DE19712899C1 - Verfahren zur Herstellung nichtinfektiöser rekombinanter Picornavirus-Partikel - Google Patents
Verfahren zur Herstellung nichtinfektiöser rekombinanter Picornavirus-PartikelInfo
- Publication number
- DE19712899C1 DE19712899C1 DE19712899A DE19712899A DE19712899C1 DE 19712899 C1 DE19712899 C1 DE 19712899C1 DE 19712899 A DE19712899 A DE 19712899A DE 19712899 A DE19712899 A DE 19712899A DE 19712899 C1 DE19712899 C1 DE 19712899C1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- structural protein
- coexpression
- particles
- region
- hepatitis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 title claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 claims description 28
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 20
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 101710117080 P3 protein Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 3
- 102100039467 P3 protein Human genes 0.000 description 3
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000710189 Aphthovirus Species 0.000 description 2
- 241000710190 Cardiovirus Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000709715 Hepatovirus Species 0.000 description 2
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101000926206 Homo sapiens Putative glutathione hydrolase 3 proenzyme Proteins 0.000 description 1
- 125000000899 L-alpha-glutamyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241001144416 Picornavirales Species 0.000 description 1
- 102100034060 Putative glutathione hydrolase 3 proenzyme Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32411—Hepatovirus, i.e. hepatitis A virus
- C12N2770/32422—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32411—Hepatovirus, i.e. hepatitis A virus
- C12N2770/32461—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/32462—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten
Herstellung von Picornavirus-Partikeln, insbesondere
Hepatitis-A-Virus-Partikeln, deren Vorstufen sowie davon
abgeleiteter Partikel.
Nach dem Stand der Technik ist es bekannt, Picornavirusstämme
durch Anzucht in eukaryontischen Zellen herzustellen. Eine
solche Anzucht ist für bestimmte Mitglieder der Familie der
Picornaviridae, bsp. das Hepatitis-A-Virus, besonders
ineffizient. Nachteilig ist außerdem, daß die in den
eukaryontischen Zellen angezüchteten Picornaviren infektiös
sind. Sie müssen vor einer Verwendung bsp. als Todimpfstoff
chemisch inaktiviert werden. Reste der zur Inaktivierung
verwendeten Substanz, bsp. Formaldehyd, können allergische
Reaktionen auslösen und die Antigenität des Viruspartikels
verändern.
Ein bezüglich der Effizienz verbessertes Verfahren, nach dem
insbesondere leere rekombinante Hepatitis-A-Virus-Partikel
herstellbar sind, haben bsp. Stapelton, J. T. et al. 1990
beschrieben (in Hollinger, F. B. et al.: Viral hepatitis and
liver disease, 50-54). Die damit erzielten
Partikelausbeuten sind für kommerzielle Anwendungen ebenfalls
nicht ausreichend.
Nach dem Stand der Technik ist weiterhin bekannt, daß die
Polyproteinprozessierung im Falle der Gattungen der Entero-
und Rhinoviren durch 3CD, 3C und 2A, im Falle der Gattungen
der Cardio- und Aphthoviren durch die L-Proteinase sowie 3C
und im Falle der Gattung der Hepatoviren durch 3C vermittelt
wird. Eine Beteiligung weiterer Nichtstrukturproteine an der
Bildung leerer Viruspartikel ist nach dem Stand der Technik
unbekannt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
anzugeben, das die Nachteile des Stands der Technik besei
tigt. Ziel ist es insbesondere, ein Verfahren mit
verbesserter Effizienz bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.
Zweckmäßige Weiterbildungen ergeben sich aus den Merkmalen
der Ansprüche 2-18.
