CN113061587A - 一种抗原谱拓展o型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用，属于兽药生物制品技术领域。rHN/NXVP1/G‑H是以重组病毒rHN/NXVP1为骨架，嵌合了O/HB/HK/99的G‑H环抗原表位基因；所述重组病毒在O/HN/CHA/93基础上嵌合了O/NXYCh/CHA/2018的VP1基因所得。O/HN/CHA/93和rHN/NXVP1与Cathay谱系病毒抗原不匹配，而rHN/NXVP1/G‑H能与PanAsia、Mya98和Ind‑2001谱系病毒抗原高度匹配，也能与Cathay谱系病毒抗原匹配，G‑H环的替换拓展了口蹄疫病毒的抗原谱，制备灭活疫苗可用于防控O型多谱系FMDV的流行。

Description

一种抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于兽药生物制品技术领域，具体涉及一种抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus，FMDV)引起猪、牛、羊等主要家畜和野生偶蹄动物感染的一种烈性传染病。该病传播迅速、发病率高，危害巨大，因此国际兽疫局(OIE)将其列为必报疫病之首，我国规定为一类动物传染病。FMDV存在A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT37个血清型，型间无交叉保护，型内交叉保护有差异。近年来，O型FMD依然严重危害我国畜牧养殖业的发展。目前引发我国O型FMD的病毒主要为三个拓扑型(ME-SA、SEA和Cathay拓扑型)中的四个谱系(Mya-98谱系(SEA)、Cathay谱系、PanAsia谱系(ME-SA)和Ind-2001谱系(ME-SA))病毒株。当前FMD多毒株的混合流行加剧了病毒的变异，导致新变异毒株不断出现，使现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降或抗原不匹配，而导致疫苗的免疫失败，迫切需要筛选与当前所有O型流行毒株抗原匹配的疫苗候选株，用于我国当前FMD的防控。
FMDV粒子结构蛋白VP1、VP2和VP3上含5个由线性或构象性的抗原表位组成的抗原位点，它们是诱导机体产生保护性抗体的主要免疫原。其中抗原位点1的G-H环是诱导机体产生中和抗体最重要的抗原表位，在疫苗免疫保护方面发挥着非常重要的作用。因此，结构蛋白VP1上的G-H环一直是FMD表位疫苗、合成肽疫苗等研究的热门靶点。另外，FMDV在免疫压力下基因高度易变，尤其是结构蛋白VP1上的G-H环，经常表现遗传多样性，其上一个或几个氨基酸的突变常引起病毒抗原的变异，从而直接影响型内不同谱系病毒株之间交叉免疫保护。
大量的研究表明，不同血清型、亚型的RNA病毒之间无交叉反应性，但通过反向遗传技术，替换它们免疫优势的表位，可以提高病毒间的交叉反应性和疫苗的交叉保护能力，能够拓展疫苗的抗原谱。如Rieder E等在A12FMDV感染性克隆的骨架上，构架了嵌合了O型或C型G-H环的重组FMDV，该病毒疫苗的豚鼠抗血清，能同时中和A型和O型或A型和C型FMDV，而嵌合C型G-H环A12 FMDV疫苗免疫猪也能产生抗C型FMDV的交叉中和抗体，能完全保护猪免遭A型FMDV的攻击，部分保护猪免遭C型FMDV的攻击。Jitendra KB等研究也发现，嵌合Asia1型FMDV G-H环保守表位143GDLAVLAQR151的重组病毒也能够被O型和Asia1型FMDV的多克隆抗体识别。这2个研究表明，不同血清型FMDV间嵌合高度易变的G-H环抗原表位，提高了病毒的交叉反应性和疫苗的交叉保护能力，拓展了FMD疫苗的抗原谱。尽管已有不同血清型间G-H环替换提高FMDV交叉反应性的报道，但到目前为止，O型血清型内G-H环替换对FMDV交叉反应性的影响尚不清楚。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用，所述口蹄疫病毒株能够同时对近些年流行的O型PanAsia谱系、Mya98谱系、Ind-2001谱系和Cathay谱系口蹄疫病毒株具有较好的交叉反应性，大大拓展了病毒疫苗的抗原谱，有利于提高我国当前O型口蹄疫的有效防控。
本发明提供了一种抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H，以重组口蹄疫病毒rHN/NXVP1为骨架，嵌合了口蹄疫疫苗株O/HB/HK/99的G-H环抗原表位基因；所述rHN/NXVP1重组病毒是在O/HN/CHA/93毒株的基础上，嵌合了O/NXYCh/CHA/2018的VP1基因得到。
优选的，所述VP1/G-H环融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述VP1/G-H环融合基因编码的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供了所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株的构建方法，包括以下步骤：
1)以半长质粒pSK-Z123为骨架，人工合成含O/NXYCh/CHA/2018VP1基因并嵌合疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的重组质粒，记为重组质粒pSK-Z123NXVP1G-H；
2)将步骤1)中所述重组质粒pSK-Z123NXVP1G-H用Spe I/Bgl II双酶切，将得到的5400bp的目标条带插入质粒pOFS中，得到重组质粒pOFS-NXVP1/G-H；
3)将步骤2)中所述重组质粒pOFS-NXVP1/G-H转染细胞，拯救病毒，得到rHN/NXVP1/G-H。
优选的，步骤2)中嵌合有疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的O/NXYCh/CHA/2018VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，步骤2)中Spe I/Bgl II双酶切的体系如下：
10×Buffer H 10μL、BglⅡ4μL、SpeⅠ4μL、质粒4μg、ddH2O补充至100μL；酶切体系为在37℃条件下孵育1h～2h。
优选的，步骤3)中在所述转染细胞前，对所述重组质粒pOFS-NXVP1/G-H进行鉴定；
