CN111996203B

CN111996203B - 重组o型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗及其制备方法和应用

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Publication number: CN111996203B
Application number: CN202010212917.3A
Authority: CN
Inventors: 郑海学; 杨帆; 曹伟军; 朱紫祥; 宁建刚; 马坤; 郝荣增; 张伟; 郑敏; 魏婷; 蒋保余; �田宏; 张克山; 党文; 马旭升; 李丹; 茹毅; 何继军; 郭建宏; 刘湘涛
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2040-03-24
Also published as: CN111996203A

Abstract

本发明提供一种重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗及其制备方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明获得SVV/FJ/001株全长cDNA，并对其5'UTR进行缺失及突变改造，同时在SVA cDNA中融合进串联的O型FMDV的重组表位基因，构建得到重组口蹄疫抗原表位的塞内卡重组病毒，该重组病毒能够表达融合进的口蹄疫B细胞表位和T细胞表位，且表达产物具有良好的反应原性，重组病毒的致病性显著降低甚至对猪无致病性，显著提高了毒株的生物安全性；制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性，在有效激发SVA中和抗体的同时还能产生针对FMDV的特异性抗体，可用于塞内卡病毒及一种或多种非塞内卡病毒的防控。

Description

重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)，也称塞内卡病毒(Senecavirus)、塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)，也是该属的唯一成员。该病毒感染猪能够引起猪的原发性水泡病，与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等引起的临床症状难以区分。SVA感染后能引起断奶仔猪、保育、育肥和繁殖的各年龄段的猪发生水泡性病变，同时伴随跛行、发热、厌食、嗜睡等临床症状，新生仔猪除了上述症状外，还可能存在持续的腹泻、脱水等症状，甚至会突然死亡。

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)属于微RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的单股正链RNA病毒，包括A、O、C、Asial、SAT1、SAT2、SAT3七个血清型，型间无交叉保护。病毒基因组全长约8.5kb，由5’端非编码区、ORF区和3’端非编码区组成。编码区编码一个多聚蛋白，经病毒自身蛋白酶和宿主细胞蛋白酶作用逐级降解，形成多种中间体和成熟的4种结构蛋白(VP4、VP2、VP3、VP1)和8种非结构蛋白(Lpro、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)。其中，VP1是结构蛋白基因编码所得的最重要的衣壳蛋白，是决定FMDV抗原性、诱导机体产生中和抗体和激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白，在其G-H环(141～160位氨基酸)和C末端(200～213位氨基酸)存在两个线性表位，已经被证明是是诱导口蹄疫免疫应答的关键抗原表位，其中G-H环上141～160位氨基酸序列合成肽可以在不同物种包括小鼠、兔子、豚鼠、猪、牛、羊等体内诱导产生中和抗体达到免疫保护效果，且也发现其侧翼序列对免疫效果具有一定的影响。200～213位氨基酸序列的合成肽也被证实可以诱发机体产生有效的免疫应答。

另有研究证明，H-2d小鼠对VP1上141～160位抗原位点免疫应答存在限制性，但是，加入外源的T细胞表位多肽后，H-2d小鼠就能克服对B淋巴细胞应答的限制性，诱导产生高水平的中和抗体(Nature,1987,330(6144):168-70)。说明T细胞表位被机体T淋巴细胞识别后，能辅助B细胞的活化和抗体的产生。FMDV的3A蛋白21-35位氨基酸的T细胞表位(JVirol.2001,75(7):3164-3174)已经被证实具有辅助诱导B细胞产生抗FMDV抗体的功能。但是目前未有将FMDV的相关基因应用到制备塞内卡重组病毒或重组疫苗中的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗及其制备方法和应用，本发明获得SVV/FJ/001株的全长cDNA，并对其5'UTR进行缺失及突变改造，同时在SVAcDNA中融合进串联的O型FMDV的B细胞表位与3A蛋白的T细胞表位基因，构建得到重组口蹄疫抗原表位的塞内卡重组病毒，该重组病毒能够表达融合进的O型口蹄疫B细胞表位和T细胞表位，且表达产物具有良好的反应原性，重组病毒的致病性显著降低甚至对猪无致病性，显著提高了毒株的生物安全性；制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性，不仅能有效激发SVA的中和抗体，而且能产生针对O型FMDV的特异性抗体，可用于塞内卡病毒及一种或多种非塞内卡病毒的防控。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种塞内卡病毒重组核酸，所述重组核酸的序列包括对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造，同时在塞内卡病毒的SphⅠ和NotⅠ酶切位点之间插入重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A；所述重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造后的5'UTR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述塞内卡病毒株包括SVV/FJ/001株。

本发明还提供了所述重组核酸在制备重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡病毒重组核酸或塞内卡重组疫苗株中的应用。

