CN102834507B - 用于生成空小rna病毒壳体的构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种在宿主细胞中表达时能够生成空病毒壳体的构建体，该构建体包含：(i)编码壳体前体蛋白的核苷酸序列；(ii)编码能够切割所述壳体前体蛋白的蛋白酶的核苷酸序列；和(iii)控制元件，其控制所述蛋白酶的表达，使得在所述宿主细胞中存在所述构建体时，所述控制元件引起所述蛋白酶以如下的水平表达，该水平足以切割所述壳体前体蛋白，但是不足以在宿主细胞中诱导显著的毒性。本发明还提供了包含此类构建体的载体和宿主细胞及其生成空病毒壳体的用途。

Description

用于生成空小RNA病毒壳体的构建体
发明领域
本发明涉及一种在宿主细胞中表达时能够生成空病毒壳体，特别地空口蹄疫病毒(FMDV)壳体的构建体。本发明还涉及包含此类构建体的载体和宿主细胞。
发明背景
口蹄疫(FMD)
FMD是一种高度传染性的且经济上毁灭性的偶蹄动物(偶蹄目(Artiodactyla))疾病，影响着驯养的反刍动物、猪和大量野生动物物种。
FMD遍及全世界广泛分布。发达地区诸如中北美洲和南极洲和诸如澳大利亚和新西兰等国家摆脱了该疾病，而FMD在许多发展中国家诸如撒哈拉沙漠以南的非洲、中东、南亚、东南亚和南美洲国家是地方性的。世界上还有一些通常摆脱了疾病的一些地区，诸如在1989年根除FMD且自1991年起已经停止疫苗接种的欧洲。然而，存在着偶尔的疾病侵入诸如由于泛亚洲(PanAsian)O毒株所致的2001年UK/EIRE/法国/荷兰流行病(Knowles等.,(2001)Veterinary Record.148.258-259)和2007年血清型O1 BFS/1967的UK爆发。
FMD的致病原(causal agent)是口蹄疫病毒(FMDV)，即小RNA病毒科(Picornaviridae)的一种正义、单链RNA病毒。FMDV以7种抗原性独特的血清型存在，即A、O、C、亚洲1和南非领土(South African Territories,SAT)1、2和3，在每种血清型内具有许多亚型。
单链RNA的翻译产生多蛋白(polyprotein)，随后其被病毒编码的蛋白酶加工以生成病毒装配和复制需要的结构和非结构蛋白。前导(L)蛋白酶在其C端自P1-2A壳体前体顺式或反式切割自身。2A蛋白酶在其C端切割自身以自P2释放P1-2A。通过3C蛋白酶实现对P1-2A的加工以生成壳体蛋白1AB (又称为VP0)、1C(VP3)和1D(VP1)。在病毒体中，发生对1AB的切割以生成1A(VP4)和1B(VP2)。
FMDV疫苗
针对FMD的常规疫苗由已经通常通过使用氮杂环丙烷诸如二乙烯亚胺(BEI)化学灭活的全病毒病毒体组成。
灭活的全病毒疫苗在控制和根除FMD的活动(campaign)中发挥关键的作用。然而，自病毒组织培养物生成的疫苗与疫苗生产期间的病毒释放风险有关。还有病毒的不正确灭活的风险，这具有导致疫苗相关FMD爆发的潜在可能性。
为了降低这些风险，已经考虑了使用FMDV的空壳体样颗粒的可能性。此类颗粒包含FMDV的结构蛋白，但是是非复制性的且非感染性的，因为它们没有RNA基因组。因为空壳体的外部结构应当与野生型病毒相同，所以空壳体应当是类似抗原性和免疫原性的。
已经进行过数次尝试来生成空FMD壳体颗粒，但是存在着与产物的产率和稳定性有关的重复出现的问题。
已经使用痘苗病毒表达系统来表达P1-2A-3C盒(Abrahams等(1995)J.Gen Virol.76:3089-3098)。发现了该盒的组成性表达是不成功的，但是可以在将盒置于噬菌体T7启动子控制下时分离出vv/FMDV重组体。然而，此类系统不能用于空壳体的延长表达，因为在一段时间后，P1-2A-3C盒的毒性会占优势。还有如下的问题，即会需要恒定的T7Pol表达来驱动P1-2A-3C生成。可能有可能在组织培养中以小规模实现这点，但是不会有可能将这点外推到制造规模。此外，在痘苗系统中生成的产物对于医学或兽医应用不是商业可行的。
Li等(2008)(PLoS ONE 28:3(5)e2273)报告了FMDV病毒壳体蛋白在蚕-杆状病毒表达系统中的表达。使用表达P1-2A和3C的完整编码区的重组病毒来接种蚕，随后自垂死的蚕收集血淋巴。显示了这些“表达的抗原”的制备物引起牛中的抗FMDV抗体应答。然而，“表达的抗原”的性质完全不清楚，并且作者似乎假设它是一种“亚基疫苗”(与空壳体形成对比)。