所述鉴定的方法采用PstI酶对所述重组质粒pOFS-NXVP1/G-H进行酶切，切出7200bp、3282bp、591bp三个条带，说明重组质粒pOFS-NXVP1/G-H包含了嵌合有疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的O/NXYCh/CHA/2018VP1基因。
本发明提供了所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H或所述构建方法构建得到的O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H在制备抗原谱广O型口蹄疫疫苗中的应用。
优选的，所述抗原谱广O型口蹄疫疫苗的防控对象为PanAsia谱系、Mya98谱系、Ind-2001谱系和/或Cathay谱系病毒株。
本发明提供了一种抗原谱广O型口蹄疫疫苗，包括所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H或所述构建方法构建得到的O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H。
本发明提供了一种抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H，以重组口蹄疫病毒rHN/NXVP1为骨架，嵌合了口蹄疫疫苗株O/HB/HK/99的G-H环抗原表位基因；所述rHN/NXVP1重组病毒是在O/HN/CHA/93毒株的基础上，嵌合了流行毒株O/NXYCh/CHA/2018的VP1基因得到。本发明利用反向遗传操作技术，以疫苗毒株O/HN/CHA/93感染性克隆为骨架，构建了嵌合O/NXYCh/CHA/2018VP1同时又嵌合疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的重组FMDVrHN/NXVP1/G-H。实验表明，本发明构建的rHN/NXVP1/G-H病毒株与亲本病毒病复制特性相似，VP1基因的重构没有明显影响重组FMDV的生长特性；但亲本病毒rHN和基因工程病毒rHN/NXVP1与近几年流行的Cathay谱系病毒株O/GXCX/CHA/2018的抗原不匹配(r1值分别为0.29和0.23)，不适合用于我国当前口蹄疫的有效防控。而本发明提供的rHN/NXVP1/G-H与我国当前流行的O型所有谱系毒株抗原均匹配(r1值均＞0.30)，说明相比亲本病毒rHN和基因工程病毒rHN/NXVP1，本发明提供的rHN/NXVP1/G-H提高了与O/Cathay谱系病毒的交叉反应性，拓展了疫苗毒株的抗原谱，适合作为疫苗候选毒株，可用于防控我国当前多谱系O型口蹄疫病毒的流行。本发明提供的rHN/NXVP1/G-H为进一步设计高效、广谱的FMDV疫苗候选毒株提供了新的思路。
附图说明
图1为FMDV全长重组质粒的基因示意图；其中灰色代表O/NXYCh/CHA/2018病毒的VP1基因，黑色代表O/HB/CHA/99病毒株的G-H环基因(约90个核苷酸))；
图2为重组质粒的酶切产物电泳图；其中M表示DNAmarker，1表示pOFS/NXVP1质粒PstI酶切，2表示pOFS/NXVP1/G-H质粒Pst I酶切；
图3为重组质粒转染BSR/T7细胞48h后的细胞形态；其中图3A：正常BSR/T7细胞，图3B：rHN/NXVP1质粒转染60h后的BSR/T7细胞，图C:rHN/NXVP1/G-H质粒转染60h后的BSR/T7细胞；
图4为rHN、rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H重组病毒株的间接免疫荧光结果；
图5为rHN、rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H重组病毒株的电镜观察结果，其中左图：rHN，中图：rHN/NXVP1右图：rHN/NXVP1/G-H；
图6为rHN、rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H重组病毒株的噬斑表型；
图7为rHN、rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H重组病毒株的一步生长曲线；
图8为rHN、rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H重组病毒株与不同谱系流行毒株的抗原匹配性(r1)。
具体实施方式
本发明提供了一种抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H，以重组口蹄疫病毒rHN/NXVP1为骨架，嵌合了口蹄疫疫苗株O/HB/HK/99G-H环抗原表位基因；所述rHN/NXVP1重组病毒是在O/HN/CHA/93毒株的基础上，嵌合了O/NXYCh/CHA/2018的VP1基因所得。
在本发明中，rHN/NXVP1/G-H病毒株为重组病毒株，将原有O/HN/CHA/93病毒的VP1基因替换为O/NXYCh/CHA/2018毒株的VP1基因，其中所述VP1基因的G-H环序列替换为O/HB/HK/99疫苗毒株的G-H环序列。所述VP1/G-H环融合基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1(accacgtcgacaggcgaatcggctgaccccgtgactgccaccgttgagaactacggtggtgagacacaggttcaaagacgccaccacacggacgtctcattcatactggacagatttgtgaaagtcacaccgcaaaactcaatgaatgtgttggacctgatgcagaccccctcccactccctggtgggggccctcctccgcactgccacctactattttgctgatttagaggtggcggtgaaacacgagggggaccttacctgggtgccaaatggagcacctgaagcagctctgggtaacaccaccaacccaacggcgtaccataaagcgccgcttacccggcttgcgttgccttacacggcaccacaccgtgtcatggccaccgtttacaacgggaactgcaagtatggcgagagccccgtgaccaatgcgagaggtgacctgcaagtattggcccagaaagcggcaagagcgctgcctacttctttcaactacggtgccattaaagccacccgggtgacagaactgctgtaccgcatgaagagggccgagacgtactgtccccggcccctcttagctgtccacccgagtgaggctagacacaaacagaaaatagtggcacctgtaaagcagtccttg)所示。