CN110205339A - 一种质粒载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种质粒载体及其构建方法与应用，属于生物技术领域。本发明质粒载体为A3EGFP‑ATPaseβ gRNA质粒载体，包括gRNA scaffold元件BUg53TB、3×P3启动子和标记基因表达盒，其中gRNA scaffold元件BUg53TB的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，包含gRNA的核苷酸序列和片段BUg53TB元件均位于3×P3启动子前。本发明gRNA质粒载体A3EGFP‑ATPaseβ gRNA上携带有可视化的增强型绿色荧光蛋白，采用脂质体转染的方法，将此gRNA质粒载体A3EGFP‑ATPaseβ gRNA在High Five细胞中表达，可极其方便地观察gRNA质粒载体在细胞内的转染情况，也可以此来对其后代进行荧光追踪，降低鉴定时的工作量。

Description

一种质粒载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种质粒载体及其构建方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

CRISPR/Cas9基因定点编辑技术如今已成为基因功能与应用研究的重要手段，它可以实现在生物体内基因组特定位点人为地对遗传物质进行改造，且由此产生的基因编辑和功能改变可稳定地在后代间传递。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑主要是通过gRNA(guide RNA)识别特定的基因序列，并引导Cas9蛋白在特定靶点处识别并对DNA双链进行切割，产生DNA双链断裂(DSB)，进而激活细胞内的DSB修复机制以达到定点改造的目的。

但是在CRISPR/Cas9具体的应用中仍存在许多问题，例如有些CRISPR/Cas9质粒不携带荧光标记基因或者携带的荧光标记标签太弱，不仅无法在转染进细胞后通过观察荧光确定转染效果，也会因此影响我们对CRISPR/Cas9质粒转入细胞后的基因敲除效果判断；同时，有些载体不仅酶切位点少，而且载体过大，致使很难转化，DNA产量也低。采用RNAi方法来降低基因表达量的方法也是实验室常用方法，但其产生的沉默效果只能短暂存在，无法在后代个体内稳定存在并遗传。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，提供了一种质粒载体及其构建方法与应用，本发明质粒载体具有增强型绿色荧光标记基因，将质粒载体转染细胞后，便于在细胞水平上观察转染效果。

一种质粒载体，质粒载体为A3EGFP-ATPaseβgRNA质粒载体，包括gRNA scaffold元件BUg53TB、3×P3启动子和标记基因表达盒，其中gRNA scaffold元件BUg53TB的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，包含gRNA的核苷酸序列和片段BUg53TB元件均位于3×P3启动子前。

所述标记基因表达盒包括选择基因表达盒和报告基因表达盒。

进一步地，所述选择基因表达盒包括在大肠杆菌中使用的选择基因表达盒，选择基因表达盒为氨苄青霉素抗性基因表达盒，报告基因表达盒为绿色荧光蛋白表达盒；优选的，绿色荧光蛋白表达盒为增强型绿色荧光蛋白表达盒；

所述gRNA scaffold元件BUg53TB的第一酶切位点位于gRNA scaffold片段BUg53TB 5’端，gRNA scaffold元件BUg53TB的第二酶切位点位于gRNA scaffold片段BUg53TB 3’端，第一酶切位点和第二酶切位点均为BglⅡ，第一酶切位点或第二酶切位点来源于改造的片段BUg53TB；

所述质粒载体，还包括启动gRNA表达的U6启动子，U6启动子的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

进一步地，所述U6启动子为家蚕的U6启动子；

所述U6启动子为RNA聚合酶III依赖的启动子；

所述质粒载体的构建方法，具体步骤如下：

(1)根据FoF1-ATPaseβ基因的靶向序列，靶向序列如SEQ ID No.1所示，在基因序列中查找GN20GG序列作为靶点，靶点序列如SEQ ID No.2所示；根据PAM识别模序确定出gRNA scaffold片段的序列如SEQ ID No.4所示；