Nach Maßgabe der Erfindung wird zur rekombinanten Herstellung
von Picornavirus-Partikeln, deren Vorstufen sowie davon
abgeleiteter Partikel eine Koexpression eines
Strukturproteinprecursormoleküls mit der korrespondierenden
P3-Region (3ABCD) in cis oder in trans durchgeführt. - Die
Teilproteine 2B und 2C werden dabei nicht exprimiert. Das
erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß die
inhibitorischen Effekte bei der Expression der Teilproteine
2B und 2C beseitigt werden und ausschließlich die minimal
benötigten Sequenzen für eine effiziente Synthese leerer
Picornavirus-Partikel verwendet werden. Dadurch wird
einerseits die Effizienz des Verfahrens verbessert und
andererseits eine picornavirale Replikation ausgeschlossen.
Durch die Verwendung der vollständigen P3-Region wird die
Effizienz der Synthese leerer Picornavirus-Partikel oder
deren Vorläufermoleküle gegenüber der Synthese bei alleiniger
Verwendung der Proteinasen 3C bzw. 3CD deutlich gesteigert.
Zweckmäßigerweise weist das Strukturproteinprecursormolekül
P1 oder P1-2A kodierende Sequenzen auf. Das Strukturprotein
precursormolekül P1 wird insbesondere im Falle der Gattungen
der Entero- und Rhinoviren verwendet. Im Falle der Gattungen
der Cardio-, Aphtho- und Hepatoviren wird vorzugsweise das
Strukturproteinvorläufermolekül mit der für P1-2A
kodierenden Sequenz verwendet.
Eine besonders effiziente Herstellung von leeren Hepatitis-A-
Virus-Partikeln kann erzielt werden, wenn die VP1-2A-
Spaltstelle an der Aminosäureposition 273/274 durch ein
Glutamat/Serin oder ein Glutamin/Serin-Paar eingenommen wird,
wobei die Angabe der Aminosäureposition sich auf die Sequenz
des attenuierten Stammes HM175 bezieht (nach Cohen, J. I. et
al. 1987, Journal of Virology 61: 3035-3039).
Bei einer Expression in cis von Strukturprotein
precursormolekül und den P3-Proteinen erfolgt eine äquimolare
Expression beider Genombereiche. Das ermöglicht eine
effiziente Herstellung leerer Hepatitis-A-Virus-Partikel.
Eine noch effizientere Herstellung von Hepatitis-A-Virus-
Partikeln kann durch die Optimierung des molaren
Verhältnisses von Strukturproteinprecursormolekül und P3-
Proteinen durch eine Expression in trans erreicht werden. Die
Koexpression in trans kann durch Koexpression von auf
getrennten Vektoren kodierten Strukturproteinprecursormolekül
und P3-Region durchgeführt werden. Sie kann ferner mittels
eines bicistronischen Expressionsvektors oder einer
bicistronischen mRNA durchgeführt werden. Dabei befinden sich
vorteilhafterweise mindestens zwei unterschiedlich effiziente
Promotorsequenzen oder Translationsinitiationssequenzen vor
dem P3- und Strukturproteincistron. Das ermöglicht es, das
molare Verhältnis des Strukturproteinprecursormoleküls und
der korrespondierenden P3-Region optimal für eine effiziente
Synthese leerer Picornavirus-Partikel einzustellen.
Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, daß die Expression der
Proteine der P3-Region durch eine Klonierung von
Sequenzelementen der 5'-nichttranslatierten Region (= 5'-NTR)
vor die für die P3-Region kodierenden Sequenzen in cis
negativ kontrolliert wird. Die negative Kontrolle der
Expression der Proteine der P3-Region trägt bei einer
Koexpression zusammen mit dem Strukturproteinprecursormolekül
dazu bei, daß beide Komponenten in einem optimalen Verhältnis
exprimiert werden.
Zweckmäßigerweise können als negativ kontrollierende
Sequenzelemente die der internen Ribosomenbindungsstelle der
5'-NTR vorgelagerten Sequenzen verwendet werden. Insbesondere
im Falle des Hepatitis-A-Virus hat es sich als günstig
erwiesen, daß die Sequenzelemente der 5'-NTR die 24 oder 45
5'-terminalen Nukleotide der 5'-NTR des Hepatitis-A-
Virusgenoms sind oder davon abgeleitet sind.