所述VP1/G-H环融合基因编码的融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:2(TTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRHHTDVSFILDRFVKVTPQNSMNVLDLMQTPSHSLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGDLTWVPNGAPEAALGNTTNPTAYHKAPLTRLALPYTAPHRVMATVYNGNCKYGESPVTNARGDLQVLAQKAARALPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLLAVHPSEARHKQKIVAPVKQSL)所示。疫苗毒株G-H环序列的替换有利于使rHN/NXVP1/G-H病毒株对PanAsia谱系、Mya98谱系、Ind-2001谱系具有好的交叉反应性的同时还能与Cathay谱系毒株发生较好的交叉反应性，拓展了rHN/NXVP1/G-H病毒株的抗原谱，有利于O型FMD的防控。
本发明提供了所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株的构建方法，包括以下步骤：
1)以半长质粒pSK-Z123为骨架，人工合成含O/NXYCh/CHA/2018的VP1基因并嵌合疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的重组质粒，记为重组质粒pSK-Z123NXVP1G-H；
2)将步骤1)中所述重组质粒pSK-Z123NXVP1G-H用Spe I/Bgl II双酶切，将得到的5400bp的目标条带插入质粒pOFS中，得到重组质粒pOFS-NXVP1/G-H；
3)将步骤2)中所述重组质粒pOFS-NXVP1/G-H转染细胞，拯救病毒，得到rHN/NXVP1/G-H。
本发明以半长质粒pSK-Z123为骨架，人工合成含O/NXYCh/CHA/2018VP1基因并嵌合疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的重组质粒，记为重组质粒pSK-Z123NXVP1G-H。
在本发明中，所述半长质粒pSK-Z123包含FMDV O/HN/CHA/93疫苗株的所有结构蛋白基因。所述半长质粒pSK-Z123在现有技术(Pinghua li等，2012)公开。人工合成重组质粒的方法优选将嵌合有疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的O/NXYCh/CHA/2018VP1基因替换FMDV O/HN/CHA/93疫苗株中原始VP1基因。嵌合有疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的O/NXYCh/CHA/2018VP1基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。在本发明实施例中，所述人工合成重组质粒委托南京金唯智生物科技有限公司合成。
得到重组质粒pSK-Z123NXVP1G-H，本发明将所述重组质粒pSK-Z123NXVP1G-H用Spe I/Bgl II双酶切，将得到的5400bp的目标条带插入质粒pOFS中，得到重组质粒pOFS-NXVP1/G-H。
在本发明中，Spe I/Bgl II双酶切的体系优选如下：
10×Buffer H 10μL、BglⅡ4μL、SpeⅠ4μL、质粒4μg、ddH2O补充至100μL；酶切体系为在37℃条件下孵育1h～2h。
本发明对所述Spe I/BglII酶的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的Spe I/BglII酶的来源即可。在本发明实施例中，所述Spe I/BglII分别购自宝生物生物科技有限公司。
双酶切后，本发明优选将所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶，回收5400bp的目标条带。本发明对所述琼脂糖凝胶电泳，切胶的方没有特殊限制，采用本领域所熟知的电泳、切胶方法即可。
在本发明中，所述质粒pOFS在插入外源基因前，优选采用Spe I/Bgl II进行双酶切。所述双酶切的条件同上，在此不做赘述。
得到重组质粒pOFS-NXVP1/G-H后，本发明将所述重组质粒pOFS-NXVP1/G-H转染细胞，拯救病毒，得到rHN/NXVP1/G-H。
在本发明中，在所述转染细胞前，优选对所述重组质粒pOFS-NXVP1/G-H进行鉴定。所述鉴定的方法采用Pst I酶对所述重组质粒pOFS-NXVP1/G-H进行初步酶切，酶切切出7200bp、3282bp、591bp三个条带，与预期长度一致。将初步酶切鉴定正确的重组质粒pOFS-NXVP1/G-H进行序列测定，结果表明重组质粒pOFS-NXVP1/G-H包含了嵌合有疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的O/NXYCh/CHA/2018VP1基因。
在本发明中，所述重组质粒pOFS-NXVP1/G-H经鉴定后，还优选进行线性化处理。所述线性化用酶的种类优选为Not I酶。线性化处理后进行回收片段。所述回收的方法优选采用DNA片段回收试剂盒进行。本发明对所述转染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转染方法即可，例如脂质体LipofectamineTM2000介导转染。转染后的细胞进行培养至细胞出现病变情况，收集细胞，冻融后收集病毒株。