本发明还提供了一种包含所述的重组核酸的重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒。

本发明还提供了一种由所述的重组核酸编码的重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒。

本发明还提供了一种包含所述的塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株。

本发明还提供了所述的塞内卡重组疫苗株，所述塞内卡重组疫苗株不仅能够激发动物对塞内卡病毒的免疫活性，还能产生针对口蹄疫病毒的免疫活性。

本发明还提供了所述塞内卡重组病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，利用特异性引物对分别扩增得到SVV/FJ/001株的S1片段和S21片段；扩增所述S1片段的特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-1R，所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F；所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述下游引物SVA-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

扩增所述S21片段的的特异性引物对包括上游引物SVA-2F1和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-2F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(2)将所述S21片段与所述重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A融合，得S2-OB-3A；

(3)将所述S1片段和S2-OB-3A片段分别与pMD20 T载体连接，得到亚克隆质粒PMD-S1和PMD-S2-OB-3A；

(4)以所述亚克隆质粒PMD-S1为模板，用突变引物SVA-m5UTRF和SVA-m5UTRR进行扩增，得到亚克隆质粒PMD-mS1，所述SVA-m5UTRF的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述SVA-m5UTRR的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

(5)将质粒PMD-mS1用PacI和SphI双酶切、质粒PMD-S2-OB-3A用SphI和NotI双酶切后，回收基因片段，连接替换插入到经PacI和NotI双酶切后的真核转录质粒prO/CHA/99中，得重组质粒prSVV/FJ-M-OB-3A；

(6)利用所述重组质粒prSVV/FJ-M-OB-3A转染塞内卡病毒敏感细胞，获得塞内卡重组病毒。

优选的，步骤(2)所述融合包括将所述重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A的基因片段与S21基因片段用NheI酶切连接，进行PCR扩增；所述PCR扩增的引物包括上游引物SVA-2F和下游引物SVA-2R；所述上游引物SVA-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

优选的，步骤(6)所述塞内卡病毒敏感细胞包括BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。

本发明还提供了所述塞内卡重组病毒或利用所述构建方法构建得到的塞内卡重组病毒在制备塞内卡重组疫苗中的应用。

本发明还提供了一种重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)将塞内卡重组病毒接种至易感细胞内进行增殖培养，得到塞内卡重组病毒液；

2)对所述塞内卡重组病毒液中的塞内卡重组病毒进行灭活和乳化，得所述塞内卡重组疫苗。

优选的，步骤1)所述易感细胞包括BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。

优选的，步骤1)所述易感细胞包括BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞的悬浮细胞。

优选的，在进行步骤1)所述增殖培养时，所述塞内卡重组病毒的病毒滴度不低于10^6.5TCID₅₀/mL。

优选的，步骤2)中利用二乙烯亚胺进行所述灭活。

优选的，所述二乙烯亚胺在所述灭活的体系中的浓度为1.5mmol/L。

优选的，所述灭活的温度为30℃，灭活的时间为36h。

优选的，步骤2)所述乳化时，将灭活后的塞内卡重组病毒与ISA 206佐剂以体积比1:1混合。

本发明还提供了利用所述制备方法制备得到的重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组疫苗。

本发明还提供了所述塞内卡重组疫苗在制备用于预防和/或控制动物由塞内卡病毒和口蹄疫病毒引起的相关疾病的药物中的应用。

优选的，所述动物包括猪、牛或羊。

本发明提供一种重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗及其制备方法和应用，获得SVV/FJ/001株的全长cDNA，并对其5'UTR进行缺失及突变改造，同时在SVAcDNA中融合进串联的O型FMDV的B细胞表位与3A蛋白的T细胞表位基因，经过病毒拯救、重组毒株生物学特性测定等，显示成功拯救的重组病毒具有与野生型相似的细胞感染特性和高产特性，同时，重组病毒能够表达融合进的细胞表位，且表达产物具有良好的反应原性，致病性研究结果显示重组病毒致病性显著降低甚至对猪无致病性，显著提高了毒株的生物安全性，免疫实验结果表明，该重组毒株具有很好的免疫原性，不仅能有效激发SVA的中和抗体，而且能产生针对FMDV的特异性抗体。该制备方法可以用于以SVA感染性cDNA为骨架，融合外源抗原基因的嵌合病毒和/或嵌合疫苗的研究，用该重组病毒制备疫苗可以实现免疫动物后不仅能产生针对骨架SVA的特异性免疫应答，还能产生针对插入的外源抗原基因的保护性免疫反应。

本发明得到的塞内卡重组病毒rSVV/FJ-M-OB-3A株病毒滴度高，稳定传代后病变时间约12～18h左右，毒价为10^6.5TCID₅₀/mL～10^10.0TCID₅₀/mL。本发明获得的重组SVA毒株rSVV/FJ-M-OB-3A株，在病毒的5'UTR进行了部分缺失及突变的改造，同时嵌合了能高效表达的O型FMDV B细胞和T细胞表位基因，该重组毒株与SVV/FJ/001的致病性相比较，显著降低了毒株对猪的致病性，甚至对猪无致病性，显著提高了生物安全性。本发明技术实现了更为主动有效的SVA重组/嵌合疫苗毒株构建方式，实现了SVA重组疫苗制备工艺的革新，具有重大应用价值。

