLVSAVVSGVTCCLRFPGQLNSDLRKLAVNLVPFPRLHFFMMGFAPLTSRGSQQYRGLSVPELTQQMFDAKNMMQAADPRHGRYLTASALFRGRMSTKEVDEQMLNVQNKNSSYFIEWIPNNIKSSVCDIPPKGLKMAVTFIGNNTCIQEMFRRVGEQFTLMFRRKAFLHWYTGEGMDEME FTEAESNMNDLVSEYQQYQDATIEEEGEFDEEEQY

全长布氏锥虫微观相关蛋白p15(MAP15)(SEQ ID NO.：3)：

ARATAVPKKAVAKKAAPKKTVAKKAAPKKAVAKKVAPKKAVAKKVVAKKAVAKKVVAKKVAPKKVVAKKVAPKKVAGKKAAAKKA

或者或另外，图1呈现来自不同锥虫物种和来自母牛、人类和锥虫的α-和β-微管蛋白的多个比对。表1和2中所展示微管蛋白肽的序列加粗并加下划线。

以下段落展示根据本发明将使用的锥虫蛋白、其部分和/或结构域、肽等的许多非限制实例。合成以下所呈现选自α微管蛋白、β微管蛋白和MAP15的24个靶肽的DNA序列并以与苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AlMV CP；参见实例1)的框架内N末端融合物形式进行克隆。单独地，将靶肽改造成串联(即，“多胞形”)并克隆到热纤梭菌地衣多糖酶的环状区域中(LicKM；参见实例1)。

α微管蛋白

在某些实施例中，在本发明的疫苗组合物中使用全长α微管蛋白。在一些实施例中，使用α微管蛋白的一个或一个以上的部分和/或结构域。在某些实施例中，利用两个或三个或三个以上的部分和/或结构域作为一个或一个以上的单独的多肽或连接在一起的一个或一个以上的融合多肽。根据本发明可使用的α微管蛋白的几个实例性部分展示于表1中：

表1.布氏锥虫α微管蛋白的实例性部分

构建体	氨基酸序列	肽的位置
			1-10(18aa)	REAICIHIGQAGCQVGNA(SEQ ID NO.4)	2-19
2-13(14aa)	TGSGLGALLLERLS(SEQ ID NO.5)	145-158
			3-17(24aa)	YNSVLSTHSLLEHTDVAAMLDNEA(SEQ ID NO.6)	185-208
4-11(15aa)	NRLIGQVVSSLTASL(SEQ ID NO.7)	228-242
			5-18(14aa)	IHFVLTSYAPVISA(SEQ ID NO.8)	265-278
6-19(21aa)	LSVSEISNAVFEPASMMTKCD(SEQ ID NO.9)	286-306
			7-29(18aa)	DVNAAVATIKTKRTIQFV(SEQ ID NO.10)	327-344
8-21(20aa)	VCMIANSTAIAEVFARIDHK(SEQ ID NO.11)	375-394

β微管蛋白

在某些实施例中，在本发明的疫苗组合物中使用全长β微管蛋白。在一些实施例中，使用β微管蛋白的一个或一个以上的部分和/或结构域。在某些实施例中，利用两个或三个或三个以上的部分和/或结构域作为一个或一个以上的单独的多肽或连接在一起的一个或一个以上的融合多肽。根据本发明可使用的β微管蛋白的几个实例性部分展示于表2中：

表2.布氏锥虫β微管蛋白的实例性部分

构建体	氨基酸序列	肽的位置
			1-1(18aa)	DEHGVDPTGTYQGDSDLQ(SEQ ID NO.12)	26-43
2-4(9aa)	PRSVLIDLE(SEQ ID NO.13)	61-69
			3-24(13aa)	SVRAGPYGQIFRP(SEQ ID NO.14)	75-89
4-12(23aa)	LLISKLREQYPDRIMMTFSIIPS(SEQ ID NO.15)	150-172
			5-14(14aa)	HQLVENSDESMCID(SEQ ID NO.16)	190-203
6-18(12aa)	VSAVVSGVTCCL(SEQ ID NO.17)	229-240
			7-19(11aa)	QYRGLSVPELT(SEQ ID NO.18)	280-290
8-22(17aa)	SYFIEWIPNNIKSSVCD(SEQ ID NO.19)	339-355
			9-25(12aa)	PPKGLKMAVTFI(SEQ ID NO.20)	357-368
10-28(20aa)	NTCIQEMFRRVGEQFTLMFR(SEQ ID NO.21)	371-390
			11-31(15aa)	DATIEEEGEFDEEEQ(SEQ ID NO.22)	427-441

MAP15

在某些实施例中，在本发明的疫苗组合物中使用全长MAP15。在一些实施例中，使用MAP15的一个或一个以上的部分和/或结构域。在某些实施例中，利用两个或三个或三个以上的部分和/或结构域作为一个或一个以上的单独的多肽或连接在一起的一个或一个以上的融合多肽。根据本发明可使用的MAP15的几个实例性部分展示于表3中：

表3.布氏锥虫MAP15的实例性部分

构建体	氨基酸序列	肽的位置
			1c-26(25aa)	ARATAVPKKAVAKKAAPKKTVAKKA(SEQ ID NO.23)	1-25
2c-30(31aa)	ARATAVPKKAVAKKAAPKKTVAKKAAPKKAV(SEQ ID NO.24)	1-31
			3c-4(24aa)	AKKVAPKKAVAKKVVAKKAVAKKV(SEQ ID NO.25)	32-55
4c-34(30aa)	VAKKVAPKKVVAKKVAPKKVAGKKAAAKKA(SEQ ID NO.26)	56-85
			5c-37(26aa)	VAPKKVVAKKVAPKKVAGKKAAAKKA(SEQ ID NO.27)	60-85

作为实例性抗原，利用选自布氏锥虫α微管蛋白、β微管蛋白、和/或MAP15的序列，如本文所详细阐述者。然而，所属领域的技术人员应理解，本文所提供的方法和组合物可适于利用任何锥虫序列。所属领域的技术人员还应理解，本文所提供的方法和组合物可适于利用任何锥虫物种和/或亚型的序列。所述变化可预期并涵盖于本文所提供的方法和组合物中。

锥虫抗原的产生

根据本发明，锥虫(例如，布氏锥虫)抗原(包括锥虫蛋白、其多个部分、片段、结构域、变体、和/或融合物)可在任何合意的系统中产生；产生并不限于植物系统。载体构建体和表达系统已为所属领域习知且可适于纳入本文所提供锥虫抗原的使用中。例如，锥虫抗原(包括锥虫蛋白、其多个部分、片段、结构域、变体、和/或融合物)可在已知表达系统中产生，其包括哺乳动物细胞系统、转基因动物、微生物表达系统、昆虫细胞系统、和植物系统(包括转基因和暂时植物系统)。尤其是在锥虫抗原作为融合蛋白产生的情况下，可能希望在非植物系统中产生所述融合蛋白。

在本发明的一些实施例中，锥虫抗原合意地在植物系统中产生。植物相对易于以遗传方式进行操纵，且具有许多优于替代源(例如，人体液、动物细胞系、重组微生物和转基因动物)的优点。植物具有用于蛋白质的复杂的转译后修饰机器，所述机器类似于哺乳动物的机器(但应注意，植物与哺乳动物之间的糖基化模式有一些差别)。此使得能够在植物组织中产生生物活性试剂。而且，植物可以经济地产生极大量的生物质而不需要复杂的设施。因此，在植物中产生蛋白质通常需要远比使用其它系统产生蛋白质所需低的资金投资和商品成本。而且，植物不受动物病原体的污染。如同脂质体和微荚膜一样，预计植物细胞对抗原通过胃肠道提供保护作用。在许多情况下，在植物中产生蛋白质使得消费安全得以提高。

可利用植物通过使用各种产生系统来产生异源蛋白。一种所述系统包括使用转基因/基因修饰植物，其中编码靶产物的基因永久地纳入植物基因组。转基因系统可生成作物生产系统。各种外源蛋白(包括许多哺乳动物起源和许多疫苗候选抗原)已经在转基因植物中表达且已知具有功能活性(塔克特(Tacket)等人，2000，传染病杂志(J.Infect.Dis.)，182：302；和萨纳吾勒(Thanavala)等人，2005，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，102：3378)。另外，将表达B型肝炎主要表面抗原的未经加工的转基因植物投与给未经免疫的人类志愿者使得产生免疫反应(卡普斯塔(Kapusta)等人，1999，美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J.)，13：1796)。

在植物中表达多肽的一种系统利用经改造以表达外源序列的植物病毒载体(例如，暂时表达)。这种途径允许使用健康的非转基因植物作为迅速生产系统。因此，基因工程植物和经重组植物病毒感染的植物可作为“绿色工厂”来迅速生成和产生所关注的特定蛋白质。植物病毒具有使得其作为表达载体用于外源蛋白产生具有吸引力的一些优点。植物RNA病毒的许多成员已经充分表征，且感染性cDNA克隆可用于促进遗传操纵。一旦感染性病毒基因物质进入易感宿主细胞，则其复制达高水平并迅速在整个植株中传播。有许多种途径可使用植物病毒表达载体来产生靶多肽，其包括将靶多肽纳入病毒基因组。一种途径涉及改造感染细菌、动物或植物的病毒的外壳蛋白以起抗原肽的载体分子的作用。所述载体蛋白质具有组装和形成在表面上展示合意的抗原表位的重组病毒样颗粒的潜力。这种途径允许时间有效地产生疫苗候选物，这是因为疫苗候选物的微粒性质有利于自植物组织容易且成本有效地回收。额外的优点包括增强的靶特异性免疫原性，纳入多个疫苗决定因子的可能性，和容易的调配成可经鼻、经口或非经肠递送的疫苗。例如，含重组植物病毒颗粒并携载融合到外壳蛋白的病毒的表位的菠菜叶子当投与时已生成免疫反应(孟德斯卡(Modelska)等人，1998，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，95：2481；和尤西波夫(Yusibov)等人，2002，疫苗(Vaccine)，19/20：3155)。

植物表达系统

根据本发明，可使用对纳入和/或维持异源核酸敏感且能够产生异源蛋白的任何植物。通常，经常会想要使用在指定条件下(例如温室和/或水性系统中)能够顺从生长的植物。可能想要选择通常人类或家养动物不食用和/或通常不作为人类食物链一部分的植物，以使其可在外面生长而无需考虑所表达多核苷酸可能被不合意地摄取。然而，在一些实施例中，可能想要利用可食用植物。在特定实施例中，将期望利用所表达多肽累积在植物的可食用部分的植物。

通常，某些想要的植物特征将由欲表达的特定多核苷酸决定。仅举几个例子，当多核苷酸编码欲以高产率生产的蛋白质时(如通常是如下情形，例如，当欲表达抗原蛋白时)，通常将想要选择具有相对高生物质的植物(例如，烟草，其具有对病毒感染高度敏感的额外优势，具有短的生长期且不在人类食物链中)。当多核苷酸编码其完整活性需要特定转录后修饰(或受其抑制)的抗原蛋白时，则可直接选择某些有能力(或无能力)完成相关修饰(例如，特定糖基化)的植物种类。例如，植物能够完成某些转译后修饰(例如，糖基化)，然而，植物将不能生成唾液酸化模式，唾液酸化模式是哺乳动物中发现的转译后修饰。因此，植物产生抗原可使得产生不同于在替代系统中所产生的一致蛋白质序列的实体。

在本发明的某些实施例中，使用农作物或农作物相关植物。在某些特定实施例中，利用可食用植物。

根据本发明使用的植物包括被子植物(Angiosperms)、苔藓植物(Bryophytes)(例如，苔纲(Hepaticae)、藓纲(Musci)等)、蕨类植物(Pteridophytes)(例如，蕨类(ferns)、木贼类(horsetails)、石松类(lycopods))、裸子植物(Gymnosperms)(例如，松柏类(conifers)、苏铁类(cycads)、银杏类(Ginkgo)、买麻藤目(Gnetales))和藻类(Algae)(例如，绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophpyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、蓝藻纲(Myxophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)和裸藻纲(Euglenophyceae))。实例性植物是以下各科的成员：豆科(Leguminosae，Fabaceae，例如，豌豆、苜蓿、大豆)；禾本科(Gramineae，Poaceae，例如，玉米、小麦、水稻)；茄科(Solanaceae)，尤其是以下各属：番茄属(Lycopersicon)(例如，番茄)、茄属(Solanum)(例如，马铃薯、茄子)、辣椒属(Capsium)(例如，胡椒)或烟草属(Nicotiana)(例如，烟草)；伞形科(Umbelliferae)，尤其是以下各属：胡萝卜属(Daucus)(例如，胡萝卜)、芹菜属(Apium)(例如，芹菜)、或芸香科(Rutaceae)(例如，柑桔类)；菊科(Compositae)，尤其是莴苣属(Lactuca)(例如，莴苣)；十字花科(Brassicaceae，Cruciferae)，尤其是以下各属：芸苔属(Brassica)或白芥属(Sinapis)。在某些方面，本发明的植物可为芸苔属或鼠耳芥属(Arabidopsis genus)。一些实例性十字花科家族成员包括油菜(Brassica campestris)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)、芥菜(B.juncea)、甘蓝型油菜(B.napus)、黑芥(B.nigra)、芽甘蓝(B.oleraceae)、撒哈拉芥(B.tournifortii)、白芥(Sinapis alba)和萝卜(Raphanussativus)。可改善转化且可使用萌芽幼苗的一些合适植物包括苜蓿、绿豆、小萝卜、小麦、芥菜、菠菜、胡萝卜、甜菜、洋葱、大蒜、芹菜、大黄、阔叶植物(例如甘蓝或莴苣、水田芥菜或水芹)、草本植物(例如荷兰芹、薄荷、或三叶草)、花椰菜、绿花椰菜、大豆、小扁豆、可食用花(例如向日葵、豌豆)等。

将载体引入植物中

通常，载体可根据已知技术递送到植物中。例如，可将载体自身直接施加到植物(例如，经由打磨接种、机械喷雾接种、真空浸润、粒子轰击或电穿孔)。或者或另外，可制备病毒体(例如，自已感染的植物制备)，且可根据已知技术施加到其它植物。

已知有多种感染各种植物种类的病毒，且根据本发明可用于多核苷酸表达(参见，例如，在病毒的分类和命名(The Classification and Nomenclature of Viruses)，“国际病毒分类学委员会第六次报告(Sixth Report of the International Committee on Taxonomy ofViruses)”(编辑墨菲(Murphy)等人，施普林格出版公司(Springer Verlag)：纽约(NewYork)，1995，其整体内容以引用的方式并入本文中；格里尔森(Grierson)等人，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)，Blackie，伦敦(London)，第126-146页，1984；告鲁斯曼(Gluzman)等人，分子生物中的通信：病毒载体(Communications in MolecularBiology：Viral Vectors)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(ColdSpring Harbor)，NY，第172-189页，1988；和马正修(Mathew)，植物病毒在线(PlantViruses Online)(http://image.fs.uidaho.edu/vide/)。在本发明某些实施例中，并不是将单个病毒载体递送到植物细胞，而是递送可共同允许病毒载体复制(且任选地细胞至细胞间和/或长距离运动)的多个不同载体。一些或所有所述蛋白质可由转基因植物的基因组编码。在本文进一步详细阐述的某些方面中，这些系统包括一个或一个以上的病毒载体组件。

载体系统包括两种异源植物病毒的组件以获得易于感染宽范围植物类型但仅造成较少或没有传染性传播风险的系统。实例性系统在此前已进行了阐述(参见，例如PCT公开案WO 00/25574和美国专利公开案2005/0026291，其二者均以引用的方式并入本文中)。如本文所提示，在本发明的特定方面中，(例如)通过浸润或机械接种、喷雾等将病毒载体施加到植物(例如，植物、植物的一部分、幼芽等)。在通过将病毒基因组直接施加到植物完成感染的情况下，可使用任何可用技术制备基因组。例如，根据本发明可有效使用的许多病毒具有ssRNA基因组。可通过在活体内或活体外转录基因组的DNA拷贝或通过复制RNA拷贝来制备ssRNA。鉴于容易使用的活体外转录系统(例如，SP6、T7、网织红细胞裂解物等)的易使用性以及保持RNA载体的DNA拷贝的方便性，所以预期本发明ssRNA载体通常将通过活体外转录(尤其利用T7或SP6聚合酶)来制备。

在本发明的某些实施例中，不是将单一病毒载体类型引入植物中，而是引入多个不同病毒载体。对于诸如复制、细胞至细胞间运动和/或长距离运动等功能，所述载体可(例如)彼此反式互补。载体可含有编码本发明锥虫抗原的不同多核苷酸。对于表达编码一种或一种以上的锥虫抗原的多个多肽的植物或其部分的选择可如以上针对单一多核苷酸或多肽所述来执行。

植物组织表达系统

如上文所讨论，根据本发明，锥虫抗原可在任何合意的系统中产生。载体构建体和表达系统已为所属领域中所熟知，且可适于合并使用本文所提供的锥虫抗原。例如，已知转基因植物产生，且可根据所属领域中已知的技术来调适构建体的生成和植物产生。在一些实施例中，植物中的暂时表达系统是合意的。两种所述系统包括克隆根和克隆植物系统、和其衍生物的产生、以及萌芽幼苗系统的产生。

克隆植物

克隆根保留RNA病毒表达载体且在延长的时期内和多次继代培养后均匀地在整个根部中稳定产生靶蛋白。与其中靶基因在细胞至细胞间或长距离运动期间经由重组而消除的植物相反，在根培养物中，保留病毒载体的完整性且所产生靶蛋白的水平随时间流逝仍与在初始筛选期间所观察到的水平类似。克隆根使得易于产生用于抗原和疫苗组合物的口服调配物的异源蛋白物质。用于生成各种源自植物用于产生抗原(例如，本发明抗原蛋白)的克隆实体的方法和试剂在此前已进行了阐述且已为所属领域习知(参见，例如，PCT公开案WO 05/81905，其以引用的方式并入本文中)。克隆实体包括能够产生抗原(例如，本发明的抗原蛋白)克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系、和克隆植物。本发明进一步提供用于在源自各种植物组织(例如，根，叶)的克隆细胞系中与在源自单个细胞的完整植物(克隆植物)中表达抗原多核苷酸和多肽产物的方法和试剂。所述方法通常基于各种类型植物病毒载体的使用。

例如，在一方面中，本发明提供获得表达编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的克隆根系的方法，所述方法包含以下步骤：(i)将包含编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的病毒载体引入植物或其一部分中；和(ii)自植物生成一个或一个以上的克隆根系。例如，可通过用可引起发根形成的土壤杆菌(Agrobacterium)(例如，发根土壤杆菌(A.rhizogenes))感染植物或植物一部分(例如，收获的一片叶子)生成克隆根系。可以各种方式筛选克隆根系以鉴别出保留病毒的各系、高水平表达编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的各系等。本发明进一步提供克隆根系(例如，根据本发明方法产生的克隆根系)且进一步涵盖使用克隆根系表达多核苷酸并产生编码本发明锥虫抗原的多肽的方法。

本发明进一步提供生成表达编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的克隆根细胞系的方法，其包含以下步骤：(i)生成克隆根系，所述克隆根系的细胞含有病毒载体，所述病毒载体的基因组包含编码本发明锥虫抗原的多核苷酸；(ii)自克隆根系释放个别细胞；和(iii)将细胞维持在适于根细胞增殖的条件下。本发明提供克隆根细胞系和使用克隆根细胞系表达多核苷酸并产生多肽的方法。

在一方面中，本发明提供生成表达编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的克隆植物细胞系的方法，其包含以下步骤：(i)生成克隆根系，所述克隆根系的细胞含有病毒载体，所述病毒载体的基因组包含编码本发明锥虫抗原的多核苷酸；(ii)自克隆根系释放个别细胞；和(iii)将细胞维持在适于植物细胞增殖的条件下进行培养。本发明进一步提供生成表达编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的克隆植物细胞系的方法，其包含以下步骤：(i)将包含编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的病毒载体引入保持在培养物中的植物细胞系的细胞中；和(ii)富集含有病毒载体的细胞。例如，富集可如下实施：(i)自培养物中取出一部分细胞；(ii)稀释所取出的细胞以降低细胞浓度；(iii)使经稀释的细胞进行增殖；和(iv)筛选含有病毒载体的细胞。克隆植物细胞系可用于产生本发明的锥虫抗原。

本发明包括用于生成克隆植物的许多种方法，所述植物的细胞含有包含编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的病毒载体。例如，本发明提供生成表达编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的克隆植物的方法，其包含以下步骤：(i)生成克隆根系，所述克隆根系的细胞包含病毒载体，所述病毒载体的基因组包含编码本发明锥虫抗原的多核苷酸；(ii)自克隆根系释放个别细胞；和(iii)将所释放细胞维持在适于植株形成的条件下。本发明进一步提供生成表达编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的克隆植物的方法，其包含以下步骤：(i)生成克隆细胞系，所述克隆植物细胞系的细胞含有病毒载体，所述病毒载体的基因组包含编码本发明锥虫抗原的多核苷酸；和(ii)将细胞维持在在适于植株形成的条件下。通常，本发明的克隆植物可表达编码本发明锥虫抗原的任何多核苷酸。所述克隆植物可用于产生抗原多肽。

如上所述，本发明提供用于在克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系(例如，源自叶、茎等的细胞系)和克隆植物中表达一个或一个以上的编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的系统。使用病毒载体将编码本发明锥虫抗原的多核苷酸引入祖代植物细胞中，所述病毒载体的基因组包括以可操作方式连接到启动子(即，在其控制下)的编码本发明锥虫抗原的多核苷酸。根据下文进一步阐述的若干技术中的任一种由含病毒的细胞构建克隆根系或克隆植物细胞系。可通过注射、用病毒转录物或感染性cDNA克隆接种、电穿孔、T-DNA介导的基因转移等将植物病毒载体或其各部分引入植物细胞中。

