CN116769735A - 一种甲病毒减毒株的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明首次在甲病毒的基因组中通过突变失活亚基因组启动子并引入II型IRES翻译起始元件阻断甲病毒在蚊虫中的复制，切断病毒的传播途径增加疫苗的安全性，同时通过改变病毒的翻译起始机制达到致弱病毒目的，所获得的减毒株不但减毒效果理想、可诱导保护性免疫反应，而且所获得的毒株不能在动物‑动物、动物‑蚊虫间传播，安全性好，该重组病毒，可用于制备减毒活疫苗、灭活疫苗或用于制备RNA疫苗。

Description

一种甲病毒减毒株的构建方法及应用

技术领域

本发明属于甲病毒防治领域，尤其涉及一种甲病毒属病毒减毒株的构建及应用。

背景技术

虫媒病毒(Arbovirus)是指一些通过吸血的节肢动物如蚊虫、蜱等叮咬敏感的脊椎动物如鸟类、蝙蝠、灵长类和家畜等，而引起自然疫源性疾病及人兽共患病的一类病毒。虫媒病毒主要集中在披膜病毒科甲病毒属、黄病毒科黄病毒属、呼肠孤病毒科和布尼亚病毒科。甲病毒属病毒是最重要的蚊媒病毒之一，引起以发热、关节炎和脑炎为主要症状的疾病。自然情况下，蚊虫是甲病毒的传播媒介。近年来，在两栖类和爬行类动物中分离到了甲病毒，说明甲病毒的传播媒介和宿主在不断的增加。许多甲病毒将多种鸟类作为它们原始的脊椎动物贮存宿主，脊椎动物宿主感染甲病毒后大多不表现临床症状，其中一些脊椎动物感染后长期出现高滴度的病毒血症，这有利于感染叮咬它们的蚊，再通过蚊虫使病毒传播到其它脊椎动物，从而造成了病毒在蚊媒与脊椎动物之间的循环。甲病毒感染引起的临床表现比较复杂，该类疾病主要的临床表现为发烧、头痛、呕吐、嗜睡、抽搐和昏迷等一系列脑炎症状，还可在全身系统性疾病中表现为发烧，全身肌痛、关节痛和皮疹，严重者可侵犯内脏，如肝和肾，发生出血和休克，甚至会导致死亡。

盖塔病毒(Getah virus,GETV)是虫媒病毒中的一种，分类学上属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)成员。该病毒属还包括基孔肯雅病毒(CHIKV)、阿尼昂尼昂病毒(ONNV)、马亚罗病毒(MAYV)、罗斯河病毒(RRV)、东部马脑炎病毒(EEEV)、西部马脑炎病毒(WEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、特罗卡拉病毒(Trocara virus)等，这些都是在人类中引起严重临床症状甚至致命的传染病。GETV分布广泛，可引起猪、马、牛、狐狸等多种家畜和野生动物感染，人也可以感染。近年来，GETV在猪群中爆发，导致部分猪场经济损失严重，已成为畜牧业的一个潜在威胁。另外，GETV具有成为人畜共患病的潜在风险，应该为GETV向人类的传播做好计划和准备。

GETV为单股正链RNA病毒，全长约12Knt，基因组中含有两个开放阅读框(ORF)。病毒基因组的长度在11000-12000核苷酸之间，具有5’帽子结构和3'Poly(A)尾，5’端非编码区和3'端非编码区分别为约为78个nt和411个nt,非编码区之间包含2个独立的开放阅读框，分别编码病毒的结构蛋白和非结构蛋白。其中，5'端的ORF是通过帽依赖性翻译起始机制从病毒基因组的5'端起始非结构蛋白的翻译，而3'端的ORF则是利用病毒复制过程中的亚基因组RNA以帽依赖型翻译起始机制起始结构蛋白的翻译。非结构蛋白和结构蛋白编码区之间有44个nt组成的连接区，连接区可形成亚基因组启动子。

传统的减毒活疫苗毒株是通过强毒株在细胞培养物或异体上连续传代产生的，这种减毒通常依赖于有限数量的点突变，存在影响疫苗的免疫原性或毒力返强风险。例如，CHIKV 181/25减毒株虽然在啮齿动物和非人类灵长动物中表现出减毒和高免疫原性，但在II期临床试验中，59名参与者中有5人产生了轻度、短暂的关节痛(EDELMAN et al.,2000)，并且从接种者血液中分离的病毒显示其减毒位点发生了回复突变(GORCHAKOV et al.,2012)。近年来，利用反向遗传操作技术通过不同种甲病毒之间的嵌合来致弱病毒。这种病毒在自然界中经媒介传播，可能会以不可预见和意想不到的方式进化，存在安全性问题。1971年德克萨斯州为控制疫情使用了VEEV TC-83减毒活疫苗，然而，在路易斯安那州蚊子中分离出来该疫苗株，表明甲病毒减毒疫苗株存在蚊子媒介传播的风险(PEDERSEN etal.,1972)。另外，SINV/VEEV嵌合疫苗株的感染试验也证明其可以通过蚊子媒介进行传播(ARRIGO et al.,2008)。然而，针对该病尚无有效的抗病毒药物和商业化疫苗。由于该病毒免疫原性差，制备灭活疫苗免疫保护期较短。与灭活疫苗相比，减毒活疫苗可以刺激机体产生强大的特异性体液免疫反应和细胞免疫反应，具有免疫效果好，保护持续期长等优点。因此，开发安全有效的GETV减毒活疫苗对于GETV的防控具有重要意义。

发明内容

本发明首次在甲病毒的基因组中通过突变失活亚基因组启动子并引入微RNA病毒IRES翻译起始元件阻断甲病毒在蚊虫中的复制，从而切断病毒的传播途径增加疫苗的安全性，同时通过改变病毒的翻译起始机制达到致弱病毒目的，所获得的减毒株不但减毒效果理想、可诱导保护性免疫反应，而且所获得的毒株不能在动物-动物、动物-蚊虫间传播，安全性好，在此基础上完成了本发明。

第一方面，本发明提供一种重组甲病毒属病毒，所述重组病毒是在甲病毒的基因组中通过突变方法失活其亚基因组启动子并引入微RNA病毒IRES翻译起始元件获得重组甲病毒属病毒。

进一步的，所述的甲病毒属病毒包括但不限于基孔肯雅病毒、阿尼昂尼昂病毒、马亚罗病毒、罗斯河病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒、特罗卡拉病毒、盖塔病毒中的一种或多种。

进一步的，所述的甲病毒属病毒选自辛德比斯病毒和盖塔病毒。

进一步的，所述的甲病毒属的重组病毒优选盖塔病毒。

进一步的，所述的微RNA病毒包括但不限于口蹄疫病毒、脑心肌炎病毒、小鼠腦脊髓炎病毒、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒中的一种或多种。

进一步的，所述的微RNA病毒优选口蹄疫病毒。

进一步的，所述的IRES元件选自I型IRES元件、II型IRES元件、III型IRES元件、IV型IRES元件、V型IRES元件中的一种或多种。

进一步的，所述的IRES元件优选II型IRES元件。

进一步的，所述的启动子为甲病毒亚基因组启动子。

第二方面，本发明提供一种包含本发明第一方面的重组甲病毒属病毒的组合物，所述的重组甲病毒属病毒是在甲病毒的基因组中通过突变方法失活其亚基因组启动子并引入微RNA病毒IRES翻译起始元件获得重组甲病毒属病毒。

进一步，所述组合物还可以包含佐剂和/或药学上可接受的辅料。

进一步，所述组合物还可以包含其它不同于重组甲病毒属病毒的抗原成分。

进一步，所述组合物可以制备为疫苗、检测试剂或其他生物诊断试剂。

第三方面，本发明提供一种本发明第一方面的重组甲病毒属病毒在制备疫苗中的用途。

进一步的，所述疫苗给药途径选自：经口给药、舌下给药、胃或肠给药、局部给药、注射给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射。

进一步的，所述疫苗用于人、猪、马、牛、狐狸等多种家畜和野生动物。

第四方面，本发明提供一种本发明第一方面的重组甲病毒属病毒株的构建方法，所述方法包括如下步骤：

S1.构建甲病毒属病毒的全长cDNA感染性克隆；

S2.在甲病毒全长cDNA感染性克隆中通过突变方法失活甲病毒亚基因组启动子并引入微RNA病毒IRES翻译起始元件，构建重组质粒；

S3.将构建的重组质粒转染至宿主细胞，获得重组甲病毒属病毒株。

进一步的，所述的IRES元件可为I型IRES元件、II型IRES元件、III型IRES元件、IV型IRES元件、V型IRES元件中的一种或多种。

进一步的，所述的IRES元件优选II型IRES元件。

进一步的，所述的甲病毒启动子为亚基因组启动子。

本发明构建的虫媒病毒甲病毒属的重组病毒株，毒性致弱，减毒效果理想、可诱导机体产生保护性免疫反应，而且该毒株不能在动物-动物、动物-蚊虫间传播，安全性好。

附图说明

图1GETV SC483株全长cDNA感染性克隆的构建策略；

图2拯救的GETV SC483病毒的生物学特性(其中A为拯救GETV SC483病毒导致细胞病变图，B为拯救GETV SC483病毒的RT-PCR扩增、Not I酶切图，C为拯救GETV SC483病毒的测序图，D为间接免疫荧光试验图，E为病毒粒子形态学电镜负染，F为噬斑形成试验，G为一步生长曲线)；

图3嵌合病毒rSC483-IRES的构建及生物学特性(其中A为野生型GETV和嵌合病毒rSC483-IRES基因组示意图；B为GETV野生型和失活型亚基因组启动子；C为rSC483-IRES的IFA鉴定；D为rSC483-IRES在BHK-21细胞上的蚀斑表型；E为rSC483-IRES在BHK-21细胞上的一步生长曲线；F为rSC483-IRES的nsP4-Cap区域的RT-PCR结果)；

图4嵌合病毒rSC483-IRES在细胞培养中的遗传和表型稳定性(A为RT-PCR检测传代过程中基因组的稳定性；B为rSC483-IRES P10和P20在BHK-21细胞上的蚀斑形态；C为rSC483-IRES P10和P20在BHK-21细胞上的一步生长曲线)；

图5rSC483-IRES在AG129小鼠体内高度减毒(A为AG129小鼠接种不同剂量rSC483-IRES的存活率；B为感染rSC483-IRES小鼠的体重变化；C为感染rSC483-IRES小鼠的病理组织学变化；D为rSC483-IRES在AG129小鼠体内的组织分布及病毒载量)；图6SC483-IRES保护AG129小鼠免受SC483-WT感染(A为免疫后7天、14天鼠血清中中和抗体效价；B为攻毒后AG129小鼠存活率；C为攻毒后3天AG129小鼠血清中病毒滴度；D为攻毒前和攻毒后7天AG129小鼠血清中和抗体效价)。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意味着限制本发明的范围和精神。

本发明首先构建了GETV SC483株全长感染性cDNA克隆，并在此基础上，通过突变方式失活亚基因组(Subgenomic,SG)启动子并引入微RNA病毒II型IRES翻译起始元件，构建并拯救了该嵌合病毒rSC483-IRES，在AG129鼠模型和自然宿主猪体内证实嵌合病毒SC483-IRES的减毒和免疫保护效果。

实施例1重组阳性质粒的构建

1.细胞、毒株及实验动物

乳仓鼠肾细胞系(BHK-21,ATCC CCL-10)和蚊子细胞(C6/36，ATCC CRL-1660)由本实验室保存。辛德毕斯病毒SINVYN_222(MH229928)(GenBank登录号：MN478486)和盖塔病毒SC483毒株(GenBank登录号：MN478486)在BHK-21细胞中扩增后，测定病毒半数感染量(TCID₅₀)后，置于-80℃备用。4-6周龄AG129小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心；所有小鼠均在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心无特定病原体设施中饲养。

2.伦理审查

所有动物实验均在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生物安全2级(P2)防护设施内进行。本研究严格按照中国实验动物管理条例《实验动物护理指南》(中华人民共和国科学技术部)和《实验动物环境和饲养设施的要求》(GB 14925-2010,国家实验动物标准化技术委员会)进行。动物试验方案由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物使用与福利伦理委员会批准(批准号210512-02)。

3.GETV全长cDNA感染性克隆及IRES嵌合病毒的构建

在SC483株病毒基因组5′末端引入锤头状核酶(hammerhead ribozyme,HamRz)序列，在病毒基因组3′末端引入丁肝病毒核酶(hepatitis deltaribozyme,HdvRz)序列。在病毒基因组4332nt位置将G突变为A，使该位置GCGGCCGC(Not I)变为GCAGCCGC，从而消除NotI酶切位点作为拯救病毒的分子标记。将设计好的SC483株全基因组全长cDNA序列分为A、B、C、D 4个片段送至吉林库美生物公司进行人工合成并顺次克隆于pOK12-CMV载体中，获得含有正确GETV基因组全长cDNA克隆的重组质粒命名为pGETV-SC483(见图1)。

利用基因合成的方式人工合成突变的SG启动子(序列见图3B)以及连接有FMDVIRES的BglⅡ-Nsp4-IRES-Cap-Xho I基因片段，经BglⅡ/Xho I酶切后克隆于已经由BglⅡ/Xho I酶切处理的GETV SC483株全长cDNA感染性克隆中，获得的重组阳性质粒，经测序验证正确后，命名为pGETV-SC483-IRES。

其中，口蹄疫病毒IRES序列和GETV翻译起始元件序列如下：

口蹄疫病毒IRES序列：

GTGCAACTTGGAACTCCGCCTGGTCTTTCCAGGTCTAGAGGGGTGACATTTTGTACTGTGCTTGACTCCACGCTCGGTCCACTGGCGAGTGCTAGTAACAGCACTGTTGCTTCGTAGCGGAGCATGGTGGCCGCGGGAACTCCTCCTTGGTAACAGGGACCCGCGGGGCCGAAAGCCACGTCCTCACGGACCCACCATGTGTGCAACCCCAGCACGGCAACTTTATTGTGAAAACCACTTTAAGGTGACACTGATACTGGTACTCAACCACTGGTGACAGGCTAAGGATGCCCTTCAGGTACCCCGAGGTAACACGCGACACTCGGGATCTGAGAAGGGGACTGGGGCTTCTTTAAAAGCGCCTGGTTTAAAAAGCTTCTACGCCTGAATAGGTGACCGGAGGCCGGCACCTTTCCTTCGAACAACTGTCTTTAAATG

GETV SG启动子序列:

ATCTGTACGGCGGTCCTAAATAGA

4.SINV全长cDNA感染性克隆及IRES嵌合病毒的构建

按照GETV全长cDNA感染性克隆及IRES嵌合病毒的构建方法，构建SINVYN_222毒株的感染性克隆，并构建IRES嵌合病毒。获得的重组阳性质粒经测序验证正确后，分别命名为pSINV和pSINV-IRES。

实施例2重组病毒拯救

采用无内毒素质粒大提试剂盒分别提取重组质粒pGETV-SC483、pGETV-SC483-IRES和pSINV-IRES，并按Polyethylenimine Transfection Reagent试剂盒使用说明，将其转染于长至80％～90％的单层BHK-21细胞中。转染后4h，用含2％胎牛血清的DMEM更换细胞培养液继续进行培养，观察细胞病变(CPE)，大约3d左右收获细胞上清，并在新鲜的BHK-21细胞上连续传代，拯救的病毒分别命名为rSC483、rSC483-IRES和rSINV-IRES。

实施例3重组病毒的稳定检测

实验方法：

1、间接免疫荧光(IFA)

将rSC483、rSC483-IRES与SC483-WT接种BHK-21细胞，培养12h后弃去培养基，加入4％多聚甲醛固定10min，PBS洗3次；用含0.1％TX-100的PBS透膜20min，PBS洗3次；用含1％BSA的PBS封闭45min；加入GETV E2多抗血清(1:500)室温孵育2h，PBS洗4次；加入AlexaFluor 488标记的山羊抗鼠IgG(1:2000)室温孵育1h，PBS洗4次后在荧光显微镜下观察，同时设立不接毒细胞对照。

2、噬斑形成实验

将rSC483、rSC483-IRES与SC483-WT稀释至100TCID50后分别取100μL接种于单层BHK-21细胞，37℃吸附1h，PBS洗3次后每孔加入3mL含1％甲基纤维素的DMEM覆盖，37℃继续培养3d，弃去培养基，加入4％多聚甲醛溶液固定30min，用0.5％结晶紫染色30min，自来水洗去染色液，观察蚀斑形成情况。

3、一步生长曲线

BHK-21细胞生长至90％单层时，按病毒感染复数(MOI)为5的剂量分别接种rSC483、rSC483-IRES和SC483-WT，37℃吸附1h后用PBS洗2次，加入含2％胎牛血清的DMEM继续培养，分别于感染后6h、12h、18h、24h、30h和36h收获细胞上清，每个时间点设置3个重复，测定TCID50并绘制病毒的一步生长曲线。

C6/36细胞生长至90％单层时，按病毒感染复数(MOI)为5的剂量分别接种rSC483-IRES和SC483-WT，28℃吸附1h后用PBS洗2次，加入含2％胎牛血清的DMEM继续培养，分别于感染后6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h收获细胞上清，每个时间点设置3个重复，测定TCID50并绘制病毒的一步生长曲线。

4、病毒TCID50的测定

BHK-21细胞经胰酶消化后，用含5％FBS的DMEM重悬，100μL/孔细胞悬液铺于96孔板中。将待测的病毒液上清用含2％FBS的DMEM进行10倍连续梯度稀释后，加入铺好细胞的96孔板中，每孔100μL，每个稀释度平行做8个重复孔，37℃继续培养2-3天，观察细胞病变程度，采用Karber法计算病毒的TCID50。

实验结果

1、GETV SC483株cDNA感染性克隆的构建

将含有GETV SC483株全长cDNA的重组质粒pGETV-SC483转染BHK-21细胞，转染后48h可观察到明显的细胞病变，72h病变程度可达95％以上，病变细胞变圆、皱缩，呈现与亲本病毒一致的病变形态，而对照细胞形态正常，轮廓清晰(图2A)。分别提取拯救病毒和亲本病毒基因组RNA，对病毒基因组进行RT-PCR扩增、Not I酶切(图2B)以及测序测定(图2C)，结果表明，拯救病毒不同于亲本病毒，其含有人为引入以消去Not I酶切位点的G4332A突变的分子标记。使用GETV特异性抗体作为检测抗体的间接免疫荧光试验(图2D)和病毒粒子形态学电镜负染观察结果(图2E)进一步表明，GETV拯救成功。噬斑形成试验(图2F)和一步生长曲线(图2G)试验结果表明，拯救病毒与亲本病毒具有相似的复制能力和增殖特性。另外，感染性克隆质粒pGETV-SC483在大肠杆菌DH5α中连续传代后的测序结果表明，该重组质粒具有良好的遗传稳定性。本研究成功构建了稳定、高效的GETV SC483株全长cDNA感染性克隆，为GETV减毒活疫苗的开发提供技术平台。

2、IRES嵌合病毒的构建

在GETV全长cDNA感染性克隆的基础上，将FMDV IRES元件插在GETV SC483株亚基因组启动子SG Promotor的下游(图3A)，同时，在保证nsP4氨基酸序列不变的情况下，使用12个同义突变将SG Promotor失活(图3B)，经病毒拯救获得IRES嵌合的GETV重组病毒rSC483-IRES。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示，GETV抗体可与rSC483-IRES和SC483-WT感染后的细胞发生特异性反应，均可见特异性荧光(图3C)。噬斑形成试验结果表明，与野生型病毒相比，rSC483-IRES在BHK-21细胞上呈现明显的小斑形态(图3D)，病毒的一步生长曲线结果进一步表明，与野生型病毒相比，嵌合病毒rSC483-IRES在BHK-21细胞上复制速率明显减慢且病毒滴度下降约10倍(图3E)。重要的是，嵌合病毒rSC483-IRES在蚊子C6/36细胞中不复制(图3E)。另外，利用RT-PCR方法使用特异性引物扩增rSC483-IRES病毒基因组中含有IRES元件的基因片段，结果显示，目的片段与预期大小一致。嵌合病毒全基因组测序结果显示嵌合病毒含有预先引入的IRES元件及突变修饰，而无其他突变。

3、SC483-IRES在体外连续传代过程中遗传稳定

为了分析携带IRES元件的嵌合病毒的表型和遗传稳定性，将rSC483-IRES在BHK-21细胞上进行连续传代20次。从P10代和P20代病毒培养上清中提取病毒RNA，使用特异性引物扩增含有IRES基因的基因片段，结果显示，P10和P20病毒仅扩增出1条目的基因片段，表明P10和P20代病毒中均含有IRES基因，而无丢失现象产物(图4A)。另外，测序结果也显示，IRES元件依然稳定存在于rSC483-IRES基因组中。在不同代次病毒之间，病毒的蚀斑形态和生长动力学没有明显变化(图4B和C)。以上数据表明嵌合病毒rSC483-IRES具有高度的遗传稳定性。

实施例4动物实验

实验方法：

1、rSC483-IRES在AG129小鼠上的致病性试验

将4-6周龄AG129小鼠随机分成6组，每组5只。其中5组经腹腔途径以0.1mL体积分别接种不同感染剂量(103、104、105、106、107TCID50)的rSC483-IRES病毒，第6组小鼠经腹腔注射10TCID50的SC483-WT作为对照。在感染后每日连续观察临床症状、采血、测量体温及体重、记录小鼠的死亡时间及数量并通过Reed-Muench法计算LD50。

将4-6周龄AG129小鼠随机分成4组，每组5只。其中3组经腹腔途径以0.1mL体积分别接种不同感染剂量(105、106、107TCID50)的rSINV-IRES(辛德毕斯病毒)病毒，第4组小鼠经腹腔注射10TCID50的SINV-WT作为对照。在感染后每日连续观察临床症状、采血、测量体温及体重、记录小鼠的死亡时间及数量并通过Reed-Muench法计算LD50。

为了分析rSC483-IRES感染AG129小鼠后各组织器官的病毒载量和病理组织损伤，20只4-6周龄AG129小鼠经腹腔途径以0.1mL体积接种106TCID50的rSC483-IRES病毒，在感染后每隔24h，随机抓取5只小鼠实施安乐死，并采集血液和组织器官(脾、胸腺、脑、腋窝淋巴结和肌肉)并称重。采集的组织一部分用10％福尔马林溶液固定，用于病理组织学分析。另一部分用于确定病毒组织器官分布和病毒载量。

2、rSC483-IRES在本动物猪上的致病性试验

5头4周龄仔猪(10-15公斤)分别经颈部肌肉途径接种108TCID50 rSC483-IRES(3头)或SC483-WT(2头)。在接种后7天内每天观察临床症状，采血、收集鼻腔和口腔分泌物，并测量体温。

3、AG129小鼠的免疫和攻毒

将4-6周龄AG129小鼠随机分为2组，每组5只。其中1组AG129小鼠分别经腹腔途径以0.1mL体积接种103TCID50的rSC483-IRES病毒，另一组小鼠接种PBS作为对照。每天观察临床症状，每周采血1次。在免疫后21天进行攻毒，所有小鼠经腹腔途径接种100倍致死感染剂量(100TCID50)SC483-WT病毒。攻毒后7日内每天观察临床症状、采血监测病毒血症并测量体温及体重。

4、猪的免疫和攻毒

3头4周龄仔猪(10-15公斤)经颈部肌肉途径接种108TCID50 rSC483-IRES病毒进行免疫，2头仔猪接种PBS作为对照每天观察猪只状态，每周采血1次。在免疫后21天，所有猪只经颈部肌肉注射108TCID50 SC483-WT强毒株进行攻毒。在攻毒后7日内每天监测临床症状，收集血清、鼻腔和口腔分泌物，并测量体温。

5、病理组织学观察

将采集的小鼠组织器官(心、肝、脾、肺、肾、胸腺、脑、胃、小肠、腋窝淋巴结和睾丸/子宫)立即固定于10％福尔马林溶液中，室温固定24小时以上。对固定好的组织器官进行石蜡包埋、切片并用苏木精和伊红(H&E)染色，观察。

6、血清中和效价的测定

通过病毒微量中和试验方法测定血清样品中GETV特异性中和抗体的滴度。简言之，血清样品经56℃热灭活后，在96孔板中进行连续倍比稀释(1:4至1:512)，向每孔中加入100TCID50 GETV SC483株病毒，37℃孵育1小时后，将1×104个BHK-21细胞添加到每个孔中37℃继续培养3-4天，在光学显微镜下判定血清样品的中和滴度。

7、实时荧光定量RT-PCR检测

RNA提取：采用Simply Ptotal RNAextraction kit试剂盒进行病毒RNA的提取，具体操作参照试剂盒说明书进行。以Oligo(dT)15为引物，使用PrimeScript^TMReverseTranscriptase反转录酶进行反转录合成cDNA。反转录条件为25℃10min，42℃60min，4℃。

qPCR检测：以pUC-nsP1质粒为标准品，将109copies/μL的pUC-nsP1质粒以10倍梯度连续稀释制备标准曲线。用GETV特异性引物nsP1-U(AGGTGTCAGGACGGCGTATT)、nsP1-L(ATCTGCCCAGTTGGTCGAGT)对样品cDNA进行定量检测，每个样品3个重复。反应体系使用TBPremix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒，具体操作参照试剂盒说明书进行。

实验结果：

1、嵌合病毒rSC483-IRES在AG129小鼠体内高度减毒

为了分析嵌合病毒rSC483-IRES的致病性，将10³、10⁴、10⁵、10⁶和10⁷TCID₅₀的rSC483-IRES嵌合病毒经腹腔途径分别接种4-6周龄的AG129小鼠。阳性对照组以相同途径接种10TCID₅₀的野生型病毒SC483-WT，阴性对照组接种PBS。所有接种SC483-WT的小鼠在感染后3天全部死亡(图5A)，且体重明显减轻(图5B)。然而，所有接种rSC483-IRES的小鼠全部存活(图5A)，且无任何临床表现，并且在14天的观察期内体重逐渐增加，与接种PBS组无异(图5B)。这些结果表明，嵌合病毒rSC483-IRES的毒力较野生型病毒SC483-WT毒力下降至少10⁶倍。组织病理学观察显示，与PBS对照组的小鼠相比，SC483-WT感染的小鼠大脑可见胶质细胞灶状浸润，为嗜神经现象，神经元细胞变性，脾脏白髓萎缩、淋巴细胞大量坏死减少并伴有纤维素样渗出以及含铁血黄素沉积，胸腺皮质萎缩，淋巴细胞大量坏死减少，而在rSC483-IRES高剂量感染组(10⁷TCID₅₀)的小鼠中仅观察到脾脏白髓淋巴细胞轻度减少(图5C)。

为进一步证实rSC483-IRES的致病性，分别用10TCID₅₀的SC483-WT病毒和10⁶TCID₅₀的rSC483-IRES嵌合病毒经腹腔途径接种4-6周龄的AG129小鼠，对病毒的组织分布及病毒滴度进行检测。结果如图5D所示，SC483-WT感染的小鼠在所有测定组织中都具有高病毒载量。与之相比，rSC483-IRES接种鼠在接种后1天，脾脏中具有较高的病毒载量，胸腺中病毒载量较低；第2天，脾脏、胸腺和腋窝淋巴结的病毒载量均有所增加；1只小鼠的后肢肌肉中也检测到低水平的病毒存在。第3天脾脏、胸腺和腋窝淋巴结中的病毒载量显著较低。在第4天以后所有组织样品中均检测不到rSC483-IRES感染性病毒粒子。这些试验数据表明，高剂量rSC483-IRES接种AG129小鼠，嵌合病毒仅在小鼠体内呈一过性感染状态，同时也证明rSC483-IRES是高度减毒株。

2、rSC483-IRES在AG129小鼠体内可诱导高水平中和抗体并提供完全保护

为了评估rSC483-IRES作为减毒活疫苗候选毒株诱导的免疫效果，4-6周龄AG129小鼠经腹腔接种10³TCID₅₀的rSC483-IRES嵌合病毒，对照组以相同途径注射等体积PBS。血清中和抗体检测结果显示，免疫组在第7天即产生了针对GETV的中和抗体，在14天中和抗体水平达到高峰，21天中和抗体依然在高峰附近(图6A)。在免疫后第21天，用100倍致死剂量的野生型病毒经腹腔途径进行攻毒。结果发现，PBS接种组的所有小鼠均产生高水平的病毒血症，且在攻毒后3天内全部死亡(图6B)。然而，所有接种rSC483-IRES的小鼠均健康存活(图6B)，并在血清中没有检测到感染性SC483-WT病毒(图6C)，但小鼠体内中和抗体水平显著升高(图6A)。以上试验结果表明，rSC483-IRES可诱导鼠体产生高水平中和抗体反应，并对野生型病毒攻击可提供100％保护。

3、嵌合病毒rSC483-IRES在猪体内减毒

为了评估rSC483-IRES嵌合病毒在自然宿主体内的毒力，2头仔猪经颈部肌肉接种10⁸TCID₅₀ SC483-WT病毒，3头仔猪经颈部肌肉接种相同剂量的rSC483-IRES病毒。结果如表1所示，接种SC483-WT病毒的猪(编号16和17)表现高热及典型的关节炎症状，并且接种后1-3天都出现病毒血症，其中16号猪鼻拭子中检测到低拷贝水平的病毒RNA。与之相比，rSC483-IRES接种猪(编号18、19和20)在7天内均无任何的临床症状，在血清和口腔/鼻拭子中也没有检测到病毒RNA存在。这些数据表明，rSC483-IRES嵌合病毒在自然宿主猪体内也表现高度减毒，接种猪不产生病毒血症和排毒。

表1嵌合病毒SC483-IRES接种猪的临床表现

4、嵌合病毒rSC483-IRES在猪体内可诱导高水平中和抗体并提供完全保护

为了进一步评估rSC483-IRES嵌合病毒的免疫保护效果，10⁸TCID₅₀ rSC483-IRES病毒经颈部肌肉途径接种猪，接种猪均产生高水平的GETV特异性中和抗体(表1)。在接种后第21天使用10⁸TCID₅₀ SC483-WT强毒株经颈部肌肉注射方式进行攻毒。PBS接种对照猪(编号34和35)在攻毒后表现发热、病毒血症、并出现关节炎症状(表2)。与之相比，所有rSC483-IRES接种猪(编号31、32和33)均无任何临床症状，也无病毒血症及排毒现象(表2)。以上试验结果表明，嵌合病毒rSC483-IRES接种猪可诱导高水平中和抗体并对GETV强毒感染提供完全保护。

表2接种SC483-IRES对GETV感染提供免疫保护

Claims (10)

1.一种重组甲病毒属病毒，所述重组病毒是在甲病毒的基因组中通过突变失活其亚基因组启动子并引入微RNA病毒IRES翻译起始元件获得重组甲病毒属病毒。

2.如权利要求1所述的重组甲病毒属病毒，其特征在于，所述的甲病毒属病毒选自基孔肯雅病毒、阿尼昂尼昂病毒、马亚罗病毒、罗斯河病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒、特罗卡拉病毒、盖塔病毒中的一种或多种。

3.如权利要求2所述的重组甲病毒属病毒，其特征在于，所述的甲病毒属的重组病毒选自盖塔病毒。

4.如权利要求1所述的重组甲病毒属病毒，其特征在于，所述的微RNA病毒选自口蹄疫病毒。

5.如权利要求1所述的重组甲病毒属病毒，其特征在于，所述的IRES元件选自I型IRES元件、II型IRES元件、III型IRES元件、IV型IRES元件、V型IRES元件中的一种或多种。

6.如权利要求5所述的重组甲病毒属病毒，其特征在于，所述的IRES元件选自II型IRES元件。

7.如权利要求1所述的重组甲病毒属病毒，其特征在于，所述的启动子为甲病毒的亚基因组启动子。

8.一种包含如权利要求1-7任一项所述的重组甲病毒属病毒的组合物，所述的重组甲病毒属病毒是在甲病毒的基因组中通过突变失活其亚基因组启动子并引入微RNA病毒IRES翻译起始元件获得重组甲病毒属病毒。

9.一种如权利要求1-7任一项所述的重组甲病毒属病毒在制备疫苗中的用途。

10.一种如权利要求1-7任一项所述的重组甲病毒属病毒株的构建方法，所述方法包括如下步骤：

S1.构建甲病毒属病毒的全长cDNA感染性克隆；

S2.在甲病毒全长cDNA感染性克隆中通过突变方法失活甲病毒亚基因组启动子并引入微RNA病毒IRES翻译起始元件，构建重组质粒；

S3.将构建的重组质粒转染至宿主细胞，获得重组甲病毒属病毒株。