附图说明

图1为实施例2中扩增SVA S1片段和S2-OB-3A片段的电泳结果，其中1为S1片段扩增产物；2为S2-OB-3A片段扩增产物；M为DL 5000 DNA Marker；

图2为实施例2中塞内卡病毒重组质粒prSVV/FJ-M-OB-3A的构建方法示意图；

图3为实施例3中重组病毒rSVV/FJ-M-OB-3A株感染BHK-21细胞后引起的细胞病变效应(CPE)，其中A表示正常BHK-21细胞；B表示出现CPE的BHK-21细胞；

图4为实施例4中接种了重组病毒rSVV/FJ-M-OB-3A株的间接免疫荧光结果，其中A表示正常细胞对照，B表示接种重组病毒rSVV/FJ-M-OB-3A株后的检测结果；

图5为实施例4中重组病毒rSVV/FJ-M-OB-3A的Westernblot分析结果。

具体实施方式

本发明所述塞内卡病毒株优选包括SVV/FJ/001株。本发明所述SVV/FJ/001株优选为保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.V201802的SVV/FJ/001，且已经在中国授权专利“塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法和应用”ZL201810003888.2中进行过公开。

本发明优选对SVV/FJ/001株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造，且改造后的SVV/FJ/001株的5'UTR基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述插入的重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A的构建方法优选包括：将O型口蹄疫病毒VP1基因132～161位氨基酸与200～213位氨基酸的编码基因串联三次，得重组B细胞表位；在所述重组B细胞表位的3'端依次串联口蹄疫病毒3A基因21-35位氨基酸的编码基因和2A基因，得所述重组O型口蹄疫病毒的表位基因OB-3A。本发明优选利用柔性Linker进行所述串联，所述柔性Linker的氨基酸序优选如SEQ ID NO.11所示：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。本发明在构建所述重组O型口蹄疫病毒表位基因时，优选的还包括根据SVV/FJ/001株的序列，在侧翼合成SVA的基因序列包含5'端SphI至3'端NheI(NheI是根据SVA的序列经氨基酸同义突变后引入的酶切位点)。本发明所述重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A优选基于O型口蹄疫病毒的基因组进行重组，所述O型口蹄疫病毒的毒株优选为O/BY/2010株，其基因序列参见Genebank：JN998085。

本发明以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，利用特异性引物对分别扩增得到SVV/FJ/001株的S1片段和S21片段；扩增所述S1片段的特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-1R，所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F；所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述下游引物SVA-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；扩增所述S21片段的的特异性引物对包括上游引物SVA-2F1和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-2F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。本发明对所述SVV/FJ/001株的cDNA的来源并没有特殊限定，优选通过提取RNA后反转录得到。本发明扩增所述S1片段和S21片段所使用的特异性引物优选如下所示：

SVA-1F0：

5'-gtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcttgaaagggggggctgggcc-3'(SEQID NO.3)；

SVA-1F：5'-ataggtttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactatagga-3'(SEQ ID NO.4)；

SVA-1R：5'-gggaagcatgctggggcaccaggcac-3'(SEQ ID NO.5)；

SVA-2F1：5'-gccctgctagcgacaacccgatcctg-3'(SEQ ID NO.6)；

SVA-2F：5'-ccccagcatgcttccctttcgcagc-3'(SEQ ID NO.10)；

SVA-2R：5'-ttttctagagcggccgct₃₈-3'(SEQ ID NO.7)。

在本发明中，优选在扩增S1片段所用上游引物SVA-1F、SVA-1F0中引入PacI酶切位点和榔头锤酶核心序列，以保证在转录后经剪切修饰产生具有感染性的病毒RNA，其下游引物SVA-1R含SphI酶切位点；扩增S21片段的上游引物SVA-2F1引入NheI酶切位点，其下游引物SVA-2R含NotI酶切位点和38nt的poly(T)。本发明对所述S1片段和S21片段的扩增体系和程序并没有特殊限定，优选按照《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.赛德曼等主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行即可。

本发明在扩增所述S1片段时，首先以用SVV/FJ/001的总RNA经反转录后的第一链cDNA为模板，用引物SVA-1F0和SVA-1R扩增，以该扩增产物为模板，用引物SVA-1F和SVA-1R进行第二轮扩增，获得第一个基因片段S1；以反转录的第一链cDNA为模板，用引物SVA-2F1和SVA-2R扩增获得第二个基因片段S21。