在本发明中，将构建的病毒株优选采用RT-PCR手段扩增VP1基因，扩增产物测序，测序结果与预期相同，表明本发明构建的病毒株为成功嵌合有VP1/G-H环融合基因的重组病毒株。扩增VP1基因的引物优选为OZ3136(+)和OZ3980(-)；所述OZ3136(+)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3(AGATAACACACGGGAAAGCC)所示，所述OZ3980(-)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4(TGCATCTGGTTGATGGTGTC)所示。扩增VP1基因的反应条件为：94℃变性2min；98℃20s，68℃3mins，30个循环；72℃延伸8min。扩增VP1基因的反应体系如下：10×反应Buffer H 10μL、2.5mmoldNTPs8μL、OZ3136(+)引物1μL、OZ3980(-)1μL、LAtaq酶1μL、cDNA 6μL、ddH2O补充至100μL。
本发明提供了所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H或所述构建方法构建得到的O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H在制备抗原广谱O型口蹄疫疫苗中的应用。
在本发明中，所述抗原广谱O型口蹄疫疫苗的防控对象优选为O型FMDVPanAsia谱系、Mya98谱系、Ind-2001谱系和/或Cathay谱系病毒株。本发明实施例中，O/HB/HK/99作为PanAsia谱系的病毒株代表，以O/NXYCh/CHA/2018作为Mya98谱系的病毒株代表，以O/XJ/CHA/2017作为Ind-2001谱系的病毒株代表，以FMDV O/GXCX/CHA/2018株作为Cathay谱系的病毒株代表，分别测定rHN/NXVP1/G-H作为疫苗候选毒株与各流行毒株的抗原匹配性，评价该疫苗候选毒株适不适合制备广谱O型口蹄疫疫苗；结果表明病毒rHN/NXVP1/G-H不仅与O/HB/HK/99、O/NXYCh/CHA/2018、O/XJ/CHA/2017病毒株具有良好的抗原匹配性(r1值均＞0.6)，而且与FMDVO/GXCX/CHA/2018株的抗原也匹配(r1值＝0.36)。表明：构建的基因工程FMDVrHN/NXVP1/G-H拓展了抗原谱，可以用于制造FMDV疫苗，用于我国口蹄疫的有效防控。
本发明提供了一种抗原广谱O型口蹄疫疫苗，包括所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H或所述构建方法构建得到的O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H。
在本发明中，所述疫苗优选为灭活疫苗。所述疫苗优选还包括佐剂。所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H和佐剂的体积比为46:54。所述rHN/NXVP1/G-H的抗原浓度优选为16μg/mL。本发明对所述抗原广谱O型口蹄疫疫苗的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的疫苗制备方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
材料来源说明
O型FMDV株O/HN/CHA/93(Cathay谱系)、O/GXCX/CHA/2018(Cathay谱系)、O/HB/HK/99(PanAsia谱系)、O/XJ/CHA/2017(Ind-2001谱系)、O/NXYCh/CHA/2018(Mya-98)为公开菌株，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得。O/HN/CHA/93毒株在文章Evaluation ofagenetically modified foot-and-mouth disease virus vaccine candidate generatedby reverse genetics(Li et al.BMC Veterinary Research 2012,8:57)中公开过，O/HB/HK/99在口蹄疫编著(刘湘涛等主编)P29页公开过，O/XJ/CHA/2017(MF461724.1)、O/NXYCh/CHA/2018(MH791315.1)和O/GXCX/CHA/2018(MH791316.1)在Genebank中公开过。rHN是FMDV疫苗毒株O/HN/CHA/93的全长感染性克隆pOFS拯救获得的基因工程病毒(病毒和质粒见Pinghua li等，2012发表的文章中公开过)为本发明的亲本病毒。
实施例1
FMDV重组全长克隆的构建方法
以FMDV O/HN/CHA/93疫苗株半长质粒pSK-Z123(该质粒在文章Evaluation of agenetically modified foot-and-mouth disease virus vaccine candidate generatedby reverse genetics中公开过，Li et al.BMC Veterinary Research 2012,8:57)为骨架，分别设计合成含当前流行毒株O/NXYCh/CHA/2018VP1基因的质粒pSK-Z123NXVP1，以及含O/NXYCh/CHA/2018VP1基因并嵌合疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因(约90个核苷酸)的质粒pSK-Z123NXVP1G-H。上述2个质粒分别用Spe I和Bgl II酶消化，分别回收约5400bp的目的带，并将其插入用同样酶消化的质粒pOFS(该质粒在文章Evaluation of a geneticallymodified foot-and-mouth disease virus vaccine candidate generated by reversegenetics中公开过，Li et al.BMC Veterinary Research 2012,8:57)中，得到阳性质粒pOFS-NXVP1和pOFS-NXVP1/G-H。FMDV全长重组质粒的全基因组结构示意图见图1。
将重组质粒pOFS-NXVP1和pOFS-NXVP1/G-H用PstI酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒送金唯智生物技术有限公司进行序列测定。