(2)使用引物设计软件设计通过重叠PCR扩增gRNA scaffold片段的引物：采用上游引物BUg53TB-BUg-F和下游引物gRNA-R扩增重叠PCR的第一部分片段gRNA scaffoldBUg，上游引物BUg53TB-BUg-F的序列如SEQ ID No.6所示，下游引物gRNA-R的序列如SEQ IDNo.9所示，扩增得到gRNA scaffold BUg片段；采用上游引物gRNA-F和下游引物BUg53TB-53TB-R重叠PCR的第二部分片段gRNA scaffold g53TB，上游引物gRNA-F的序列如SEQ IDNo.8所示，下游引物BUg53TB-53TB-R的序列如SEQ ID No.7所示，扩增得到gRNA scaffoldg53TB片段；

(3)以含有Inx3基因的质粒VK001-Inx3为模板，以BUg53TB-BUg-F与gRNA-R为特异性引物进行PCR扩增得到gRNA scaffold BUg片段并回收；

(4)以含有Inx3基因的质粒VK001-Inx3为模板，以gRNA-F与BUg53TB-53TB-R为特异性引物进行PCR扩增得到gRNA scaffold g53TB片段并回收；

(5)将步骤(3)gRNA scaffold BUg片段与步骤(4)gRNA scaffold g53TB片段融合得到gRNA scaffold片段，将gRNA scaffold片段连接到克隆载体pMD19-T上得到pMD19-ATPaseβgRNA质粒；

(6)对步骤(5)pMD19-ATPaseβgRNA质粒进行BglⅡ酶切，琼脂糖凝胶回收580bp片段，对载体A3EGFP进行BglⅡ酶切，回收7200bp载体骨架，将带有酶切位点粘性末端的ATPaseβgRNA片段连接到A3EGFP的线性化载体上，菌液PCR鉴定及测序鉴定正确后，得到质粒A3EGFP-ATPaseβgRNA。

所述gRNA scaffold片段的序列包括Bgl II识别序列、U6启动子、gRNA序列、5’+3’序列、6T序列、Bgl II识别序列，5’+3’序列如SEQ ID No.5所示。

所述gRNA scaffold g53TB片段序列包括gRNA序列、5’+3’序列、6T序列、Bgl II识别序列。

所述步骤(5)中将步骤(3)gRNA scaffold BUg片段与步骤(4)gRNA scaffoldg53TB片段融合得到gRNA scaffold片段的具体方法为：

将步骤(3)的回收产物和步骤(4)的回收产物混合作为模板，以BUg53TB-BUg-F和BUg53TB-53TB-R为引物进行PCR扩增得到gRNA scaffold片段。

所述质粒载体在昆虫细胞转染中的应用。

进一步地，所述昆虫细胞为粉纹夜蛾细胞系High Five、斜纹夜蛾细胞系Spli221或草地贪夜蛾细胞系Sf9；

本发明的有益效果：

(1)本发明gRNA质粒载体A3EGFP-ATPaseβgRNA上携带有可视化的增强型绿色荧光蛋白，采用脂质体转染的方法，将此gRNA质粒载体A3EGFP-ATPaseβgRNA在High Five细胞中表达，可极其方便地观察gRNA质粒载体在细胞内的转染情况，也可以此对其后代进行荧光追踪，大大降低了鉴定时的工作量；

(2)本发明利用重叠PCR,不仅将商业化质粒中不含gRNA的scaffold片段成功克隆出来，并在此过程中利用引物gRNA-F和gRNA-R将gRNA也融合入到此scaffold片段中，为整个克隆实验节约了时间和经费，更是为将商业化质粒改造成经济节约型质粒提供了一种思路。

附图说明

图1为gRNA scaffold片段BUg53TB的结构图；

图2为gRNA scaffold BUg(Bgl II+U6+gRNA)片段的PCR扩增；

图3为g53TB(gRNA+5’+3’+6T+Bgl II)片段的PCR扩增；

图4为gRNA scaffold片段；

图5为BUg53TB片段连接到克隆载体pMD19-T的菌液PCR；

图6为BUg53TB片段连接到表达载体A3EGFP的菌液PCR；

图7为质粒载体A3EGFP-ATPaseβgRNA转染High Five细胞72h后的荧光观察图。

具体实施方式

本发明公开了一种质粒载体及其构建方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1：一种质粒载体，质粒载体为A3EGFP-ATPaseβgRNA质粒载体，包括gRNAscaffold元件BUg53TB(见图1)、3×P3启动子和标记基因表达盒，其中gRNA scaffold元件BUg53TB的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，包含gRNA的核苷酸序列和片段BUg53TB元件均位于3×P3启动子前；