本发明将所述S21片段与所述重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A融合，得S2-OB-3A。本发明所述融合优选包括将所述重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A的基因片段与S21基因片段用NheI酶切连接，进行PCR扩增；所述PCR扩增的引物包括上游引物SVA-2F和下游引物SVA-2R；所述上游引物SVA-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。本发明所述PCR扩增的条件优选为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃4min30s，30个循环；72℃10min。

本发明将所述S1片段和S2-OB-3A片段分别与pMD20 T载体连接，得到亚克隆质粒PMD-S1和PMD-S2-OB-3A。本发明优选将得到的扩增产物，分别通过胶回收的方式收集所述S1片段和S2-OB-3A片段。本发明对所述连接的体系和程序并没有特殊限定。

本发明以所述亚克隆质粒PMD-S1为模板，用突变引物SVA-m5UTRF和SVA-m5UTRR进行扩增，得到亚克隆质粒PMD-mS1，所述SVA-m5UTRF的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述SVA-m5UTRR的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。本发明所述突变引物的序列分别为：

SVA-m5UTRF：5'-gttctagcctactcgttttttcccctactcactcattcgtgttgtaactacaggat-3'(SEQ ID NO.8)；

SVA-m5UTRR：

5'-atcctgtagttacaacacgaatgagtgagtaggggaaaaaacgagtaggctagaac-3'(SEQ IDNO.9)。

经本发明所述突变后，获得的mS1含有经缺失突变改造的5’UTR基因，是如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

本发明将质粒PMD-mS1用PacI和SphI双酶切、质粒PMD-S2-OB-3A用SphI和NotI双酶切后，回收基因片段，连接替换插入到经PacI和NotI双酶切后的真核转录质粒prO/CHA/99中，得重组质粒prSVV/FJ-M-OB-3A。本发明所述重组质粒prSVV/FJ-M-OB-3A中包含有改造的SVV/FJ/001全长基因同时嵌合O型FMDV B细胞和T细胞表位基因。

本发明利用所述重组质粒prSVV/FJ-M-OB-3A转染塞内卡病毒敏感细胞，获得塞内卡重组病毒。本发明所述塞内卡病毒敏感细胞包括BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。

本发明步骤1)中所述的易感细胞优选包括BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞，更优选为BHK-21悬浮细胞或ST悬浮细胞。

本发明在进行步骤1)所述增殖培养时，所述塞内卡重组病毒的病毒滴度优选不低于10^6.5TCID₅₀/mL，更优选为10^6.5TCID₅₀/mL～10^10.0TCID₅₀/mL。本发明所述的塞内卡重组病毒株在所述易感细胞中进行增殖时滴度高，能够很好地适应细胞增殖，抗原产能高。

本发明步骤2)中优选利用二乙烯亚胺进行所述灭活。所述二乙烯亚胺在所述灭活的体系中的浓度优选为1.5mmol/L。本发明所述灭活的温度优选为30℃，灭活的时间优选为36h。

本发明在步骤2)所述乳化时，优选将灭活后的塞内卡重组病毒与ISA206佐剂以体积比1:1混合。

本发明所述动物优选包括猪、牛或羊。

在本发明中，所述塞内卡重组病毒/疫苗株优选的还可以包含一种或多种非塞尼卡谷病毒株的抗原表位基因，所述非塞尼卡谷病毒株优选包括：口蹄疫病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒，因此以上述塞内卡重组病毒制备得到的相应的塞内卡重组疫苗，除预防和/或控制动物塞尼卡谷病毒外，还可以预防和/或控制一种或多种非塞尼卡谷病毒引起的相关疾病。

下面结合实施例对本发明提供的重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

O型口蹄疫病毒B细胞表位和T细胞表位基因的获得

根据O/BY/2010株基因序列(Genebank：JN998085)，人工合成的方式将O型FMDVVP1的132～161位氨基酸、200～213位氨基酸的编码基因之间用柔性Linker(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)串联三次，并在3'端用Linker串联FMDV 3A的21～35位氨基酸的编码基因，同时串联2A基因，得到串联的O型FMDV B细胞表位、3A T细胞表位和2A基因，即重组表位基因OB-3A。同时根据SVV/FJ/001株的序列，在侧翼合成SVA的基因序列包含5'端SphI至3'端NheI(NheI是根据SVA的序列经氨基酸同义突变后引入的酶切位点)，合成含重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A的基因是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

实施例2

重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡病毒感染性克隆的构建

所用SVV/FJ/001毒株保藏于中国典型培养物保藏中心(微生物保藏号：CCTCC NO:V201802)，(公开于授权专利“塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法和应用”ZL201810003888.2中，其全文通过引用并入本申请中)，根据SVA基因组序列(Genebank：KY747510)，设计合成扩增引物：

SVA-1F0：

5'-gtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcttgaaagggggggctgggcc-3'(SEQID NO.3)；