Nach einem weiteren verfahrensmäßigen Ausgestaltungsmerkmal
wird die Koexpression in eukaryontischen oder in
prokaryontischen Zellen oder in den entsprechenden
Zellextrakten durchgeführt, wobei die kozuexprimierenden
Sequenzen 3' eines eukaryontischen oder eines
prokaryontischen Promotors kloniert werden. Dabei kann
beispielsweise das Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem
(Liljeström P., Garoff H., Bio/Technology 9, 1356-1361) oder
das Baculovirusexpressionssystem (Bishop DHL, 1990, 62-67,
Current Opinion in Biotechnology) zum Einsatz kommen.
Die Erfindung umfaßt des weiteren einen Kit bzw. eine
Zusammenstellung von Mitteln zur Durchführung des
vorbezeichneten Verfahrens. Schließlich können die
erfindungsgemäßen Picornavirus-Partikel zur Herstellung eines
Medikaments, Impfstoffs, von Galenika oder Diagnostika
verwendet werden.
Nachfolgend wird die Erfindung in der Zeichnung und anhand
von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen
Fig. 1 die Genomorganisation des Hepatitis-A-Virus,
Fig. 2 die Semliki-Forest-Virus-Expressionskonstrukte
pSFV3-HM/HM-P1-2A(E/S) und pSFV1-HM-P3,
Fig. 3 das Expressionskonstrukt pGEM2-HAV-Δ2BC und
Fig. 4a und b den Nachweis leerer rekombinant erzeugter
Hepatitis-A-Virus-Partikel.
In Fig. 1 ist die Genomorganisation des Hepatitis-A-Virus
dargestellt. Die in der 5'-nichttranslatierten Region (5'-
NTR) lokalisierte interne Ribosomenbindungsstelle (IRES)
vermittelt die Initiation der Polyproteinsynthese. Das
Polyprotein kodiert für die Struktur- (VP4-VP1) und die
Nichtstrukturproteine (2A-3D). Die Ersteren bilden die
Virushülle, die Letzteren übernehmen verschiedene Funktionen
im Lebenszyklus des Virus.
Fig. 2 zeigt pSFV3-HM/HM-P1-2A(E/S), welches für das
Strukturproteinprecursormolekül P1-2A mit einer Glu/Ser-VP1-
2A-Spaltstelle kodiert, und pSFV1-HM-P3, welches für die
vollständige P3-Region des attenuierten HAV-Stammes HM175
kodiert. Nach Transfektion in vitro transkribierter und
gecappter RNA in geeignete Wirtszellen vermitteln die P3-
Proteine die eigene proteolytische Prozessierung sowie die
proteolytische Prozessierung des Strukturproteinprecursor
moleküls P1-2A. Darüberhinaus vermitteln sie die effiziente
Bildung leerer Hepatitis-A-Virus-Partikel.
Das in Fig. 3 dargestellte T7-promovierte Expressions
konstrukt kodiert für ein HAV-Polyprotein, bei dem die 2BC-
Region fast vollständig deletiert wurde. Das Leseraster des
Teilpolyproteins wurde nicht zerstört. Nach Transfektion in
geeignete Zellen und Bereitstellung von T7-RNA-Polymerase
vermittelt der T7-Promotor die Transkription des teil
deletierten viralen Genoms. Die Reste der 2BC-Region
ermöglichen die 3C-vermittelte Polyproteinspaltung zwischen
2A und Δ2B sowie Δ2C und 3A und damit die Bereitstellung von
autentischem P1-2A und P3. Die P3-Proteine vermitteln die
weiteren proteolytischen Spaltungen der rekombinanten
Proteine und ermöglichen die effiziente Bildung leerer
Hepatitis-A-Virus-Partikel.