标记基因表达盒包括选择基因表达盒和报告基因表达盒。

选择基因表达盒包括在大肠杆菌中使用的选择基因表达盒，选择基因表达盒为氨苄青霉素抗性基因表达盒，报告基因表达盒为绿色荧光蛋白表达盒；

本实施例中绿色荧光蛋白表达盒为增强型绿色荧光蛋白表达盒；

如图1所示，gRNA scaffold元件BUg53TB的第一酶切位点位于gRNA scaffold片段BUg53TB 5’端，gRNA scaffold元件BUg53TB的第二酶切位点位于gRNA scaffold片段BUg53TB 3’端，第一酶切位点和第二酶切位点均为BglⅡ，第一酶切位点或第二酶切位点来源于改造的片段BUg53TB；

质粒载体，还包括启动gRNA表达的U6启动子，U6启动子的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；

U6启动子为家蚕的U6启动子，也为RNA聚合酶III依赖的启动子。

实施例2：质粒载体的构建方法，具体步骤如下：

(1)根据FoF1-ATPaseβ基因的靶向序列，靶向序列如SEQ ID No.1所示，通过网站http://crispr.mit.edu/设计FoF1-ATPaseβ的靶点序列，即在基因序列的起始密码子附近及下游中查找GN20GG序列作为靶点，其中N为任意碱基，靶点序列如SEQ ID No.2所示；根据PAM识别模序确定出gRNA scaffold片段的序列如SEQ ID No.4所示；其中gRNA scaffold片段的序列包括Bgl II识别序列、U6启动子、gRNA序列、5’+3’序列、6T序列、Bgl II识别序列，5’+3’序列如SEQ ID No.5所示；

(2)使用引物设计软件Primer Premier 5设计通过重叠PCR扩增gRNA scaffold片段的引物：采用上游引物BUg53TB-BUg-F和下游引物gRNA-R扩增重叠PCR的第一部分片段gRNA scaffold BUg，上游引物BUg53TB-BUg-F的序列如SEQ ID No.6所示，下游引物gRNA-R的序列如SEQ ID No.9所示，扩增得到gRNA scaffold BUg片段；采用上游引物gRNA-F和下游引物BUg53TB-53TB-R扩增重叠PCR的第二部分片段gRNA scaffold g53TB，上游引物gRNA-的序列如SEQ ID No.8所示，下游引物BUg53TB-53TB-R的序列如SEQ ID No.7所示，扩增得到gRNA scaffold g53TB片段；本实施例中引物市购于硕擎生物科技有限公司；

(3)gRNA scaffold BUg片段克隆(见图2)：以含有Inx3基因的质粒VK001-Inx3为模板，以BUg53TB-BUg-F与gRNA-R为特异性引物进行PCR扩增得到gRNA scaffold BUg片段并回收；其中VK001来源于购自北京唯尚立德的昆虫Cas9/gRNA构建试剂盒中的载体，含有U6启动子；图2可知，M为DNA Marker，BUg片段大小为493bp；

(4)gRNA scaffold g53TB片段克隆(见图3)：以含有Inx3基因的质粒VK001-Inx3为模板，以gRNA-F与BUg53TB-53TB-R为特异性引物进行PCR扩增得到gRNA scaffold g53TB片段并回收；其中gRNA scaffold g53TB片段序列包括gRNA序列、5’+3’序列、6T序列、BglII识别序列；图3可知，M为DNA Marker，g53TB片段大小为108bp；

(5)将步骤(3)gRNA scaffold BUg片段与步骤(4)gRNA scaffold g53TB片段融合得到gRNA scaffold片段(见图4)，具体方法为将步骤(3)的回收产物和步骤(4)的回收产物混合作为模板，以BUg53TB-BUg-F和BUg53TB-53TB-R为引物进行PCR扩增得到gRNAscaffold片段；从图4可知，M为DNA Marker，BUg53TB片段大小为580bp；将gRNA scaffold片段连接到克隆载体pMD19-T上得到pMD19-ATPaseβgRNA质粒；克隆载体pMD19-T购于Takara，货号6013；BUg53TB连接到克隆载体pMD19-T的菌液PCR见图5，从图5可知，BUg53TB片段大小用通用引物对M13(正向引物序列：

5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’；反向引物序列：

5’AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3’)进行PCR时，条带大小为736bp；

(6)A3EGFP-ATPaseβgRNA载体的构建：对步骤(5)pMD19-ATPaseβgRNA质粒进行BglⅡ酶切，琼脂糖凝胶回收580bp片段，对载体A3EGFP进行BglⅡ酶切，回收7200bp载体骨架，采用T4 DNA Ligase将带有酶切位点粘性末端的ATPaseβgRNA片段连接到A3EGFP的线性化载体上，菌液PCR鉴定及测序鉴定正确后，得到质粒A3EGFP-ATPaseβgRNA；本实施例载体A3EGFP见文献“GENETIC TRANSFORMATION MEDIATED BY piggyBac IN THE ASIAN CORNBORER,Ostrinia furnacalis(LEPIDOPTERA:CRAMBIDAE)”，T4DNA Ligase购于Takara，货号2011A；BUg53TB连接到表达载体A3EGFP的菌液PCR见图6，BUg53TB片段大小在连接到表达载体A3EGFP上时，用特异性引物BUg53TB-Bug-F、BUg53TB-53TB-R鉴定得到的条带大小为580bp，即BUg53TB成功连接到了表达载体A3EGFP上。

实施例3：质粒载体A3EGFP-ATPaseβgRNA载体转染细胞

(1)准备两组生长状态良好的High Five细胞铺在6孔板中，每孔约2×10⁵个细胞。其中，第一组不转染任何质粒作为空白对照组，第二组转染gRNA质粒A3EGFP-ATPaseβgRNA作为处理组；

(2)当6孔板中的细胞生长密度达到80％-90％时，除去旧培养基，加入新的培养基，用枪头轻轻吹打悬浮细胞，台盼蓝计数；

(3)将6孔板中计数后的细胞于27℃隔水式恒温培养箱内贴壁培养2h后，用双无培养基(无血清，无抗生素)孵育30min，然后吸出双无培养基。将转染试剂混合液逐滴加入长有细胞的表达对照组和处理组中，然后放到摇床上轻轻晃动(约21rpm/min)，使转染试剂混合液混合均匀，然后于27℃隔水式恒温培养箱中静置继续培养。4h后进行换液，即将转染试剂混合液吸出，并用2ml双无培养基将孔中残留的转染试剂混合液清洗干净后，再加入含有10％血清的培养基；在摇床上轻轻晃动至培养基均匀，然后放在27℃隔水式恒温培养箱中，以此时开始计时，培养72h以用于后续步骤细胞内绿色荧光的观察；

其中，用于6孔板中1个孔用量的转染试剂混合液的配制如下：吸取100μl的双无培养基置于1.5ml EP管中，然后加入2μg的质粒，混匀；另外将100μl的双无培养基和6μl转染试剂Cell fection II(购自驰恩)加入到另外一个1.5ml的EP管中，震荡混匀；将两个EP管中的溶液合并，混匀后室温静置45min，且在该45min的静置期内，每15min震荡几下，总共震荡三次，之后向其中加入800μl的双无培养基，形成转染试剂混合液；

观察细胞内绿色荧光

转染72h后，弃去培养基，用无血培清洗1次以除去未贴壁的死细胞，然后加入1ml10％培养基。并将六孔板放在OLYMPUS倒置荧光显微镜下观察其荧光，并用20×拍照；

根据上述操作步骤，gRNA质粒载体A3EGFP-ATPaseβgRNA转染High Five细胞72h后的荧光观察图(bar＝50μm)见图7，其中，DIC为明场，GFP为绿色荧光，Merge为前两个的叠加图，检测gRNA载体质粒A3EGFP-ATPaseβgRNA在High Five细胞中的表达情况，结果表明，gRNA载体质粒A3EGFP-ATPaseβgRNA在High Five细胞中能表达出很强的绿色荧光，说明gRNA载体质粒A3EGFP-ATPaseβgRNA已成功导入细胞中，且能正常表达绿色荧光。由此可得出结论，我们构建的gRNA载体质粒A3EGFP-ATPaseβgRNA是成功的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一种质粒载体及其构建方法与应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1551

<212> DNA

<213> 斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)

<400> 1

atgttggggg cagtaagtcg ggttggtagc ggccttttag ccgtaaagtc ggtagctgaa 60

aaaaccttaa cagaatgtgg caaaatcgca accgtatctg ccatcaacaa aagggattat 120

gcagcaaaag ccgctgcagg caaaggccaa ggtaaggtag tggctgtcat cggtgctgtt 180

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ttcacccagg ctggttctga agtgtctgcc ctgctgggtc gtattccctc tgctgtaggt 960

taccaaccaa ccctggccac tgacatgggt accatgcagg agcgtattac caccaccaag 1020

aagggatcca tcacctccgt gcaggctatc tacgtgcccg ctgatgactt gactgaccct 1080

gcccctgcca ccaccttcgc tcacttggac gccaccactg tactgtcccg tgctattgct 1140

gagctgggta tctaccccgc cgtggaccct ctcgactcta cttcccgtat catggacccc 1200

aacattattg gtgctgagca ctacaatgtg gctcgtggtg tccagaagat ccttcaggac 1260

tacaagtcac tccaggacat catcgctatc ctgggtatgg atgagttgtc tgaggaagac 1320

aagctgactg tcgctcgcgc ccgtaagatc cagaggttct tgtcccagcc tttccaggtt 1380

gccgaggtat tcactggaca cgctggcaaa ctggtgcccc ttgaggaaac catcaagggc 1440

ttttctaaaa tcctgcaggg cgagtatgat cacctacctg aagtagcatt ctacatggtt 1500

ggacctattg aggaagttgt tgctaaggcc gaaaccctag ccaagtcgta a 1551

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)

<400> 2

gcagtaagtc gggttggtag 20

<210> 3

<211> 467

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 3

aggttatgta gtacacattg ttgtaaatca ctgaattgtt ttagatgatt ttaacaatta 60

gtacttatta atattaaata agtacatacc ttgagaattt aaaaatcgtc aactataagc 120

catacgaatt taagcttggt acttggctta tagataagga cagaataaga attgttaacg 180

tgtaagacaa ggtcagatag tcatagtgat tttgtcaaag taataacaga tggcgctgta 240

caaaccataa ctgttttcat ttgtttttat ggattttatt acaaattcta aaggttttat 300

tgttattatt taatttcgtt ttaattatat tatatatctt taatagaata tgttaagagt 360

ttttgctctt tttgaataat ctttgtaaag tcgagtgttg ttgtaaatca cgctttcaat 420

agtttagttt ttttaggtat atatacaaaa tatcgtgctc tacaagt 467

<210> 4

<211> 580

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agatctaggt tatgtagtac acattgttgt aaatcactga attgttttag atgattttaa 60

caattagtac ttattaatat taaataagta cataccttga gaatttaaaa atcgtcaact 120

ataagccata cgaatttaag cttggtactt ggcttataga taaggacaga ataagaattg 180

ttaacgtgta agacaaggtc agatagtcat agtgattttg tcaaagtaat aacagatggc 240

gctgtacaaa ccataactgt tttcatttgt ttttatggat tttattacaa attctaaagg 300

ttttattgtt attatttaat ttcgttttaa ttatattata tatctttaat agaatatgtt 360

aagagttttt gctctttttg aataatcttt gtaaagtcga gtgttgttgt aaatcacgct 420

ttcaatagtt tagttttttt aggtatatat acaaaatatc gtgctctaca agtgcagtaa 480

gtcgggttgg taggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gccgttatca 540

acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt ttttagatct 580

<210> 5

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagcc gttatcaact tgaaaaagtg 60

gcaccgagtc ggtgc 75

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agatctaggt tatgtagtac acattg 26

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agatctaaaa aagcaccgac tcggtgccac t 31

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcagtaagtc gggttggtag gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctaccaaccc gacttactgc acttgtagag cacgatattt 40

Claims (10)

1.一种质粒载体，其特征在于：质粒载体为A3EGFP-ATPaseβ gRNA质粒载体，包括gRNAscaffold元件BUg53TB、3×P3启动子和标记基因表达盒，其中gRNA scaffold元件BUg53TB的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，包含gRNA的核苷酸序列和片段BUg53TB元件均位于3×P3启动子前。