SVA-1F：5'-ataggtttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactatagga-3'(SEQ ID NO.4)

SVA-1R：5'-gggaagcatgctggggcaccaggcac-3'(SEQ ID NO.5)

SVA-2F1：5'-gccctgctagcgacaacccgatcctg-3'(SEQ ID NO.6)

SVA-2F：5'-ccccagcatgcttccctttcgcagc-3'(SEQ ID NO.10)

SVA-2R：5'-ttttctagagcggccgct₃₈-3'(SEQ ID NO.7)

SVA-m5UTRF：5'-gttctagcctactcgttttttcccctactcactcattcgtgttgtaactacaggat-3'(SEQ ID NO.8)

SVA-m5UTRR：

5'-atcctgtagttacaacacgaatgagtgagtaggggaaaaaacgagtaggctagaac-3'(SEQ IDNO.9)。

在以上的特异引物中，扩增S1片段所用上游引物SVA-1F、SVA-1F0中引入PacI酶切位点和榔头锤酶核心序列，以保证在转录后经剪切修饰产生具有感染性的病毒RNA，其下游引物SVA-1R含SphI酶切位点；扩增S21片段的上游引物SVA-2F1引入NheI酶切位点，其下游引物SVA-2R含NotI酶切位点和38nt的poly(T)。SVA-m5UTRF和SVA-m5UTRR是对S1片段上的5’UTR基因进行缺失和定点突变的引物。

用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取SVV/FJ/001的总RNA，用引物SVA-2R反转录合成第一链cDNA，用具有极强延伸能力的PrimeScript Reverse Transcriptase(TaKaRa公司)反转录酶，按照产品说明书配制20μL反应体系，于42℃反应1h备用，以反转录的第一链cDNA为模板，用引物SVA-1F0和SVA-1R扩增，以该扩增产物为模板，用引物SVA-1F和SVA-1R进行第二轮扩增，获得第一个基因片段S1；以反转录的第一链cDNA为模板，用引物SVA-2F1和SVA-2R扩增获得第二个基因片段S21。上述扩增用适合长片段扩增、性能优良的LA

(TaKaRa公司)DNA聚合酶，按照产品说明书配制50μL反应体系，扩增条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃3min30s，35个循环；72℃10min，纯化回收PCR扩增产物。其中S1的扩增产物的电泳结果如图1所示，S1大小为3506bp，与预期大小相符。

将实施例1中得到的含O型FMDV B细胞表位、3AT细胞表位和2A基因的基因片段与上述扩增得到的S21基因片段通过NheI酶切连接后进行PCR扩增，反应加入引物SVA-2F和SVA-2R，得到SVA S2-OB-3A片段，扩增条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃4min30s，30个循环；72℃10min，纯化回收PCR扩增产物。上述扩增产物的电泳结果如图1所示，S1和S2-OB-3A大小分别为3506bp和4494bp，与预期大小相符。

将上述S1和S2-OB-3A基因片段分别进行胶回收，与pMD20 T载体连接，转化JM109感受态细胞，筛选、测序鉴定阳性克隆，分别命名为PMD-S1和PMD-S2-OB-3A。以质粒PMD-S1为模板，用引物SVA-m5UTRF和SVA-m5UTRR扩增，缺失并突变S1片段上的5’UTR基因，扩增使用高保真性的

HS(TaKaRa公司)DNA聚合酶，按照产品说明书配制50μL反应体系，扩增条件为：95℃5min；95℃1min，55℃1min，68℃6min，20个循环；68℃10min，扩增产物用DpnI消化去除模板质粒后，转化DH5α感受态细胞，筛选、测序鉴定阳性克隆，命名为PMD-mS1，测序结果显示mS1含有经缺失突变改造的5’UTR基因，是如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

将质粒PMD-mS1用PacI和SphI双酶切、质粒PCD-S2-OB-3A用SphI和NotI双酶切后，分别回收目的片段，然后将含有O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99(公开于授权专利“Asia1型口蹄疫重组病毒及其制备方法和应用”ZL201310175323.X和“A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用”ZL201310175324.4中，其全文通过引用并入本申请中)用PacI和NotI双酶切，纯化回收载体片段，经T4连接酶连接、转化至JM109感受态细胞中，经酶切、测序鉴定阳性克隆，获得含5'UTR改造的嵌合O型口蹄疫病毒B细胞表位和T细胞表位的SVA重组质粒prSVV/FJ-M-OB-3A，构建方法如图2所示。