结果表明，两个重组质粒用Pst I酶切出与预期大小相符的基因片段(见图2)，测序结果也表明2个重组质粒含预期的基因替换。其中pOFS、pOFS-NXVP1和pOFS-NXVP1/G-H质粒的VP1核苷酸序列分别见SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:1，其对应的氨基酸序列见SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:2。
实施例2
重组病毒的拯救
Not I酶线化质粒pOFS/NXVP1和pOFS/NXVP1/G-H，然后用DNA片段回收试剂盒纯化回收作为转染模板。常规培养的单层BSR/T7细胞生长至70％～80％时用脂质体LipofectamineTM2000介导转染(具体操作方法见按照操作说明书)。转染后6h加入2mL含8％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen公司)，置37℃5％CO2培养箱继续培养，并观察细胞出现致细胞病变的情况。转染72h后收获细胞，反复冻融2～3次后，在BHK-21上连续传代，-70传以下保存各代病毒备用。
转染结果表明：两个质粒在转染BSR/T7细胞60h后，均出现典型的致细胞病变(cytopathogenic effct,CPE)，即纤维状分布的细胞变大、变圆，成葡萄状分布(见图3)。拯救的基因工程病毒分别命名为rHN/HBVP1和rHN/HBVP1/G-H。
实施例3
重组病毒的鉴定
3.1、RT-PCR
取实施例2制备的转染的上清液，分别用RNAasy Mini Kit提取细胞毒总RNA，用引物OZ3136(+)和OZ3980(-)引物对(OZ3136(+):AGATAACACACGGGAAAGCC,SEQ ID NO:3，OZ3980(-):TGCATCTGGTTGATGGTGTC，SEQ ID NO:4)进行RT-PCR扩增，得到VP1基因片段，经试剂盒纯化回收后送上海桑尼有限公司测序，验证重组病毒的正确性。
表1 RT-PCR反应体系
Figure BDA0003048750770000111
反应体系置42℃恒温水浴锅温浴90min，反应结束进行RT-PCR扩增反应。扩增程序如下：94℃变性2min；98℃20s，68℃3mins，30个循环；72℃延伸8min。
测序结果表明：rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H重组病毒均含有预期的替换，说明本发明成功构建了含预期基因替换的重组FMDV。
表2重组质粒详情
质粒名称 VP1核酸序列 VP1氨基酸序列 重组病毒
pOFS SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 rHN
pOFS/NXVP1 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 rHN/NXVP1
pOFS/NXVP1/G-H SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 rHN/NXVP1/G-H
3.2、间接免疫荧光
BHK-21单层细胞生长至70％～80％满时，分别接种亲本病毒rHN和rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H重组病毒。接种病毒的细胞用间接免疫荧光检测特定蛋白的表达。具体步骤为：
(1)接种病毒的细胞在37℃孵育6h后弃培养液，PBS(0.01mol/L pH值7.2)漂洗3次，后加入4％冰冷的多聚甲醛，室温固定30min；
(2)PBS漂洗3次，加入5％BSA室温封闭30min；
(3)PBS漂洗3次后分别加入1:500稀释的抗FMDV非结构蛋白3A的单抗3A24，37℃孵育1h；
(4)PBS漂洗5次，加入1:100稀释的FITC标记的IgG二抗，37℃孵育1h；
(5)PBS漂洗5次，加入0.5μg/ml DAPI(PBS配制)染色10min，PBS洗5次，去除多余的DAPI，置共聚焦荧光显微镜下拍照，同时设正常细胞对照。
结果表明：接种rHN、rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H的BHK-21细胞与3A单抗作用均能看到可见的绿色荧光，而对照细胞与3A单抗作用均看不到任何可见荧光(见图4)，表明本发明成功构建了重组FMDV，VP1蛋白的替换与重构没有影响感染性FMDV的拯救。
3.3、电镜观察
BHK-21细胞中分别增殖FMDV rHN和rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H各200mL，冻融2～3次后，加BEI灭活，12000rpm/min离心1h，收集病毒上清，4℃条件下35000rpm/min离心3h。离心的沉淀用PBS(pH＝7.6)缓冲液重悬，负染后电镜观察。
结果：亲本病毒rHN和重组病毒rHN/NXVP1，rHN/NXVP1/G-H一样，直径约为25nm、球形的FMDV粒子(图5)。
实施例4
重组病毒的蚀斑表型和一步生长曲线
将亲本病毒rHN和重组病毒rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H分别做10系列稀释，然后将不同稀释度病毒分别接种长满的单层BHK-21细胞(200ul/孔，6孔板)，置于37℃培养箱，每10min摇动一次，1h后加入2mL黄芪胶混合液(一份2×MEM，一份1.2％黄芪胶，1％血清)静止培养，48h后吸弃培养液，用PBS洗涤1～2次后，加入固定液(50％丙酮+50％甲醇)，室温固定30min，结晶紫染色1h，清水冲洗，观察病毒的蚀斑表型，并计算每个病毒的蚀斑形成单位(PFU/mL)。
将第6代重组病毒和亲本病毒以2×106病毒感染量接种长满的单层BHK-21细胞(25mL培养瓶)，吸附1h后弃接种的病毒液，用MEM洗2次后，加5ml MEM培养基，置于37℃、CO2培养箱继续培养。接种后4h、8h、12h、16h和20h收取样品，反复冻融3次，在BHK-21单层细胞上(96孔板)按照常规方法测定病毒的滴度(TCID50)(实验进行2次重复)，绘制病毒的一步生长曲线。
结果表明：重组病毒rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H与亲本病毒rHN蚀斑表型(见图6)和一步生长曲线相似(见图7)。表明FMDV基因的重配没有明显影响重组FMDV的复制能力。
实施例5
FMDV灭活疫苗的制备方法
5.1、FMDV的增殖，灭活和纯化