以下章节阐述生成表达编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系、和克隆植物的方法。“根系”不同于“根细胞系”，原因在于根系产生真实根状结构或根而根细胞系则由不会形成根状结构的根细胞构成。术语“系”的使用意欲表示，所述系的细胞可增殖且可将遗传信息传递给后代细胞。细胞系的细胞通常在培养物中增殖而不作为有组织结构(诸如那些在完整植物中所发现的)的一部分。术语“根系”的使用意欲表示，根结构中细胞可增殖而不作为完整植物的一部分。应注意，术语“植物细胞”涵盖根细胞。然而，为使本发明用于生成根系和根细胞系的方法与那些用于直接自非根组织生成植物细胞系(与自克隆根系或源自克隆根系的克隆植物生成克隆植物细胞系相反)的方法加以区分，本文所用术语“植物细胞”和“植物细胞系”一般指构成非根植物组织的细胞和细胞系。植物细胞可来自(例如)叶、茎、芽、花部分等。应注意，种子可源自本文所产生的克隆植物。所述种子可含有病毒载体，同样由所述种子获得的植株也将含有所述病毒载体。获得种子储备品的方法已为所属领域熟知(参见，例如，美国专利公开案2004/093643)。

克隆根系

本发明提供用于生成其中使用植物病毒载体引导编码本发明锥虫抗原的多核苷酸表达的克隆根系的系统。根据许多已知方法中的任一者将一个或一个以上的包括以可操作方式连接到启动子的编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的病毒表达载体引入植物或其一部分中。例如，植物的叶子可用病毒转录物接种。可将载体自身直接施加到植物(例如，经由打磨接种、机械喷雾接种、真空浸润、粒子轰击或电穿孔)。或者或另外，可制备病毒体(例如，自己感染的植物制备)，且可根据已知技术施加到其它植物。

当通过将病毒基因组直接施加到植物来实现感染时，可利用任何可用技术制备病毒基因组。例如，许多根据本发明可有效使用的病毒具有ssRNA基因组。可通过在活体内或活体外转录基因组的DNA拷贝或通过复制RNA拷贝来制备ssRNA。鉴于容易使用的活体外转录系统(例如，SP6、T7、网织红细胞裂解物等)的易于使用性以及保持RNA载体DNA拷贝的方便性，所以预期本发明ssRNA载体通常将通过活体外转录(尤其利用T7或SP6聚合酶)来制备。可使用感染性cDNA克隆。根据所属领域已知方法可利用土壤杆菌介导的基因转移使用(例如)土壤杆菌浸润法(agroinfiltration)将病毒核酸(诸如完整病毒基因组或其各部分)转移到植物细胞中。

然后可在适于病毒转录物复制的条件下维持(例如，培养或生长)植物或植物的一分部。在本发明某些实施例中，病毒传播超出初始接种的细胞，例如，由细胞到细胞的局部传播和/或由初始接种的叶子进入其它叶子的系统性传播。然而，在本发明的一些实施例中，病毒并未传播。因此，病毒载体可包含编码功能性MP和/或CP的基因，但可缺少一或两个所述基因。通常，将病毒载体引入(感染)植物或其一部分的多个细胞中。

在将病毒载体引入植物之后，收获叶子。通常，可在引入病毒载体之后的任何时间收获叶子。然而，可能期望在将病毒载体引入植物之后将所述植物保持一段时间，例如，一段足以使病毒复制且任选地使病毒由病毒最初引入的细胞传播的时间。通过(例如)下文进一步阐述的已知方法制备克隆根培养物(或多个培养物)。

通常，可利用任何可用方法自己引入病毒载体的植物或植物组织制备克隆根培养物。一种所述方法利用存在于某些细菌质粒中的基因。这些质粒发现于各种可感染多种有机体并向其转移DNA的土壤杆菌中。作为一个属，土壤杆菌可将DNA转移到大量的各种植物类型中，其包括许多双子叶和单子叶被子植物物种和裸子植物(参见，例如，吉尔文(Gelvin)，2003，微生物学与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Rev.，67：16)和其中的参考文献，其所有均以引用的方式并入本文中。植物细胞基因转化的分子基础是，存于各种土壤杆菌种类内的大型肿瘤诱导(Ti)或生根(Ri)质粒的一个区域自细菌转移出并整合到植物核基因组上。存在于所述质粒中时这个区域称作T-区而自质粒切除后称作T-DNA。通常，在天然存在的土壤杆菌感染中单链T-DNA分子转移到植物细胞中且最终纳入(以双链形式)基因组中。基于Ti质粒的系统广泛将外源遗传物质引入植物中且用于转基因植物的产生。

利用各种土壤杆菌种类和T-DNA的转移感染植物具有多种作用。例如，根瘤土壤杆菌会引起冠瘿病而发根土壤杆菌会在感染部位导致发根的生长(一种称作“发根病”的病状)。每一个根可由单一基因转化的细胞产生。因此，根中的根细胞是克隆的，且每一根代表一个细胞克隆群。通过发根土壤杆菌感染所产生根的特征在于高生长速率和遗传稳定性(吉瑞(Giri)等人，2000，生物技术研究进展(Biotech.Adv.)，18：1和其中的参考文献，其所有均以引用的方式并入本文中)。此外，这些根能够再生出遗传稳定的植物(吉瑞(Giri)2000，同以上参考文献)。

通常，本发明涵盖任何土壤杆菌菌株(尤其是发根土壤杆菌菌株)的使用，其能够自植物细胞诱导根的形成。如上文所提及，Ri质粒的一部分(Ri T-DNA)是引起发根病的原因。而Ri质粒此部分向植物细胞的转移可方便地通过用携带Ri质粒的土壤杆菌感染来实现，本发明还涵盖使用将相关区域引入植物细胞的替代方法。所述方法包括可将遗传物质引入植物细胞的任何可用方法，其包括基因枪法(biolistics)、电穿孔、PEG介导的DNA摄取、基于Ti的载体等。也可借助病毒载体将Ri T-DNA的相关部分引入植物细胞中。Ri基因可包括在含有编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的相同载体中或不同病毒载体中，所述不同病毒载体可与含有编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的载体为相同或不同类型。应注意，对于产生发根可能不需要整个Ri T-DNA，且本发明涵盖Ri T-DNA各部分的应用，但限制条件是所述部分含有足以诱发根形成的遗传物质，如所属领域所已知。根据本发明也可将额外遗传物质(例如，存在于Ri质粒内但不存在于T-DNA内的基因)转移到植物细胞，所述额外遗传物质特别是表达产物促使T-DNA整合于植物细胞DNA中的基因。

为根据本发明某些实施例制备克隆根系，使收获的叶子部分与发根土壤杆菌在适于感染和转化的条件下接触。将叶子部分保持在培养物中以使发根形成。每一根都是克隆根，即，根中的细胞源自Ri T-DNA转移到其中的单一祖细胞。根据本发明，所述祖细胞的一部分将含有病毒载体。因此，源自这一祖细胞的根中的细胞将含有病毒载体，原因在于病毒载体将复制并在细胞分裂过程中传递。因此高比例(例如，至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、所有(100％)或大体上所有(至少98％)的细胞将含有病毒载体。应注意，由于病毒载体在克隆根内由子细胞继承，所以根内病毒载体的运动对于将病毒载体保持在整个根内并非必需的。个别克隆发根可从叶子部分去除并进一步培养。所述根在本文中也称作根系。分离的克隆根在分离后继续生长。

使用本发明方法已生成许多不同的克隆根系。所述根系是使用含有编码本发明锥虫抗原(例如，编码包括锥虫蛋白、其各部分、片段、结构域、变体和/或融合物)的多核苷酸的病毒载体生成。根系通过西方印迹加以测试。根系展现出各种多肽的多种不同的表达水平。选出展现高表达的根系且进一步培养。随后对这些根系再次进行测试，且显示在延长时期内保持高表达水平，此表明具有稳定性。表达水平相当于或大于用与生成克隆根系所用者相同的病毒载体感染的完整植物中的表达水平。此外，根系表达的稳定性优于用相同病毒载体感染的植物中所获得的稳定性。多达80％的所述经病毒感染植物在2到3次传代后恢复成野生型。(所述传代涉及用转录物接种植物，使感染(局部或系统性)得到确立，取叶子样品，并接种随后用于表达测试的新鲜植物。)

可大规模培养根系用于产生本发明多肽的抗原，如下文进一步论述。应注意，通常将克隆根系(和源自克隆根系的细胞系)保持在不包括通常在根和植物细胞培养中所用的各种化合物(例如，诸如植物生长素、细胞分裂素等植物生长激素)的培养基中。此特征大大降低了与组织培养相关的费用，且发明者预计此会对利用植物生产蛋白质的经济可行性起到明显作用。

可使用多种方法中的任一者来选择表达本发明锥虫抗原的多核苷酸的克隆根。西方印迹、ELISA分析等均可用来检测经编码的多肽。在可检测标记物(诸如GFP)的情形中，可实施替代方法，诸如肉眼筛选。如果使用包含编码可选标记物的多核苷酸的病毒载体，则可进行适当选择(例如，可在适宜抗生素存在下或营养条件存在下培养源自其的叶子材料和/或根且鉴别并分离存活根)。某些病毒载体含有两种或两种以上的编码本发明锥虫抗原的多核苷酸，例如，两种或两种以上的编码不同多肽的多核苷酸。如果这些中的一个是可选择或可检测标记物，则通过选择或检测标记物的表达来选择或检测的克隆根会很有可能同时表达第二多核苷酸。也可使用PCR和其它核酸检测方法实施包含特定多核苷酸的根系的筛选。

或者或另外，可通过接种病毒感染后将形成局部损伤的宿主植物(例如，超敏宿主植物)来针对是否病毒筛选克隆根系。例如，可将5mg根组织在50μl磷酸盐缓冲液中进行匀浆并用来接种烟草植株的单个叶子。如果病毒存在于根培养物中，则2到3天内经感染叶子上就会出现特征损伤。此意味着根系含有携载编码本发明锥虫抗原的多核苷酸(靶基因)的重组病毒。如果未形成局部损伤，则煤油病毒，且因是阴性而将所述根系舍弃。此方法在时间和成本方面都是相当有效的。初步针对是否存在病毒进行筛选后，使含有病毒的根接受二次筛选，例如，通过西方印迹或ELISA选择高水平表达者。也可应用额外的筛选，例如，针对快速生长、在特定培养基中或特定环境条件下的生长等进行筛选。通常，这些筛选方法可在本文所述克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和/或克隆植物中任一者的形成中应用。

如所属领域的技术人员将了解，可对本发明生成包含病毒载体的克隆根系的方法的阐述进行多种修改。所述修改在本发明的范围内。例如，尽管通常想要在引入RiT-DNA基因之前将病毒载体引入完整植物或其一部分中，但在本发明某些实施例中是在引入病毒载体之前引入Ri-DNA。此外，可能使完整植物与发根土壤杆菌接触，而不是收获叶子部分且随后将其暴露于细菌中。

也可使用由携带病毒载体的植物或其一部分的单个细胞生成克隆根系的其它方法(即，不使用发根土壤杆菌或来自Ri质粒的遗传物质的方法)。例如，已知用某些植物激素或各种植物激素的组合进行处理可引起植物组织上根的形成。

源自克隆根系的克隆细胞系

如上所述，本发明提供生成克隆根系的方法，其中根系中的细胞含有病毒载体。如所属领域所熟知，可由根生成多种不同细胞系。例如，可使用多种已知方法自由根得到的个别根细胞生成根细胞系。所述根细胞系可由根内各种不同根细胞类型获得。通常，根材料经收获和离解(例如，经物理和/或酶促消化)以释放个别根细胞，随后将根细胞进一步培养。通常并不需要完整的原生质体形成。需要时，可以极稀的细胞浓度将根细胞加以铺板，以自单个根细胞获得根细胞系。以此方式获得的根细胞系是含有病毒载体的克隆根细胞系。因此，所述根细胞系展示编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的稳定表达。克隆植物细胞系也可以类似方式自克隆根获得，例如，通过在适宜植物激素存在下培养经离解的根细胞。筛选和连续多轮富集可用来鉴别以高水平表达编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的细胞系。然而，如果获得细胞系的克隆根系已以高水平表达，则无需进行所述额外筛选。

与克隆根系的情形中一样，克隆根细胞系的细胞源自包含病毒载体的单个祖细胞且因此也会含有病毒载体，这是因为病毒载体会复制且在分裂过程中进行传递。因此，高比例(例如，至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、所有(100％)或大体上所有(至少98％))细胞会含有病毒载体。应注意，由于病毒载体可由克隆根细胞系内的子细胞继承，因此细胞中病毒载体的运动对于维持病毒载体并非必需的。克隆根细胞系可用于产生编码本发明锥虫抗原的多核苷酸，如下文所述。

克隆植物细胞系

本发明提供用于生成克隆植物细胞系的方法，其中使用植物病毒载体引导编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的表达。根据本发明方法，将一个或一个以上的包括以可操作方式连接到启动子的编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的病毒表达载体引入保持在细胞培养物中的植物细胞系的细胞中。来自各种植物类型的大量植物细胞系已为所属领域已知，可使用其中的任一者。可根据用于实施本发明的已知方法生成新近获得的细胞系。根据多种方法中的任一者将病毒载体引入植物细胞系细胞中。例如，可产生原生质体且然后将病毒转录物电穿孔进入细胞中。也可使用将植物病毒载体引入植物细胞系细胞的其它方法。

一种生成本发明的克隆植物细胞系和适于引入植物细胞(例如，原生质体)中的病毒载体的方法可应用如下：引入病毒载体后，植物细胞系可维持在组织培养物中。在此期间，病毒载体可复制，且编码本发明锥虫抗原的多核苷酸可进行表达。例如，通过连续富集过程自培养物中获得克隆植物细胞系。例如，可自培养物中移出样品，任选地加以稀释以使细胞浓度降低，并以个别液滴形式铺板于皮氏培养皿(Petri dish)上。然后维持各液滴以使细胞分裂。

应了解，液滴可含有可变数目的细胞，这取决于培养物的初始密度和稀释量。如果想要仅在一轮富集后即获得表达编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的克隆细胞系，则可将细胞稀释以使大多数液滴含有0或1个细胞。然而，可能更为有效的是，选择使每一液滴中存在多个细胞的浓度且随后筛选各液滴以鉴别出含有表达细胞者。通常，可采用任何适宜的筛选程序。例如，可使用可检测标记物(诸如GFP)的选择或检测。可使用西方印迹或ELISA分析。个别液滴(100ul)包含足够多的用于实施这些分析的细胞。实施多轮富集以分离表达水平持续较高的细胞系。可通过使用用于单细胞克隆的标准方法进行进一步限制稀释来生成单克隆植物细胞系(即，源自单个祖细胞的群体)。然而，没必要分离个别克隆系。含有多个克隆细胞系的群体可用于编码本发明的一种或一种以上锥虫抗原的多核苷酸的表达。

通常，将以上关于生成克隆根系所述的某些考虑因素应用于克隆植物细胞系的生成中。例如，多个含有一种或一种以上编码本发明锥虫抗原的多核苷酸的病毒载体可作为多个不同载体的组合来使用。可使用类似的筛选方法。与在克隆根系和克隆根细胞系的情形中一样，克隆植物细胞系的细胞源自含有病毒载体的单个祖细胞且因此也会含有病毒载体，原因在于所述病毒载体会复制且在细胞分裂期间进行传递。因此，高比例(例如，至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、所有(100％)或大体上所有(至少98％))细胞会含有病毒载体。应注意，由于病毒载体是由克隆植物细胞系内的子细胞继承，因此细胞之间病毒载体的运动对于保持病毒载体并非必需的。克隆植物细胞系可用于产生编码本发明锥虫抗原的多肽，如下文所述。

克隆植物

可自根据上文所述各种方法产生的克隆根、克隆根细胞系和/或克隆植物细胞系生成克隆植物。用于自根、根细胞系和植物细胞系(例如本文所述克隆根系、克隆根细胞系和克隆植物细胞系)生成植物的方法为所属领域熟知(参见例如，佩雷斯(Peres)等人，2001，植物细胞、组织与器官培养(Plant Cell，Tissue，Organ Culture)，65：37；和本文其它地方引用的有关植物分子生物学和生物技术方面的标准参考文献)。因此本发明提供生成克隆植物的方法，所述方法包含以下步骤：(i)根据本发明上述方法中的任一者生成克隆根系、克隆根细胞系或克隆植物细胞系；和(ii)自克隆根系、克隆根细胞系或克隆植物生成完整植株。可根据标准方法使克隆植物进行繁殖和生长。

与在克隆根系、克隆根细胞系和克隆植物细胞系的情形中一样，克隆植物的细胞源自包含病毒载体的单个祖细胞且因此也会含有病毒载体，原因在于所述病毒载体会复制且会在细胞分裂过程中进行传递。因此，高比例(例如，至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、所有(100％)或大体上所有(至少98％))细胞会含有病毒载体。应注意，由于病毒载体是由克隆植物内的子细胞继承，因此病毒载体的运动对于保持病毒载体并非必需的。

幼芽和萌芽幼苗植物表达系统

用于生成各种用于产生本发明锥虫抗原的幼芽和萌芽幼苗的系统和试剂在此前已进行了阐述且已为所属领域习知(参见，例如，PCT公开案WO 04/43886，其以引用的方式并入本文中)。本发明进一步提供可使用的萌芽幼苗作为含锥虫抗原的生物质。在某些方面中，提供直接食用的含抗原的组合物的生物质。在一些方面中，生物质在食用之前进行处理，例如，通过匀浆、碾碎、干燥或提取。在某些方面中，从生物质中纯化出锥虫抗原并调配成医药组合物。

另外提供在萌芽幼苗中产生锥虫抗原的方法，所述萌芽幼苗可在活的时候食用或收获(例如，芸苔属的幼芽、萌芽幼苗)。在某些方面中，本发明涉及使种子在封闭可调控环境(例如，室内、容器中等)中生长成可食用萌芽幼苗。种子可为含有编码锥虫抗原的表达盒的基因工程种子，所述锥虫抗原的表达是由外源性诱导启动子驱动。可使用各种可(例如)通过光、加热、植物激素、营养物等诱导的外源性诱导启动子。

在相关实施例中，本发明提供在萌芽幼苗中产生锥虫抗原的方法，所述方法通过首先使用土壤杆菌转化系统利用编码锥虫抗原的表达盒转化植物来生成萌芽幼苗的种子储备品，其中锥虫抗原的表达是由诱导启动子驱动。转基因种子可从转化植物获得，在封闭可调控环境中生长，并经诱导以表达锥虫抗原。

在一些实施例中，提供涉及用编码锥虫抗原的病毒表达盒感染萌芽幼苗的方法，所述锥虫抗原的表达可由病毒启动子或诱导启动子中的任一者驱动。萌芽幼苗在封闭可调控环境中生长2到14天或至少直到已获得足够水平的锥虫抗原用于食用或收获为止。

本发明进一步提供在萌芽幼苗中产生锥虫抗原的系统，所述系统包括具有环境控制的容纳单元和含有编码一种或一种以上的锥虫抗原的表达盒的萌芽幼苗，其中表达是由组成或诱导启动子驱动。系统可提供优于不可控的室外环境或温室的独特优点。因此，本发明能够使种植者准确得知诱导锥虫抗原表达的时间。可极大地减少产生锥虫抗原的时间和成本。

在某些方面中，暂时转染的幼芽含有编码本发明锥虫抗原的病毒载体序列。使幼苗生长一段时期以使得在幼芽中产生病毒核酸，之后是一段生长时期，其中产生病毒的多个拷贝，由此产生锥虫抗原。

在某些方面中，使含有编码锥虫抗原的核酸的基因工程种子或胚胎在封闭可调控环境中生长到萌芽幼苗阶段。所述封闭可调控环境可为种子可在室内生长的容纳单元或室。封闭可调控环境的所有环境因子均可控。由于幼芽不需要光来生长，且照明可能昂贵，因此基因工程种子或胚胎可在室内在缺少光的条件下生长到萌芽幼苗阶段。

在本发明的封闭可调控环境中可调控的其它环境因子包括温度、湿度、水、营养物、气体(例如，O₂或CO₂含量或空气循环)、化学物质(例如诸如糖或糖衍生物等小分子或诸如植物激素、赤霉酸或脱落酸等激素)和诸如此类。

根据本发明的某些方法，编码锥虫抗原的核酸的表达可由外源性诱导启动子控制。外源性诱导启动子使得核酸的表达响应外部而非内部刺激增加或减少。许多环境因子可充当由基因工程幼芽的表达盒所携载核酸的表达的诱导物。启动子可为热诱导启动子，例如热休克启动子。例如，使用热休克启动子，可简单的升高封闭环境的温度来诱导核酸的表达。其它启动子包括光诱导启动子。若封闭可调控环境中的灯一直开着，则光诱导启动子可保持作为组成启动子。或者或另外，核酸的表达可在发育期间的特定时间通过简单的打开灯来启动。启动子可为用于诱导核酸表达的化学诱导启动子。根据这些实施例，化学物质可简单的喷雾或喷射于种子、胚胎或幼苗上来诱导核酸的表达。喷射和喷雾可经精确控制并引导到所期望的靶种子、胚胎或幼苗上。封闭环境没有将使得化学物质散开远离期望靶的风或气流，因此所述化学物质停留在合意的靶上。

根据本发明，诱导表达的时间可经选择以便在收获时锥虫抗原在萌芽幼苗中的表达达到最大。在胚胎中在特定生长阶段诱导表达(例如，在胚胎中在萌芽后特定天数时诱导表达)可在收获时获得锥虫抗原的最大合成。例如，萌芽后4天自启动子诱导表达所获得的蛋白质合成可比在3天后或5天后自启动子诱导表达所获得的蛋白质合成多。所属领域的技术人员应了解，可通过常规实验实现最大表达。在某些方法中，萌芽幼苗是在萌芽后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12天时收获。

在表达载体具有组成启动子而非诱导启动子的情况下，萌芽幼苗可在萌芽幼苗转化后的某一时间时收获。例如，若萌芽幼苗是在发育的早期阶段(例如在胚胎阶段)以病毒方式转化，则萌芽幼苗可在表达处于其转化后最大值时收获，例如在转化后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14天收获。幼芽可以再转化后发育1、2、3或更多个月，此取决于种子的萌芽。

通常，一旦开始锥虫抗原的表达，使种子、胚胎或萌芽幼苗生长直到表达足够水平的锥虫抗原。在某些方面中，足够水平是若生吃所收获的生物质将为患者提供治疗益处的水平。或者或另外，足够水平是锥虫抗原可从生物质浓缩或纯化并调配成当投与时为患者提供治疗益处的医药组合物的水平。通常，锥虫抗原并非萌芽幼苗中实际上所表达的蛋白质。无论如何，锥虫抗原通常以比自然界中萌芽幼苗中将存在的浓度高的浓度表达。

一旦锥虫抗原的表达经诱导，使其生长直到萌芽幼苗阶段，此时收获萌芽幼苗。萌芽幼苗可在活的时候收获。收获活的萌芽幼苗具有许多优点，其包括最小的努力和破坏。本发明的萌芽幼苗可以水培方式生长，此使得收获即是将萌芽幼苗从其水培溶液中提起的简单的事情。本发明萌芽幼苗的生长不需要土壤，但如果所属领域的技术人员认为需要或想要也可提供。由于幼芽可无土壤生长，因此在收获时不需要清洗萌芽幼苗材料。能够直接从水培环境中收获萌芽幼苗而不需要冲洗或擦洗使得所收获物质的破坏最小。植物的破坏和萎蔫包括细胞凋亡。在细胞凋亡期间，某些蛋白水解酶变得活跃，此可使萌芽幼苗中所表达的医药用蛋白质降解，导致蛋白质的治疗活性降低。细胞凋亡诱导的蛋白质水解可明显降低成熟植株的蛋白质产率。使用本发明的方法，直到目前蛋白质从植株中提取出来才收获可避免细胞凋亡。

例如，活的幼芽可经捣碎、碾碎或掺和以在含蛋白酶抑制剂的缓冲液中产生萌芽幼苗生物质浆液。缓冲液可维持在约4℃下。在一些方面中，萌芽幼苗生物质经空气干燥、喷雾干燥、冷冻或冻干。如同在成熟植株中一样，这些方法中的一些(例如空气干燥)可导致医药用蛋白活性损失。然而，由于萌芽幼苗极小且具有大的表面积对体积比，所以此种情况不太可能发生。所属领域的技术人员应了解，使所表达蛋白质的蛋白质水解降到最低的收获生物质的许多技术均可用且可应用于本发明。

在一些实施例中，萌芽幼苗可食用。在某些实施例中，表达足够水平锥虫抗原的萌芽幼苗在收获后食用(例如，收获之后立即、在收获后的最短时期内食用)以便在食用萌芽幼苗之前绝对不加处理。以此方式，在将锥虫抗原投与给需要治疗的患者之前使任何收获诱导的锥虫抗原的蛋白质水解破坏降到最低。例如，可直接将准备好食用的萌芽幼苗供给患者。另一选择为或另外地，将基因工程种子或胚胎供给需要治疗的患者并由患者使其生长到萌芽幼苗阶段。在一方面中，将一批基因工程萌芽幼苗提供给患者或将治疗患者的医师，以便可栽培表达某些合意锥虫抗原的萌芽幼苗的连续储备品。此对于发展中国家的居民可能尤其有价值，在发展中国家昂贵的医药可能负担不起或不能交付使用。本发明萌芽幼苗易于生长使得本发明的萌芽幼苗尤其适用于所述发展中国家群体。

封闭环境的可调控性质赋予本发明优于在室外环境中生长植物的优点。通常，植物中表达医药用蛋白的基因工程萌芽幼苗的生长比生长基因工程植物更快地提供医药产品(因为植株在较小时收获)且具有较少努力、风险和调控因素。本发明所用的封闭可调控环境降低或消除了自然界中植物交叉授粉的风险。

例如，热诱导启动子同样将不能在室外使用，因为室外温度不能控制。启动子将在室外温度升高到高于某一水平的任何时间启动。同样，启动子将在每次室外温度下降时关闭。所述温度改变可能在一天中出现，例如，白天启动表达且晚上关闭。热诱导启动子(例如本文所阐述者)甚至对于在温室中使用也是不可行的，温室对气候改变的敏感性几乎达到与室外一样的程度。在温室中生长基因工程植物成本相当高。相反，在本发明系统中，可控制每一种变量以便每次收获时可获得最大量的表达。

在某些实施例中，本发明萌芽幼苗生长在托盘中，在萌芽幼苗发育期间的任何时间均可洒水、喷射或喷雾。例如，托盘可配备有一个或一个以上的洒水、喷射、喷雾和引流装置，所述装置可在萌芽幼苗发育期间在特定时间且以精确量输送和/或去除水、营养物、化学物质等。例如，种子需要足够水分来使其保持潮湿。过量的水分通过托盘中的孔排入室地板的排水沟中。典型地，排出水经适当处理用于去除有害化学物质，然后排放回环境中。

托盘的另一优点在于其可容纳在极小空间内。由于萌芽幼苗生长不需要光，因此含有种子、胚胎或萌芽幼苗的托盘可可彼此上下地紧密垂直堆栈，此在经构建特定用于这些目的容纳设施中每单位地板空间提供大量的生物质。此外，托盘的堆栈可在容纳单元中以水平行排列。一旦幼苗生长到适于收获的阶段(约2到14天)，则将个别幼苗托盘人工或通过自动机构(例如传送带)移入处理设施中。

本发明系统的独特之处在于其提供为锥虫抗原源的萌芽幼苗生物质。无论是直接食用还是加工成医药组合物的形式，由于萌芽幼苗是在封闭可调控环境中生长，所以萌芽幼苗生物质和/或源自生物质的医药组合物均可以低成本提供给消费者。此外，生长萌芽幼苗的条件可控的事实使得产物的质量和纯度一致。本发明的封闭可调控环境避免了EPA的许多安全规程，这些规程可阻止科学家在室外生长基因工程农产品。

经转化幼芽

可使用各种方法来转化植物细胞并产生基因工程萌芽幼苗。用于转化要求在活体外生成转基因植物细胞系、然后使细胞系再生于完整植物中的植物的两种可用方法包括根瘤土壤杆菌介导的基因转移和微粒轰击或电穿孔。病毒转化是一种转化胚胎和萌芽幼苗的较快速且成本较低的方法，其中可收获所述胚胎和萌芽幼苗而无试验上的或世代上的滞后以获得想要的产物。对于这些技术中的任一者，所属领域的技术人员将了解如何调节和优化传统上用于植物、种子、胚胎、或萌芽幼苗的转化方案。

土壤杆菌转化表达盒

土壤杆菌是革兰氏阴性(gram-negative)菌科根瘤菌科的代表性属。此物种是产生诸如冠瘿和发根病等植物肿瘤的原因。在去分化植物组织(这是肿瘤的特征)中，土壤杆菌产生被称为冠瘿氨基酸的氨基酸衍生物并通过植株进行分解代谢。引起冠瘿氨基酸表达的细菌基因是嵌合表达盒的控制元件的便利源。根据本发明，土壤杆菌转换系统可用于生成可食用萌芽幼苗，只是所述萌芽幼苗比成熟植株早收获。土壤杆菌转化方法可容易地应用以使表达锥虫抗原的萌芽幼苗再生。

通常，转化植物涉及使在组织培养物中生长的植物细胞通过与携载植物/细菌载体的根瘤土壤杆菌一起共同培养来转化。载体含有编码锥虫抗原的基因。土壤杆菌将载体转移到植物宿主细胞中且然后使用抗生素治疗来消除。表达锥虫抗原的经转化植物细胞经选择，分化且最终再生于完整的小植株中(海恩(Hellens)等人，2000，植物分子生物学(Plant Mol.Biol)，42：819；普林-史密斯(Pilon-Smits)等人，1999，植物生理学(Plant Physiolog.)，119：123；巴菲德(Barfield)等人，1991，植物细胞报告(Plant CellReports)，10：308；和瑞沃(Riva)等人，1998，生物工程学报(J.Biotech.)，1(3)；其各自以引用的方式并入本文中)。

用于本发明的表达载体包括编码设计用于在植物中发挥作用的锥虫抗原的基因(或表达盒)，且在表达盒的上游和下游有伴随序列。伴随序列通常是质粒或病毒起源且为载体提供所需特征以将DNA从细菌转移到合意的植物宿主中。

基础细菌/植物载体构建体可合意地提供宽宿主范围的原核生物复制起点(一种原核生物可选标记物)。合适的原核生物可选标记物包括对抗生素(例如氨苄西林(ampicillin)或四环素(tetracycline))的抗性。载体中也可存在所属领域已习知编码额外功能的其它DNA序列。

土壤杆菌介导的DNA至植物染色体的转移需要土壤杆菌T-DNA序列。通常去除T-DNA的肿瘤诱导基因并用编码锥虫抗原的序列代替。保留T-DNA边界序列，因为其引发T-DNA区域至植物基因组的整合。若锥虫抗原的表达并不易于服从检测，则细菌/植物载体构建体可包括在植物细胞已经转化的情况下适于测定的可选标记基因(例如，nptII卡那霉素(kanamycin)抗性基因)。对于相同或不同细菌/植物载体(Ti质粒)而言是Ti序列。Ti序列包括致病基因，所述基因编码致使T-DNA切除、转移和整合于植物基因组中的一系列蛋白质(谢尔(Schell)，1987，科学(Science)，237：1176)。适于允许异源序列整合于植物基因组的其它序列可包括转位子序列和诸如此类用于同源重组。

某些构建体应包括表达抗原蛋白的表达盒。在给定转化中可使用一个、两个或两个以上的表达盒。重组表达盒除锥虫抗原编码序列以外还含有至少以下元件：启动子区域、植物5′未转译序列、起始密码子(取决于所表达基因是否具有其自身)、和转录和转译终止序列。此外，在本发明的表达盒或嵌合基因中可包括转录和转译终止子。视需要，表达盒中可包括允许蛋白质加工和易位的信号释放序列。各种启动子、信号序列和转录和转译终止子阐述于(例如)劳顿(Lawton)等人(1987，植物分子生物学(Plant Mol.Biol)，9：315)和美国专利第5,888,789号中(其二者均以引用的方式并入本文中)。此外，抗生素抗性的结构基因通常用作选择因子(弗瑞雷(Fraley)等人1983，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，80：4803，其以引用的方式并入本文中)。盒的5′和3′端处独特的限制性核酸内切酶位点使得容易的插入预先存在的载体中。已阐述携载至少一个T-DNA边界序列的用于土壤杆菌介导的转化的其它二元载体系统(PCT/EP99/07414，其以引用的方式并入本文中)。

再生

经转化植物的种子可经收获、干燥、清洗并测试生存力和合意基因产物的存在和表达。在确定基因产物的存在和表达之后，通常将种子储备品储存在具有适当温度、湿度、卫生及使用安全性(必要时)的条件下。然后可从所培养的原生质体再生完整植物，例如，如在埃文斯(Evans)等人(植物细胞培养手册(Handbook of Plant CellCultures)，第1卷，麦美伦出版公司(MacMillan Publishing Co.)，纽约(New York)，NY，1983，其以引用的方式并入本文中)；和沃斯(Vasil)(编辑，植物的细胞培养和体细胞遗传(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)，美国学术出版社(Acad.Press)，奥兰多(Orlando)，FL，第I卷，1984和第III卷，1986，其以引用的方式并入本文中)。在某些方面中，植物仅再生到萌芽幼苗阶段。在一些方面中，使完整植物再生以产生种子储备品并从种子储备品的种子生成萌芽幼苗。

可分离出原生质体并进行培养以获得完整再生植物的所有植物均可通过本发明进行转化以便回收含转移基因的完整植物。已知实际上所有植物均可从培养的细胞或组织再生，其包括(但不限于)产生可食用幼芽的植物的所有主要种类。一些合适的植物包括苜蓿、绿豆、小萝卜、小麦、芥菜、菠菜、胡萝卜、甜菜、洋葱、大蒜、芹菜、大黄、阔叶植物(例如甘蓝或莴苣、水田芥菜或水芹)、草本植物(例如荷兰芹、薄荷、或三叶草)、花椰菜、绿花椰菜、大豆、小扁豆、可食用花(例如向日葵)等。

用于再生的方式植物种类之间有所不同。然而，所属领域的技术人员应了解，通常首先获得含异源基因拷贝的经转化原生质体的悬浮液。形成愈伤组织且可自愈伤组织诱导芽并随后生根。或者或另外，可自原生质体悬浮液诱导胚胎形成。这些胚胎如同天然胚胎一样萌芽以形成植株。将种子浸泡于水中或用水喷洒种子以使种子的水含量增加到35-45％之间来引发萌芽。为进行萌芽，通常将种子在控制温度和空气流动条件下维持在饱和水气中。培养基通常应含有各种氨基酸和激素(例如植物生长素和细胞分裂素)。在培养基中添加谷氨酸和脯氨酸是有利的，尤其对于诸如苜蓿等物种而言。芽和根正常地同时发育。有效再生将取决于培养基、基因型和培养物的历史。若这三个变量均经控制，则再生完全可重现且可重复。

使从经转化植物细胞生长的成熟植株自交并鉴别出不分离的纯合转基因植物。近交植株产生含本发明抗原编码序列的种子。所述种子可萌芽并生长到萌芽幼苗阶段以产生本发明的锥虫抗原。

在相关实施例中，本发明的种子可形成种子产品并出售，附带如何使幼苗生长到适当的萌芽幼苗阶段用于投与或收获变成医药组合物的说明书。在一些相关实施例中，从本发明的近交植株可开发出体现想要的特性的杂种或新颖变种。

直接整合

通过微粒轰击或电穿孔将DNA片段直接整合到植物细胞的基因组中可用于本发明中(参见，例如基克特(Kikkert)等人，1999，Plant：J.Tiss.Cult.Assoc，35：43；贝特斯(Bates)，1994，分子生物技术(Mol.Biotech.)，2：135)。更具体地说，表达本发明锥虫抗原的载体可通过各种技术引入植物细胞中。如上文所阐述，载体可包括在植物细胞中使用的可选标记物。载体可包括允许在中间宿主中选择并繁殖的序列，例如含有复制起点和可选标记物的序列。典型地，中间宿主包括细菌和酵母菌。在一个实施例中，中间宿主是细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)，复制起点是colE1型复制起点)且可选标记物是编码氨苄西林抗性的基因。所述序列已为所属领域习知且市面上有售(例如，克隆技术(Clontech)，帕罗奥图(Palo Alto)，CA或Stratagene，拉由拉市(La Jolla)，CA)。

本发明的载体可修饰成中间植物转化质粒，所述质粒含有与根瘤土壤杆菌载体同源的区域、来自根瘤土壤杆菌的T-DNA边界区域和上述抗原编码核酸或表达盒。其它载体可包括诱导根瘤土壤杆菌质粒的非致瘤植物肿瘤。

根据此实施例，本发明载体的直接转化可涉及借助微量移液管将载体直接微注入植物细胞中以机械转移重组DNA(参见，例如克洛斯威(Crossway)，1985，分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)，202：179，其以引用的方式并入本文中)。遗传物质可使用聚乙二醇转移到植物细胞中(参见，例如克伦斯(Krens)等人，1982，自然(Nature)296：72)。将核酸引入植物中的另一种方法是通过小颗粒的高速弹道穿透，小珠粒或颗粒的基质内或表面上具有核酸(参见，例如克莱恩(Klein)等人，1987，自然(Nature)327：70；克努森(Knudsen)等人，植物学(Planta)，185：330)。引入的再一种方法是使原生质体与其它实体微细胞、细胞、溶酶体或表面为可融合脂质的其它小体融合(参见，例如弗雷利(Fraley)等人，1982，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，79：1859)。本发明载体可通过电穿孔引入植物细胞中(参见，例如弗洛姆(Fromm)等人1985，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，82：5824)。根据此技术，在含基因构建体的质粒的存在下使植物原生质体电穿孔。高场强的电脉冲可逆地对生物膜进行可渗透化处理以允许引入质粒。经电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁，隔开并形成植物愈伤组织，所述组织可再生以形成本发明的萌芽幼苗。所属领域的技术人员将了解如何利用这些方法来转化可用于生成可食用萌芽幼苗的植物细胞。

病毒转化

类似于常规表达系统，植物病毒载体可用于产生全长蛋白质(包括全长抗原)。根据本发明，植物病毒载体可用于感染种子、胚胎、萌芽幼苗等并在其中产生抗原。病毒系统可用于表达从短肽到复杂的大蛋白质等各种物质。具体来说，已阐述使用烟草病毒载体，例如，麦考密克(McCormick)等人(1999，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，96：703；熊谷(Kumagai)等人2000，基因(Gene)，245：169；和维尔赤(Verch)等人，1998，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)，220：69；其所有均以引用的方式并入本文中)。因此，植物病毒载体具有已经证明的表达短肽以及大的复杂蛋白质的能力。

在某些实施例中，利用宿主/病毒系统生成表达锥虫抗原的转基因幼芽。通过病毒感染所产生的转基因幼芽提供已经证明安全的转基因蛋白源。例如，幼芽不受动物病原体的污染。与(例如)烟草不同，来自可食用幼芽的蛋白质至少理论上可用于口服应用中而无需纯化，此明显降低成本。此外，病毒/幼芽系统为扩大规模和制造提供更简单更便宜的途径，由于将转基因引入病毒中，其可在数天内生长直到达商业规模。相反，在有足够的种子或植物材料可用于大规模试验或商业化之前，转基因植物可需要长达5-7年。

根据本发明，植物RNA病毒具有某些优点，所述优点使得其作为外源蛋白表达的载体具有吸引力。许多植物RNA病毒的分子生物学和病理学已经充分描述且有关于病毒生物学、基因和调控序列的相当多的知识。大多数植物RNA病毒具有小基因组且感染性cDNA克隆可用于促进遗传操纵。一旦感染性病毒基因物质进入易感宿主细胞，则其复制达高水平并迅速在整个萌芽幼苗中传播(接种后1到4天)。病毒颗粒可容易地且经济地自经感染萌芽幼苗组织回收。病毒具有宽宿主范围，此使得能够使用单一构建体来感染若干易感染物种。这些特征可容易地转移到幼芽。

外源序列通常可通过将一个病毒基因用想要的序列替换、在适当位置处将外源序列插入病毒基因组、或使外源肽融合到病毒的结构蛋白质自植物RNA病毒表达。而且，这些途径中的任一者可经组合以通过病毒重要功能中的反式互补表达外源序列。存在许多不同的策略作为在病毒感染的植株中使用烟草花叶病毒(TMV)、苜蓿花叶病毒(AlMV)和其嵌合体表达外源序列的工具。

AlMV的基因组是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae family)病毒的代表且由三个基因组RNA(RNA 1-3)和亚基因组RNA(RNA4)构成。基因组RNA 1和2分别编码病毒复制酶蛋白P1和P2。基因组RNA3编码细胞至细胞间运动蛋白P3和外壳蛋白(CP)。CP是从亚基因组RNA4转译而来，RNA4是从基因组RNA3合成，且需要起始感染。研究已证明，CP涉及多种功能，其包括基因组活化、复制、RNA稳定性、症状形成和RNA壳体化(参见例如，鲍尔(Bol)等人，1971，病毒学(Virology)，46：73；范德沃森(Van Der Vossen)等人，1994，病毒学(Virology)202：891；尤西波夫(Yusibov)等人，病毒学(Virology)，208：405；尤西波夫(Yusibov)等人，1998，病毒学(Virology)，242：1；鲍尔(Bol)等人，(综述，100篇参考文献)，1999，J.Gen.Virol，80：1089；德·格拉夫(De Graaff)，1995，病毒学(Virology)，208：583；贾斯帕斯(Jaspars)等人，1974，病毒学研究进展(Adv.VirusRes.)，19：37；勒施-弗莱斯(Loesch-Fries)，1985，病毒学(Virology)，146：177；尼尔曼(Neeleman)等人，1991，病毒学(Virology)，181：687；尼尔曼(Neeleman)等人，1993，病毒学(Virology)，196：883；范德库勒(Van Der Kuyl)等人，1991，病毒学(Virology)，183：731；和范德库勒(Van Der Kuyl)等人，1991，病毒学(Virology)，185：496)。

病毒从种子、胚胎、或萌芽幼苗的接种部分至未接种部分的长距离运动和系统性感染通常需要病毒颗粒的壳体化。根据本发明，可在植物发育的任何阶段进行接种。在胚胎和幼芽中，所接种病毒的传播可极为迅速。AlMV的病毒体是通过独特CP(24kD)壳体化，形成多于一种类型的颗粒。颗粒的尺寸(长度为30到60nm且直径为18nm)和形状(球形、椭圆形或杆状)取决于壳体化RNA的尺寸。组装后，认为AlMVCP的N末端位于病毒颗粒的表面且似乎不干扰病毒组装(鲍尔(Bol)等人，1971，病毒学(Virology)，6：73)。此外，在N末端具有额外38-氨基酸肽的ALMV CP在活体外形成颗粒并保持生物活性(尤西波夫(Yusibov)等人，1995，J.Gen.Virol，77：567)。

AlMV具有宽宿主范围，其包括许多农业上有价值的作物，其包括植物种子、胚胎和幼芽。总之，这些特征使得ALMV CP成为载体分子的优良候选物且AlMV成为植物中发育的幼芽阶段的表达外源序列的有吸引力的候选载体。而且，当从异源载体(例如TMV)表达时，AlMV CP使TMV基因组壳体化而不干扰病毒感染力(尤西波夫(Yusibov)等人，1997，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，94：5784，其以引用的方式并入本文中)。此允许使用TMV作为融合到外源序列的AlMV CP的载体病毒。

TMV(烟草花叶病毒的原型)具有由经17.0kD CP壳体化的单链正义RNA构成的基因组，此获得棒形颗粒(长度300nm)。CP是TMV的唯一结构蛋白且病毒在受感染宿主中壳体化并长距离运动需要CP(西都(Saito)等人，1990，病毒学(Virology)176：329)。183和126kD蛋白质是从基因组RNA转译且病毒复制需要所述183和126kD蛋白质(石川(Ishikawa)等人，1986，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，14：8291)。30kD蛋白质是病毒的细胞至细胞间运动蛋白(麦诗(Meshi)等人，1987，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)，6：2557)。运动蛋白和外壳蛋白是从亚基因组mRNA转译(亨特(Hunter)等人，1976，自然(Nature)，260：759；布吕宁(Bruening)等人，1976，病毒学(Virology)，71：498；和比奇(Beachy)等人，1976，病毒学(Virology)，73：498，其各自以引用的方式并入本文中)。

转化植物组织的其它方法包括转化植物的花。拟南芥(Arabidopsis thaliana)的转化可通过将植物的花浸渍于根瘤土壤杆菌的溶液中来完成(柯蒂斯(Curtis)等人，2001，转基因研究(Transgenic Res.)，10：363；和晴(Qing)等人，2000，分子育种：植物改良的新策略(Molecular Breeding：New Strategies in Plant Improvement)1：67)。在通过“浸渍”植物生成的种子群体中形成转化植物。在花发育期间的特定点，子房壁中存在小孔，根瘤土壤杆菌通过所述小孔进入子房内部。一旦进入子房内部，根瘤土壤杆菌增殖并转化个别子房(戴斯弗友(Desfeux)等人，2000，植物生理学(Plant Physiology)，123：895)。经转化的子房遵循在子房内种子形成的典型途径。

土壤杆菌介导的暂时表达

如本文所指出，在本发明的许多实施例中，期望用于在植物中迅速(例如，暂时)表达蛋白质或多肽的系统。除其它以外，本发明提供在植物中完成所述迅速表达的有效系统，所述系统利用土壤杆菌构建体来输送表达所关注蛋白质或多肽的病毒表达系统。在一些实施例中，本文所述锥虫抗原中的任一者均可利用发射载体技术(launchvector technology)(例如如下文所述)表达。在一些实施例中，发射载体构建体也可用于热稳定蛋白的情况下，如在标题为“与热稳定蛋白的锥虫多肽融合物”的章节中更详细的阐述。

在一些实施例中，根据本发明，所制得“发射载体”含有包括复制序列在内的土壤杆菌序列且还含有携载编码所关注蛋白质或多肽的基因的植物病毒序列(包括自我复制序列)。通常通过允许大体上系统性递送的土壤杆菌浸润法将发射载体引入植物组织中。对于暂时转化，发射载体的未整合T-DNA拷贝在核酸组织(nucleous)中保持暂时存在且经转录以导致携载基因的表达(迦毕罗(Kapila)等人，1997)。土壤杆菌介导的暂时表达与病毒载体不同，其不能使所关注基因表达进行系统性传播。此系统的一个优点是克隆大于2kb的基因以生成利用病毒载体不可能获得的构建体的可能性(沃内特(Voinnet)等人，2003)。而且，使用所述技术，可利用多于一种的转基因转化植物，以便可表达并组装多亚基蛋白(例如，络合蛋白的抗体亚单元)。而且，借助与不同土壤杆菌共浸润来共同表达多个转基因的可能性可通过单独浸润或使用混合培养物加以利用。

在某些实施例中，发射载体包括允许在土壤杆菌中进行选择(或至少检测)并允许在经浸润组织中进行选择/检测的序列。而且，发射载体通常包括在植物中经转录以使得产生病毒RNA、随后生成病毒蛋白的序列。而且，病毒蛋白和病毒RNA的产生使得迅速产生编码所关注医药活性蛋白质的RNA的多个拷贝。所述产生导致所关注靶在相对较短时期内的迅速蛋白质产生。由此，可生成用于蛋白质产生的高效系统。

利用病毒表达载体的土壤杆菌浸润技术可用于产生有限量的所关注蛋白质以在决定其是否值得生成转基因植物之前检验表达水平。或者或另外，利用病毒表达载体的土壤杆菌浸润技术用于迅速生成能够作为主要生产平台产生大量蛋白质的植物。因此，此暂时表达系统可以工业规模使用。

进一步提供可用于本发明这些和那些方面中的不同土壤杆菌质粒、二元质粒或其衍生物(例如pBIV、pBI1221、pGreen等)中的任一者。若干合适载体已为所属领域习知且可根据所属领域已知的方法或本文所阐述的方法来引导和/或修饰以用于本文所提供的所述方法中。

一种特定实例性发射载体是pBID4。这种载体含有在引入植物之后驱动重组病毒基因组初始转录的花椰菜花叶病毒(DNA植物病毒)的35S启动子和nos终止子(土壤杆菌胭脂碱合成酶的转录终止子)。所述载体进一步含有烟草花叶病毒基因组的序列，其包括用于病毒复制(126/183K)和细胞至细胞间运动(MP)的基因。所述载体进一步含有编码所关注多肽的基因，所述基因插入烟草花叶病毒基因组序列内的独特克隆位点中并在外壳蛋白亚基因组mRNA启动子的转录控制之下。由于此“靶基因”(即，编码所关注蛋白质或多肽的基因)代替了TMV外壳蛋白的编码序列，因此所得病毒载体是裸露的自我复制RNA，所述RNA所经受的重组比含CP的载体少且不能在环境中有效传播并存活。左和右边界序列(LB和RB)界定了植物用携载发射载体的重组土壤杆菌浸润之后转移到植物细胞中的发射载体区域。一旦将携载所述载体的土壤杆菌引入植物组织中(通常通过土壤杆菌浸润法，但或者通过注射或其它方式)，则将在几分钟内生成LB与RB之间的序列的多个单链DNA(ssDNA)拷贝并释放。然后这些所引入的序列通过病毒复制扩增。靶基因的转译导致在短时期内大量靶蛋白或多肽的累积。

在本发明的一些实施例中，土壤杆菌介导的暂时表达产生多达约5g或更多靶蛋白/kg植物组织。例如，在一些实施例中，每公斤植物组织产生多达约4、3、2、1、或0.5g的靶蛋白。在一些实施例中，每公斤植物组织产生至少约20-500mg、或约50-500的靶蛋白，或约50-200、或约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或约200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、1750、2000、2500、3000mg或更多的蛋白质。

在本发明的一些实施例中，这些表达水平是从浸润开始在约6、5、4、3或2周内实现。在一些实施例中，这些表达水平是从引入表达构建体开始在约10、7、5、4、3、2天或甚至1天内实现。因此，从引入(例如，浸润)到收获的时间通常少于约2周、10天、1周或更少。而且，本发明此实施例一个极具吸引力的方面在于其使得从氨基酸序列的选择开始在约8周或更少的时间内产生蛋白质(甚至包括用于“初步”表达研究的时间)。而且，每一批蛋白质通常可在约8周、6、周、5周、或更少的时间内产生。所属领域的技术人员将了解，这些数值可随所用植物类型而稍微有所变化。大多数幼芽(包括豌豆)将在所给的数值范围内。然而，烟草本塞姆氏(Nicotianabenthamiana)因为生长较慢(由于种子很小)而可能生长较长的时间、甚至直到浸润之前。其它预期调节根据所用特定植物的生物学对所属领域的技术人员应明了。在一些实施例中，某些豌豆品种(包括例如菜豌豆(marrowfat pea)、bill jump pea、黄特拉珀豌豆(yellow trapper pea)、斑点豌豆(speckled pea)、和青豌豆(green pea)尤其有用。

本发明者还发现，各种烟草属植物在本发明此方面的实践中尤其有用，尤其包括烟草本塞姆氏。通常，在本发明此实施例的实践中，使烟草本塞姆氏植株生长足以生长适量生物质的时间，然后浸润(即，递送含发射载体的土壤杆菌)。典型地，使植物生长约3周以上的时期、更通常约4周以上、或约5-6周之间以在浸润之前累积生物质。

本发明者进一步惊奇地发现，尽管TMV和AlMV序列二者可证明在所述发射载体构建体中有效，但在一些实施例中AlMV序列在确保高水平产生所输送蛋白质或多肽方面尤其有效。

因此，在本发明某些特定实施例中，所关注蛋白质或多肽是在植物中(例如，烟草本塞姆氏)自引导携载所关注基因的AlM V序列的产生的发射载体开始来产生。

与热稳定蛋白的锥虫多肽融合物

在本发明的某些方面中，提供含有融合多肽的锥虫抗原，所述融合多肽包含以可操作方式连接到热稳定蛋白(例如，LicB、LicKM等，且进一步详细阐述于下文中)的锥虫蛋白(或其片段或变体)。本发明融合多肽可在所属领域已知的任何可用表达系统中产生(包括但不限于发射载体技术)。在某些实施例中，本发明融合蛋白是在植物或其一部分(例如，植物、植物细胞、根、幼芽等)中产生。

在人类或动物细胞中未天然发现的酶或其它蛋白质尤其适于本发明的融合多肽。融合时赋予融合产物热稳定性的热稳定蛋白有益。热稳定性使所产生蛋白质保持其构象，并在室温下保持所产生蛋白质。此特征有助于容易、时间有效且成本有效的回收融合多肽。根据本发明可使用的热稳定酶的代表性家族是葡聚糖水解酶家族。这些酶特定裂解混合连接多糖中毗邻1，3-β键结的1，4-β糖苷键(哈恩(Hahn)等人，1994美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，91：10417)。在谷类(例如燕麦和大麦)中发现了所述酶，且在许多真菌和细菌种类(包括热纤梭菌)中也发现了所述酶(古德卡瓦奇(Goldenkova)等人，2002，分子生物学(Mol.Biol.)36：698)。因此，用于本发明融合多肽的合意热稳定蛋白包括糖苷酶。实例性热稳定糖苷酶蛋白质包括那些由选自表4中所列的基因库登录号所代表者，其各自的内容均以每一参考编号的基因库登录信息整体纳入的引用方式并入本文中。用于本发明融合蛋白的实例性热稳定酶包括热纤梭菌P29716、短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)P37073、和海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)P45798，其各自针对其基因库登录号以引用的方式并入本文中。实例中所阐述的代表性融合蛋白利用从热纤梭菌分离出的经修饰热稳定酶，然而，根据本发明同样可利用任何热稳定蛋白。

表4：热稳定糖苷酶蛋白质

P29716	(β-葡聚糖酶热纤梭菌)
		P37073	(β-葡聚糖酶短芽孢杆菌)
1MVE A	(β-葡聚糖酶产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes))
		P07883	(胞外琼脂糖天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor))
P23903	(葡聚糖内切-13-β-葡萄糖苷酶A1环状芽胞杆菌(Bacillus circulans))
		P27051	(β-葡聚糖酶地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis))
P45797	(β-葡聚糖酶多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa，Bacilluspolymyxa))
		P37073	(β-葡聚糖酶短芽孢杆菌)
P45798	(β-葡聚糖酶海洋红嗜热盐菌)
		P38645	(β-葡糖苷酶好热性放线菌(Thermobispora bispora))

P40942	(梭状芽孢杆菌(Celloxylanase Clostridium stercorarium))
		P14002	(β-葡糖苷酶热纤梭菌)
033830	(α-葡糖苷酶喜温海洋杆菌(Thermotoga maritima))
		043097	(木聚糖酶疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus))
P54583	(内切-葡聚糖酶El解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus))
		P14288	(β-半乳糖苷酶酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius))
052629	(β-半乳糖苷酶乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei))
		P29094	(寡-16-葡糖苷酶热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius))
P49067	(α-淀粉酶超高温古生菌强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus))
		JC7532	(纤维素酶芽孢杆菌属)
Q60037	(木聚糖酶A喜温海洋杆菌)
		P33558	(木聚糖酶A梭状芽孢杆菌)
P05117	(聚半乳糖醛酸酶-2前驱物番茄(Solanum lycopersicum))
		P04954	(纤维素酶D热纤梭菌)
Q4J929	(N-糖基化酶酸热硫化叶菌)
		033833	(β-果糖苷酶喜温海洋杆菌)
P49425	(内切-14-β-甘露糖苷酶海洋红嗜热盐菌)
		P06279	(α-淀粉酶嗜热脂肪地芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophilus))
P45702  P45703P40943	(木聚糖酶嗜热脂肪地芽抱杆菌)
		P09961	(α-淀粉酶1嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum))
Q60042	(木聚糖酶A新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana))
		AAN05438AAN05439	(β-糖苷酶嗜热栖热菌(Thermus thermophilus))
AAN05437	(糖透酶嗜热栖热菌)
		AAN05440	(β-糖苷酶Thermus filiformis)
AAD43138	(β-糖苷酶葡萄热圆菌(Thermosphaera aggregans))

当根据本发明设计融合蛋白和多肽时，当然希望保存抗原的免疫原性。更进一步，在本发明的某些方面中希望所提供的构建体提供融合蛋白的热稳定性。此特征有助于容易、时间有效且成本有效地回收融合靶抗原。在某些方面中，所选择的抗原融合伙伴可提供增强免疫原性、可纳入多个疫苗决定子而无需先前的对接种疫苗个体的免疫原性暴露等额外优点。所关注融合肽的其它有益特点包括对纳入一种或一种以上抗原提供操纵便利性的蛋白质以及有可能使疫苗制剂的生产、纯化和/或调配方便的蛋白质。所属领域的技术人员应了解，三方面的因素(three dimensional presentation)可影响这些有益特性中的每一者。因此，保存免疫性或优选品质可能会影响(例如)融合伙伴的选择和/或融合位置的选择(例如，N末端、C末端、内部、其组合)。另一选择为或另外地，选择偏好可影响所选用于融合的区段的长度，无论是抗原的长度还是所选融合伙伴的长度。

本发明者已示范各种抗原与热稳定蛋白的成功融合。例如，本发明者已使用热稳定载体分子LicB(也称为地衣多糖酶)用于融合蛋白的产生。LicB是来自热纤梭菌的1，3-1，4-β葡聚糖酶(LicB)(基因库登录号：X63355[gi：40697])。LicB属于球状蛋白家族。根据LicB的三维结构，其N和C末端在表面上彼此靠近，极接近活性结构域。LicB还具有暴露于表面上远离活性结构域的环状结构。我们已经生成蛋白质的环状结构和N与C末端均可作为锥虫抗原多肽的插入位点的构建体。锥虫抗原多肽可以N或C末端融合物或至表面环的插入物形式表达。重要的是，LicB在低pH和高温(高达75℃)下维持其酶活性。因此，使用LicB作为载体分子贡献许多优点，其包括可能增强靶特异性免疫原性、纳入多个疫苗决定子的潜力、和可经鼻、经口或非经肠递送的疫苗的简单调配物。而且，在植物中产生LicB融合物将降低动物或人类病原体污染的风险。参见本文提供的实例。

本发明包含锥虫抗原的融合蛋白可在各种表达系统中的任一者中产生，其包括活体外和活体内系统二者。所属领域的技术人员将容易地了解，通常期望针对特定表达系统优化核酸序列。例如，在本文所提供的范例中，提供用于在植物中表达锥虫抗原-LicKM融合物的优化序列(参见实例1)。因此，根据本发明编码锥虫抗原融合蛋白和其片段的任何相关核酸均想要涵盖在本发明核酸构建体中。

为在植物系统中产生，可利用表达锥虫抗原(例如，锥虫蛋白或其片段或融合物)的转基因植物。或者或另外，转基因植物可使用所属领域习知生成稳定生产作物的方法来产生。另外，利用暂时表达系统的植物可用于锥虫抗原的产生。当利用植物表达系统时，无论是利用转基因还是植物中的暂时表达，根据系统对合意抗原的适用性核表达、叶绿体表达、线粒体表达或病毒表达中的任一者均可加以利用。而且，可利用根据本发明用于产生抗原和融合蛋白的额外表达系统。例如，哺乳动物表达系统(例如，哺乳动物细胞系(例如，CHO等))、细菌表达系统(例如，大肠杆菌)、昆虫表达系统(例如，杆状病毒(baculovirus))、酵母菌表达系统和活体外表达系统(例如，网状体裂解物(reticulate lysate))均可用于表达本发明的抗原和融合蛋白。

抗原的产生和分离

通常，可使用所属领域已知的标准方法来培养或生长本发明的植物、植物细胞、和/或植物组织(例如，克隆植物、克隆植物细胞、克隆根、克隆根系、幼芽、萌芽幼苗、植物等)用于产生抗原。已采用多种培养基和生物反应器来培养发根细胞、根细胞系和植物细胞(参见，例如吉瑞(Giri)等人，2000，生物技术进展(Biotechnol.Adv.)，18：1；荛(Rao)等人，2002，生物技术进展，20：101；和上述二者中的参考文献，其所有均以引用的方式并入本文中)。可以任何适宜方式使克隆植物生长。

在某些实施例中，本发明的锥虫抗原可通过任何已知方法产生。在一些实施例中，锥虫抗原表达于植物或其一部分中。根据所属领域已知的常规条件和技术将蛋白质分离并纯化。这些包括诸如提取、沉淀、色谱、亲和色谱、电泳等方法。本发明涉及纯化和使用所属领域已知且本文所提供的各种植物表达系统中的任一者(包括本文所述的病毒植物表达系统)的锥虫抗原的负担得起的扩大生产。

在本发明的许多实施例中，希望分离锥虫抗原用于疫苗产品。在本发明蛋白质从表达其的植物组织或其一部分(例如，根、根细胞、植物、植物细胞)产生的情况下，可使用本文进一步详细阐述的方法或或所属领域已知的任何适当方法来自植物材料部分或完全分离中任一者。当希望将表达产物自一些或所有表达其的植物细胞或组织中分离出时，可使用任何可用的纯化技术。所属领域的技术人员熟习大量分级分离和分离程序(参见例如，斯科普斯(Scopes)等人，蛋白质纯化：原理和实践(Protein Purification：Principles and Practice)，第3版；简森(Janson)等人，1993；蛋白质纯化：原理、高分辨率方法和应用(Protein Purification：Principles，High Resolution Methods，andApplications)，威立(Wiley-VCH)，1998；施普林格出版公司(Springer-Verlag)，NY，1993；和罗伊(Roe)，蛋白质纯化技术(Protein Purification Techniques)，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)，2001；其每一者均以引用方式并入本文中)。通常将希望使产物超过约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％纯。参见例如美国专利第6,740,740号和第6,841,659号(其每一者均以引用方式并入本文中)针对用于从植物组织或液体中纯化物质的某些方法的讨论。

所属领域的技术人员应了解，获得想要的锥虫抗原产物的一种方法是提取。植物材料(例如，根、叶等)可经提取以自剩余生物质中获取期望产物，从而增加产物浓度和纯度。植物也可在缓冲溶液中进行提取。例如，可以1∶1的重量比例将植物材料转移到一定量已经(例如)磷酸盐缓冲液缓冲的冰冷水中。需要时也可添加蛋白酶抑制剂。通过剧烈掺和或碾磨来粉碎植物材料，同时悬浮于缓冲溶液中并通过过滤或离心获取经提取的生物质。可通过额外步骤进一步纯化存于溶液中的产物或通过冷冻干燥或沉淀将其转化成干粉。可通过压榨实施提取。植物或根可通过在压榨机中压榨来提取或当其通过紧密间隔的辊时碾碎来提取。收集自经碾碎的植物或根中榨出的液体并根据所属领域熟知的方法进行加工。压榨提取可使产物以更加浓缩的形式释放。然而，产物的总产量可低于在溶液中提取的产物产量。

疫苗

本发明提供用于治疗用途的医药用抗原蛋白，例如锥虫(例如，布氏锥虫)抗原(例如，锥虫蛋白或其免疫原性部分、或包含锥虫蛋白或其免疫原性部分的融合蛋白)，其作为疫苗用于治疗性和/或预防性治疗锥虫感染有活性。此外，本发明提供兽医用途，如此锥虫抗原在兽医应用中有活性。在某些实施例中，锥虫抗原可通过本发明的植物或其一部分(例如，根、细胞、幼芽、细胞系、植物等)来产生。在某些实施例中，所提供的锥虫抗原表达于植物、植物细胞和/或植物组织(例如，幼芽、萌芽幼苗、根、根培养物、克隆细胞、克隆细胞系、克隆植物等)，且可直接使用植物或在制备投与给个体的医药时经部分纯化或经纯化。

本发明提供表达锥虫抗原且当投与给需要的个体时保持医药活性的植物、植物细胞和植物组织。实例性个体包括脊椎动物(例如，哺乳动物，例如人类)。根据本发明，个体包括兽医个体，例如牛、绵羊、犬科动物、猫科动物等。在某些方面中，将可食用植物或其一部分(例如，幼芽、根)以治疗有效量经口投与给个体。在一些方面中，在医药制剂中提供一种或一种以上的锥虫抗原，如本文所述。

本发明的疫苗组合物包含一种或一种以上的锥虫抗原。在某些实施例中，所投与的疫苗组合物中包括至少两种本发明的锥虫抗原。

根据本发明，希望用锥虫抗原疫苗治疗个体以引起生理效应。疫苗蛋白对病症或疾病可具有治愈疗效或缓解性且可在投与后改善、减轻、缓解疾病或病症的症状或严重程度、延迟所述疾病或病症的发作、使疾病或病症的症状或严重程度好转或减轻。包含锥虫抗原的疫苗可具有预防性且可用于阻止或延迟疾病的发作或当出现所述疾病、病症或病理状态时减轻其严重程度。通过用本发明的抗原治疗个体所引起的生理效应可包括有效免疫反应以阻止有机体感染。

在一些实施例中，本发明疫苗是通过经口和/或粘膜途径递送。经口和/或粘膜递送具有阻止粘膜组织感染(许多病原体感染的主要途径)的潜力。经口和/或粘膜递送可引起系统性免疫反应。在用于经口投与抗原的异源表达系统的开发方面已取得相当大的进展，所述抗原可刺激粘膜免疫系统且可引起系统性免疫性.然而，先前对于口服疫苗递送的努力已证明，需要相当大量的抗原以获得效能。因此，大量靶抗原的经济生产是产生有效口服疫苗的前提。开发表达抗原(包括热稳定抗原)的植物代表了解决所述困难的更现实途径。

本发明的医药制剂可以各种途径投与给个体，例如，经口、经鼻、经肠、非经肠、肌内或静脉内、经直肠、经阴道、局部地、经眼睛、经肺或通过接触施加。在某些实施例中，表达于植物或其一部分中的锥虫抗原通过将植物直接投与给个体经口投与给所述个体。在一些方面中，表达于植物或其一部分中的疫苗蛋白经提取和/或纯化，且用于制备医药组合物。可能希望对所述分离产物进行调配以用于其期望用途(例如，作为医药剂、疫苗组合物等)。在一些实施例中，将希望将产物与一些或所有表达其的植物组织调配在一起。

当需要将产物与植物材料调配在一起时，常会希望利用对相关接受者(例如，人类或其它动物)无毒的植物。相关植物组织(例如，细胞、根、叶)可简单的收获并根据所属领域已知的技术加工，其中需适当考虑保持所表达产物的活性。在本发明某些实施例中，想使锥虫抗原表达于可食用植物中(且具体而言在所述植物的可食用部分中)以便随后可食用所述物质。例如，在疫苗抗原经口递送后有活性的情况下(当适当调配时)，可能希望在可食用植物部分产生抗原蛋白，并将所表达锥虫抗原与一些或所有表达蛋白质的植物材料调配在一起用于经口递送。

所提供的疫苗抗原(即，本发明的锥虫抗原)可根据已知技术进行调配。例如，可将有效量的疫苗产物与一种或一种以上的有机或无机、液体或固体医药上适宜的载剂物质调配在一起。根据本发明产生的疫苗抗原可以以下剂型使用：例如片剂、胶囊、含片、分散液、悬浮液、溶液、软胶囊、药丸、囊片、乳霜、软膏、气溶胶、粉状产品袋、液体溶液、溶剂、稀释剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂和固体粘结剂，只要蛋白质的生物活性不会受到所述剂型的破坏即可。

通常，组合物可包含多种不同医药上可接受的载剂、佐剂、或媒剂、或一种或一种以上的所述载剂、佐剂、或媒剂的组合中的任一者。本文所用词语“医药上可接受的载剂、佐剂或媒剂”包括溶剂、分散介质、包覆层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及诸如此类与医药投与相容的试剂。可用作医药上可接受载剂的物质包括(但不限于)糖，例如，乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如，玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，例如，羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如，可可油和栓剂蜡；油，例如，花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如，丙二醇；酯，例如，油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如，氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无致热原的水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer’s solution)；根据调配师的判断，所述组合物中可含有乙醇和磷酸盐缓冲液与其它无毒的相容润滑剂(例如，月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、释放剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和加香剂、防腐剂和抗氧化剂。例如，疫苗抗原产物可借助常规混合、粒化、糖衣丸形成、溶解、冷冻干燥或类似工艺以医药组合物形式提供。

额外疫苗组分

本发明疫苗可额外包括任何适当佐剂以当投与给个体时增强疫苗的免疫原性。例如，所述佐剂可包括(但不限于)皂树树皮(Quillaja saponaria(QS))的提取物(其包括食品级QS的经纯化细分馏份，例如Quil A和QS-21)、白矾(alum)、氢氧化铝、磷酸铝、MF59、Malp2、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、铝胶、3去-O-酰化单磷酸类脂A(3D-MPL)。其它佐剂包括免疫调节寡核苷酸，例如如WO 96/02555中所揭示的未甲基化的CpG序列。当提供为TH1细胞反应的优先刺激剂的佐剂时，预期不同佐剂(例如彼等以上所提及者)的组合。例如，QS21可与3D-MPL一起调配。QS21：3D-MPL的比例通常为月1∶10到10∶1；1∶5到5∶1；且通常大体上1∶1。对于最优协同作用的期望范围可为2.5∶1到1∶1 3D-MPL∶QS21。适用于人类疫苗调配物的经纯化QS提取物的剂量为0.01mg到10mg/公斤体重。

应注意，某些热稳定蛋白(例如，地衣多糖酶)自身可展示免疫反应增强活性，因此使用所述蛋白质无论是与锥虫抗原的融合物还是单独均可考虑使用佐剂。因此，本发明的疫苗组合物可进一步包含一种或一种以上的佐剂。某些疫苗组合物可包含两种或两种以上的佐剂。而且，根据调配物和投与途径，特定调配物和/或组合中可能希望有某些佐剂。

在某些情况下，可能希望通过延缓皮下或肌内注射的疫苗产物(例如，蛋白质)的一种或一种以上组分的吸收来延长本发明疫苗的效能。此可通过使用具有差的溶解性的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。因此，产物的吸收速率取决于其溶解速率，而其溶解速率又取决于尺寸和形式。或者或另外，可通过将产物溶解或悬浮于油性媒剂中来实现非经肠投与产物的延迟吸收。可通过在生物可降解聚合物(例如，聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成蛋白质的微囊基质来制备可注射储积形式。可根据产物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质控制释放速率。生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。储积可注射调配物可通过将产物包裹于与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。可使用替代聚合物递送媒剂用于口服调配物。例如，可使用生物可降解、生物相容聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸等。因此，抗原或其免疫原性部分可(例如)与聚合物递送媒剂组合调配成微粒。

经肠投与的疫苗抗原的制剂可以固体、半固体、悬浮液或乳液形式引入且可与任何医药上接受的载剂(诸如水、悬浮剂和乳化剂)混合在一起。抗原可借助泵或缓释形式投与，尤其是当作为预防措施加以投与时，以能够在个体中阻止疾病的发展或改善或延迟已确认的疾病。可将补充性活性化合物(例如对欲治疗疾病或临床病况具有独立活性的化合物)纳入组合物中或可与其一起投与。可使用调味剂和着色剂。

本发明的疫苗产物(任选地与植物组织一起)尤其适用于作为医药组合物经口投与。可使用口服液体调配物，且其对于小儿群体可特别有效。所收获的植物材料可以多种方法中的任一者(例如，空气干燥、冷冻干燥、提取等)进行加工，这取决于想要的治疗产物的性质和其想要的形式。上文所述的这类组合物可单独经口摄取，或连同食物或饲料或饮料一起摄取。用于经口投与的组合物包括以干粉、粮食、水性或非水性溶剂、悬浮液或乳液形式提供的植物、植物提取物和由经感染植物纯化的蛋白质。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射有机酯。水性载剂包括水、水-醇溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲医用非经肠媒剂，包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化钠溶液、含有乳糖或固定油的林格氏溶液。干粉的实例包括已干燥(例如，经冷冻干燥、空气干燥或喷雾干燥)的任何植物生物质。例如，可将植物放置于约120华氏度(degrees Fahrenheit)的市售空气干燥器中直到生物质含有少于5重量％水分，由此对植物进行空气干燥。经干燥植物可以整块固体形式储存以待进一步加工，或可通过碾磨而进一步加工成想要的网目大小的粉末。或者或另外，对于空气干燥敏感的产物可使用冷冻干燥。可将产物放置于真空干燥器中并在真空下进行冷冻干燥直到生物质含有少于约5重量％水分，由此对产物进行冷冻干燥。干燥材料可如本文所述进行进一步加工。

源于植物的材料可如此投与，或与一种或一种以上的草药制剂一起投与。可用的草药制剂包括液体和固体草药制剂。草药制剂的一些实例包括酊剂、提取物(例如，水性提取物、醇提取物)、煎剂、干燥制剂(例如，经空气干燥、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥)、粉剂(例如，冻干粉)和液体。草药制剂可以任何标准的递送媒剂提供，诸如胶囊、片剂、栓剂、液体剂等。所属领域的技术人员应了解可应用于本发明的递送草药制剂的各种调配物和用药程式。

本发明根系、细胞系、植物、提取物、粉末、干燥制剂和纯化的蛋白质或核酸产物等可呈含有或不含一种或一种以上的上述赋形剂的囊封形式。可用诸如肠溶包衣、释放控制包衣和医药调配领域熟知的其它包衣等包衣及外壳来制备诸如片剂、糖衣丸、胶囊、药丸和颗粒等的固体剂型。在所述固体剂型中，活性剂可与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。如在正常实践中，所述剂型除惰性稀释剂外可包含额外物质，例如，压片润滑剂和其它压片助剂(例如，硬脂酸镁和微晶纤维素)。在胶囊、片剂和药丸的情况下，所述剂型可包含缓冲剂。其可任选地含有遮光剂，且可具有仅或优先在肠道的某一部分中和/或以延迟方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

在一些方法中，根据本发明表达锥虫抗原的植物或其一部分或其生物质作为药膳经口投与。所述可食用组合物通常通过食用未加工形式(呈固体形式时)或通过饮用(呈液体形式时)来食用。植物材料可直接摄取而无前加工步骤或在最少烹饪准备之后摄取。例如，疫苗蛋白可表达于可直接食用的幼芽中。例如，疫苗抗原表达于苜蓿芽、绿豆芽、或菠菜或莴苣叶芽中等。在一个实施例中，植物生物质可经加工并摄取加工步骤后所回收的物质。

用于本发明的加工方法是食物或饲料工业中常用的方法。所述方法的最终产物通常包括大量的表达抗原且可方便的食用或饮用。最终产物可与其它食物或饲料形式(诸如盐、载剂、调味剂、抗生素等)混合，并以固体、半固体、悬浮液、乳液或液体形式消耗。所述方法可包括保存步骤，例如，巴斯德灭菌、烹调或加入保存剂和防腐剂。在本发明中可使用和加工任何植物以产生可食用或可饮用的植物材料。源于植物的制剂中锥虫抗原的量可通过所属领域标准方法(例如，凝胶电泳、ELISA或西方印迹分析)利用对产物具有特异性的探针或抗体测试。此测定可用于使所摄取的疫苗抗原蛋白的量标准化。例如，可测定疫苗抗原的量并通过(例如)将具有不同产物含量的各批产物混合来调节，以使摄取单一剂量所饮用或食用的材料量标准化。然而，本发明的封闭可调控环境将会使实施所述标准程序的需要降到最低。

植物细胞或组织中所产生且个体可食用的疫苗蛋优选地可由消化系统吸收。摄取仅接受最小程度加工的植物组织的一个优点是使蛋白质囊封或隔离于植物细胞中。因此，产物可接受至少某种保护以免在到达肠道或小肠之前在上部消化道中被消化且会有较高比例的活性产物可用于吸收。

本发明医药组合物可以治疗方式或预防方式投与。所述组合物可用于治疗或预防疾病。例如，可治疗任何患有疾病或处于形成疾病风险中的个体。应了解，在还未诊断出具有任何疾病症状的情况下可认为个体处于形成疾病的风险中。例如，若已知个体已经处于或将要处于具有相对较高的暴露于锥虫感染风险的情况下，则将认为所述个体处于形成所述疾病的风险中。同样，若个体家庭的成员或朋友已经诊断患有锥虫感染，则可认为所述处于形成所述疾病的风险中。

用于经口投与的液体剂型包括(但不限于)医药上可接受的乳液、微乳剂、溶液、悬浮液、浆液和酏剂。除活性剂以外，液体剂型可含有所属领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、助溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨糖醇酐脂肪酸酯和其混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物可包括佐剂，例如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。

用于直肠或阴道投与的组合物可为栓剂或保留灌肠剂，其可通过将本发明组合物与适宜无刺激赋形剂或载剂(诸如可可油、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，这些赋形剂或载剂在环境温度下为固体但在体温下为液体，且因而其在直肠或阴道腔内融化并释放活性蛋白质。

用于局部、经粘膜或经皮投与本发明疫苗组合物的剂型包括软膏、膏剂、乳霜、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片。活性剂或其制剂可在无菌条件下与医药上可接受载剂和(若需要)任何所需防腐剂或缓冲剂混合。对于经粘膜或经皮投与，调配物中可使用适于欲渗透障壁的渗透剂。所述渗透剂已为所属领域熟知，且包括(例如)用于经粘膜投与的洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻喷雾剂或栓剂来达成。对于经皮投与，抗原或其免疫原性部分可调配成软膏、药膏、凝胶或乳霜，如所属领域所熟知。眼用调配物、滴耳剂和滴眼剂均涵盖于本发明的范围内。此外，本发明涵盖经皮贴片的用途，所述经皮贴片具有提供疫苗蛋白质至身体的受控递送的附加优点。所述剂型可通过将疫苗产物悬浮或分散于适宜介质中来制备。可使用吸收促进剂来增加疫苗蛋白穿过皮肤的通量。可通过提供速率控制膜或通过将疫苗蛋白分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。

本发明组合物是以实现想要的结果所需的量和时间进行投与。在本发明某些实施例中，医药组合物的“治疗有效量”是指有效治疗、减轻或预防个体疾病的量。因此，本文所用“有效治疗、减轻或预防疾病的量”指无毒但足以治疗、减轻或预防任一个体中疾病的医药组合物的量。例如，“治疗有效量”可为用以治疗、减轻或预防感染(例如，病毒感染、锥虫感染)等的量。

视个体物种、年龄和一般健康状况、疾病阶段、特定医药混合物、其投与模式单等，所需确切量个体与个体之间会有所不同。本发明的锥虫抗原(包括表达抗原的植物和/或其制剂)可调配成容易投与且剂量均匀的剂量单位形式。本文所用表达“剂量单位形式”是指适用于欲治疗患者的疫苗组合物的物理离散单位。然而，应了解，本发明组合物的总日用量通常由主治医生在合理的医学判断范围内决定。用于任一特定患者或有机体的具体治疗有效剂量水平可根据各种因素确定，其包括感染的严重程度或风险；所用具体化合物的活性；所用具体组合物；患者年龄、体重、一般健康状况、性别；患者的饮食；患者的药物动力学状况；所用具体抗原的投与时间、投与途径和排泄速率；治疗持续时间；与所用疫苗组合物组合或同时使用的药物；和医疗技术领域中熟知的类似因素。

应了解，本发明疫苗组合物可用于组合疗法(例如，联合疫苗疗法)，即，医药组合物可与一种或一种以上的其它想要的医药和/或接种程序同时、先于其或在其之后投与。用于联合方案中的疗法的特定组合(例如，锥虫感染的疫苗、治疗性治疗)通常应考虑想要的治疗和/或程序的相容性和欲实现的想要的治疗效果。应了解，所用疗法和/或疫苗对于同一病症可实现想要的效果(例如，本发明抗原可与另一锥虫疫苗同时投与)，或其可实现不同的效果。

在某些实施例中，疫苗组合物包含至少两种锥虫抗原。例如，某些疫苗组合物可包含至少两种本发明的锥虫抗原(例如，本发明含HA结构域和NA结构域的抗原)。在一些方面中，所述联合疫苗可包括一种包含锥虫抗原的热稳定融合蛋白；在一些方面中，提供两种或两种以上的包含锥虫抗原的热稳定融合蛋白。

当利用联合疫苗时，将了解，锥虫抗原的任何组合都可用于所述组合中。组合物可包括多种锥虫抗原，其包括多种本文所提供的抗原。而且，组合物可包括本文所提供的一种或一种以上的抗原与一种或一种以上的额外抗原。锥虫抗原的组合包括源自一种或一种以上的各种亚型或菌株的锥虫抗原，以便免疫赋予抗多于一种感染类型的免疫反应。锥虫抗原的组合可包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或四种以上的源自不同亚型或菌株的抗原。在一些组合中，至少两种或至少三种来自不同亚型的抗原组合成一种疫苗组合物。而且，联合疫苗可利用锥虫抗原和一种或一种以上的独特传染剂的抗原。

试剂盒

在一些实施例中，本发明提供包括本发明锥虫(例如，布氏锥虫)抗原的医药包或试剂盒。在某些实施例中，医药包或试剂盒包括产生本发明锥虫抗原的活的萌芽幼苗、克隆实体或植株、或含有疫苗的制剂、提取物或医药组合物，其在一个或一个以上的容器中且所述容器任选地填充有一种或一种以上的本发明医药组合物的额外成分。在一些实施例中，医药包或试剂盒包括包含本发明经纯化锥虫抗原的医药组合物，所述医药组合物在一个或一个以上的容器中且所述容器任选地填充有一种或一种以上的本发明医药组合物的额外成分。在某些实施例中，医药包或试剂盒包括额外的已批准治疗剂(例如，锥虫抗原、锥虫疫苗)用作组合疗法。任选地，所述容器可附带有监管医药产品制造、使用或销售的政府机构所规定形式的公告，所述公告反映出政府机构已批准制造、使用或销售用于人类投与。

提供包括治疗剂的试剂盒。作为一个但非限制性实例，锥虫疫苗可作为口服调配物提供并作为疗法投与。或者或另外，锥虫疫苗可提供于可注射调配物中用于投与。在一些实施例中，锥虫疫苗可提供于可吸入调配物用于投与。因此，试剂盒中可提供用于投与给遭受锥虫感染或处于锥虫感染风险中的个体的医药剂量或说明。

随后的代表性实例意欲帮助说明本发明，且不意欲或不应理解为限制本发明的范围。实际上，本发明的各种变化形式和除了那些本文中所展示和所阐述者以外的其许多其它实施例自本文献的全部内容(包括随后的实例和本文中所引用的科学和专利文献的参考文献)对所属领域技术人员将变得明显。以下实例含有可适于在本发明的各种实施例和其等效物中实践本发明的信息、范例和指导。

范例

实例1.疫苗候选物构建体的生成

融合到布氏锥虫α微管蛋白、β微管蛋白、和MAP15的抗原序列的AlMV外壳蛋白(CP)融合物的生成

合成靶肽的DNA序列并以与苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AlMV CP)的框架内N末端融合物形式进行克隆，所述外壳蛋白由基于AlMV的RNA3载体表达。基于AlMV的RNA 3载体需要复制酶蛋白P1和P2来复制RNA3。重组AlMV CP是通过次基因组信使RNA4自RNA3表达。AlMV系统在烟草植株中倍增期间，重组AlMV CP组装成病毒体，在病毒体表面上展示靶肽的多个拷贝(图2)。

采取不基于模板的PCR途径来改造α微管蛋白、β微管蛋白和MAP15肽。使用含16-20个彼此作为模板的互补核苷酸的引物合成编码每一靶肽的DNA片段。5′引物包括KpnI限制性核酸内切酶识别位点、接着是ATG起始密码子和氨基酸丝氨酸的密码子，而每一构建体的3′引物含有SalI限制性核酸内切酶识别位点。PCR产物作为KpnI-SalI片段克隆到基于AlMV RNA3的暂时表达载体的cDNA克隆体中，以便所得肽序列在框架内具有AlMV CP氨基酸序列(SEQ ID NO.28；KpnI和SalI限制酶切位点加粗且加下划线)。

TGAGT

GTTCTTCACAAAAGAAAGCTGGTGGGAAAGCTGGTAAACCTACTAAACGTTCTCAGAACTATGCTGCCTTACGCAAAGCTCAACTGCCGAAGCCTCCGGCGTTGAAAGTCCCGGTTGTAAAACCGACGAATACTATACTGCCACAGACGGGCTGCGTGTGGCAAAGCCTCGGGACCCCTCTGAGTCTGAGCTCTTTTAATGGGCTCGGCGTGAGATTCCTCTACAGTTTTCTGAAGGATTTCGCGGGACCTCGGATCCTCGAAGAGGATCTGATTTACAGGATGGTGTTTTCCATAACACCGTCCTATGCCGGCACCTTTTGTCTCACTGATGACGTGACGACTGAGGATGGTAGGGCCGTTGCGCATGGTAATCCCATGCAAGAATTTCCTCATGGCGCGTTTCACGCTAATGAGAAGTTCGGGTTTGAGTTGGTCTTCACAGCTCCTACCCATGCGGGAATGCAAAACCAAAATTTCAAGCATTCCTATGCCGTAGCCCTCTGTCTGGACTTCGACGCGCAGCCTGAGGGATCTAAAAATCCCTCATACCGATTCAACGAAGTTTGGGTCGAGAGAAAGGCGTTCCCGCGAGCAGGGCCCCTCCGCAGTTTGATTACTGTGGGGCTGCTCGACGAAGCTGACGATCTTGATCG TCATTGA

特别地，来自α微管蛋白的编码8个靶肽的核苷酸序列，其与来自智人和欧洲牛的序列完全不同源(表1中所示)；来自β微管蛋白的编码11个靶肽的核苷酸序列，其与来自智人和欧洲牛的序列不完全同源(表2中所示)；和来自MAP15编码5个靶肽的核苷酸序列，其代表两种或两种以上的重复基序(表3中所示)，所有这些核苷酸序列均可根据此方法产生。

热稳定载体构建体的生成

微管蛋白多胞形和β微管蛋白多胞形是通过将多个肽接合在一起形成单一构建体而生成。明确地说，使表1中所示的序列接合在一起以生成α微管蛋白多胞形(“Atub”)，并使表2中所示的序列接合在一起以生成β微管蛋白多胞形(“Btub”)。表3中所示的序列可接合在一起生成MAP15多胞形(“MAP15”)。这些多胞形可用于多种目的。例如，所述多胞形可用于免疫兔子以获得用于表征含个别肽的重组颗粒的血清。或者或另外，其可在大肠杆菌中产生，经纯化并用于ELISA分钟以筛选识别多胞形中所含有的多种抗原的抗体。最后，多胞形可以与热稳定载体蛋白质(例如，地衣多糖酶)的融合物形式进行改造，如以下段落中所述。

全长天然热纤梭菌地衣多糖酶LicB依次由前导肽(Lp)、N末端部分(A)、表面环(l)、C末端部分(C)、Pro-Thrbox和纤维小体-结合结构域(C-BD)构成。从编码LicB的基因中去除编码Lp、Pro-Thr box和C-BD的编码序列，将分子循环重排以颠倒N和C末端(缪斯查克(Musiychuk)等人，2007，流感与其它呼吸系统病毒(Influenza andOther Respiratory Viruses)，1：1)，并在N和C末端处以及表面环(l)中纳入用于克隆靶序列的独特限制性内切核酸酶位点。所得工程载体分子序列经检验，并指定为LicKM：

SEQ ID NO.：29

GGATCCTTAATTAAAATGGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCATTGACTCGAGCTC

SEQ ID NO.：30(组氨酸标签加粗并加下划线)：

MGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVD

对于某些构建体来说，信号肽(例如，PR-1A；“致病性相关蛋白1A”)和内质网保留序列(例如，KDEL序列)分别在LicKM的N和C末端处进行改造。这些构建体的核酸和氨基酸序列展示于SEQ ID NO.：31和SEQ ID NO.：32中：

SEQ ID NO.：31

GGATCCTTAATTAAAATGGGATTTGTTCTCTTTTCACAATTGCCTTCATTTCTTCTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGTGCCCAAAATGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCATAAGGATGAACTTTGACTCGAGCTC

SEQ ID NO.：32

MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAQNGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDHHHHHHKDEL

将源自pBR322质粒的pET表达载体经改造以利用T7噬菌体基因10促进高水平转录和转译的特征。噬菌体编码的RNA聚合酶对于T7启动子序列具有高度特异性，所述T7启动子序列在除T7噬菌体基因组以外的基因组中很少遇到。pET-32用于使α微管蛋白多胞形(“Atub”)、β微管蛋白多胞形(“Btub”)和全长MAP15(“MAP15”)构建体融合到已克隆于此载体中的经修饰地衣多糖酶序列的环状区域中。在经修饰pET-32载体的BamHI与HindIII位点之间(其中T7启动子与T7终止子之间的区域已经切除)克隆具有上游序列PR-1A、KDEL序列和下游His₆标签的地衣多糖酶基因的催化结构域。以此方式获得pET-Atub-LicKM-KDEL、pET-Btub-LicKM-KDEL、pET-MAP15-LicKM-KDEL。应注意，可使用液泡保留序列(VAC)来代替KDEL序列。

将α微管蛋白、β微管蛋白、和/或MAP15的DNA片段亚克隆到LicKM的环(l)部分中以在用于转译的正确阅读框架中获得融合物。构建LicKM-Atub、LicKM-Btub、和LicKM-MAP15融合物。将Atub、Btub、或MAP15的DNA片段使用BamHI和HindIII位点亚克隆到LicKM的环中以在用于转译的正确阅读框架中获得融合物。

将靶抗原构建体LicKM-Atub、LicKM-Btub、或LicKM-MAP15个别亚克隆到所选病毒载体(pBI-D4)中。pBI-D4是pBI121衍生的二元载体，其中编码大肠杆菌β-D-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的报告基因已由“聚合接头”取代，其中在Xbal与Sacl位点之间已经克隆出源自TMV的载体并将其称为“发射载体”，如本文所述。pBI-D4是基于TMV的构建体，其中欲表达的外源基因(例如，靶抗原，例如LicKM-Atub、LicKM-Btub、LicKM-MAP15)取代TMV的外壳蛋白(CP)基因。病毒保留了TMV 126/183kDa基因、运动蛋白(MP)基因和延伸到CP开放阅读框架(ORF)的CP亚基因组mRNA启动子(sgp)。CP的起始密码子已经发生突变。病毒缺少CP且因此不能经由韧皮部在整个宿主植物中运动。然而，病毒感染的细胞至细胞间运动保持正常运转，且病毒可以此方式缓慢运动到上部叶子。多克隆位点(Pacl-Pmel-Agel-Xhol)已在sgp端经改造用于表达外源基因，且随后是TMV 3′非转译区域(NTR)。35S启动子在病毒序列的5′端融合。载体序列位于pBI121的BamHI与SacI位点之间。锤头状核酶被放置于病毒序列的3′处(陈(Chen)等人，2003，分子育种(Mol.Breed.)，11：287)。这些构建体包括编码LicKM-Atub、LicKM-Btub、或LicKM-MAP15的序列与编码来自烟草PR-1a蛋白质的信号肽、6x His标签与ER-保留锚定序列KDEL的序列或液泡序列的融合物。对于含编码PR-LicKM-Atub-KDEL、PR-LicKM-Btub-KDEL和R-LicKM-MAP15-KDEL的序列的构建体来说，将编码DNA作为Pacl-XhoI片段引入pBI-D4中。随后已证实核苷酸序列跨越最终表达构建体的亚克隆接点。

实例2：植物的生成和抗原产生

植物的接种

将表达经修饰AlMV P1和P2蛋白质的转基因烟草本塞姆氏(N.benthamiana)植株的健康叶子用RNA3转录物接种，所述RNA3转录物含有编码α微管蛋白-CP、β微管蛋白-CP、和/或MAP15-CP融合蛋白的序列。活体外转录反应根据标准反应方案实施(参见，例如，勒万多夫斯基(Lewandowski)和道森(Dawson)，1998，病毒学(Virology)，251：427-437；和奥苏伯尔(Ausubel)等人，1987，最新分子生物学实验方法汇编(CurrentProtocols in Molecular Biology)，格林和威利(Greene&Wiley)，纽约(New York))。将转录物稀释于50％DEPC处理的水、25％FES缓冲液和25％GP缓冲液中并根据标准程序在撒有金刚砂的叶子上机械摩擦(参见，例如，道森(Dawson)等人，1986，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，83：1832；和克纳普(Knapp)等人，2001，病毒学杂志(J.Virol)，75：5518)。经接种的叶子在浸润后4-7天(例如，6天)收获。通过SDS PAGE、随后西方印记针对是否存在靶抗原表达对植物进行筛选(图3)。

植物的土壤杆菌浸润

根据本发明，利用通过土壤杆菌浸润实现的土壤杆菌介导的暂时表达系统(特尔本(Turpen)等人，1993，病毒学方法杂志(J.Virol.Methods)，42：227)。将烟草本塞姆氏的健康叶子用发根土壤杆菌或根瘤土壤杆菌(GV3101)接种，所述土壤杆菌含有经改造以表达LicKM-Atub、LicKM-Btub、和/或LicKM-MAP15融合蛋白的病毒载体。

将根瘤土壤杆菌菌株GV3101用构建体pBI-D4-LicKM-Atub、pBI-D4-LicKM-Btub、pBI-D4-LicKM-MAP15、PR-LicKM-Atub-KDEL、PR-LicKM-Btub-KDEL或PR-LicKM-MAP15-KDEL进行转化。如迦毕罗(Kapila)等人(1997，植物科学(Plant Sci.)，122：101)所述使土壤杆菌培养物生长并诱导。使2ml起始培养物(从新鲜菌落中采集)在含有25μg/ml卡那霉素的YEB(5g/l牛肉提取物、1g/l酵母提取液、5g/l蛋白胨、5g/l蔗糖、2mM MgSO₄)中于28℃下过夜生长。将起始培养物以1∶500稀释于500ml的YEB中，所述YEB中含有25μg/ml卡那霉素、10mM2-4(-吗啉)乙磺酸(MES)pH 5.6、2mM额外的MgSO₄和20μM乙酰丁香酮。然后使稀释培养物于28℃下过夜生长到O.D.₆₀₀为大约1.7。将细胞于3,000xg下离心15分钟并重新悬浮于MMA介质(MS盐、10mM MES pH 5.6、20g/l蔗糖、200μM乙酰丁香酮)至O.D.₆₀₀为2.4，将其于室温下保持1-3小时，并用于土壤杆菌浸润。将烟草本塞姆氏叶子使用无针头的一次性注射器注射土壤杆菌悬浮液。浸润后4-7天(例如，6天)收获经浸润的叶子。通过SDS PAGE、随后西方印记针对是否存在靶抗原表达对植物进行筛选。

实例3：疫苗候选物的产生

表达AlMV CP融合蛋白的病毒颗粒纯化

感染后的第4、5、6和7天收获100mg烟草本塞姆氏浸润叶子材料的样品。收获后立即分析新鲜组织的蛋白质表达或收集于-80℃下用于制备后续粗植物提取物或用于融合蛋白纯化。使植物材料保持干燥直到碾磨。

将植物组织在3体积提取缓冲液(0.1M NaPO₄、pH 7.1；0.33M山梨糖醇；2.5mMEDTA；和在使用前才添加的2.5mM DEDTC)中碾磨2分钟。将匀浆于5,000xg下旋转30分钟，并取上清液(40μl)和颗粒样品。将上清液通过神奇滤布(Miracloth)过滤，并于15,000xg(JLA 8100转子)下重新旋转1-1.5小时。分离出40μl上清液样品，并添加10μl的1x SDS加样缓冲液。将溶液煮沸，并将10μl装载于SDS PAGE凝胶上，随后用考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)使凝胶着色。将经纯化的上清液用5％-10％PEG 20,000于4℃下沉淀1小时。PEG溶解之后，将溶液搅拌2-3小时，且然后于15,000xg下旋转30分钟。去除上清液，并将颗粒重新悬浮于30ml重悬浮缓冲液(100mM Na₂HPO₄，pH＝7.1；2.5mM EDTA，pH 8)并于-20℃下冷冻过夜。将试管在冰上解冻并于15,000xg下旋转30分钟，随后于30,000xg下超离心30分钟。将最终溶液浓缩到1mg/ml。测量上清液的蛋白质浓度并通过SDS PAGE、随后西方印迹进行分析(图4)。

地衣多糖酶融合蛋白的纯化

为纯化来自烟草本塞姆氏叶子组织的PR-LicKM-Atub-KDEL、PR-LicKM-Btub-KDEL和PR-LicKM-MAP15-KDEL，将100g叶子与250ml 6M胍；50mM磷酸钠，pH 7.5；100mM NaCl混合。将10mM β-巯基乙醇和10mM咪唑添加到溶液中，并将溶液于4℃下以10,000rpm旋转30分钟。上清液通过神奇滤布过滤，并在此于4℃下以20,000rpm旋转30分钟。上清液通过神奇滤布过滤并通过重力流穿过2ml Ni-NTA珠粒。将所述珠粒用于PBS中的20ml 6M胍洗涤，然后用于PBS中的10ml 25mM咪唑和6M胍洗涤。将蛋白质用于PBS中的10ml 250mM咪唑和6M胍稀释。将珠粒用于PBS中的10ml 1M咪唑和6M胍洗涤。将1mM DTT和10mMEDTA的溶液添加到250mM咪唑部分中，并将样品加热10分钟。添加2X体积10mM碳酸钠(pH 9.5)和500mM NaCl，并将溶液加热5分钟。将样品于室温下培育4小时至一整夜。将所得沉淀离心并在10mM碳酸钠(pH 9.5)和250mM NaCl中透析过夜。将沉淀离心并浓缩到1mg/ml。

或者或另外，将用含pBID4-LicKM-Atub-KDEL、pBID4-LicKM-Btub-KDEL和pBID4-MAP15-KDEL构建体的重组根瘤土壤杆菌浸润的植物叶子通过匀浆化碾磨。含“无EDTA”蛋白酶抑制剂(罗氏(Roche))和Triton X-100 1％的提取缓冲液以3体积w/v的比例使用并于4℃下摇动30分钟。通过在4℃下以9,000xg/10分钟离心使提取物澄清。随后上清液通过神奇滤布过滤，于4℃下以20,000xg离心30分钟，并通过0.45-μm过滤器过滤，然后进行色谱纯化。

使用硫酸铵沉淀法来缩减所得提取物。简言之，将(NH₄)₂SO₄添加到提取物中至20％饱和，在冰上培育1小时，并以18,000xg离心15分钟。将颗粒丢弃并缓慢添加(NH₄)₂SO₄至60％饱和，在冰上培育1小时，并以18,000xg离心15分钟。丢弃上清液，并将所得颗粒重新悬浮液缓冲液中，然后于冰上保持20分钟，随后以18,000xg离心30分钟。将上清液以10,000体积洗涤缓冲液透析过夜。

His标记的LicKM-Atub-KDEL、LicKM-Btub-KDEL和LicKM-MAP15-KDEL嵌合蛋白通过使用IMAC(“固定化金属亲和色谱”，通用电气医疗集团(GE Healthcare))在室温下于重力下纯化。在非变性条件下实施纯化。收集0.5ml流份的蛋白质，将其合并，添加20mM EDTA，以1X PBS于4℃下透析过夜，并通过SDS-PAGE分析。

另一选择，然后将各流份收集在一起，添加20mM EDTA，以NaH₂PO₄ 10mM于4℃下透析过夜，并通过阴离子交换色谱纯化。对于LicKM-Atub-KDEL、LicKM-Btub-KDEL和LicKM-MAP15-KDEL纯化，使用阴离子交换柱快流速Q琼脂糖凝胶(Q Sepharose Fast Flow)(阿莫仙法玛西亚生物科学(Amersham PharmaciaBiosciences))。将LicKM-Atub-KDEL、LicKM-Btub-KDEL和LicKM-MAP15-KDEL亲和或离子交换纯化的嵌合蛋白的样品在12％聚丙烯酰胺凝胶上、随后考玛斯染色进行分离。还将所分离蛋白质以电泳方式转移到PDVF膜以使用多克隆抗地衣多糖酶抗体并随后用抗兔IgG辣根过氧化物酶偶联抗体用于西方印迹分析。

透析后所收集的流份使用pAb α-地衣多糖酶和pAb α-His₆二者通过免疫印迹进行分析。His标签由所表达嵌合蛋白质来保持并通过软件计算纯化蛋白质的最终浓度。

实例4：小鼠免疫原性和攻击研究

实施免疫原性研究以确定基于植物产生的抗原融合物的疫苗是否能够保护小鼠对抗锥虫(即，布氏锥虫)感染。这些研究中所利用的抗原是表达α微管蛋白-CP、β微管蛋白-CP和MAP15-CP融合蛋白的经纯化病毒颗粒，如上文所述。

小鼠免疫原性和攻击研究1

在第一免疫原性研究中，10组瑞士韦伯斯特小鼠(Swiss Webster mice)(8周龄；10只小鼠/组)腹膜内注射重组病毒颗粒的汇集物，其中每一重组颗粒的第一剂量为100μg且第二和第三剂量为50μg。第一剂量是在第0天与弗氏完全佐剂一起投与，第二剂量是在第14天与弗氏不完全佐剂一起投与，且第三剂量是在第28天无佐剂的情况下投与。免疫接种程序表汇总于表5中。

表5.第一小鼠免疫原性研究的免疫接种程序表

组	抗原	第0天时的剂量(μg)	第14天时的剂量(μg)	第28天时的剂量(μg)
					1	AlMVCP	400	200	200
2	Atub(1-4)	400	200	200
					3	Atub(5-8)	400	200	200
4	Btub(1-4)	400	200	200
					5	Btub(5-8)	400	200	200
6	MAP15	200	100	100
					7	MAP15+Atub(1-4)	600	300	300
8	MAP15+Atub(5-8)	600	300	300
					9	MAP15+Btub(1-4)	600	300	300
10	MAP15+Btub(5-8)	600	300	300
					11	天然微管蛋白	40	20	20
12	仅佐剂	0	0	0

所有组中的小鼠在第三剂量后用10²布氏锥虫菌株UTRO 010291B攻击15天。从攻击后的第3天到第17天每天监测小鼠的寄生虫血症。第一周以后，每周实施寄生虫血症的监测直到攻击后第60天为止。汇集物的组成和研究的结果呈现于表6中：

表6.第一小鼠免疫原性研究的汇总

所用抗原	％攻击后存活的动物
		Atub(1-4)	60
Atub(5-8)	70

Btub(1-4)	90
		Btub(5-8)	90
AlMV	0
		MAP15	0
MAP15+Atub(1-4)	0
		MAP15+Atub(5-8)	0
MAP15+Btub(1-4)	0
		MAP15+Btub(5-8)	0
天然微管蛋白	0
		仅佐剂	0

在表6中，“Atub(1-4)”是含α微管蛋白肽1-10、2-13、6-19和7-29(分别为SEQID NO.：4、5、9和10)的重组颗粒混合物；“Atub(5-8)”是含α微管蛋白肽3-17、4-11和8-21(分别为SEQ ID NO.：6、7和11)的重组颗粒混合物；“Btub(1-4)”是含β微管蛋白肽2-4、3-24、5-14、和11-31(分别为SEQ ID NO.：13、14、16和22)的重组颗粒混合物；且“Btub(5-8)”是含β微管蛋白肽1-1、7-19、8-22和9-25(分别为SEQ ID NO.：12、18、19和20)的重组颗粒混合物；参见表7的肽序列。有四组还投与含来自MAP15的肽的重组颗粒。

有四种候选疫苗提供显著对抗攻击性感染的保护作用，其中至少60％的动物攻击后存活：Atub(1-4)和Atub(5-8)提供60％-70％保护作用，而Btub(1-4)和Btub(5-8)提供90％保护作用。接受野生型AlMV颗粒的阴性对照组中的动物在攻击后无一存活。接受MAP15的组未得到保护。因此，在其它组合物中并不包括MAP15。

此外，实施ELISA分析以确定经免疫的小鼠是否已产生识别布氏锥虫抗原的抗体。在这些试验中，在进行免疫和攻击的前3天获得小鼠血清。简言之，使从小鼠中获得的血液在冰上凝固30分钟。将血液以8000rpm离心5分钟。将血清抽吸到新的试管中。重复离心步骤以避免红血球感染。将血清储存在-80℃下。

基本上如下所述实施ELISA。将板用100ng来自布氏锥虫布氏亚种经纯化的微管蛋白、α-微管蛋白多胞形、β-微管蛋白多胞形、偶联到KLH(钥孔虫戚血兰素)的合成β-微管蛋白2-4肽或β-微管蛋白5-14肽涂布过夜。将经涂布板在室温下阻断2小时。将血清连续稀释于I型阻断剂(I-Block)(5g I型阻断剂粉末/1)中并每孔添加50μl。将板在摇床上于室温下培育2小时且然后在洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水；0.05％吐温-20(Tween-20))中洗涤。将辣根过氧化物酶(HRP)偶联二级抗体(α-小鼠IgG或IgG亚型)稀释于I-Block中(以1∶10,000)并每孔添加50μl。将板在室温下在摇床上培育1小时且然后在洗涤缓冲液中洗涤。向每一孔中添加90μl OPD底物(每20ml水1片OPD缓冲片剂和1片OPD底物片剂)。将各板载黑暗中培养直到显示最佳色(约10分钟)。向每一孔中添加10μl 5M H₂SO₄以终止反应，并在490nm下读取吸光度。

这些试验的结果呈现于图5A-B中。在第三次免疫后获得的小鼠血清中检测微管蛋白肽-特异性IgG。α-微管蛋白(Atub 1-4、Atub 5-8)或β-微管蛋白(Btub 1-4、Btub 5-8)测试组的总IgG效价高于对照组(佐剂或野生型病毒颗粒)的总IgG效价，尽管并不明显。用经纯化布氏锥虫布氏亚种微管蛋白免疫的小鼠具有显著IgG效价(图5A)。IgG业型的分析揭示，与对照组相比，所有测试组均具有升高的IgG1效价，对于Atub 1-4、Atub 5-8、Btub 1-4、全长微管蛋白组很明显，但Btub 5-8组较不明显。除诱导对抗全长微管蛋白的组以外，所有测试组的IgG2a和IgG2b效价与对照组并无明显不同(图5B)。

抗体效价和存活率未必肯定相关。因此，本发明涵盖以下认识：保护作用可能不仅基于体液免疫反应，而且也可能涉及细胞介导的免疫机制。或者或另外，所生成抗一种或一种以上的疫苗候选物的抗体可能不能被ELISA中所用的涂布试剂识别。

总之，这些数据表明来自α和β微管蛋白的肽具有用于疫苗开发的潜力，且因此经选择进行进一步表征和评估(参见表7)。

表7.所选用于进一步评估的来自α和β微管蛋白的肽

小鼠免疫原性和攻击研究2

将所选肽进行纯化并在第二轮小鼠攻击模型试验中进行评估。将肽组合成四种与第一免疫原性研究中所用者相同的汇集物，而且还个别评估了四种肽(Btub 2-4、3-24、5-14和11-31)。用于第二免疫原性研究的免疫接种和攻击程序表与第一免疫原性研究中所用者相同，只是每组包括15只小鼠，攻击延迟且小鼠在第65天投与第三加强剂量，之后在第86天攻击。免疫接种程序表呈现于表8中：

表8.第二小鼠免疫原性研究的免疫接种程序表

组	抗原	第0天时的剂量(μg)	第14天时的剂量(μg)	第28天时的剂量(μg)	第65天时的剂量(μg)
						1	AlMV CP	400	200	200	200
2	AlMV CP	100	50	50	50
						3	Atub(1-4)	400	200	200	200
4	Atub(5-8)	400	200	200	200
						5	Btub(1-4)	400	200	200	200
6	Btub(5-8)	400	200	200	200
						7	Btub 2-4	100	50	50	50
8	Btub 3-24	100	50	50	50
						9	Btub 5-14	100	50	50	50
10	Btub11-31	100	50	50	50
						11	微管蛋白	40	20	20	20
12	佐剂	0	0	0	0

第二免疫原性研究的结果呈现于表9中：

表9.第二小鼠免疫原性研究的汇总

所用抗原	％攻击后存活的动物
		AlMV(400μg)	13
AlMV(100μg)	20
		Atub(1-4)	40
Atub(5-8)	40
		Btub(1-4)	53
Btub(5-8)	100
		Btub 2-4	100
Btub 3-24	0

Btub 5-14	100
		Btub 11-31	40
天然微管蛋白	27
		仅佐剂	13
Atub(重组全长)	27
		Btub(重组全长)	33
未经治疗	0

第二研究的结果证实了第一研究的结果。Atub(1-4)和(5-8)提供40％保护作用，其与来自第一研究的结果相当(参见表6，60-70％保护作用，且Btub(5-8)提供100％保护作用，其证实了第一研究的结果(90％保护作用)。另一方面，Btub(1-4)在此研究中提供53％保护作用，而在第一研究中此汇集物提供90％保护作用。然而，对此汇集物个别组分的贡献的分析展示，此汇集物的2个组分Btub 2-4和5-14提供100％对抗攻击的保护作用，而Btub 11-31提供40％保护作用，且Btub 3-24未提供任何保护作用。大肠杆菌中所产生的全长α微管蛋白或β微管蛋白仅对经免疫动物提供27-33％保护作用，且接受野生型AlMV颗粒加佐剂或仅佐剂的对照组仅展示13％存活。

此外，实施ELISA分析以确定经免疫的小鼠是否已产生识别布氏锥虫抗原的抗体。这些试验大体上如针对小鼠免疫原性和攻击研究1所述来实施。

这些试验的结果呈现于图6A-B中。除来自Atub 5-8的血清以外，第三次免疫后获得的所有血清与相应免疫前血清相比均具有升高的总IgG效价。与对照组(例如，佐剂或野生型病毒颗粒)相比，Atub 1-4、重组全长α-微管蛋白、Btub 1-4、Btub 5-8、Btub 3、Btub 11、纯化微管蛋白、和重组全长β-微管蛋白的总IgG效价明显(图6A)。Atubl-4、Btub 1-4、Btub 5-8、和微管蛋白的IgG亚型模式与小鼠研究1中所观察到者类似，这是因为IgG1是主要亚型。除具有高IgG1、及较高IgG2a及IgG2b的Btub 11以外，测试个别微管蛋白肽(Btub2、Btub3、Btub5)的各组的亚型抗体效价均不具有统计学显着性(图6B)。

抗体效价和存活率未必肯定相关。因此，本发明涵盖以下认识：保护作用可能不仅基于体液免疫反应，而且也可能涉及细胞介导的免疫机制。

小鼠免疫原性和攻击研究3

实施第三小鼠免疫原性研究以确定每一个别肽对保护作用的贡献。此研究的要点展示于表10中。

表10.第三小鼠免疫原性研究的免疫接种程序表

组	疫苗(腹膜腔内)	佐剂	第一剂量(μg/剂量)	第二剂量(μg/剂量)	第三剂量(μg/剂量)
						1	AlMV	CFA	600	300	300
2	AlMV	CFA	100	50	50

3	Atub(1-4)	CFA	400	200	200
						4	Atub(5-8)	CFA	300	150	150
5	Atub 1-10	CFA	100	50	50
						6	Atub 2-13	CFA	100	50	50
7	Atub 3-17	CFA	100	50	50
						8	Atub 4-11	CFA	100	50	50
9	Atub 6-19	CFA	100	50	50
						10	Atub 7-29	CFA	100	50	50
11	Btub(1-4)	CFA	400	200	200
						12	Btub(5-8)+Btub 2-4+Btub5-14	CFA	600	300	300
13	Btub 2-4	CFA	100	50	50
						14	Btub 5-14	CFA	100	50	50
15	Btub 11-31	CFA	100	50	50
						16	Btub 1-1	CFA	100	50	50
17	Btub 7-19	CFA	100	50	50
						18	Btub 8-22	CFA	100	50	50
19	Btub 9-25	CFA	100	50	50
						20	Btub 5-14	铝胶	100	50	50
21	Btub 2-4	铝胶	100	50	50
						22	Btub 5-14	----	100	50	50
23	Btub 2-4	----	100	50	50
						24	佐剂	铝胶	0	0	0
25	佐剂	CFA	0	0	0

给药和攻击方案类似于第一免疫原性研究所用者，只是每组有10只动物。除第20组到第25组中的动物以外，所有动物均在有弗氏完全佐剂(CFA；剂量1)和弗氏不完全佐剂(剂量2)的情况下接受疫苗候选物。第20组和第21组中的动物分别在有由sponsor提供的铝胶的情况下接受Btub 2或Btub 5(剂量1和2)，且第22组和第23组中的动物分别在无任何佐剂的情况下接受Btub 2或Btub5。铝胶在牛研究中用作佐剂，且因此在此小鼠研究中有三个组包括铝胶(两个为试验组且一个为对照组)以评价其对诱导保护性免疫性的贡献。所有研究组中的小鼠均在第38天用500只寄生虫(布氏锥虫)进行攻击。

小鼠免疫原性和攻击研究4

实施第四小鼠免疫原性研究以确定每一个别肽对保护作用的贡献。在第四免疫原性研究中，将8组瑞士韦伯斯特小鼠(8-9周龄；10小鼠/组)在肩胛骨之间用200μl/剂量的疫苗候选物加10μl 1mg/ml QuilA皮下注射。根据表11中所示的剂量程序表在研究的第0天、第14天和第28天实施投与：

表11.第四小鼠免疫原性研究的免疫接种程序表

组	疫苗	第一剂量(μg/剂量)	第二剂量(μg/剂量)	第三剂量(μg/剂量)	布氏锥虫布氏亚种UTRO010291B攻击
						1	AlMV	100	50	50	102
2	Btub(5-8)	400	200	200	102
						3	Btub 1-1	100	50	50	102
4	Btub 7-19	100	50	50	102
						5	Btub 8-22	100	50	50	102
6	Btub 9-25	100	50	50	102
						7	无疫苗	-	-	-	102
8	空白	-	-	-	102

收集在第一剂量之前3天、第二剂量之后9天和第三剂量之后7天的血清。所有组中的小鼠均在第三剂量之后10天用10²布氏锥虫布氏亚种菌株UTRO 010291B攻击。

小鼠免疫原性和攻击研究5

实施第五小鼠免疫原性研究以自汇集物中选择提供抗布氏锥虫的保护作用的肽，并测试其各自对在先前试验中所观察到的总保护率的贡献。此外，测试LicKM-Atub多胞形和LicKM-Btub多胞形抗原抗布氏锥虫布氏亚种的保护效能。所有α或β微管蛋白肽中所含的多胞形分别以串联形式融合。其从作为热稳定载体蛋白质的地衣多糖酶的表面环内开始表达成多肽。AlMV和LicKM(地衣多糖酶)组作为阴性对照。因此，包括在小鼠研究2中各自给出100％保护作用的Btub2和Btub5作为参考组(表12)：

表12.小鼠免疫原性研究的免疫接种程序表

组	疫苗	佐剂	第一剂量(μg/剂量)	第二剂量(μg/剂量)	第三剂量(μg/剂量)
						1	AlMV	QuilA	100	50	50
2	Atub 1-10	QuilA	100	50	50
						3	Atub 4-11	QuilA	100	50	50
4	Btub 2-4	QuilA	100	50	50
						5	Btub 5-14	QuilA	100	50	50
6	LicKM	QuilA	140	70	70
						7	LicKM-Atub多胞形	QuilA	200	100	100
8	LicKM-Btub多胞形	QuilA	200	100	100
						9	无疫苗	QuilA	-	-	-
10	空白	-	-	-	-

雌性瑞士韦伯斯特小鼠(7-8周龄)(每组7只)在肩胛骨之间皮下接种。疫苗候选物的体积为200μl/剂量加10μl QuilA(1mg/ml)。在研究的第0天、第14天和第28天实施给药。按照程序表在第三剂量之后10天进行攻击，然而此时有数只小鼠由于未知的原因死亡。在第三剂量后动物数目已经稳定的19天时进行攻击。小鼠用5×102布氏锥虫布氏亚种菌株UTRO 010291B进行攻击。此攻击剂量比小鼠研究2中所用者高2.5倍，此反映出正不断努力使寄生虫方法标准化。每组攻击后存活的动物的数目在表13中给出。

表13.在小鼠研究5中存活的小鼠

组	疫苗	存活的动物/总数
			1	AlMV	2/6
2	Atub 1-10	1/4
			3	Atub 4-11	0/7
4	Btub 2-4	3/5
			5	Btub 5-14	4/7
6	LicKM	1/7
			7	LicKM-Atub多胞形	0/6
8	LicKM-Btub多胞形	0/6
			9	仅佐剂	1/7
10	空白	0/5
			11	空白/空白	5/5

^a-每一组中存活的动物的数目/动物的总数

Atub 1-10、Atub 4-11、LicKM-Atub多胞形、LicKM-Btub多胞形、ALMV对照和佐剂对照组并无保护性。大多数用Btub 2-4或Btub 5-14免疫的动物在攻击后存活下来。存活者由于其攻击后血液中并未展示寄生虫，因此其受到完全保护。Btub 2和Btub 5的结果与之前在小鼠研究2中所观察到的保护作用一致。

实例5：布氏锥虫接种的模型系统

牛重构研究1

此研究定义用于牛的试验条件，其包括用于随后牛研究的寄生虫的攻击剂量。牛重构研究的细节展示于表14中：

表14.牛重构研究1的试验设计

组	疫苗(肌内)	第一剂量(μg/剂量)	第二剂量(μg/剂量)	第三剂量(μg/剂量)	布氏锥虫布氏亚种菌株UTRO 010291B攻击肌内
						1	AlMV+铝胶	1000	3000	3000	5×103
2	AlMV+铝胶	1000	3000	3000	5×106

3	Btub 2-4+Btub5-14+铝胶	500+500	1500+1500	1500+1500	5×103
						4	Btub 2-4+Btub5-14+铝胶	500+500	1500+1500	1500+1500	5×106
5	Btub 2-4+Btub5-14	500+500	1500+1500	1500+1500	5×103
						6	未经治疗的动物				5×103

对雌性安科莱牛(Ankole cattle)(大约18月龄)(每组四头)在第0天、第14天和第28天进行免疫。在每次免疫之前和在第39天攻击之前收集血清样品(10ml)用于免疫原性分析。收集血液样品以监测寄生虫血症，以确定压紧细胞体积(PCV)并获得用于免疫原性分析的血清。实施寄生虫血症和PCV监测直到攻击后45天。

将500μg Btub 2和500μg Btub5在两个不同的注射位点单独肌内投与。第二和第三次免疫同样每次用1500μg实施。在AlMV的情况下，将1000μg颗粒在两个注射位点之间分摊，其中500μg/位点。除第5组中的动物以外，所有动物均在铝胶(2％)的存在下接受疫苗候选物。第6组中的动物未接受任何免疫治疗，但在第39天进行攻击。在此研究中，试验寄生虫的两个攻击剂量(5×10³和5×10⁶)以确定用于随后牛研究的最优剂量。

表15.攻击后牛的寄生虫血症

AI＝动物接种(将牛血液接种到小鼠中)；ELISA＝酶联免疫吸附分析；Pa＝寄生虫血症，利用红细胞压积离心技术监测；PCR＝聚合酶链反应

各组中利用野生型或重组颗粒进行免疫并接受5×10³个寄生虫/动物的攻击剂量的动物在17天后并未展示任何寄生虫血症。另一方面，用5×10⁶个寄生虫进行攻击的动物展示寄生虫血症。具体地说，接受野生型AlMV颗粒(对照)的动物组在攻击后7天展示寄生虫血症，而接受重组AlMV颗粒的动物组直到攻击后第17天仍未患寄生虫血症，此表明靶肽赋予明显的保护作用。选择5×10⁶个寄生虫/动物的攻击剂量用于随后的牛试验。

牛重构研究2

实施此研究以确定是5×10⁴还是5×10⁵个寄生虫/动物可在安科莱牛中确立感染。

表16.牛重构研究2的试验设计

组	布氏锥虫布氏亚种菌株UTRO 010297B攻击
		1	5×103
2	5×104
		3	5×105
4	5×106

将16头先前未暴露于锥虫的雌性安科莱牛分成4个试验组。各动物通过颈静脉利用表16中所列的剂量进行静脉内攻击。在攻击之前和之后取血液样品。使用红细胞压积离心技术(HCT)确定寄生虫血症和PCV。每隔一天观察动物的直肠温度、一般身体状况和行为。

表17.受攻击安科莱牛中的寄生虫血症和症状

组	剂量	攻击后7-14天
						寄生虫血症	临床症状
1	5×103	所有动物均显阴性
				2	5×104	2个动物显阳性(＜105寄生虫/ml血液)
3	5×105	所有动物均显阴性
				4	5×106	所有动物均显阳性(7.9×106-6.3×107寄生虫/ml血	发烧(39.3℃到40.7

液)

℃)

包括那些为HCT阴性者(第1、2和3组)在内的所有动物均展示生病的征兆，例如虚弱、偶尔腹泻和PCV降到低于攻击前的值。攻击后14天结束研究。

利用5×10⁴、而不利用5×10³或5×10⁵的攻击剂量观察散发性布氏锥虫布氏亚种感染。用5×10⁶的布氏锥虫攻击剂量感染实验组内的所有动物。利用5×10⁶的攻击剂量，重新获得在牛重构研究1中所观察到的结果。因此，本发明者证明，这是安科莱牛在短期短期实验试验中获得读出的足够攻击剂量。

牛免疫原性研究

利用牛攻击研究来鉴别和确立最终抗原疫苗组合物。产生50mg量的自小鼠攻击研究中所选择的每一靶抗原。实施牛攻击研究以确定构成最终疫苗候选物的靶的最优组合和剂量。在整个项目期间将对此研究中存活的牛将进一步监测潜在的不利作用(包括自体免疫反应)。

牛免疫原性研究1

将如本文所述生长的烟草本塞姆氏植物批料用每一构建体单独和重组病毒颗粒(约50mg)接种，此代表每一靶抗原独立经纯化。在牛攻击研究中在汇集物中评估靶抗原(表18)。汇集物1包含所有所选抗原并以不同的浓度进行评估。汇集物2包含在攻击期间提供50％和更高保护作用的靶抗原。汇集物3包含攻击时提供小于50％保护作用的抗原。汇集物4包含与任何人类微管蛋白序列具有小于40％一致性的肽。

表18.牛免疫原性研究1

组	疫苗(肌内)	疫苗剂量(μg/剂量)	布氏锥虫布氏亚种菌株UTRO 010291B攻击
				1	AlMV	1000	106
2	PBS+佐剂	----	106
				3	汇集物1	每一者2000	106
4	汇集物1	每一者1000	106
				5	汇集物1	每一者500	106
6	汇集物1	每一者250	106
				7	汇集物2	每一者1000	106
8	汇集物3	每一者1000	106
				9	汇集物4	每一者1000	106
10	未治疗的动物		106

雌性安科莱牛(每组六头)在第0天、第14天和第28天进行肌内免疫。在每次免疫之前和在第38天攻击之前收集血清样品用于免疫原性分析。还收集攻击后10天的血液样品以监测寄生虫血症。第8组的动物未接受任何免疫治疗，但在第38天时进行肌内攻击。尽管个别肽已展示在小鼠中提供100％保护作用，但单一靶并不足以在牛中诱导完全保护性免疫性。因此，评估呈汇集物形式的各种肽。作为此研究的结果，鉴别出最终疫苗调配物中所包括的肽。可基于最少数目的肽具有最高保护效能来选择。

除效能评估以外，在整个项目期间保留来自牛免疫原性研究1的牛并监测任何潜在长期不利作用(包括自体免疫反应)。在小动物研究中测试来自这些动物的血清和乳汁的潜在免疫反应、过敏反应和/或自体免疫反应。

牛免疫原性研究2

实施研究以确定最终疫苗组合物中每一靶抗原的含量和/或剂量。将实施额外研究以确定适宜佐剂含量和确定调配物的安全性。为实施这些研究，制得500mg量的每一所选靶。

将500mg重组颗粒(其代表在牛免疫原性研究1中所鉴别出具有保护性的每一靶)的进行纯化。将纯化颗粒汇集于不同缓冲液中病使用病毒颗粒的电子显微镜术、病毒颗粒的琼脂糖凝胶电泳和使用特异性针对每一靶肽的引物进行病毒RNA的RT-PCR来分析颗粒完整性。测试调配物在冷冻和冻干状态下的可储存性和长期稳定性。在牛中在铝胶连同单磷酸类脂A(MPL)或其它佐剂的存在下评估具有期望特性的调配物。研究设计汇总于表19中。

表19.牛免疫原性研究2

组	疫苗(肌内)	布氏锥虫布氏亚种菌株UTRO 010291B攻击肌内
			1	AlMV	106
2	PBS+佐剂	106
			3	调配物1	106
4	调配物2	106
			5	调配物3	106
6	调配物4	106
			7	调配物5	106
8	调配物6	106
			9	未治疗的动物	106

雌性安科莱牛(每组六头)在第0天、第14天和第28天进行肌内免疫。在每次免疫之前和在第38天肌内攻击之前收集血清样品用于免疫原性分析。还收集攻击后10天的血液样品以监测寄生虫血症。第9组的动物未接受任何免疫治疗，但在第38天时进行攻击。此研究的目标是鉴别出有效疫苗调配物。此研究还确立了疫苗调配物中每一个别靶的最优剂量。

牛免疫原性研究3

在此研究中，优化抗原产生，并在牛攻击研究中评估最终疫苗调配物抗非洲锥虫病的同源和异源变体的效能。产生500mg量的每一所选靶，进行调配并在牛中测试保护效能。使用所制得调配物的某些部分以研究并确立储存和分配的条件。

植物浸润和靶蛋白累积之后，以5kg(生物质)的规模实施蛋白质纯化的初步台式试验。确立回收靶蛋白的基本程序。调查多种分离技术以确定将允许最高产物回收率(至少70％)与最高纯度(至少90％)的组合。一般分离技术(例如尺寸排除色谱法)与依赖于靶蛋白的特异性技术一起使用。可针对以下想要的目标实施进一步优化：减少处理时间，增加过程可靠性，增加靶累积和回收，降低成本，和使环境和健康危害降到最低。利用在过程开发和优化期间所获得的知识用于纯化公斤数量的靶抗原。此包括检查和调节规模扩大的假设、以及详述有助于从实验室到工业规模的迅速成本有效的规模扩大的设备的生产要求。

一旦靶抗原准备完毕，制备已展示提供高保护作用的调配物并评估抗寄生虫的同源和异源变体的攻击(表20)。此外，以不同剂量方案测试疫苗的保护效能(表20)。

表20.牛免疫原性研究3

组	疫苗	第一剂量	第二剂量	第三剂量	攻击
						1	AlMV+铝胶	+	+	+	同源
2	AlMV+铝胶	+	+	+	异源
						3	PBS+铝胶	+	+	+	同源
4	调配物X	+	+	+	同源
						5	调配物X	+	+	+	异源
6	调配物X	-	+	+	同源
						7	调配物X	-	-	+	同源
8	未治疗的动物				同源
						9	未治疗的动物				同源

雌性安科莱牛(每组六头)在第0天、第14天和第28天进行肌内免疫。在每次免疫之前和在第38天攻击之前收集血清样品用于免疫原性分析。还收集攻击后10天的血液样品以监测寄生虫血症。第9组的动物未接受任何免疫治疗，但在第38天时进行攻击。此研究的结果是确立最优剂量方案并确定疫苗是否对同源和异源病原体变体均起保护作用。此外，利用试验室规模生产(最多5kg)所确立的过程和方法用于大规模(高达50kg)生产。

牛免疫原性研究4

获得八十头以前没有暴露于布氏锥虫历史的雌性安科莱牛。通过ELISA针对牛以前是否暴露于锥虫(布氏锥虫和/或刚果锥虫)来筛选。将阴性动物放置于马克大学(Makerere University)动物设施处检疫1个月，直到开始研究之后。

将雌性安科莱牛(大约18月龄)(每组六头)在第0天、第14天和第42天进行免疫。在两个不同注射位点处在作为佐剂的100μl(1mg/ml)QuilA存在下皮下投与所有疫苗候选物(1ml)。类似地实施第二和第三次免疫(表21)：

表21：牛免疫原性研究4

^*牛未进行接种但攻击

^**牛既未接种亦未攻击

通过颈静脉在每次免疫之前和第53天攻击之前和攻击后收集血液样品(10ml)。血液样品用于监测寄生虫血症，以确定压紧细胞体积(PCV)并获得用于免疫原性分析的血清。

第1-10组中的牛用5×10布氏锥虫布氏亚种寄生虫(菌株UTRO 010291B)攻击。第11组未进行攻击。

通过红细胞压积离心法(HCT)监测寄生虫血症的发作和其进展(武(Woo)，1970，热带学报(Acta Tropica)，27：384；以引用的方式纳入本文中)，随后通过匹配法评估血沉棕黄层中的寄生虫数目(赫伯特(Herbert)和拉姆斯登(Lumsden)，1976，Exp.Parasitol，40：427；以引用的方式纳入本文中)。结果呈现于表22中：

表22：牛免疫原性研究4：平均寄生虫血症

^*寄生虫血症是以攻击后所指天数的log值的平均

除空白对照(第11组)中的动物以外，所有动物攻击后11天其血液中均有寄生虫。在攻击后39天，在Btub5(第5组)和Btub11(第6组)中含寄生虫的牛的数目降为零。这些牛在攻击后45和52天仍保持阴性，此表明寄生虫(如果存在的话)低于10³/ml血液。

急性感染期：有3头牛在攻击后11天由于动物间搏斗导致虚弱而死亡。17头牛在攻击后17天与34天之间死亡。除Btub2+5+11以外，在此阶段每组失去1到3个动物(表23)：

表23.牛免疫原性研究4：攻击后17到34天牛的死亡

	AlMV	Btub2+5+11	Btub2+5	Btub2	Btub5	Btub11	Btub1	Btub7	Atub3	空白/攻击
											死亡/总数	3/6	0/5a	3/5a	1/6	1/5a	2/6	2/6	2/6	1/6	2/6

^a-动物由于内部搏斗而死亡

慢性感染期：所有AlMV对照动物在攻击后在61与64天之间均死掉。试验组内的动物也死亡了，然而，每一试验组有1或2个活的比对照长最多11天的动物。明显地，用Btub 5免疫的所有4只动物存活的时间比AlMV免疫的对照长9-11天(图7)。

寄生虫血症和存活：在AI中所有动物均在攻击后59天测试寄生虫血症(血液从牛转移到小鼠中)。AI的检出限为约100个锥虫/ml血液。在AI中经测试为阴性的牛的数目在表24中给出：

表24.牛免疫原性研究4：攻击后59天牛中的寄生虫血症状况

	AlMV	Btub2+5+11	Btub2+5	Btub2	Btub5	Btub 11	Btub1	Btub7	Atub3	空白/攻击
											阴性/总数	0/3	1/5	0/2	0/5	2/4	1/4	1/4	2/4	3/5	0/4

在AI中经测试呈阴性的动物与在AI中经测试呈阳性者相比趋向于存活更长的时间(表25)：

表25.牛免疫原性研究4：超过对照的牛的平均存活

	AlMV	Btub 2+5+11	Btub2+5	Btub2	Btub5	Btub11	Btub1	Btub7	Atub3	空白/攻击
											阴性	0	10*	0	0	9.5	10	8	10.5	7.7？	0
阳性	0	3.3	3	6	10	0	4	3	0	0

^*平均存活以天数给出。

不想受任一特定理论限制，疾病急性期期间的死亡可能是由于初始高寄生虫负载。然而，在此研究中，经免疫动物中的寄生虫数目与对照动物相比减少较快。甚至在展示有希望或完全从寄生虫中恢复的组中在锥虫病后期期间动物的死亡可能由于内部器官的继发损坏而造成的。锥虫感染造成贫血，此导致对器官和肌肉的氧供应缺乏。患病动物的尸体解剖展示内部器官、肌肉且尤其是骨髓水肿(很稀薄)。

动物在攻击后约73天突然死亡引起了关于是否动物饮食的改变可能造成额外应力的问题。此改变是不可避免，这是因为干草的输送由于邻国肯尼亚(Kenya)的政治危机而延迟。肯尼亚的政治危机导致燃料短缺、经常停电，仅列举几个在此试验期间不可预知的挑战。

本发明者观察到在用微管蛋白亚单元候选物接种的牛中寄生虫减少并清除，但在对照组中未观察到。大多数在AI中测试为阴性的动物活的时间比经测试AI阳性的AlMV免疫的对照长9-11天。具体来说，用Btub5免疫接种看来似乎延长经攻击动物的存活。

牛免疫原性研究5

在自然条件下，锥虫是通过采采蝇的叮咬传播到宿主中。因此，本发明涵盖以下认识：锥虫感染的此天然途径可经由皮内注射进行最佳模仿。实施以下实验以确定皮内途径是否适于用锥虫试验性感染牛。

通过ELISA和PCR筛选24头雌性安科莱牛(约15-24月龄)以确保之前未暴露于锥虫。将动物随机分成6组，每组4头动物，且然后用布氏锥虫布氏亚种(UTRO 010291B)攻击(表26)。在攻击之前和之后去血液样品。

表26.牛免疫原性研究5的试验设计

组	寄生虫种类	寄生虫剂量	攻击途径
				1	布氏锥虫布氏亚种	103	皮内

2	布氏锥虫布氏亚种	104	皮内
				3	布氏锥虫布氏亚种	105	皮内
4	布氏锥虫布氏亚种	106	皮内
				5	布氏锥虫布氏亚种	106	静脉内
6	布氏锥虫布氏亚种	103	静脉内

将攻击剂量以800μl/动物的最终体积经静脉内或通过颈静脉或皮内递送到颈部区域。从攻击后第5天开始每天监测动物的寄生虫血症进展。

对血液试样实施红细胞压积离心法(HCT)，随后依照默里(Murray)方法(一种经修改的暗场/血沉棕黄层程序)(阿科尔(Akol)和默里，1983，Exp.Parasitol，55：386；以引用的方式并入本文中；表27)进行寄生虫计数。简言之，通过切入毛细管以吸取1mm红细胞和1mm血浆以从红细胞压积微毛细管收回血沉棕黄层区。使内容物在载玻片上铺开并用22×22mm盖玻片覆盖并在配备有背景照明的显微镜下检查。