实施例3

重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡病毒的拯救及不同细胞的培养特性

3.1重组塞内卡病毒的拯救

用

Plasmid Plus Maxi Kit(QIAGEN公司)制备由实施例2得到的重组质粒prSVV/FJ-M-OB-3A，当BHK-21细胞生长至80％时用于转染，在脂质体Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)的介导下将4μg重组质粒转染BHK-21细胞，同时设立脂质体对照和正常细胞对照，放置于含5％CO₂的37℃培养箱中，转染6h后弃去上清，加入MEM培养基，继续培养，观察细胞状态及细胞病变情况，待细胞出现90％左右病变时收获病毒，反复冻融3次后再次接种BHK-21细胞，直到病毒能稳定地产生细胞病变，出现细胞变圆、脱落，逐渐形成空斑、崩解成碎片的病变现象。将得到的重组病毒命名为rSVV/FJ-M-OB-3A，在图3中，A：为正常对照BHK-21细胞图片；B：拯救的重组病毒rSVV/FJ-M-OB-3A感染BHK-21。

3.2重组塞内卡病毒在不同细胞的培养特性

将上述3.1拯救获得的重组塞内卡病毒rSVV/FJ-M-OB-3A株感染不同细胞，结果发现该重组毒株能够在BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞等细胞中增殖，并引起典型的细胞病变，与野生亲本毒株SVV/FJ/001株在上述不同细胞上的培养特性相似。

实施例4

重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒的鉴定

4.1 RT-PCR鉴定重组病毒的稳定性

将稳定传代的rSVV/FJ-M-OB-3A株感染BHK-21细胞的上清用RNAeasyMini Kit(Qiagen)提取总RNA，反转录后，扩增融合B细胞和T细胞表位基因的S2-OB-3A基因片段及含5'UTR的S1基因，纯化回收后送测序，结果显示获得的插入外源基因的片段及5'UTR基因与理论序列一致。将传代5代、10代、15代、20代的重组病毒用同样方法扩增上述两个片段，经测序显示，重组病毒在传代过程中插入的OB-3A基因和5'UTR的定点缺失突变能够稳定存在。

4.2间接免疫荧光鉴定SVA病毒抗原

将rSVV/FJ-M-OB-3A株感染BHK-21细胞的培养物反复冻融后，接种至底部放置了载玻片的生长有BHK-21细胞的六孔板里(单层细胞生长至60～70％)，置于含5％CO₂的37℃培养箱中，24h后按常规方法做间接免疫荧光，一抗为SVA豚鼠阳性血清，二抗为FITC标记山羊抗豚鼠IgG(Sigma公司)，同时设正常细胞对照。接种rSVV/FJ-M-OB-3A株培养物的细胞中可见绿色特异性荧光，而正常细胞对照无可见荧光产生(图4)。

4.3 Western blot分析

收取SVV/FJ/001株、rSVV/FJ-M-OB-3A株感染的细胞和正常对照细胞，按照Westernblot方法处理细胞蛋白样品后进行SDS-PAGE电泳、转膜，封闭，一抗分别为O型FMDV兔多抗，3A蛋白兔多抗，二抗为HRP标记山羊抗兔IgG(Sigma公司)。结果显示，rSVV/FJ-M-OB-3A株感染的细胞样品用O型FMDV的抗体和3A蛋白抗体均能检测到特异性的反应条带，而SVV/FJ/001株样品和正常细胞对照均未出现蛋白条带(图5)。

实施例5

重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒的致病力试验

5.1重组塞内卡病毒对细胞的致病力试验

按照常规方法消化SVA的易感细胞，如实施例3中的BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、IBRS-2等细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，将细胞铺于12孔板中，于37℃含有5％CO₂的培养箱中培养，待细胞单层长到80～90％时备用。用DMEM以10倍倍比稀释病毒液，将各稀释度(10^-5.0～10^-10.0)的病毒液分别加入细胞板中，每个稀释度4孔，放入37℃含有5％CO₂的培养箱中进行培养，观察4天，用Reed-Muench氏法测定病毒对BHK-21细胞等不同细胞的半数感染量(TCID₅₀)。按照该法测定rSVV/FJ-M-OB-3A株在BHK-21等不同细胞上的病毒滴度，计算rSVV/FJ-M-OB-3A株的TCID50为10^-6.5/mL～10^-10.0/mL。

Reed-Muench计算方法是本领域的已有技术，现有文献“Reed,L.J.and Muench,H.(1938)."A Simple Method of Estimating Fifty Percent Endpoints".The AmericanJournal of Hygiene 27:493–497”中对此已经进行了详细地描述，该文献在此通过引用方式并入本申请用作参考。