2.权利要求1所述质粒载体，其特征在于：标记基因表达盒包括选择基因表达盒和报告基因表达盒。

3.权利要求2所述质粒载体，其特征在于：选择基因表达盒为氨苄青霉素抗性基因表达盒，报告基因表达盒为绿色荧光蛋白表达盒。

4.权利要求1所述质粒载体，其特征在于：gRNA scaffold元件BUg53TB的第一酶切位点位于gRNA scaffold片段BUg53TB 5’端，gRNA scaffold元件BUg53TB的第二酶切位点位于gRNA scaffold片段BUg53TB 3’端，第一酶切位点和第二酶切位点均为BglⅡ。

5.权利要求1所述质粒载体，其特征在于：还包括启动gRNA表达的U6启动子，U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

6.权利要求1所述质粒载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)根据FoF1-ATPaseβ基因序列的靶向序列，靶向序列如SEQ ID No.1所示，在基因序列中查找GN20GG序列作为靶点，靶点序列如SEQ ID No.2所示；根据PAM识别模序确定出gRNA scaffold片段的序列如SEQ ID No.4所示；

(2)使用引物设计软件设计通过重叠PCR扩增gRNA scaffold片段的引物：采用上游引物BUg53TB-BUg-F和下游引物gRNA-R扩增重叠PCR的第一部分片段gRNA scaffold BUg，上游引物BUg53TB-BUg-F的序列如SEQ ID No.6所示，下游引物gRNA-R的序列如SEQ ID No.9所示，扩增得到gRNA scaffold BUg片段；采用上游引物gRNA-F和下游引物BUg53TB-53TB-R扩增重叠PCR的第二部分片段gRNA scaffold g53TB，上游引物gRNA-F的序列如SEQ IDNo.8所示，下游引物BUg53TB-53TB-R的序列如SEQ ID No.7所示，扩增得到gRNA scaffoldg53TB片段；

(3)以含有Inx3基因的质粒VK001-Inx3为模板，以BUg53TB-BUg-F与gRNA-R为特异性引物进行PCR扩增得到gRNA scaffold BUg片段并回收；

(4)以含有Inx3基因的质粒VK001-Inx3为模板，以gRNA-F与BUg53TB-53TB-R为特异性引物进行PCR扩增得到gRNA scaffold g53TB片段并回收；

(5)将步骤(3)gRNA scaffold BUg片段与步骤(4)gRNA scaffold g53TB片段融合得到gRNA scaffold片段，将gRNA scaffold片段连接到克隆载体pMD19-T上得到pMD19-ATPaseβgRNA质粒；

(6)对步骤(5)pMD19-ATPaseβ gRNA质粒进行Bgl Ⅱ酶切，琼脂糖凝胶回收580bp片段，对载体A3EGFP进行Bgl Ⅱ酶切，回收7200bp载体骨架，将带有酶切位点粘性末端的ATPaseβgRNA片段连接到A3EGFP的线性化载体上，菌液PCR鉴定及测序鉴定正确后，得到质粒A3EGFP-ATPaseβ gRNA。

7.权利要求6所述质粒载体的构建方法，其特征在于：gRNA scaffold片段的序列包括Bgl II识别序列、U6启动子、gRNA序列、5’+3’序列、6T序列、Bgl II识别序列，5’+3’序列如SEQ ID No.5所示。

8.权利要求6所述质粒载体的构建方法，其特征在于：gRNA scaffold g53TB片段序列包括gRNA序列、5’+3’序列、6T序列、Bgl II识别序列。

9.权利要求6所述质粒载体的构建方法，其特征在于：步骤(5)中将步骤(3)gRNAscaffold BUg片段与步骤(4)gRNA scaffold g53TB片段融合得到gRNA scaffold片段的具体方法为：

将步骤(3)的回收产物和步骤(4)的回收产物混合作为模板，以BUg53TB-BUg-F和BUg53TB-53TB-R为引物进行PCR扩增得到gRNA scaffold片段。

10.权利要求1～5任一项所述质粒载体在昆虫细胞转染中的应用。