Cao等((2009)Veterinary Microbiology 137:10-17)描述了一种重组杆状病毒系统，其自个别启动子同时表达FMDV的P12A和3C蛋白的基因。Western印迹显示了，3C蛋白酶以某种程度加工壳体蛋白，并且可以通过免疫电子显微术观察到空壳体颗粒。用空壳体的粗制提取物免疫确实产生免疫应答，但是FMDV特异性抗体和中和抗体的水平比常规的灭活疫苗低。预测这是由于空壳体颗粒水平较低。推断需要进一步的研究来改善昆虫细胞中的蛋白质表达和空壳体装配的量。
如此，需要用于生成空病毒壳体的改善的方法，所述空病毒壳体以合理的产率生成免疫原性的、稳定产物。
发明概述
令人惊讶地，本发明人已经发现了在历史上与FMDV空壳体产生有关的低产率的原因在于3C蛋白酶的水平在宿主细胞中太高，这引起毒性。为了以高产率生成空壳体颗粒，必要的是平衡3C蛋白酶的表达和/或活性，从而其表达/活性足以切割壳体蛋白前体，而不以诱导宿主细胞中的毒性的水平表达/存在活性。
如此，在第一方面，本发明提供了一种在宿主细胞中表达时能够生成空病毒壳体的构建体，该构建体包含：
(i)编码壳体前体蛋白的核苷酸序列；
(ii)编码能够切割所述壳体前体蛋白的蛋白酶的核苷酸序列；和
(iii)控制元件，其控制所述蛋白酶的表达，
使得在所述宿主细胞中存在所述构建体时，所述控制元件引起所述蛋白酶以如下的水平表达，该水平足以切割所述壳体前体蛋白，但是不足以在所述宿主细胞中诱导显著的毒性。
所述控制元件可以是可源自逆转录病毒的，特别地，控制元件可以是逆转录病毒移码位点，诸如HIV-1移码位点。HIV-1移码位点在所翻译的约5%的mRNA中引起移码。
所述移码位点可以位于所述编码壳体前体蛋白的核苷酸序列与所述编码蛋白酶的核苷酸序列间，使得在翻译所述构建体时，
(1)若核糖体不经过移码，则它生成截短产物(其包含所述壳体前体蛋白，而不包含所述蛋白酶)；但是
(2)若所述核糖体确实经过移码，则翻译所述壳体前体蛋白和所述蛋白酶两者。
在本发明的第一方面的构建体中，也可以降低蛋白酶的活性。例如，蛋白酶可以包括至少一处降低其壳体前体蛋白切割活性的突变。
所述蛋白酶(例如，突变体蛋白酶)可以具有约三分之一(3-fold lower)的野生型蛋白酶的壳体前体蛋白切割活性。
由包含依照本发明的第一方面的构建体的宿主细胞生成的空壳体可以是小RNA病毒壳体，诸如口蹄疫病毒(FMDV)壳体。
为了生成空FMDV壳体，前体蛋白可以是P1，且蛋白酶可以是3C。为了降低3C蛋白酶的活性，它可以包含例如在Cys142处的突变。
在第二方面，本发明提供了一种载体，其包含依照本发明的第一方面的构建体。载体可以例如是杆状病毒转移载体；DNA载体、质粒或病毒载体。
在第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含依照本发明的第一方面的构建体。在第一个实施方案中，宿主细胞可能能够生成依照本发明的第二方面的载体。在第二个实施方案中，宿主细胞可能能够生成空病毒壳体。
宿主细胞可以例如是昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本发明的其它方面涉及：
(i)一种用于生成空病毒壳体的方法，其通过在宿主细胞中表达依照本发明的第一方面的构建体，并收获由宿主细胞生成的空病毒壳体来进行；
(ii)一种用于生成疫苗的方法，其通过此类方法生成空病毒壳体，并在疫苗中掺入空病毒壳体来进行；
(iii)一种治疗和/或预防受试者中的疾病的方法，其通过在受试者中表达依照本发明的第一方面的构建体，使得在体内生成空壳体来进行；
(iv)依照本发明的第一方面的构建体或依照本发明的第二方面的载体，其用于预防和/或治疗疾病；
(v)依照本发明的第一方面的构建体，或依照本发明的第二方面的载体在制造供预防和/或治疗疾病用的药物中的用途；
(vi)逆转录病毒控制元件控制小RNA病毒蛋白表达的用途；和
(vii)包含在逆转录病毒控制元件控制下的编码小RNA病毒蛋白的核苷酸序列的构建体。
基于“空壳体”的疫苗比传统的灭活的全病原体疫苗(例如用于FMD)有利，因为其不需要高安全密封制造房，如此减轻病毒“逃逸”的任何风险。它们还是非感染性的、容易操作的并且(考虑到本发明)制备容易且便宜。
附图简述