5.2重组塞内卡病毒对猪的致病力试验

从非疫区筛选试验用猪9头，并经中和实验检测，SVV中和抗体效价＜1：4。根据已经建立的SVV/FJ/001株对猪的攻毒模型的条件，将制备的rSVV/FJ-M-OB-3A株采用注射途径进行攻毒，攻毒剂量设立两个梯度，分别为2×10⁹TCID₅₀，2×10¹⁰TCID₅₀，同时设立SVV/FJ/001株细胞毒为对照，攻毒剂量为2×10⁹TCID₅₀，2mL/头，连续观察13天，观察并记录记录发病情况，根据蹄部、鼻镜、口唇出现水泡等症状判定动物发病情况，并计分(5分制，判定标准参照口蹄疫判分标准制定，分数越高表明临床症状越严重)。攻毒结果显示，对照野生亲本毒SVV/FJ/001株攻毒后从第二天开始出现典型临床症状，蹄部出现水泡，之后有的在鼻镜上出现水泡。而重组塞内卡病毒rSVV/FJ-M-OB-3A株攻毒后，两个攻毒剂量组均未出现任何临床症状，结果见表1。

表1重组塞内卡病毒对猪致病力试验临床症状

实施例6

重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒疫苗的制备和免疫

6.1疫苗制备

6.1.1病毒液的制备：将获得的rSVV/FJ-M-OB-3A株按照实施例3的方法用易感细胞培养，将病毒按培养液量的1％接入已形成单层的易感细胞中，当病变达到80％以上时，收获含病毒的细胞培养液，经反复冻融后，-70℃保存备用。按照实施例5所述测定病毒含量，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀，结果每毫升病毒液不低于10^6.5TCID₅₀。

6.1.2灭活：用终浓度为1.5mmol/L二乙烯亚胺(Binary ethylenimine,BEI)(Sigma公司)，于30℃灭活36h，加入阻断剂硫代硫酸钠溶液，4℃过夜，保存备用。同时，将灭活后的病毒液在SVA易感细胞上盲传三代做安检，设立病毒对照和正常细胞对照，结果灭活后的病毒液不能引起易感细胞发生病变。

6.1.3疫苗的配制：灭活抗原经安检后与ISA206佐剂(法国SEPPIC)以1：1比例乳化制备成水包油包水剂型疫苗，分装备用。

6.2疫苗免疫试验

将得到的安检合格的重组塞内卡病毒灭活疫苗免疫6头猪，同时设2头非免疫对照，测定其免疫效力。实验用猪购自非疫区，并经中和实验检测，SVA中和抗体效价＜1：4；经国家口蹄疫参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测O型抗体均＜1：4；FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。于一免28d进行二免，并在免疫后28d、42d、56d分别采血、分离血清，SVA进行中和抗体检测，用ELISA方法检测O型口蹄疫抗体，结果表明，该重组毒株具有很好的免疫原性，不仅能有效激发SVA的中和抗体(表2)，而且能产生针对O型FMDV的特异性抗体，效价均≥64。

表2重组塞内卡疫苗免疫后中和抗体水平检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗及其制备方法和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggaact gcaaatacgc cgggggctca ctgcccaacg tgagaggcga tctccaagtg 60

ctggctcaga aggcagcgag gccgctgcct actggaggcg gagggtctag acacaaacag 120

aaaatagtgg cgcctgtaaa gcagtccttg ggaggcggag ggagcgggaa ctgcaaatac 180

gccgggggct cactgcccaa cgtgagaggc gatctccaag tgctggctca gaaggcagcg 240

aggccgctgc ctactggagg cggagggtct agacacaaac agaaaatagt ggcgcctgta 300

aagcagtcct tgggaggcgg agggagcggg aactgcaaat acgccggggg ctcactgccc 360

aacgtgagag gcgatctcca agtgctggct cagaaggcag cgaggccgct gcctactgga 420

ggcggagggt ctagacacaa acagaaaata gtggcgcctg taaagcagtc cttgggaggc 480

ggagggagcg cagcaattga attctttgag gggatggtcc atgactccat caagggaggc 540

ggagggtcta actttgatct gctcaagttg gcaggggacg tggagtccaa ccctgggccc 600

<210> 2

<211> 655

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgaaagggg gggctgggcc ctcatgccca gtccttcctt tccccttccg gggggtaaac 60

cggctgtgtt tgctagaggc acagaggagc aacatccaac ctgcttttgt ggggaacagt 120

gcggctccaa ttcctgcgtc gccaaaggtg ttagcgcacc caaacggcgc atctaccaat 180

gctattggtg tggtctgcga gttctagcct actcgttttt tcccctactc actcattcgt 240

gttgtaacta caggatttgg ccctcgcacg ggatgtgcga taaccgcaag attgactcaa 300

gcgcggaaag cgttgtaacc acatgctgtt agtcccttta tggctgtgag atggctatcc 360

acctcggatc actgaactgg agctcgaccc tccttagtaa gggaaccgag aggccttcct 420

gcaacaagct ccgacacaga gtccacgtga ttgctaccac catgagtaca tggttctccc 480

ctctcgaccc aggacttctt tttgaatatc cacggctcga tccagagggt ggggcatgat 540

ccccctagca tagcgagcta cagcgggaac tgtagctagg ccttagcgtg ccttggatac 600

tgcctgatag ggcgacggcc tagtcgtgtc ggttctatag gtagcacata caaat 655

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgaggacga aactatagga aaggaattcc tatagtcttg aaaggggggg ctgggcc 57