Fig. 4a und 4b stellen die Profile der Saccharosegradienten
der in den Fig. 2 und 3 gezeigten Konstrukte nach
Ultrazentrifugation dar. Das virale Antigen wurde mit Hilfe
des neutralisierenden monoklonalen Antikörpers K2-4F2 im
ELISA detektiert. Der Hauptanteil des K2-4F2-reaktiven
viralen Antigens wanderte in die 20%(w/w) Saccharosefraktion.
Daraus ergibt sich eine Sedimentationskonstante von etwa 90 S.
Folglich entspricht das rekombinant erzeugte Hepatitis-A-
Virus-Antigen strukturell und immunologisch leeren Hepatitis-
A-Virus-Partikeln.
Es sind folgende Parameter bei der Ultrazentrifugation
verwendet worden: Laufzeit = 75 Minuten; Umdrehungen =
48.000 rpm; Temperatur = 5°C; Rotor SW65 (Beckmann);
Gradientzusammensetzung: 5-30%(w/w) Saccharose in 10 mM Tris
pH 7,3. Der Gradient ist mittels eines HAV-infizierten
Zellextraktes geeicht worden.
Für die Klonierung von pSFV3-HM/HM-P1-2A(E/S) gemäß Fig. 2
wurden das 2,7kb-MscI-XhoI-Fragment aus pEXT7-HM/HM-P1-
2A(E/S) sowie der BamHI-linearisierte und dephosphorylierte
Vektor pSFV3 (Gibco-BRL, Bethesda, USA) verwendet. Die
Einzelstrangüberhänge wurden vor der Ligation mit Hilfe einer
Klenow-Auffüllreaktion beseitigt. Das Plasmid pSFV3-HM/HM-P1-
2A(E/S) kodiert für P1-2A des HAV-Stammes HM175 (attenuiert)
mit 5 N-terminalen Fremdaminosäuren, wobei die VP1-2A-
Spaltstelle an VP1-Aminosäureposition 273/274 ein
Glutamat/Serin-Paar (E/S) darstellt. Die
Translationsinitiation erfolgt "cap"-abhängig über ein
Startkodon, welches in einer Kozak-Konsensussequenz vorliegt
(Kozak, M. 1989. J. Cell. Biol. 108: 229-225).
Für die Klonierung von pSFV1-HM-P3 (siehe Fig. 2) wurde
zunächst pSFV1 (Gibco-BRL, Bethesda, USA) BamHI linearisiert
und mit Hilfe einer Klenow-Polymerase-Reaktion die
Einzelstrangüberhänge aufgefüllt. Mit Hilfe der Primer "sense
P3" (5'- ATG GTC CGG AGC ACC ATG GGA ATT TCA GAT GAT GAT AAT
GAT AG-3') und "antisense P3" (5'-T TTA GCT AGC TCA TGA AAG
GTC ACA AAT GAA ACA CTG GTC A-3') sowie pT7-HAV1 als Template
wurde mittels PCR der P3-Genombereich (Base 4996-7409)
amplifiziert. Das PCR-Fragment wurde anschließend Kpn2I/NheI
geschnitten und anschließend mit Hilfe von Klenow-Polymerase
die überstehenden Einzelstrangbereiche aufgefüllt. Durch
Insertion dieses Fragmentes in das dephosphorylierte pSFV1-
Vektorfragment wurde pSFV1-HM-P3 kloniert. Es kodiert für den
gesamten P3-Bereich des attenuierten HAV-Stammes HM175, wobei
ein Methioninrest als zusätzliche N-terminale Aminosäure
kodiert wird. Die Translationsinitiation wird durch eine
Kozak-Translationsinitiationssequenz vermittelt.
Die SpeI-linearisierten Plasmide pSFV3-HM/HM-P1-2A(E/S) und
pSFV1-HM-P3 dienen als Template für die in vitro
Transkription gekappter RNA (Current Protocols in Molecular
Biology, Supplement 25, John Wiley & Sons, Inc.). Gleiche
Mengen des unaufgereinigten in vitro Transkriptionsansatzes
SFV3-HM/HM-P1-2A(E/S) und SFV1-HM-P3 werden gemischt und
durch Elektroporation in jeweils 2 × 106 COS7-Zellen
transfiziert (Transfektionsparameter siehe Wilk, T. et al.