图1：表达载体pOPINE5949-FS。载体是商业载体pTriEx1.1(EMDSciences)的衍生物，但是已经适应于无缝克隆。显示了该载体的显著特征和诊断用限制性位点的部位。成功表达FMDV空壳体必需的关键步骤是在独特的NotI和Bsu36I限制性位点间的3C编码区前面引入编码HIV-1移码位点的序列。因此，源自p10或CMV启动子的所有mRNA翻译P1前体蛋白，但是仅某个亚组翻译3C蛋白酶。在用于形成重组杆状病毒时，顺时针方向在ORF603与ORF1629间的序列与病毒基因组重组。然后，P10启动子作为杆状病毒感染周期的一部分激活，在受感染细胞中生成重组产物。
图2：编码P1-2A-3B3-3C(右道)或P1-2A-3B3-3C163S(左道)的重组杆状病毒间的表达水平比较。对3C活性的灭活挽救P1的丰富合成。
图3：用于在P1-3C接合处引起移码的序列。关键特征是发生滑动的一系列尿嘧啶(加下划线)，其后面有假结，其引起核糖体暂停，因此促进滑动。
图4：将HIV-1移码序列导入FMDV序列中。P1阅读框是两个中的上方一个，并且插入导致翻译产物在以红色标记的终止密码子处的截短。在插入序列(橙色盒)开始处的-1移码导致将阅读框校正为包括3C翻译(下方的框)。
图5：在残基142处突变的3C蛋白酶的体外活性测量。注意在与亲本序列比较时，142T和142S两者都具有降低的活性。
图6：小RNA病毒系统发生。紧密相关的家族共享共同的编码策略和复制周期；已经对充分研究的病毒诸如脊髓灰质炎病毒(PV)和口蹄疫病毒(FMDV)观察到的事情已经适用于其它成员。
完整的系统发生和讨论可以参见：Hughes AL.(2004)Phylogeny of thePicornaviridae and differential evolutionary divergence of picornavirus proteins.Infect Genet Evol.4:143-52。
图7：图1中的表达盒及其可能的翻译产物的线性图谱。提示的P1和P1-2A-3B-FS-3C产物相对翻译水平自文献取得，并且尚未凭经验确定。
图8：3C蛋白酶的毒性。用重组杆状病毒感染的昆虫细胞，所述重组杆状病毒表达偶联的FMDV P1和3C。在A中，第1道是在残基163处的活性位点Cys中的突变体，并且自发降解成P1的P1-3C融合蛋白的丰富合成是明显的。第2道是野生型蛋白酶；成熟壳体蛋白VP1的P1的非常少的合成是明显的。在B中，比较表达P1(第1道)和与减弱的3C偶联的P1(第2道)的重组病毒。现在高水平合成得到维持，并且将P1前体以化学计量方式转化成成熟的壳体蛋白VP1。通过10%SDS-PAGE解析细胞裂解物，并且用多价FMDV抗血清(其中大部分反应性针对VP1)探查Western印迹。还存在摩尔量的VP0和VP3，但是没有被此血清揭示。
图9：空FMDV壳体的装配。对来自已经实现了3C蛋白酶活性修饰的经重组杆状病毒感染的昆虫细胞的表达产物的蔗糖梯度分析。一些未加工的P1前体(可能是聚集的)存在于梯度底部，而VP1可切割产物在35-45%蔗糖级分中形成强烈的宽峰。
梯度中的位置是对装配颗粒，而非可溶性抗原预期的。
图10：通过杆状病毒表达生成的空FMDV A血清型壳体的显现。将来自蔗糖梯度的峰级分合并，并浓缩，之后吸附到经碳包被的Formvar网格，并用乙酸双氧铀负染色。看到许多具有25nm直径的颗粒(加箭头的两个)。注意颗粒内部的染料显示它们是空的。
显示与二十面体结构一致的特别好的角限定的颗粒加红色箭头。
图11：通过杆状病毒表达生成的空FMDV O血清型壳体的显现。
图12：表明豚鼠中响应用合成的壳体免疫的特异性抗体诱导的图。使用(A)病毒中和测试，和(B)液相阻断ELISA来测量抗体效价。用合成的A血清型壳体免疫豚鼠导致诱导与在先前的研究中表明为保护性的水平一致的抗体效价。
发明详述
构建体
在本发明的第一方面，本发明提供了构建体，其包含：
(i)编码壳体前体蛋白的核苷酸序列；
(ii)编码能够切割壳体前体蛋白的蛋白酶的核苷酸序列；和
(iii)控制蛋白酶表达的控制元件。
术语“核苷酸序列”包括RNA或DNA序列。它可以是单链或双链。例如，它可以是基因组的、重组的、mRNA或cDNA。
构建体可以是可能以连续方式包含核苷酸序列(i)和(ii)的核苷酸序列。核苷酸序列(i)和(ii)间可以存在着某个序列部分。控制元件可以存在于所述序列部分中，使得它控制蛋白酶的表达，但不控制或影响壳体前体蛋白的表达。
构建体可以作为质粒、转移载体或宿主细胞基因组的一部分存在(见下文)。
控制元件
本发明的第一方面的构建体包含控制蛋白酶表达的控制元件。控制元件可以例如至少部分控制蛋白酶的转录和/或翻译。
具体地，控制元件引起蛋白酶以如下的水平表达，所述水平足以切割壳体前体蛋白，但是不足以在宿主细胞中诱导显著的毒性。
可以使用本领域中已知的技术来分析对壳体前体蛋白的切割。例如，可以通过凝胶电泳来分离来自宿主细胞的重组蛋白提取物，并将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上以进行Western印迹。用抗病毒抗体的Western印迹应当揭示蛋白酶介导的切割的程度和范围。
例如，对于FMDV，未加工的壳体前体蛋白(P1-P2A)会以81kDa的条带出现，而切割可生成VP31(47kDa)、VP3(24kDa)和/或VP1(24kDa)。
对壳体前体蛋白的切割也可以通过空壳体的生成来推断(见下文)。
也可以使用本领域中已知的技术来分析由蛋白酶诱导的在宿主细胞中的细胞毒性程度。例如，可以使用锥虫蓝排除，例如通过混合等体积的0.4%锥虫蓝与细胞，并限定存活力水平来进行，如通过Countess自动化细胞计数器(Invitrogen)测量的。
若蛋白酶使小于10%、小于5%或小于2%的宿主细胞不能存活，则不认为毒性水平是“显著的”。若宿主细胞能够以在没有3C蛋白共表达情况中会实现的水平(忽略蛋白酶对壳体前体蛋白的切割效果)的80、90或95%表达壳体前体蛋白，则不认为毒性水平是“显著的”。
与若缺乏控制元件会导致的表达水平相比，控制元件可以降低3C蛋白酶的表达。
控制元件可以是移码位点，其引起翻译中的核糖体在阅读mRNA时在一定百分比的情况中(in a percentage of cases)跳过(或重复)至少一个碱基。在移码期间，可以诱导翻译中的核糖体在转录物中的独特点处向前或向后滑动一个核苷酸，然后，分别在+1或-1阅读框中继续蛋白质合成。
编程的-1核糖体移码信号是充分表征的，而且还已经报告了一些细菌-1移码事件。许多感染真核细胞的病毒利用编程的-1核糖体移码，表明牵涉移码过程的顺式元件在真核生物中是起作用的。在病毒系统中，移码的效率是合成的病毒蛋白产物的化学计量的一项至关重要的决定因素，其必须得到严格维持以有效增殖病毒。
人免疫缺陷病毒(HIV)-1使用核糖体移码来生成需要的Gag和Gag-Pol多蛋白比率。认为移码信号的茎-环结构阻碍核糖体，并且引起5’方向的滑动，这引起-1移码，然后在新框中继续翻译(见图3)。
控制元件可以在翻译的1-20%、1-10%、3-7%或约5%的mRNA中引起移码。
移码序列可以包含发生滑动的一系列约6个尿嘧啶，其后面有能够形成假结的序列，所述假结引起核糖体暂停，促进滑动。
控制元件可以在蛋白酶编码核苷酸序列的上游并在壳体前体蛋白编码序列下游。
空壳体
“空壳体”是包含病毒的蛋白质壳，但是缺乏RNA或DNA基因组的实体。空壳体应当以与野生型疫苗相同的方式是抗原性和免疫原性的，因为它保留相同的结构性表位，但是它由于缺乏基因组而应当不产生感染。
可以使用本领域中已知的技术诸如蔗糖密度离心或电子显微术(Abrahams等(1995)如上文)来调查或证实空壳体的生成。
可以使用对野生型病毒上的构象性表位特异性的单克隆抗体以调查空壳体的抗原性是否得到保留。
蛋白酶
蛋白酶可以是任何病毒蛋白酶，其切割壳体前体蛋白作为壳体的生成和装配的步骤。
如上文所提及的，对于小RNA病毒，诸如FMDV，将前体P1蛋白水解加工成VP0(VP2加上VP4)、VP3和VP1依靠病毒蛋白酶3C或其前体3CD发生。
下文给出了来自FMDV甲型毒株的FMDV野生型3C蛋白酶的序列：
1 sgapptdlqk mvmgntkpve lildgktvai ccatgvfgta ylvprhlfae kydkimldgr
61 tmtdsdyrvf efeikvkgqd mlsdaalmvl hrgnrvrdit khfrdvarmk kgtpvvgvin
121 nadvgrlifs gealtykdiv vcmdgdtmpg lfaykaatka gycggavlak dgaetfivgt
181 hsaggngvgy cscvsrsmlf kmkahidpep hhe
已经阐明了3C蛋白酶的晶体结构，并且实施突变分析以提供关于活性位点的信息(Sweeney等(2007)J.Virol.81:115-124)。
本发明的第一方面的构建体可以包含至少一处降低其壳体前体蛋白切割活性的突变。
突变可以例如在蛋白酶的活性位点中。认为活性位点中存在着由残基163、46和84组成的催化三联体。突变可以牵涉这些残基中一个或多个的缺失或取代。突变应当降低但不消除壳体前体蛋白切割活性。
3C蛋白酶的晶体结构揭示了存在着在肽结合裂缝上折叠并且促成底物识别的β-带(β-ribbon)(Sweeney等(2007)如上文)。突变可以例如在β带(残基138至150)中。突变可以例如是残基142处的取代。突变可以是C142V、C142A或C142T突变。突变可以是C142T突变。
突变可以将酶的特异性常数降低为三分之一至二分之一，或三分之一至三分之二(reduce by between 3-fold and 1.5 fold)。例如，若野生型酶的特异性常数是990kcat/Km，则突变体酶的特异性常数可以是495-330，或660-330kcat/Km。
突变体蛋白酶可以具有野生型蛋白酶的壳体前体蛋白切割活性的10-50%、20-40%或约30%。
壳体前体蛋白
壳体前体蛋白可以(对于小RNA病毒)是P1，其被3C蛋白酶切割成VP0、VP3和VP1。
或者，壳体前体蛋白可以是P1-2A。2A蛋白酶在其C端切割自身以自P2释放P1-2A。
壳体前体蛋白可以被蛋白酶切割以形成空壳体(一部分)。前体蛋白可以包含形成空壳体必需的所有类型的蛋白质，其可通过蛋白酶切割生成。
载体
在第二方面，本发明提供了一种包含依照本发明的第一方面的构建体的载体。
载体可以例如是质粒、或杆状病毒转移载体、DNA载体或病毒载体。
载体可能能够将构建体转移至宿主细胞。
载体可能能够将构建体转移至植物、昆虫、或动物细胞。
杆状病毒表达系统广泛用于生成病毒和病毒样颗粒。
本发明的载体可以是例如一种或多种用于转化增殖杆状病毒穿梭载体的细胞(例如，大肠杆菌细胞)的转移质粒。
本发明的第一方面的构建体可以是或包含通过自转移载体至杆状病毒穿梭载体(杆粒)中的DNA位点特异性转座而生成的重组杆状病毒DNA。可以将此DNA转染入昆虫细胞中以生成重组杆状病毒。
本发明的载体可以是所得的重组杆状病毒。
其它病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)。
在基因疗法方法中通常使用逆转录病毒。重组逆转录病毒诸如Moloney鼠白血病病毒具有以合适的方式整合入宿主基因组中的能力。它们含有逆转录酶，其允许整合入宿主基因组。已经在许多FDA批准的临床试验诸如SCID-X1试验中使用了逆转录病毒载体。
使用逆转录病毒诸如Moloney逆转录病毒的主要缺点牵涉需要细胞活跃分裂以进行转导。因此，细胞诸如神经元对通过逆转录病毒的感染和转染非常有抗性。
慢病毒是一种逆转录病毒亚类。最近，由于其整合入不分裂细胞基因组中的能力，它们已经被调适为基因投递媒介物(载体)。RNA形式的病毒基因组在病毒进入细胞时被逆转录以生成DNA，然后，所述DNA通过病毒整合酶酶在随机位置处插入基因组中。载体(现在称作前病毒)仍然在基因组中，并且在细胞分裂时传到其后代上。
出于安全性原因，慢病毒载体从未携带其复制需要的基因。为了生成慢病毒，将数种质粒转染入所谓的包装细胞系(通常为HEK 293)中。一种或多种质粒(一般称为包装质粒)编码病毒体蛋白质，诸如壳体和逆转录酶。另一种质粒含有要通过载体投递的遗传物质。此质粒被转录以生成单链RNA病毒基因组，并且以存在ψ(普西,psi)序列标记。使用此序列来将基因组包装入病毒体中。
与慢病毒形成对比，腺病毒DNA不整合入基因组中，并且不在细胞分裂期间复制。其主要应用在基因疗法和疫苗接种中。因为人通常与腺病毒(其引起呼吸系统、胃肠道和眼部感染)接触，所以它们触发快速的免疫应答及潜在的危险后果。为了克服此问题，科学家们目前正调查人对其没有免疫力的腺病毒。
腺伴随病毒(AAV)是一种感染人和一些其它灵长类物种的小病毒。目前已知AAV不引起疾病，因此该病毒引起非常轻微的免疫应答。AAV可以感染分裂和不分裂细胞两者，并且可以将其基因组掺入宿主细胞的基因组中。这些特征使AAV成为一种用于创建供基因疗法用的病毒载体的非常有吸引力的候选物。
宿主细胞
本发明还提供了一种包含本发明的第一方面的构建体的宿主细胞。
宿主细胞可能能够生成依照本发明的第二方面的载体(诸如病毒载体)。
宿主细胞可以是包装细胞或生产者细胞，其能够生成病毒载体。
宿主细胞可以是Sf9昆虫细胞，其能够生成依照本发明的第二方面的重组杆状病毒。
宿主细胞可能能够生成空病毒壳体。
宿主细胞可以是细菌、昆虫、植物或动物细胞。
生成方法
本发明还提供了一种用于生成空病毒壳体的方法，其包括下列步骤：
(i)在宿主细胞中表达依照本发明的第一方面的构建体；并
(ii)收获由宿主细胞生成的空病毒壳体。
可以例如通过用本发明的第二方面的载体转染或转导来将本发明的构建体导入宿主细胞中。
若在宿主细胞外部表达空病毒壳体，则它们可以自上清液收获。
若在宿主细胞内部表达空病毒壳体，则它们可以例如如下收获，
(i)裂解宿主细胞(例如通过冷冻-融化)；及任选地
(ii)浓缩(例如通过PEG-沉淀)，和/或
(iii)纯化。
本发明还提供了一种用于生产疫苗的方法，其包括通过所述方法生成空病毒壳体，并在疫苗中掺入该空病毒壳体的步骤。
疫苗还可以包含药学可接受稀释剂、佐剂或赋形剂。
病毒
本发明涉及特定病毒的空壳体的生成。
病毒可以是例如小RNA病毒。
表1中给出了小RNA病毒属、种和血清型的例子：
表1
还存在着植物小RNA病毒，其已经分类成超家族伴生豇豆病毒科(Secoviridae)，其含有科豇豆花叶病毒科(Comoviridae)(豇豆花叶病毒属(Comovirus)、蚕豆萎蔫病毒属(Fabavirus)和线虫传多角体病毒属(Nepovirus))、欧防风黄点病毒科(Sequiviridae)(欧防风黄点病毒属(Sequivirus)和水稻矮化病毒属(Waikavirus))和许多未指定的属(樱桃锉叶病毒属(Cheravirus)、温州蜜柑矮缩病毒属(Sadwavirus)和灼烧病毒(Torradovirus)(模式种番茄灼烧病毒(Tomato torrado virus)))。
病毒可以是蜜蜂病毒，诸如以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysisvirus)；克什米尔蜜蜂病毒(Kashmir bee virus)；Kakugo病毒；瓦螨病毒(VarroaDestructor Virus)；囊雏病病毒(Sacbrood Virus)；残翅病毒(Deformed WingVirus)。已经将所有此类病毒与蜜蜂集群的损失联系起来，因此需要诊断测试来测定集群损失的原因。
病毒可以是动物病原体，诸如FMDV或猪水泡病病毒。病毒可以是人病原体，诸如肠道病毒71(其引起腹泻的爆发)；柯萨奇病毒B病毒(其引起糖尿病和心肌炎)、或脊髓灰质炎病毒。
(以其天然状态)充当人或动物病原体的病毒的空壳体的生成对于疫苗和治疗性组合物的生成是重要的。
疫苗
如本文中所使用的，术语“疫苗”指在对受试者施用时诱导或刺激保护性免疫应答的制剂。疫苗可以使生物体对特定疾病免疫。
可以治疗性使用疫苗，以治疗现有的感染；或预防性使用，以阻断或降低感染的可能性和/或预防或降低染上疾病的可能性。
疫苗包含一种或多种接种实体(vaccinating entity)和任选地一种或多种佐剂、赋形剂、载体和稀释剂。
疫苗还可以包含或能够表达另一种活性剂，例如可以在接种实体诱导的适应性免疫应答前刺激早期保护的活性剂。药剂可以是抗病毒剂，诸如I型干扰素。或者/另外，药剂可以是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
接种实体可以例如通过本发明的第一方面的构建体、本发明的第二方面的载体或由本发明的第三方面的宿主细胞生成的空壳体得到。
DNA疫苗接种比基于蛋白质的疫苗具有一些优点。例如，DNA疫苗导致抗原在体内的内源表达，允许抗原性肽经由MHC I和II类两种途径呈递给免疫系统，由此不仅引发CD4+T细胞，还引发CD8+T细胞。如此，DNA疫苗能够诱导体液免疫应答和强烈的细胞免疫应答两者。使用质粒DNA作为疫苗还可以经由细菌质粒骨架中的未甲基化CpG基序和Toll样受体9(TLR9)触发宿主的先天性免疫系统。
疫苗可能缺乏非结构蛋白编码基因2B和2C，其可以通过下调MHC和细胞因子分泌来干扰细胞免疫应答(Moffat等,(2005)J Virol.79.4382-95及Moffat等,(2007)J Virol.81.1129-39)。
许多商品化的FMD疫苗是多价的，以提供针对不同FMD血清型的覆盖。同样，本发明的疫苗可以包含多种接种实体，每种接种实体针对不同血清型和/或给定血清型内的不同亚型。
治疗/预防疾病
本发明还提供了一种治疗和/或预防受试者中的疾病的方法，其通过施用有效量的此类疫苗来进行。
术语“预防”意图指预防、延迟、阻碍或妨碍疾病的传染(contraction)。疫苗可以例如预防或降低感染性病毒进入细胞的可能性。
如本文中所使用的，“治疗/处理”指照顾患病的受试者，以改善、治愈或减少疾病的症状，或者降低或停止疾病的进展。它还指使病毒感染的受试者对其它受试者不具传染性的处理。
受试者可以是对疾病易感的任何动物或植物。受试者可以是人、昆虫(诸如蜜蜂)、植物、哺乳动物或其它动物。
对于FMD，受试者可以是偶蹄动物。FMD易感性动物包括农业资产中的牛、绵羊、猪和山羊，及骆驼科动物(camelids)(骆驼、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、原驼(guanaco)和小羊驼 一些野生动物诸如刺猬、河狸鼠(coypu)和任何野生偶蹄动物诸如鹿和动物园动物包括象也可以染上FMD。
施用
非病毒基因投递的方法包括使用物理方法(无载体基因投递)和化学方法(基于合成载体的基因投递)。物理方法，包括针注射、电穿孔、基因枪、超声、和流体动力学投递，采用物理力，其透过细胞膜并促进胞内基因转移。化学方法使用合成的或天然存在的化合物作为载体来将核苷酸序列投递入细胞中。
最合适的投递方法会取决于用于将核苷酸序列投递至靶细胞的投递系统。例如，对于质粒施用，可以肌肉内、皮内或上述的组合施用质粒制备物。
可以通过本领域中已知的方法，诸如直接注射来对受试者施用病毒载体。
小RNA病毒蛋白质的逆转录病毒控制
本发明还涉及逆转录病毒控制元件控制小RNA病毒蛋白质表达的用途及包含在逆转录病毒控制元件控制下的编码小RNA病毒蛋白质的核苷酸序列的构建体。
逆转录病毒控制元件可以是逆转录病毒移码位点，诸如可源自控制所述病毒中Gag和Gag-pol表达的HIV-1移码位点的移码位点。
小RNA病毒蛋白质可以是非结构蛋白质，诸如蛋白酶。小RNA病毒蛋白质可能能够切割壳体前体蛋白。小RNA病毒蛋白质可以是来自小RNA病毒的3C蛋白酶或其前体3CD。
本发明现在会通过实施例进一步描述，所述实施例意图用来帮助本领域普通技术人员实施本发明，而并不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：对载体中其表达在p10启动子控制下的蛋白酶3C的突变分析
杆状病毒转移载体pOPINE5949编码在强p10杆状病毒启动子控制下的通过短的间隔物区(2A-3B3)连接的FMDV壳体前体蛋白P1和在后面的FMDV3C蛋白酶(图1)。缺少FMDV基因组的大部分剩余部分。在用于生成重组杆状病毒时，理论结果是表达P1-2A-3B3-3C融合蛋白，其会自身切割以生成成熟的壳体蛋白VP1-4(由P1编码)，并装配成病毒壳体。用这样的重组杆状病毒感染的实际结果是生成非常少的产物。
这种低产物量是3C毒性的结果。这通过如下的实情例示说明，即在pOPINE5949内纳入3C的活性位点半胱氨酸(Cys 163)的单点突变允许大量P1-2A-3B3-3C融合蛋白的表达(图2)。这正式地证明3C活性是重组FMDV合成的一项控制性特征。
方法
通过标准的定点诱变来引入Cys 163突变，然后再表达(re-express)突变体盒。
Western印迹
将蛋白质样品在预制的10%Tris.HCl SDS-聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上分离，并使用半干印迹仪来转移至Immobilion-P膜(Millipore)。使用含有0.1%v/vTween-20的TBS(TBS-T)、5%w/v奶粉于室温将滤膜封闭1小时。以在PBS-T,5%w/v奶粉中1∶1000的稀释度使用针对FMDV甲型病毒的豚鼠一抗，于室温持续1小时。在用TBS-T清洗几次后，将膜与经HRP缀合的抗豚鼠抗体一起温育1小时，并通过BM化学发光(Roche)检测结合的抗体。
实施例2：降低3C蛋白酶活性和表达的构建体的生成
为了减轻这两个极端间的3C蛋白酶活性，如下组合两种方法：
1)在编码P1和3C的序列间的3B接头区中引入移码元件，其引起合成的3C量降低；和
2)3C残基Cys142的突变，如此降低3C的活性。
移码元件是引起翻译中的核糖体在阅读mRNA时在一定百分比的情况中跳过碱基的序列部分。充分描述的移码元件是对逆转录病毒HIV-1描述的移码元件，其在翻译的约5%的mRNA中引起-1移码。本发明人使用了由Dinman等(PNAS 2002年4月16日第99卷no.85331-5336(图3)限定的序列。
如此，通过3B3接头区中以使得阅读框在此位置终止的方式插入的移码序列构建了载体pOPINE5949-FS。移码序列的插入中断P1-2A-3B3-3C mRNA的连续性，使得翻译产物在3B3区中是截短的，并且不生成3C(尽管编码其的下游序列存在于信息中)。然而，核糖体在此区域中的负1移码导致由核糖体衔接的mRNA亚组进行的P1-2A-3B3-3C融合蛋白表达(图4)。若移码事件的频率在昆虫细胞中与在哺乳动物细胞中测量的频率相同，则翻译产物会是95%P1-2A和5%P1-2A-3B3-3C。如此，存在着成比例偏低的3C蛋白酶合成水平。
使用pOPINE5949-FS序列构建的重组杆状病毒显示了与低水平的3C蛋白酶生成一致的可切割样式(数据未显示)。然而，合成的总体水平仍指示一些细胞毒性，并且通过于在酶活性中具有作用的位置Cys 142处对3C序列定点诱变来进一步降低3C的活性(Sweeney等(2007-如上文))(图5)。
实施例3：经切割的VP1产物和FMDV空壳体的生成
在重组杆状病毒中组合移码和142T突变产生了期望的P1和3C水平，并且导致了大量的经切割VP1产物，其与其它切割产物装配以形成空FMDV壳体。
通过提及而将上述说明书中提及的所有出版物收入本文。本发明所描述的方法和系统的各种修饰和变型在不偏离本发明范围和精神的前提下对于本领域技术人员会是显而易见的。虽然本发明已经结合具体的优选实施方案进行了描述，但是应当理解，如要求保护的本发明不应过度地限于此类具体实施方案。实际上，对于病毒学、分子生物学或相关领域技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修饰意图在所附权利要求书的范围内。

Claims (15)

1.一种在重组杆状病毒中存在并在昆虫细胞中表达时能够生成空病毒壳体的构建体，该构建体包含：
(i)编码壳体前体蛋白P1的核苷酸序列；
(ii)编码能够切割所述壳体前体蛋白的蛋白酶3C的核苷酸序列，其中所述蛋白酶包含降低其壳体前体蛋白切割活性的位于Cys142的突变；和
(iii)控制元件，其控制所述蛋白酶的表达，
使得在所述昆虫细胞中存在所述构建体时，所述控制元件引起所述蛋白酶以足以切割所述壳体前体蛋白，但是不足以在所述昆虫细胞中诱导显著的毒性的水平表达，其中所述控制元件是逆转录病毒移码位点。
2.依照权利要求1的构建体，其中所述控制元件是HIV-1移码位点。
3.依照权利要求1的构建体，其中所述移码位点位于所述编码壳体前体蛋白的核苷酸序列和所述编码蛋白酶的核苷酸序列之间，使得在翻译所述构建体时，若核糖体不经过移码，则它生成包含所述壳体前体蛋白，而不包含所述蛋白酶的截短产物；但是若所述核糖体确实经过移码，则翻译所述壳体前体蛋白和所述蛋白酶两者。
4.依照权利要求1的构建体，其中所述控制元件在所翻译的3-7％的mRNA中引起移码。
5.依照权利要求1的构建体，其中所述突变体蛋白酶具有野生型蛋白酶的20-40％的壳体前体蛋白切割活性。
6.依照权利要求1-5中任一项的构建体，其在宿主细胞中表达时能够生成空的小RNA病毒壳体。
7.依照权利要求1的构建体，其在宿主细胞中表达时能够生成空口蹄疫病毒(FMDV)壳体。
8.包含权利要求1-7中任一项的构建体的载体。
9.依照权利要求8的载体，其是杆状病毒转移载体；DNA载体、质粒或病毒载体。
10.包含依照权利要求1-7中任一项构建体的宿主细胞。
11.依照权利要求10的宿主细胞，其能够生成依照权利要求8或9的载体。
12.依照权利要求11的宿主细胞，其能够生成空病毒壳体并是昆虫细胞。
13.一种用于生成空病毒壳体的方法，其包括下列步骤：
(i)在昆虫细胞中表达依照权利要求1至7中任一项的构建体；并
(ii)收获由所述昆虫细胞生成的空病毒壳体。
14.一种用于生成疫苗的方法，其包括通过依照权利要求13的方法生成空病毒壳体，并在疫苗中掺入所述空病毒壳体的步骤。
15.依照权利要求1至7中任一项的构建体，或依照权利要求8的载体在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途。
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