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataggtttaa ttaatgttaa gcgtctgatg agtccgtgag gacgaaacta tagga 55

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggaagcatg ctggggcacc aggcac 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccctgctag cgacaacccg atcctg 26

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttttctagag cggccgcttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttt 55

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttctagcct actcgttttt tcccctactc actcattcgt gttgtaacta caggat 56

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atcctgtagt tacaacacga atgagtgagt aggggaaaaa acgagtaggc tagaac 56

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccccagcatg cttccctttc gcagc 25

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims

1.一种塞内卡病毒重组核酸，其特征在于，所述重组核酸的序列包括对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造，同时在塞内卡病毒的SphⅠ和NotⅠ酶切位点之间插入重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A；所述重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造后的5'UTR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的重组核酸，其特征在于，所述塞内卡病毒株选自SVV/FJ/001株，所述SVV/FJ/001株的保藏编号为CCTCC NO.V201802。

3.权利要求1或2所述重组核酸在制备重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡病毒重组核酸或塞内卡重组疫苗株中的应用。

4.一种包含权利要求1或2所述的重组核酸的重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒。

5.一种由权利要求1或2所述的重组核酸编码的重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒。

6.一种包含权利要求4或5所述的塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株。

7.权利要求4或5所述塞内卡重组病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，利用特异性引物对扩增得到SVV/FJ/001株的S1片段和S21片段；扩增所述S1片段的特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-1R，所述上游引物包括SVA-1F0和 SVA-1F；所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述上游引物 SVA-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述下游引物SVA-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述SVV/FJ/001株的保藏编号为CCTCC NO.V201802；

（2）将所述S21片段与所述重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A融合，得S2-OB-3A；

（3）将所述S1片段和S2-OB-3A片段分别与pMD20 T载体连接，得到亚克隆质粒PMD-S1和PMD-S2-OB-3A；

（4）以所述亚克隆质粒PMD-S1为模板，用突变引物SVA-m5UTRF和SVA-m5UTRR进行扩增，得到亚克隆质粒PMD-mS1，所述SVA-m5UTRF的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述SVA-m5UTRR的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

（5）将质粒PMD-mS1用PacI和SphI双酶切、质粒PMD-S2-OB-3A用SphI和NotI双酶切后，回收基因片段，连接替换插入到经PacI和NotI双酶切后的真核转录质粒prO/CHA/99中，得重组质粒prSVV/FJ-M-OB-3A；

（6）利用所述重组质粒prSVV/FJ-M-OB-3A转染塞内卡病毒敏感细胞，获得塞内卡重组病毒。

8.根据权利要求7所述构建方法，其特征在于，步骤（2）所述融合包括将所述重组O型口蹄疫病毒表位基因OB-3A的基因片段与S21基因片段用NheI酶切连接，进行PCR扩增；所述PCR扩增的引物包括上游引物SVA-2F和下游引物SVA-2R；所述上游引物SVA-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

9.根据权利要求7所述构建方法，其特征在于，步骤（6）所述塞内卡病毒敏感细胞选自BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。

10.权利要求4或5所述重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒或利用权利要求7~9任一项所述构建方法构建得到的塞内卡重组病毒在制备塞内卡重组疫苗中的应用。

11.一种重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将权利要求4或5所述塞内卡重组病毒接种至易感细胞内进行增殖培养，得到塞内卡重组病毒液；

2）对所述塞内卡重组病毒液中的塞内卡重组病毒进行灭活和乳化，得所述塞内卡重组疫苗。

12.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，步骤1）所述易感细胞选自BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。

13.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，步骤1）所述易感细胞选自BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞的悬浮细胞。

14.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，在进行步骤1）所述增殖培养时，所述塞内卡重组病毒的病毒滴度不低于10^6.5 TCID₅₀/mL。

15.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，步骤2）中利用二乙烯亚胺进行所述灭活。

16.根据权利要求15所述制备方法，其特征在于，所述二乙烯亚胺在所述灭活的体系中的浓度为1.5 mmol/L。

17.根据权利要求11或16所述制备方法，其特征在于，所述灭活的温度为30℃，灭活的时间为36h。

18.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，步骤2）所述乳化时，将灭活后的塞内卡重组病毒与ISA 206佐剂以体积比1:1混合。

19.利用权利要求11~18任一项所述制备方法制备得到的重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组疫苗。

20.权利要求6所述塞内卡重组疫苗株或权利要求19所述塞内卡重组疫苗在制备用于预防和/或控制动物由塞内卡病毒和口蹄疫病毒引起的相关疾病的药物中的应用。

21.根据权利要求20 所述的应用，其特征在于，所述动物选自猪、牛或羊。