1992, Virus Genes 6: 229-246). Die Zellen werden
anschließend auf 30 cm2 Zellkulturschalen ausgesät und 48
Stunden im Zellkulturbrutschrank inkubiert. Der Nachweis der
rekombinant erzeugten leeren Viruspartikel erfolgt
beispielsweise durch Ultrazentrifugation im kontinuierlichen
5-30%(w/w) Saccharosegradienten. Hierzu werden die Fraktionen
des Saccharosegradienten mit Hilfe eines "Enzyme Linked
Immunosorbent Assay" (ELISA) auf der Basis des
neutralisierenden monoklonalen Antikörpers K2-4F2 (MacGregor,
A. W. et al. 1983, J. Clin. Microbiology 18: 1237-1243)
analysiert. Das rekombinant erzeugte Antigen besitzt eine
Sedimentationskonstante von etwa 90 S und entspricht, wie aus
Fig. 4a ersichtlich ist, strukturell und immunologisch leeren
Hepatitis-A-Virus-Partikeln.
Zunächst wird der für das HAV-Genom eines attenuierten HAV-
Stammes kodierende Sequenzbereich des Plasmids p5'P2P3-3'.18f
(Zhang, H. et al. 1995, Virology 212: 686-697) unter die
Kontrolle eines T7-Promotors gesetzt. Hierzu wird das 7,5kb-
HindIII/SphI-Fragment in kompatibel geschnittenen pGEM2
inseriert.
Aus dem so erzeugten cDNA-Konstrukt pGEM2-HAV wird daraufhin
der 2BC-Genombereich deletiert. Hierzu wird mit Hilfe der
Primer "sense VP1" (5'-GGG GTA CCC ACA ACC ATG GTT GGA GAT
GAT TCT GGA GGT-3') und "antisense Δ2B" (5'-CC GGT ACC CTC
AGT ATA AAA GAA AGA AAT TTA GGC-3') sowie pGEM2-HAV als
Template der für VP1-Δ2B-kodierende Bereich durch PCR
amplifiziert. Das so erzeugte DNA-Fragment wird KpnI-
geschnitten, mittels einer Mung-Bean-Nukleasereaktion der
Einzelstrangüberhang abgedaut und anschließend SacI
geschnitten. Dieses Fragment wird in EcoRI/SacI-geschnittenen
pGEM2-HAV, dessen EcoRI-Schnittstelle mittels Klenow-
Polymerase aufgefüllt wurde, ligiert. Das dadurch erzeugte
Konstrukt pGEM2-HAV-Δ2BC (Fig. 3) wird mittels Lipofektion in
COS7-Zellen transfiziert. Die Expression wird durch die
Infektion mit Vakzinia-T7-Virus eingeleitet. 24 Stunden nach
der Infektion wird der Zellextrakt, analog zu Beispiel 1
analysiert. Das rekombinant erzeugte Antigen besitzt eine
Sedimentationskonstante von etwa 90 S und entspricht, wie aus
Fig. 4b ersichtlich ist, strukturell und immunologisch leeren
Hepatitis-A-Virus-Partikeln.
Claims (18)
1. Verfahren zur rekombinanten Herstellung von
Picornavirus-Partikeln, deren Vorstufen sowie davon
abgeleiteter Partikel, wobei eine Koexpression eines
Strukturproteinprecursormoleküls mit der korrespondierenden
P3-Region (3ABCD) in cis oder in trans durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Strukturprotein
precursormolekül die für P1 kodierende oder eine davon
abgeleitete Sequenz aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Strukturprotein
precursormolekül die für P1-2A kodierende oder eine davon
abgeleitete Sequenz aufweist.