表27.利用依照默里方法的经修改血沉棕黄层技术寄生虫血症的得分

锥虫数目	锥虫/ml血液	得分
			群游＞100/视野	＞106	6+
＞10/视野	＞105	5+
			1-10/视野	104-5×105	4+
1/2个视野-1/10个视野	5×103-5×104	3+
			1-10/制备	103-104	2+
1/制备	102-103	1+

除第1组(10³布氏锥虫布氏亚种/皮内)中的一个动物以外，所有动物在攻击后第7天均展示寄生虫。大多数动物发烧(直肠温度＞39℃)。PCV值下降但维持在＞24％的正常范围内。14天后结束试验。

表28.经攻击安科莱牛中的寄生虫血症

^a-通过血沉棕黄层检查未检测到寄生虫

^b对于得分的解释参考表2

^c表中忽略第7天和第11天之间的天数，这是因为在此期间未出现明显变化

表29.攻击后12天的平均寄生虫血症

组	锥虫物种	剂量	途径	牛	攻击后12天
						1	布氏锥虫布氏亚种	103	皮内	4	3.3+
2	布氏锥虫布氏亚种	104	皮内	4	3.25+
						3	布氏锥虫布氏亚种	105	皮内	4	3+
4	布氏锥虫布氏亚种	106	皮内	4	3.25+
						5	布氏锥虫布氏亚种	106	静脉内	4	4+
6	布氏锥虫布氏亚种	103	静脉内	4	3.5+

利用依照默里等人(1983)经改进的寄生虫学方法测试来自早期研究的血液样品以判断敏感性的增加。

牛免疫原性研究5证明，皮内投与攻击剂量作为静脉内投与是有效的。

牛免疫原性研究6

根据表30中所呈现的试验计划实施另一免疫原性研究：

表30.第六牛免疫原性研究的试验计划

每次注射的总体积为1ml免疫原加100μl QuilA(1mg/ml)。还测试了仅具有铝胶的组合物(即，在不存在QuilA的情况下)。

表31：牛研究6的接种程序表和血清收集

第1次抽血	第一剂量	第2次抽血	第二剂量	第3次抽血	第三剂量	第4次抽血	攻击
								第-4天	第0天	第10天	第14天	第24天	第28天	第34天	第38天

等效内容和范围

所属领域的技术人员仅使用常规实验即可识别或能确定本文所述本发明特定实施例的许多等效物。本发明的范围并不欲限于上述说明，而是如随附权利要求书中所阐述。

所属领域的技术人员仅使用常规实验即可识别或能确定本文所述的本发明特定实施例的许多等效物。本发明的范围并不欲限于上述说明，而是如随附权利要求书中所阐述。

除非上下文中说明相反含义或另有说明，否则在权利要求书中例如“一”和“所述”物件可意指一个或多于一个。除非上下文中说明相反含义或另有说明，否则如果一个、多于一个、或所有的群组成员都存在于、用于、或与给定产物或过程相关，则可认为在群组的一个或一个以上的成员间包括“或”的权利要求或说明是适合表述这种情况的。本发明包括其中恰好只有一个群组成员存在于、用于、或与给定产物或过程相关的实施例。本发明包括其中多于一个、或所有的群组成员都存在于、用于、或与给定产物或过程相关的实施例。此外，应了解本发明涵盖所有变化、组合和置换，其中将一种或一种以上的限制、要素、条款、说明性术语等自一项或一项以上的所列权利要求引入另一权利要求中。具体来说，依赖于另一权利要求的任何权利要求均可加以修改以包括在依赖于相同基础权利要求的任何其它权利要求中发现的一种或一种以上的要素或限制。而且，在权利要求列举组合物的情况下，除非另外说明或除非对所属领域的技术人员来说明显矛盾或不一致，否则，应了解包括使用组合物用于本文所揭示的任一目的的方法且包括根据本文所揭示的任一制备方法和所属领域中已知的其它方法来制备组合物的方法。

在以列表形式阐述要素的情况下，例如以马库西(Markush)群组格式阐述，应了解其也揭示每一要素亚组，且可自所述群组中移除任何要素。应了解，一般来说，如果称本发明或本发明的方面包括特定要素、特征等，则本发明某些实施例或本发明的各方面由所述要素、特征等组成或基本上由其组成。为了简单起见，在本文内容中仅具体列举这些实施例中的某些实施例。应注意，术语“包含”意欲为开放式且允许包括额外的要素或步骤。

如果给定范围，则包括终点。此外，应了解除非上下文和所属领域的技术人员的理解中另有说明或另外明确表明，除非上下文明确表示其它含义，否则在本发明不同实施例中表示为范围的值可采用所述范围内的任一特定值或子范围，精确到所述范围下限最小整数的十分之一。

此外，应了解可自任何一项或一项以上的权利要求中明确排除在先前技术范围内的任何本发明特定实施例。由于认为这些实施例已为所属领域的技术人员熟知，因此即使本文中没有明确阐述排除，也可将其排除。本发明组合物的任何特定实施例(例如，任何锥虫物种或菌株；任何锥虫蛋白；任何融合蛋白；任何表达系统；任何植物产生系统；任何投与方法等)可能出于任何原因未包括在任何一项或一项以上的权利要求中，无论是否与存在的先前技术有关。

Claims (143)

1、一种分离抗原，其包含融合到热稳定蛋白或融合到苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaicvirus)(AIMV)外壳蛋白的锥虫(Trypanosoma)蛋白组分；

其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个选自由α微管蛋白、β微管蛋白、MAP15、和其片段组成的群组的结构域。

2、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分为多胞形。

3、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个α微管蛋白或α微管蛋白片段，其包含选自由SEQ ID NO.：1和4-11组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

4、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：6中给出的氨基酸序列。

5、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个β微管蛋白或β微管蛋白片段，其包含选自由SEQ ID NO.：2和12-22组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

6、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：12中给出的氨基酸序列。

7、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：13中给出的氨基酸序列。

8、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：16中给出的氨基酸序列。

9、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：22中给出的氨基酸序列。

10、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个MAP15或MAP15片段，其包含选自由SEQ ID NO.：3和23-27组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

11、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含含有SEQ IDNO.：1中给出的氨基酸序列的全长α微管蛋白。

12、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含含有SEQ IDNO.：2中给出的氨基酸序列的全长β微管蛋白。

13、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含含有SEQ IDNO.：3中给出的氨基酸序列的全长MAP15。

14、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述热稳定蛋白包含经修饰的地衣多糖酶蛋白。

15、根据权利要求14所述的分离抗原，其中地衣多糖酶的编码序列已针对植物中的蛋白质表达进行优化。

16、根据权利要求14所述的分离抗原，其中所述地衣多糖酶蛋白包含地衣多糖酶LicB的N末端结构域、C末端结构域、和表面环状结构域。

17、根据权利要求1所述的分离抗原，其中融合到地衣多糖酶的所述锥虫蛋白组分是N末端融合蛋白、C末端融合蛋白或表面环状插入融合蛋白中的任一者。

18、根据权利要求1所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含含有至少两个选自由SEQ ID NO.：1-27中的任一者组成的群组的序列的氨基酸序列。

19、根据权利要求18所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的一部分和β微管蛋白的一部分。

20、根据权利要求18所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的多个部分。

21、根据权利要求18所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含β微管蛋白的多个部分。

22、根据权利要求18所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含MAP15的多个部分。

23、根据权利要求18所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含全长α微管蛋白和全长β微管蛋白。

24、一种疫苗组合物，其包含抗原和医药上可接受的载剂，所述抗原包含融合到热稳定蛋白或融合到AlMV外壳蛋白的锥虫蛋白组分；

其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个选自由α微管蛋白的一部分、β微管蛋白的一部分和MAP15的一部分组成的群组的结构域；且

其中所述组合物在投与给个体后能够引起免疫反应。

25、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个α微管蛋白或α微管蛋白片段，其包含选自由SEQ ID NO.：1和4-11组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

26、根据权利要求24所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：6中给出的氨基酸序列。

27、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个β微管蛋白或β微管蛋白片段，其包含选自由SEQ IDNO.：2和12-22组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

28、根据权利要求24所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：12中给出的氨基酸序列。

29、根据权利要求24所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：13中给出的氨基酸序列。

30、根据权利要求24所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：16中给出的氨基酸序列。

31、根据权利要求24所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：22中给出的氨基酸序列。

32、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个MAP15或MAP15片段，其包含选自由SEQ ID NO.：3和23-27组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

33、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含含有选自SEQ ID NO.：1的任一序列中给出的氨基酸序列的全长α微管蛋白。

34、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含含有选自SEQ ID NO.：2的任一序列中给出的氨基酸序列的全长β微管蛋白。

35、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含含有选自SEQ ID NO.：3的任一序列中给出的氨基酸序列的全长MAP15。

36、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述热稳定蛋白包含经修饰的地衣多糖酶蛋白。

37、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述热稳定蛋白包含来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的经修饰的地衣多糖酶蛋白序列。

38、根据权利要求36所述的疫苗组合物，其中地衣多糖酶的编码序列已针对植物中的蛋白质表达进行优化。

39、根据权利要求36所述的疫苗组合物，其中所述地衣多糖酶蛋白序列包含地衣多糖酶的N末端结构域、C末端结构域和表面环状结构域。

40、根据权利要求39所述的疫苗组合物，其中融合到地衣多糖酶的所述锥虫蛋白组分是N末端融合蛋白、C末端融合蛋白或表面环状插入融合蛋白中的任一者。

41、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含至少两个包含选自由SEQ ID NO.：1-27中的任一者组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列的结构域，且其中所述组合物在投与给个体后能够引起免疫反应。

42、根据权利要求41所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的至少一部分和β微管蛋白的至少一部分。

43、根据权利要求41所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的多个部分。

44、根据权利要求41所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含β微管蛋白的多个部分。

45、根据权利要求41所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含MAP15的多个部分。

46、根据权利要求41所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含全长α微管蛋白和全长β微管蛋白。

47、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其进一步包含第二抗原，其中所述组合物在投与给动物后能够引起免疫反应。

48、根据权利要求47所述的疫苗组合物，其中所述第二抗原包含融合到热稳定蛋白或融合到AlMV外壳蛋白的锥虫蛋白组分和医药上可接受的载剂；

其中所述第一抗原的锥虫蛋白组分包含至少一个选自由α微管蛋白的一部分、β微管蛋白的一部分和MAP15的一部分组成的群组的结构域，且所述第二抗原的锥虫蛋白组分包含至少一个不同于所述第一抗原的选自由α微管蛋白的一部分、β微管蛋白的一部分和MAP15的一部分组成的群组的结构域；且

其中所述组合物在投与给个体后能够引起免疫反应。

49、根据权利要求48所述的疫苗组合物，其中所述第一抗原的锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的一部分且所述第二抗原的锥虫蛋白组分包含β微管蛋白的一部分。

50、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述抗原是在选自转基因植物和暂时表达所述抗原的植物的植物中产生。

51、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述组合物包含来自植物细胞、植株、种子、果实或其提取物的经纯化、部分纯化或未经纯化的抗原。

52、根据权利要求24所述的疫苗组合物，其进一步包含至少一种疫苗佐剂。

53、根据权利要求52所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自由弗氏完全佐剂(complete Freund′s adjuvant)、弗氏不完全佐剂、明矾、MF59、皂苷、铝胶(alhydrogel)、QuilA、和MALP2组成的群组。

54、一种疫苗组合物，其包含至少两种抗原，所述抗原各包含锥虫蛋白组分，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个选自由α微管蛋白的一部分、β微管蛋白的一部分和MAP15的一部分组成的群组的结构域；其中至少一种抗原融合到热稳定蛋白或融合到AlMV外壳蛋白；其中所述组合物包含医药上可接受的载剂；且其中所述组合物在投与给个体后能够引起免疫反应。

55、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中至少一种锥虫蛋白组分包含至少一个α微管蛋白或α微管蛋白片段，其包含选自由SEQ ID NO.：1和4-11组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

56、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中至少一种锥虫蛋白组分包含SEQ IDNO.：6中给出的氨基酸序列。

57、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中至少一种锥虫蛋白组分包含至少一个β微管蛋白或β微管蛋白片段，其包含选自由SEQ ID NO.：2或SEQ ID NO.：12-22中的任一者组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

58、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中至少一种锥虫蛋白组分包含SEQ IDNO.：12中给出的氨基酸序列。

59、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中至少一种锥虫蛋白组分包含SEQ IDNO.：13中给出的氨基酸序列。

60、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中至少一种锥虫蛋白组分包含SEQ IDNO.：16中给出的氨基酸序列。

61、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中至少一种锥虫蛋白组分包含SEQ IDNO.：22中给出的氨基酸序列。

62、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中至少一种锥虫蛋白组分包含至少一个MAP15或MAP15片段，其包含选自由SEQ ID NO.：3和23-27组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

63、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中至少一种锥虫蛋白组分包含含有SEQ ID NO.：1中给出的序列的全长α微管蛋白。

64、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中至少一种锥虫蛋白组分包含含有SEQ ID NO.：2中给出的序列的全长β微管蛋白。

65、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中至少一种锥虫蛋白组分包含含有SEQ ID NO.：3中给出的序列的全长MAP15。

66、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中所述热稳定蛋白包含经修饰的地衣多糖酶蛋白。

67、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中所述热稳定蛋白包含来自热纤梭菌的经修饰的地衣多糖酶蛋白序列。

68、根据权利要求66所述的疫苗组合物，其中地衣多糖酶的编码序列已针对植物中的蛋白质表达进行优化。

69、根据权利要求66所述的疫苗组合物，其中所述地衣多糖酶蛋白序列包含地衣多糖酶的N末端结构域、C末端结构域和表面环状结构域。

70、根据权利要求69所述的疫苗组合物，其中融合到地衣多糖酶的所述锥虫蛋白组分是N末端融合蛋白、C末端融合蛋白或表面环状插入融合蛋白中的任一者。

71、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含至少两个包含选自由SEQ ID NO.：1-27中的任一者组成的群组的任一序列中给出的序列的结构域，且其中所述组合物在投与给个体后能够引起免疫反应。

72、根据权利要求71所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的一部分和β微管蛋白的一部分。

73、根据权利要求71所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的多个部分。

74、根据权利要求71所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含β微管蛋白的多个部分。

75、根据权利要求71所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含MAP15的多个部分。

76、根据权利要求71所述的疫苗组合物，其中所述锥虫蛋白组分包含全长α微管蛋白和全长β微管蛋白。

77、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其进一步包含第三抗原，其中所述组合物在投与给动物后能够引起免疫反应。

78、根据权利要求71所述的疫苗组合物，其中所述第三抗原包含融合到热稳定蛋白或融合到AlMV外壳蛋白的锥虫蛋白组分和医药上可接受的载剂；

其中所述第一抗原的锥虫蛋白组分包含至少一个选自由α微管蛋白的一部分、β微管蛋白的一部分和MAP15的一部分组成的群组的结构域，且所述第二抗原的锥虫蛋白组分包含至少一个不同于所述第一抗原的选自由α微管蛋白的一部分、β微管蛋白的一部分和MAP15的一部分组成的群组的结构域；且

其中所述组合物在投与给个体后能够引起免疫反应。

79、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中所述抗原是在选自转基因植物和暂时表达所述抗原的植物的植物中产生。

80、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其中所述组合物包含来自植物细胞、植株、种子、果实或其提取物的经纯化、部分纯化或未经纯化的抗原。

81、根据权利要求54所述的疫苗组合物，其进一步包含至少一种疫苗佐剂。

82、根据权利要求81所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自由弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、明矾、MF59、皂苷、铝胶、QuilA、和MALP2组成的群组。

83、一种在个体中诱导抗锥虫感染的保护性免疫反应的方法，其包含向个体投与有效量的抗锥虫疫苗组合物，其中所述投与足以刺激抗原特异性抗体的产生或刺激所述个体的细胞免疫反应；由此诱导保护性免疫反应；

其中所述疫苗组合物包含含有融合到热稳定蛋白或融合到AlMV外壳蛋白的锥虫蛋白组分的抗原；且

其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个选自由α微管蛋白的一部分、β微管蛋白的一部分、和MAP15的一部分组成的群组的结构域。

84、根据权利要求83所述的方法，其中所述组合物是经口、鼻内、皮下、静脉内、腹膜内或肌内投与。

85、根据权利要求84所述的方法，其中所述组合物是经由将植物细胞投喂给所述个体而经口投与。

86、根据权利要求83所述的方法，其中所述个体是人类。

87、根据权利要求83所述的方法，其中所述个体选自由鸟、猪和马组成的群组。

88、一种产生抗原蛋白的方法，所述抗原蛋白包含融合到热稳定蛋白或融合到AlMV外壳蛋白的锥虫蛋白组分，所述方法包含：

制备编码包含融合到热稳定蛋白或融合到AlMV外壳蛋白的锥虫蛋白组分的抗原的核酸构建体；

将所述核酸构建体引入细胞中；和

在有利于所述抗原蛋白的表达的条件下培养所述细胞，由此产生所述抗原蛋白；

其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个选自由α微管蛋白的一部分、β微管蛋白的一部分和MAP15的一部分组成的群组的结构域。

89、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个α微管蛋白或α微管蛋白片段，其包含选自由SEQ ID NO.：1和4-11组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

90、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：6中给出的氨基酸序列。

91、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个β微管蛋白或β微管蛋白片段，其包含选自由SEQ ID NO.：2和12-22组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

92、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：12中给出的氨基酸序列。

93、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：13中给出的氨基酸序列。

94、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：16中给出的氨基酸序列。

95、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：22中给出的氨基酸序列。

96、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个MAP15或MAP15片段，其包含选自由SEQ ID NO.：3和23-27组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

97、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含含有SEQ ID NO.：1中给出的序列的全长α微管蛋白。

98、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含含有SEQ ID NO.：2中给出的序列的全长β微管蛋白。

99、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含含有SEQ ID NO.：3中给出的序列的全长MAP15。

100、根据权利要求88所述的方法，其中所述热稳定蛋白包含经修饰的地衣多糖酶蛋白。

101、根据权利要求88所述的方法，其中地衣多糖酶的编码序列已针对植物中的蛋白质表达进行优化。

102、根据权利要求88所述的方法，其中所述地衣多糖酶蛋白序列包含地衣多糖酶的N末端结构域、C末端结构域和表面环状结构域。

103、根据权利要求88所述的方法，其中融合到地衣多糖酶的所述锥虫蛋白组分是N末端融合蛋白、C末端融合蛋白或表面环状插入融合蛋白中的任一者。

104、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含至少两个选自由α微管蛋白的一部分、β微管蛋白的一部分和MAP15的一部分组成的群组的结构域。

105、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的一部分和β微管蛋白的一部分。

106、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的多个部分。

107、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含β微管蛋白的多个部分。

108、根据权利要求88所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含MAP15的多个部分。

109、根据权利要求88所述的方法，其中所述抗原蛋白的表达受病毒启动子的控制。

110、根据权利要求88所述的方法，其中所述核酸构建体进一步包含载体核酸序列。

111、根据权利要求88所述的方法，其中所述载体是二元载体。

112、根据权利要求88所述的方法，其中所述核酸构建体进一步包含编码病毒蛋白的序列。

113、根据权利要求88所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。

114、根据权利要求113所述的方法，其中所述植物细胞来自烟草属(Nicotianagenus)。

115、根据权利要求88所述的方法，其进一步包含回收所产生的部分纯化或纯化抗原蛋白。

116、一种分离的核酸构建体，其包含编码融合到热稳定蛋白或融合到AlMV外壳蛋白的锥虫蛋白组分的核酸序列；且其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个选自由α微管蛋白的一部分、β微管蛋白的一部分和MAP15的一部分组成的群组的结构域。

117、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个α微管蛋白或α微管蛋白片段，其包含选自由SEQ ID NO.：1和4-11组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

118、根据权利要求116所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：6中给出的氨基酸序列。

119、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个β微管蛋白或β微管蛋白片段，其包含选自由SEQ ID NO.：2和12-22组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

120、根据权利要求116所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：12中给出的氨基酸序列。

121、根据权利要求116所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：13中给出的氨基酸序列。

122、根据权利要求116所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：16中给出的氨基酸序列。

123、根据权利要求116所述的分离抗原，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：22中给出的氨基酸序列。

124、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含至少一个MAP15或MAP15片段，其包含选自由SEQ ID NO.：3和23-27组成的群组的任一序列中给出的氨基酸序列。

125、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：1中给出的序列。

126、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：2中给出的序列。

127、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含SEQ ID NO.：3中给出的序列。

128、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的至少一部分或β微管蛋白的至少一部分，

其中所述热稳定蛋白包含经修饰的地衣多糖酶蛋白。

129、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的至少一部分或β微管蛋白的至少一部分，

其中地衣多糖酶的编码序列已针对植物中的蛋白质表达进行优化。

130、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的至少一部分或β微管蛋白的至少一部分，

其中所述地衣多糖酶蛋白序列包含地衣多糖酶的N末端结构域、C末端结构域和表面环状结构域。

131、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的至少一部分或β微管蛋白的至少一部分，

其中融合到地衣多糖酶的所述锥虫蛋白组分是N末端融合蛋白、C末端融合蛋白或表面环状插入融合蛋白中的任一者。

132、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含至少两个选自由α微管蛋白的一部分和β微管蛋白的一部分组成的群组的结构域。

133、根据权利要求116所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的多个部分。

134、根据权利要求116所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含β微管蛋白的多个部分。

135、根据权利要求116所述的方法，其中所述锥虫蛋白组分包含MAP15的多个部分。

136、根据权利要求132所述的分离的酸构建体，其中所述锥虫蛋白组分包含α微管蛋白的至少一部分和β微管蛋白的至少一部分。

137、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其进一步包含载体核酸序列。

138、根据权利要求116所述的分离的核酸构建体，其进一步包含病毒启动子核酸序列。

139、根据权利要求116所述的方法，其中所述载体是二元载体。

140、根据权利要求116所述的方法，其进一步包含编码病毒蛋白的核酸序列。

141、一种宿主细胞，其包含根据权利要求116所述的核酸构建体。

142、根据权利要求141所述的宿主细胞，其是植物细胞。

143、根据权利要求142所述的植物，其是选自烟草属的属种。

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