100％长满的单层贴壁BHK-21细胞(分与75mL细胞瓶)，分别接种亲本病毒rHN、重组病毒rHN/NXVP1和rHN/NXVP1/G-H(18ml接毒液+2ml病毒液)，37℃温箱继续培养，待95％以上细胞出现典型的致细胞病变效应时，分别收获病毒，每个病毒收获约400mL。收集的病毒液中加入Triton X-100(10mL/L)，室温摇震10min，4℃6000rpm/min离心30min，去除细胞碎片。收集的病毒上清用5mmol BEI 28℃灭活28h。灭活后的病毒抗原用乳鼠进行灭活安全检验。检验合格后，蔗糖梯度离心法纯化病毒，用液相色谱仪检测病毒抗原的146S含量。用pH为7.6的PBS溶液稀释抗原浓度为16μg/mL。
5.2、疫苗配制
将佐剂ISA201置于37℃恒温水浴锅预热，按抗原:佐剂体积比＝46:54的比例将适量的佐剂缓慢加入病毒抗原中，缓慢摇振，直至抗原和佐剂不分层，将配好的疫苗制品(146S抗原浓度为6μg/mL)置于4～8/保存备用。
实施例6
动物实验
选取90日龄健康易感的猪18头(O型口蹄疫液相阻断ELISA抗体效价＜1:6，3ABC抗体阴性)，分为A、B、C 3组，每组6头。A组免疫接种亲本病毒疫苗，B组免疫接种rHN/NXVP1病毒疫苗，C组免疫接种rHN/NXVP1/G-H病毒疫苗。每头猪肌肉注射接种，每头免疫接种2mL剂量。免疫28天后采血，收集血清，用微量中和实验检测每个病毒的抗血清中和不同谱系FMDV株(O/GXCX/CHA/2018、O/HB/HK/99、O/XJ/CHA/2017、O/NXYCh/CHA/2018)的交叉中和抗体效价，评价疫苗毒株与流行毒株的抗原匹配性。抗原匹配性关系常用r1值判定，r1＝中和异源病毒的抗体效价/中和同源病毒的抗体效价，r1值愈接近1，毒株间抗原关系愈靠近；反之，抗原关系疏远，毒株差异较大。其中当r1值≥0.3时，说明制备参考血清的抗原和另一抗原相似，该疫苗可有效抵御另一毒株的攻击，适用于制造疫苗；当r值＜0.3时，则说明制备参考血清的抗原和另一抗原差异显著，该疫苗不能有效抵御另一毒株的攻击，不适用于制造疫苗。结果显示：FMDV疫苗毒rHN和重组病毒rHN/NXVP1与O/HB/HK/99(PanAsia谱系)、O/NXYCh/CHA/2018(Mya98谱系)、O/XJ/CHA/2017(Ind-2001谱系)有良好的抗原匹配性(r1值均＞0.6)(见图8)，但与近年流行的FMDV O/GXCX/CHA/2018株(Cathay谱系)抗原不匹配(r1值＜0.3)(见图8)。而基因工程病毒rHN/NXVP1/G-H不仅与O/HB/HK/99、O/NXYCh/CHA/2018、O/XJ/CHA/2017病毒株具有良好的抗原匹配性(r1值均＞0.6)(见图8)，而且与近几年流行的FMDVO/GXCX/CHA/2018株的抗原也匹配(r1值＝0.36)(见图8)。这表明本发明构建的基因工程FMDV rHN/NXVP1/G-H拓展了抗原谱，可以用于制造FMDV疫苗，用于O型口蹄疫的生物防控。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accacgtcga caggcgaatc ggctgacccc gtgactgcca ccgttgagaa ctacggtggt 60
gagacacagg ttcaaagacg ccaccacacg gacgtctcat tcatactgga cagatttgtg 120
aaagtcacac cgcaaaactc aatgaatgtg ttggacctga tgcagacccc ctcccactcc 180
ctggtggggg ccctcctccg cactgccacc tactattttg ctgatttaga ggtggcggtg 240
aaacacgagg gggaccttac ctgggtgcca aatggagcac ctgaagcagc tctgggtaac 300
accaccaacc caacggcgta ccataaagcg ccgcttaccc ggcttgcgtt gccttacacg 360
gcaccacacc gtgtcatggc caccgtttac aacgggaact gcaagtatgg cgagagcccc 420
gtgaccaatg cgagaggtga cctgcaagta ttggcccaga aagcggcaag agcgctgcct 480
acttctttca actacggtgc cattaaagcc acccgggtga cagaactgct gtaccgcatg 540
aagagggccg agacgtactg tccccggccc ctcttagctg tccacccgag tgaggctaga 600
cacaaacaga aaatagtggc acctgtaaag cagtccttg 639
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val
20 25 30
Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Gln Asn Ser Met
35 40 45
Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ser His Ser Leu Val Gly Ala
50 55 60
Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val
65 70 75 80
Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala
85 90 95
Ala Leu Gly Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu
100 105 110
Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Met Ala Thr
115 120 125
Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Ala
130 135 140
Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Ala Leu Pro
145 150 155 160
Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu
165 170 175
Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu
180 185 190
Ala Val His Pro Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro
195 200 205
Val Lys Gln Ser Leu
210
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agataacaca cgggaaagcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcatctggt tgatggtgtc 20
<210> 5
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accacctctg cgggcgagtc cgcggacccc gttaccgcca ccgttgagaa ttacggtggt 60
gagacacagg tccagagacg ccagcacacg gatatctcgt ttatactaga cagatttgtg 120
aaagtcacac caaaagacca aatcaatgtg ctggacctga tgcagatccc tgcccacact 180
ttagtagggg ccctcctgcg gacggccacc tactacttct ccgacttgga gttggctgtc 240
aaacacaagg gtgatctcac ctgggttccg aacggggccc ctgagacagc tttggacaac 300
accaccaacc caacagctta ccacaaagca ccactcacgc gactggcctt gccttacacg 360
gccccacacc gcgtcttagc gaccgtctac aacggaagtt gtaagtacag tggcgcccgc 420
gtgagcaacg tgaggggtga ccttcaagtg ttggctcaga aggcagaaag agctctgccc 480
acctccttta actatggtgc cattaaggca acccgggtga ctgagttact ctaccgaatg 540
aagagagccg agacatactg ccccaggccc cttcttgcca ttcaaccgag tgacgctaga 600
cacaagcaga agatcgtggc acccgcaaaa cagcttctg 639
<210> 6
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Thr Ser Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ile
20 25 30
Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile
35 40 45
Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala
50 55 60
Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Leu Ala Val
65 70 75 80
Lys His Lys Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr
85 90 95
Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu
100 105 110
Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr
115 120 125
Val Tyr Asn Gly Ser Cys Lys Tyr Ser Gly Ala Arg Val Ser Asn Val
130 135 140
Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro
145 150 155 160
Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu
165 170 175
Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu
180 185 190
Ala Ile Gln Pro Ser Asp Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro
195 200 205
Ala Lys Gln Leu Leu
210
<210> 7
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accacgtcga caggcgaatc ggctgacccc gtgactgcca ccgttgagaa ctacggtggt 60
gagacacagg ttcaaagacg ccaccacacg gacgtctcat tcatactgga cagatttgtg 120
aaagtcacac cgcaaaactc aatgaatgtg ttggacctga tgcagacccc ctcccactcc 180
ctggtggggg ccctcctccg cactgccacc tactattttg ctgatttaga ggtggcggtg 240
aaacacgagg gggaccttac ctgggtgcca aatggagcac ctgaagcagc tctgggtaac 300
accaccaacc caacggcgta ccataaagcg ccgcttaccc ggcttgcgtt gccttacacg 360
gcaccacacc gtgtcatggc caccgtttac aacgggaact gcaaatacgc cgaaggctca 420
ctgaccaacg tgagaggtga tctccaggtg ctggctcaga aggcggcgcg accgctgccc 480
acttctttca actacggtgc cattaaagcc acccgggtga cagaactgct gtaccgcatg 540
aagagggccg agacgtactg tccccggccc ctcttagctg tccacccgag tgaggctaga 600
cacaaacaga aaatagtggc acctgtaaag cagtccttg 639
<210> 8
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val
20 25 30
Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Gln Asn Ser Met
35 40 45
Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ser His Ser Leu Val Gly Ala
50 55 60
Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val
65 70 75 80
Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala
85 90 95
Ala Leu Gly Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu
100 105 110
Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Met Ala Thr
115 120 125
Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Glu Gly Ser Leu Thr Asn Val
130 135 140
Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro
145 150 155 160
Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu
165 170 175
Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu
180 185 190
Ala Val His Pro Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro
195 200 205
Val Lys Gln Ser Leu
210

Claims (10)

1.一种抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H，其特征在于，以重组口蹄疫病毒rHN/NXVP1为骨架，嵌合了口蹄疫疫苗株O/HB/HK/99的G-H环抗原表位基因；所述rHN/NXVP1重组病毒是在O/HN/CHA/93毒株的基础上，嵌合了O/NXYCh/CHA/2018的VP1基因所得。
2.根据权利要求1所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株，其特征在于，所述VP1/G-H环融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株，其特征在于，所述VP1/G-H环融合基因编码的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.权利要求1～3任意一项所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以半长质粒pSK-Z123为骨架，人工合成含O/NXYCh/CHA/2018的VP1基因并嵌合疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的重组质粒，记为重组质粒pSK-Z123NXVP1G-H；
2)将步骤1)中所述重组质粒pSK-Z123NXVP1G-H用Spe I/Bgl II双酶切，将得到的5400bp的目标条带插入质粒pOFS中，得到重组质粒pOFS-NXVP1/G-H；
3)将步骤2)中所述重组质粒pOFS-NXVP1/G-H转染细胞，拯救病毒，得到rHN/NXVP1/G-H。
5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤2)中嵌合有疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的O/NXYCh/CHA/2018的VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤2)中Spe I/Bgl II双酶切的体系如下：
10×Buffer H 10μL、BglⅡ4μL、SpeⅠ4μL、质粒4μg、ddH2O补充至100μL；酶切体系为在37℃条件下孵育1h～2h。
7.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤3)中在所述转染细胞前，对所述重组质粒pOFS-NXVP1/G-H进行鉴定；
所述鉴定的方法采用PstI酶对所述重组质粒pOFS-NXVP1/G-H进行酶切，酶切出7200bp、3282bp、591bp三个条带，说明重组质粒pOFS-NXVP1/G-H包含了嵌合有疫苗毒株O/HB/HK/99G-H环基因的O/NXYCh/CHA/2018VP1基因。
8.权利要求1～3任意一项所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H或权利要求4～7任意一项所述构建方法构建得到的O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H在制备抗原广谱O型口蹄疫疫苗中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述抗原广谱O型口蹄疫疫苗的防控对象为PanAsia谱系、Mya98谱系、Ind-2001谱系和/或Cathay谱系病毒株。
10.一种抗原广谱O型口蹄疫疫苗，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述抗原谱拓展O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H或权利要求4～7任意一项所述构建方法构建得到的O型口蹄疫病毒株rHN/NXVP1/G-H。
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