4. Verfahren zur Herstellung von Hepatitis-A-Viruspartikeln
nach Anspruch 3, wobei die VP1-2A-Spaltstelle an der
Aminosäureposition 273/274 durch ein Glutamat/Serin- oder ein
Glutamin/Serin-Paar eingenommen wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die
Koexpression in trans durch die Koexpression von auf
getrennten Vektoren kodierten Strukturproteinprecursormolekül
und P3-Region durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Koexpression in trans mittels eines bicistronischen
Expressionsvektors durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
sich mindestens zwei unterschiedliche Promotorsequenzen vor
dem P3- und Strukturproteincistron befinden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6, wobei
die Koexpression in trans mittels einer bicistronischen mRNA
durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
mindestens zwei unterschiedliche Translationsinitiations
sequenzen vor dem P3- und Strukturproteincistron sich
befinden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Koexpression in cis äquimolar gestaltet wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Expression der Proteine der P3-Region durch eine
Klonierung von Sequenzelementen der 5'-nichttranslatierten
Region (= 5'-NTR) vor die für die P3-Region kodierenden
Sequenzen negativ kontrolliert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei als Sequenzelemente
die der internen Ribosomenbindungsstelle (= IRES) der 5'-NTR
vorgelagerten Sequenzelemente verwendet werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Sequenzelemente
der 5'-NTR die 24, vorzugsweise höchstens die 48, terminalen
Sequenzen der 5'-NTR des Hepatitis-A-Virus-Genoms sind oder
davon abgeleitet sind.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Koexpression in eukaryontischen oder in prokaryontischen
Zellen oder in den entsprechenden Zellextrakten durchgeführt
wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die zu koexprimierenden Sequenzen 3' einer Transkriptions
initiationsstelle eines eukaryontischen Promotors,
vorzugsweise eines CMV-Promotors, oder eines prokaryontischen
Promotors, vorzugsweise eines T7-Promotors, kloniert werden.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Picornavirus-Partikel Hepatitis-A-Viruspartikeln sind.
17. Kit bzw. Zusammenstellung von Mitteln zur Durchführung
des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
18. Verwendung von Picornavirus-Partikeln nach Anspruch 1
zur Herstellung eines Medikaments, Impfstoffs, von Galenika
oder Diagnostika.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19712899A DE19712899C1 (de) | 1997-03-27 | 1997-03-27 | Verfahren zur Herstellung nichtinfektiöser rekombinanter Picornavirus-Partikel |
| US09/381,847 US6440718B1 (en) | 1997-03-27 | 1998-03-26 | Method for producing non-infectious recombinant picornavirus particles |
| EP98919073A EP0970220A1 (de) | 1997-03-27 | 1998-03-26 | Verfahren zur herstellung nichtinfektiöser rekombinanter picornavirus-partikel |
| PCT/DE1998/000879 WO1998044122A1 (de) | 1997-03-27 | 1998-03-26 | Verfahren zur herstellung nichtinfektiöser rekombinanter picornavirus-partikel |
| AU72049/98A AU7204998A (en) | 1997-03-27 | 1998-03-26 | Method for producing non-infectious recombinant picornavirus particles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19712899A DE19712899C1 (de) | 1997-03-27 | 1997-03-27 | Verfahren zur Herstellung nichtinfektiöser rekombinanter Picornavirus-Partikel |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19712899C1 true DE19712899C1 (de) | 1998-12-10 |
Family
ID=7824803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19712899A Expired - Fee Related DE19712899C1 (de) | 1997-03-27 | 1997-03-27 | Verfahren zur Herstellung nichtinfektiöser rekombinanter Picornavirus-Partikel |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6440718B1 (de) |
| EP (1) | EP0970220A1 (de) |
| AU (1) | AU7204998A (de) |
| DE (1) | DE19712899C1 (de) |
| WO (1) | WO1998044122A1 (de) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7947493B2 (en) * | 2003-07-09 | 2011-05-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Compositions and methods for regulating mRNA transcription and translation |
| ES2392445T3 (es) * | 2004-07-13 | 2012-12-10 | Gen-Probe Incorporated | Composiciones y métodos para la detección de ácido nucleico del virus de la hepatitis A |
| GB0918375D0 (en) | 2009-10-20 | 2009-12-02 | Animal Health Inst | Construct |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5294548A (en) | 1990-04-02 | 1994-03-15 | American Biogenetic Sciences, Inc | Recombianant Hepatitis a virus |
-
1997
- 1997-03-27 DE DE19712899A patent/DE19712899C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-03-26 WO PCT/DE1998/000879 patent/WO1998044122A1/de not_active Application Discontinuation
- 1998-03-26 US US09/381,847 patent/US6440718B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-26 EP EP98919073A patent/EP0970220A1/de not_active Withdrawn
- 1998-03-26 AU AU72049/98A patent/AU7204998A/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| STAPELTON, J.T. et.al.: 1990 in HOLLINGER, F.B. et.al.: Viral Hepatitis and liver disease, S. 50-54 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0970220A1 (de) | 2000-01-12 |
| WO1998044122A1 (de) | 1998-10-08 |
| US6440718B1 (en) | 2002-08-27 |
| AU7204998A (en) | 1998-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69535314T2 (de) | Modifizierte Pflanzenviren als Vektore für Heterologe Peptide | |
| DE69533130T2 (de) | VEKTOREN DER ALPHAVIRUS cDNA | |
| US6190666B1 (en) | DNA expression systems based on alphaviruses | |
| DE69535389T2 (de) | Methode zur selektion hoch-exprimierender wirtszellen | |
| US8415148B2 (en) | Expression system | |
| EP1851239B1 (de) | Replikationsdefiziente rna-viren als impfstoffe | |
| DE69838073T2 (de) | Rekombinante nodavirus-zusammensetzungen und verfahren | |
| Emerson et al. | 2B and 2C mutations are essential but mutations throughout the genome of HAV contribute to adaptation to cell culture | |
| DE23193601T1 (de) | Verfahren zur erhöhung der funktion eines aav-vektors | |
| US20230287405A1 (en) | Methods for using transcription-dependent directed evolution of aav capsids | |
| US4357421A (en) | Synthetic gene coding for influenza hemagglutinin | |
| WO2001039797A3 (en) | Artificial chromosome constructs containing nucleic acid sequences capable of directing the formation of a recombinant rna-virus | |
| US6770283B1 (en) | DNA expression systems based on alphaviruses | |
| DE19712899C1 (de) | Verfahren zur Herstellung nichtinfektiöser rekombinanter Picornavirus-Partikel | |
| DE69625356T2 (de) | cDNA KLON FÜR DEN SÜDAFRIKANISCHEN ARBOVIRUS NO.86 | |
| US20220243243A1 (en) | Expression of products from nucleic acid concatemers | |
| CN112301042B (zh) | A型塞内卡病毒全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用 | |
| Stanway et al. | Molecular cloning of the genomes of poliovirus type 3 strains by the cDNA: RNA hybrid method | |
| WO2000014263A8 (en) | Recombinant hepatitis a virus (hav), hav variants, hav-based vaccines and methods of producing them | |
| AU736586B2 (en) | An infectious clone for human parainfluenza virus type 3 | |
| CA2400667C (en) | Modified nodavirus rna for gene delivery | |
| JPH01500485A (ja) | Ａ型肝炎に対するワクチンのためのポリペプチド物質の合成をコードする組換プラスミドｄｎａ | |
| CN117568337A (zh) | 一种基于人源tRNA的自环化RNA | |
| Hofmann et al. | An Intraleader Open Reading Frame is Selected from a Hypervariable 5’Terminus during Persistent Infection by the Bovine Coronavirus | |
| CN110205339A (zh) | 一种质粒载体及其构建方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8100 | Publication of patent without earlier publication of application | ||
| D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |