CN104894231A - 家蚕血细胞特异表达基因组织蛋白酶o调控元件的鉴定 - Google Patents

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崔红娟
余霜
杨丽群
张奎
徐曼
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Abstract

本发明涉及家蚕血细胞特异性表达基因的筛选方法及由蛋白酶O基因启动子的克隆，分析发现其血细胞特异表达调控元件的方法。通过下述步骤制得：1、首先通过家蚕组织芯片表达数据、转录组数据和定量RT-PCR等方法，筛选出血细胞特异表达候选基因蛋白酶O基因，成功验证该基因家蚕血细胞特异表达。2、成功对相关基因启动子进行克隆，并进行功能分析。3、成功对Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行了改进，建立了有效的血细胞启动子检测体系。最后在细胞和个体水平对候选基因启动子活性进行检测，并对其组织特异性进行了验证。4、通过本研究得到家蚕血细胞特异性基因蛋白酶O基因启动子，分析发现其启动子在转录起始位点上游-333到-80之间片段具有组织特异性调控元件，控制该基因在血细胞的特异表达。

Description

家蚕血细胞特异表达基因组织蛋白酶O调控元件的鉴定
技术领域
本发明涉及本发明涉及生物技术领域，家蚕血细胞特异性表达蛋白酶O基因启动子分析与鉴定。具体涉及家蚕血细胞特异性表达基因的筛选方法及由蛋白酶O基因启动子的克隆，分析发现其血细胞特异表达调控元件的方法。
背景技术
家蚕是一种具有重要经济价值的昆虫，作为鳞翅目的模式生物，家蚕在理论研究和生产应用方面都具有重要作用。目前对家蚕血细胞的研究比较少，主要原因是可以利用的研究手段有限。随着家蚕基因组框架图和精细图谱绘制工作的相继完成，人类对家蚕的研究和认识已经进入后基因组时代，“发现基因，研究基因，利用基因”是我们现在研究家蚕的主要策略，目前已经发现众多的家蚕血液特异表达基因，面对这些大量的未知基因，如何研究和利用这些基因是我们目前要解决的主要任务之一。随着家蚕转基因技术的突破和完善，转基因已经成为家蚕研究基因和利用基因的强有力工具，但转基因技术也需要其他研究工具的配合才能更好的发挥功效。这些血细胞特异高量表达的基因可能具有非常重要的作用，其中也包括不少和家蚕免疫抗性相关的基因，要通过转基因来研究和利用这些家蚕血细胞特异高量表达的基因就需要有一个家蚕血细胞特异高量表达的启动子，但目前没有家蚕血细胞特异高量表达启动子的相关报道。研究家蚕血细胞特异性的表达基因及其功能与调控，对于阐释家蚕血细胞的生长发育分子机理具有重要意义。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒的位点特意转座子的表达框的质粒在大肠杆菌中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。一个大肠杆菌宿主，DHlOBac，包含杆状病毒质粒(杆粒)和辅助质粒，在转染pFastBac表达结构后可以产生重组杆粒。一个控制表达的质粒，包括Gus或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶或氯霉素乙酰转移酶。Y.Zhai等人以Bac-to-Bac系统结合萤光素酶报告基因重构载体分析了家蚕乙酰葡糖胺糖苷酶的启动子活性，表明启动子活性与基因表达水平一直于在血液、皮肤、脂肪体高表达，截断分析发现基因-347～-223bp存在核心调控元件。J.等人应用转基因技术分析了家蚕内源性卵黄蛋白原基因启动子的功能特性，实验表明其启动子只在蛹期雌性家蚕脂肪体表达，具有性别，组织、时间三重特异的表达模式。高志宏等利用Bac-to-Bac系统对丝素重链启动子进行研究，在丝腺中，2.1kb的启动子仅在后部丝腺驱动EGFP蛋白的表达，而在中部丝腺中不表达，0.9k～2.1k的区域可能存在其他的顺式调控元件
本研究首先通过家蚕组织芯片表达数据、转录组数据和RT-PCR等方法，筛选出蛋白酶O基因为血细胞特异表达候选基因。然后对相关基因进行克隆，并对候选基因的启动子区进行克隆。我们成功对Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行了改进，建立了一套有效的血细胞启动子检测体系。最后在细胞和个体水平对候选基因启动子活性进行检测，并对其组织特异性进行了验证。通过本研究得到家蚕血细胞特异性基因蛋白酶O基因启动子，分析发现其启动子在转录起始位点上游-333到-80之间片段具有组织特异性调控元件，控制该基因在血细胞的特异表达。
发明内容
本发明涉及到家蚕血细胞特异性表达蛋白酶O基因启动子分析与鉴定。具体涉及家蚕血细胞特异性表达基因的筛选方法及由蛋白酶O基因启动子的克隆，分析发现其血细胞特异表达调控元件的方法。
1、首先通过家蚕组织芯片表达数据、转录组数据和定量RT-PCR等方法，筛选出血细胞特异表达候选基因蛋白酶O基因，成功验证该基因家蚕血细胞特异表达。
2、成功对相关基因启动子进行克隆，并进行功能分析。
3、克服了无家蚕血细胞特异启动子这一困难，我们成功对Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行了改进，建立了一套有效的血细胞启动子检测体系。最后在细胞和个体水平对候选基因启动子活性进行检测，并对其组织特异性进行了验证。为家蚕血细胞特异高量表达基因的研究和利用提供了有利的工具。
4、通过本研究得到家蚕血细胞特异性基因蛋白酶O基因启动子，分析发现其启动子在转录起始位点上游-333到-80之间片段具有组织特异性调控元件，控制该基因在血细胞的特异表达。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下
附图说明
图1 芯片数据筛选家蚕血细胞特异基因
家蚕组织芯片数据进行过滤，表达强度大于800，则认为该基因表达，分析发现芯片探针号为sw05834和sw17255，两个探针在SilkDB数据库中对应的同一个注释基因编号为BGIBMGA009231，该基因表达集中在血液中，且表达量较高，表明具有血液特异性。
图2 家蚕组织蛋白酶O组织表达谱
提取家蚕各组织的RNA反转成cDNA之后进行Real Time PCR检测，结果证明了组织蛋白酶O基因在血液中特异表达。
图3 5’RACE片段克隆结果
1：保守序列克隆；2：5’RACE片段；
利用PCR和RACE技术，克隆得到了家蚕组织蛋白酶O的5’末端序列，确定了组织蛋白酶O基因的转录起始位点(TSS)。
图4 TFSEARCH对启动子组织蛋白酶O启动子转录因子
在线使用TFSEARCH对启动子转录因子进行分析HSF：heat shock facteor(热激蛋白因子)Dfd：Deformed元件BR-C：Broad-Complex元件Hb：(Hunchback)元件Kr：(Krueppel)元件TSS：转录起始位点。图中表示了pBmCatO(1912bp，-1836/+76，)、pBmCatO1(1530bp，-1454/+76)、pBmCatO2(938bp，-862/+76)、pBmCatO3(409bp，-333/+76)、and pBmCatO4(156bp，-80/+76)引物的位点。
图5 组织蛋白酶O启动子序列各截断示意图
图6 组织蛋白酶O启动子序列各截断片段PCR图
1：pBmCatO(1912bp，-1836/+76，)2：pBmCatO1(1530bp，-1454/+76)3：pBmCatO2(938bp，-862/+76)4：pBmCatO3(409bp，-333/+76)5：and pBmCatO4(156bp，-80/+76)M：marker
按照(图4)示意图对家蚕组织蛋白酶O基因组序列分别设计该基因各截短启动子。SEQ ID No：16～SEQ ID No：21所示的扩增引物pBmCatO-F/pBmCatO-R，pBmCatO1-F/pBmCatO-R，pBmCatO2-F/pBmCatO-R，pBmCatO3-FpBmC/pBmCatO-R和pBmCatO4-F/pBmCatO-R引物对分别扩增出pBmCatO(1912bp，-1836/+76，)，pBmCatO1(1530bp，-1454/+76)，pBmCatO2(938bp，-862/+76)，pBmCatO3(409bp，-333/+76)，and pBmCatO4(156bp，-80/+76)的启动子片段，分别测序验证，证明克隆启动子的正确。
图7 pFastBacTMDual载体以及载体改装示意图
图7-a为pFastBacTMDual载体结构图，图7-b为载体改装示意图：pPH作为阳性对照含有两个启动子PP10启动子能驱动EGFP表达的，PPH启动DsRed的表达，pΔP作为阴性对照，只含有能驱动EGFP表达的PP10，PHS为实验组PP10驱动EGFP表达，而我们的组织蛋白酶O的启动子驱动DsRed的在组织中的表达。EGFP信号代表了被病毒侵染的程度，而DsRed信号表示启动是否在该组织有活性。
图8 组织蛋白酶O启动子片段重组Bacmid的鉴定
图8-a中，1：蓝斑 2：白斑A 3：白斑B 4：白斑C(1-4引物为EGFP-R/M13-R) 5：蓝斑 6：白斑A 7：白斑B 8：白斑C(5-8引物为M13-F/M13-R) 9、Marker图8-b中 1：蓝斑 2：pFast空载 3：pPH 4：pCatO(1-5引物为EGFP-R/M13-R) 6：2K plus marker 7：蓝斑 8：pFast空载 9：pPH 10：pCat0
(7-11引物为M13-F/M13-R)12：marker
白色单菌落扩大培养提取重组病毒Bacmid，M13F/M13R引物分别位于病毒Bacmid的转座元件mini-attTn7的两侧，当无外源基因插入时PCR扩增会出现约300bp，转化后发生重组的Bacmid PCR产物会明显增大大小为2560bp加上插入克隆片段的大小，如图所示pCatO重组Bacmid用SEQ ID NO 14～SEQ ID No：15所示的扩增引物M13-F/M13-R对可以扩出6000bp的片段，而蓝斑没发生重组只有300bp大小，说明发生了重组，EGFP-R/M13-R引物对能在白斑扩出4000bp左右的特异片段，而蓝斑无法扩出任何片段说明，插入的片段就是我们克隆的启动子序列已经EGFP和dsred的片段。同样的原理对pFast空载以及pPH也做了鉴定，说明了载体的构建准确，已经重组Bacmid的正确性。
图9 组织蛋白酶O启动子各截短片段在细胞系swu-3上启动子活性检测
通过细胞转染和病毒感染swu-3细胞发现，阴性对照pΔP只能表达绿色荧光蛋白说明病毒感染的状况，阳性对照pPH能同时表达绿色荧光蛋白以及红色荧光蛋白说明两个启动子都发挥了作用，都能成功地驱动表达，说明了这个构建系统的可行性。5种不同大小的组织蛋白酶O启动子均能在驱动红色荧光蛋白，感染三天后约有90％以上的细胞产生荧光，说明这个5不同大小的组织蛋白酶O启动子在swu-3细胞都用启动子活性都能驱动红色荧光蛋白的表达。
图10 组织蛋白酶O启动子各截短片段家蚕蚕体血细胞活性检测
图11 组织蛋白酶O启动子各截短片段家蚕蚕体脂肪体活性检测
图12 组织蛋白酶O启动子各截短片段家蚕蚕体丝腺体活性检测
在病毒感染家蚕5龄幼虫后发现，阴性对照pΔP只能表达绿色荧光蛋白不在在任何组织驱动红色荧光蛋白的表达，阳性对照pPH能在血细胞，脂肪体以及丝腺体中驱动红色荧光蛋白说明该启动子都发挥了作用，都能成功地驱动作为阳性对照。家蚕的pBmCatO(1912bp，-1836/+76，)pBmCatO1(1530bp，-1454/+76)pBmCatO2(938bp，-862/+76)pBmCatO3(409bp，-3333/+76)启动子特异地在血细胞驱动红色荧光蛋白基因的表达(图10)，而脂肪体以及丝腺不能驱动红色荧光蛋白基因的表达(图11、12)，说明这四个启动子在血细胞特异性，而在其他组织无启动子活性。而pBmCatO4(156bp，-80/+76)启动子在血细胞，丝腺以及脂肪体都能驱动红色荧光蛋白的表达，这就说明pBmCatO4(156bp，-80/+76)启动子具有启动子活性，但没有组织特异性，研究者认为在启动子序列(-333/-80)这间存一个重要的血细胞特异表达元件，抑制了启动子在其他组织的驱动。
具体实施方式
材料试剂
本实验所用材料为大造(P50)和细胞系Bm-swu3，由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室家蚕资源库提供和保存。
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1、芯片筛选血细胞特异表达的基因
家蚕组织芯片数据(http：//silkworm.swu.edu.cn/microarray/)是在家蚕组范围内，分析目前已知和预测的家蚕基因在5龄3天各组织的表达情况。对家蚕组织芯片数据进行过滤，表达强度大于800，则认为该基因表达，分析发现芯片探针号为sw05834和sw17255，两个探针在SilkDB数据库中对应的同一个注释基因编号为BGIBMGA009231，该基因表达集中在血液中，且表达量较高，推测具有血液特异性(图1)。该基因被注释为家蚕组织蛋白酶O基因。
2、荧光定量PCR分析家蚕组织蛋白酶O基因组织表达情况
根据家蚕组织蛋白酶cathepsin O基因组序列设计扩增cathepsin O的特异引物，SEQ ID No：8所示cathepsin O的正向引物：5’CGGGAGCCGTTTATGGTCT 3’，SEQ ID No：9所示反向引物5’CATTCCCTCTTCTCGCCAAT 3’。提取家蚕各组织五龄三天各组织：头、体壁、血液、中肠、精巢、卵巢、马氏管、脂肪体和翅原基的RNA反转成cDNA之后进行荧光定量PCR检测，反应在实时定量仪器OneStep Plus(Applied Biosystems)中完成，采用SYBR Green法，选择TaKaRa公司的Premix Ex TaqTM II试剂盒进行定量PCR反应，以BmGDPDH作为内参基因，SEQ ID No：6-7(图2)。
3、组织蛋白酶O基因5’RACE
3、1 总RNA的提取
1. 将无RNA酶的1.5mL离心管置于冰上，加入300μL 1×PBS和5μL饱和的苯基硫脲(PTU)。
2. 取龄期为5龄三天的家蚕幼虫，用注射器刺破其腹足，迅速将血淋巴滴入上述预冷离心管中，直至1mL。
3. 3000g，4℃，离心5min，弃上清后加入1mL Trizol，迅速激烈摇晃10min，至沉淀完全溶解后，可进行下一步实验或-80℃保存。
4. 将上述离心管冰上静置10min，于12000g，4℃，离心15min。转移上清液至另一干净的无RNA酶1.5mL离心管。
5. 加入300μL预冷的氯仿，剧烈震荡10s，冰上静置10min，待溶液分层。
6. 12000g，4℃，离心15min，转移上清液至同样1.5mL无RNA酶离心管。
7. 重复一次步骤(5)和(6)。
8. 加入800μL预冷的异丙醇，轻轻摇匀，冰上静置10min。10000g，4℃，离心10min。
9. 弃上清液后加入1000μL 75％乙醇，温柔将沉淀吹起重悬，注意保持沉淀形状完整，不要吹散。
10. 重复步骤(9)。
11. 待沉淀干燥至边缘变成半透明时加入30μL无RNA酶的DEPC水。
12. 用DNA酶于37℃，消化20-30min。
13. 用无RNA酶水将DNA酶消化体系定容至100μL，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)充分混匀。
14. 12000g，室温离心5min，转移上清液至1.5mL无RNA酶离心管。
15. 加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)混匀。
16. 12000g，室温离心5min，转移上清液至1.5mL无RNA酶离心管。
17. 加入10μL 3M CH3COONa(PH 5.2)和250μL冷乙醇，-80℃静止20min.
18. 12000g，4℃，离心10min，弃上清。
19. 加入1000μL 75％乙醇，重悬沉淀。
20. 待沉淀干燥后加入30μL无RNA酶水。
3、2 RNA的检测
用紫外分光光度计检测所提取的RNA的纯度和浓度。
用变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物的完整性，具体步骤如下：
1.变性琼脂糖凝胶的制备
称取0.5g琼脂糖于干净的100mL锥形瓶中，加入40mL无RNA酶的DEPC水，用微波炉加热使琼脂糖彻底融化。待瓶中溶液温度降至60-70℃后，依次加入5mL 10×MOPS缓冲液、5mL甲醛和2μL Gold view，混合均匀后倒至胶板中插上梳子，待其冷却，制得琼脂糖凝胶。
2.电泳
取1μL样品，和1×loading buffer混匀后点样至胶孔中。将胶以胶孔端朝向负极的方向放入电泳槽，加入适量1×MOPS缓冲液淹没胶块，在120V的电压下进行电泳。电泳完成后用凝胶成像系统检测。
3、3 RACE模板的制备 
使用invitrogen公司的GeneRacerTM RACE Ready cDNA Kit制备RACE模板。参照其说明书按如下步骤操作：
1、去磷酸化反应
(1)取一1.5mL无RNA酶离心管置于冰上，配制如下去磷酸化反应体系：
(2)冰上混匀并瞬时离心后，50℃水浴1h。
(3)瞬时离心后重置于冰上。
(4)向反应体系中加入90μL无RNA酶水和100μL酚：氯仿，激烈涡旋30s后，在室温下以13000r离心5min。
(5)将上层水相转移至新的1.5mL无RNA酶离心管中。
(6)加入2μL 10mg/mL Mussel glycogen和10μL 3M CH3COONa(PH 5.2)，混合均匀后加入220μL 95％的乙醇。
(7)干冰上静止20min或-20℃过夜。
(8)4℃下以最高速度离心20min后弃上清。 
(9)加500μL 70％乙醇，重悬沉淀。
(10)4℃下以最高速度离心2min后，用移液枪移除液体；再次瞬时离心，移除多余的液体。
(11)待沉淀干燥后加入7μL无RNA酶水。
2、去帽子反应 
(1)向上述去磷酸化的7μLRNA产物中加入以下反应试剂：
(2)用移液枪轻柔混合，瞬时离心收集液体。
(3)37℃水浴1h，瞬时离心后置于冰上。后续RNA纯化步骤与去磷酸化反应中的步骤(4)-(10)相同。
3、连接反应 
(1)将试剂盒中含有0.25μg的GeneRacerTMRNA Oligo的离心管瞬时离心，将RNA粉末收集于管底。
(2)将7μL去帽子反应后的RNA移入离心管中，充分混合后瞬离。
(3)65℃水浴5min以除去RNA的二级结构。 
(4)加入以下试剂，用移液枪混匀后瞬离：
(5)37水浴1h，瞬时离心后置于冰上。后续RNA纯化步骤与去磷酸化反应中的步骤(4)-(9)相同，最后用10μL无RNA酶水溶解。
4、反转录反应 
向上述10μL RNA产物中加入1μL GeneRacerTMPrimer，1μL dNTP Mix和1μL无RNA酶水。
65℃，10min以除去RNA二级结构。 
冰上静止至少1min后瞬时离心。 
向13μL的上述混合物中加入以下试剂：
轻柔颠倒数次后瞬时离心收集液体。
50℃，30-60min
70℃，15min使反转录酶失活。
加入1μL RNaseH，37℃，20min.
瞬时离心后迅速保存至-20℃。
3、4 家蚕组织蛋白酶基因5’RACE
1、5’RACE第一轮扩增体系及PCR程序：
试剂：
2、将第一轮PCR产物进行稀释(如50×)，作为第二轮PCR的模板。其反应体系和PCR程序如下：
3. 取5μL第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
4. 目的片段的回收
准备一个干净的1.5mL离心管，称取重量。将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、EB染色5-10min后，在紫外光下用干净刀片切下含目的片段的胶条(注意人身安全的防护)，放入之前称重的1.5ml离心管，再次称重并记录。利用Axygen DNA凝胶回收试剂盒进行回收。具体步骤如下：
1. 将后一次含胶条的离心管重量减去前一次记录的空离心管重，即为胶条的重量。
2. 按胶重量∶溶液A的体积为1∶3的重量比，加入溶液Buffer DE-A，混合均匀后于75℃水浴加热，其间振荡助溶2-3次，直至凝胶完全熔化。
3. 按溶液A∶溶液B为2∶1的体积加入Buffer DE-B，充分混匀。(若DNA片段小于400bp，则加入一个凝胶体积的异丙醇)。
4. 将混合溶液转移到分离柱中，12000g离心1min，倒掉收集管中的液体。
5. 加入500μL Buffer W1于分离管，12000g离心30s，倒掉收集管中的液体。
6. 加入700μL Buffer W2于分离管，12000g离心30s，倒掉收集管中的液体。
7. 加入700μL Buffer W2于分离管，12000g离心1min，倒掉收集管中的液体。
8. 12000g空离1min，去除剩余液体。
9. 将分离管置于新的离心管中，加入30μL高压灭菌的ddH2O于分离管膜中央，静置5-10min。
10. 12000g离心5min。将DNA贮存于-20℃可长期保存。
回收产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测回收效率和纯度。
5. 目的片段与载体的连接
使用TaKaRa PMD19-T Simple试剂盒进行连接。其方法步骤按照使用说明书进行操作：
混匀并瞬离后于16℃连接4小时。
6. 转化
1. 从-80℃取出感受态细胞100μL，在冰上放置至完全融解。
2. 加入10μL连接产物，轻轻混匀后，冰上放置30min。
3. 42℃热击60s，迅速轻放回冰上冷却2min。
4. 加入300μL无抗生素的LB液体培养基，37℃，220rpm摇荡培养1h。
5. 参照《分子克隆实验指南》制备氨苄青霉素平板。
6. 取适量的菌液(50-200μL)，均匀涂布于平板上，37℃正置培养30min后，再倒置培养14-16h。
7. 阳性克隆的筛选
1. 挑取菌落于加有300μL LB液体培养基(含氨苄青霉素)的1.5mL离心管中培养，37℃摇荡培养4-6h，至培养基达到相应浑浊度。
2. 取1μL菌液作为模板，以目的片段相应的引物进行PCR扩增。
3. 用1％的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，筛选出阳性单克隆。送华大公司进行测序。
4. 测序后，利用BioEdit软件对5’RACE进行拼接，获取基因5’RACE(图3)。
4、组织蛋白酶O启动子片段的获得
4.1 家蚕基因组提取基因组提取步骤：
1)准备好高压灭菌的研钵，先加入液氮预冷，将去除蛾尿的蚕蛾放入研钵中，加入液氮速冻，轻轻敲碎，至快干燥时快速研磨，反复几次，注意持续加入液氮，直到白色成粉末状″
2)加入2mL的抽提缓冲液，溶解后轻轻摇匀匀浆，将匀浆液转至5mL离心管中，尽量转移干净，然后加入10-12μL 20mg/mL在37℃预热半小时的蛋白酶K至终浓度100μg/mL，在52℃水浴中过夜
3)加入2mL的饱和平衡酚，温和振荡15min摇匀，12000rpm离心15min，转移上清液到新的5mL的离心管中 
4)加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)，温和振荡15min，重复上述离心步骤，转移上清液到新的5mL的离心管中
5)加入等体积的氯仿抽提，温和震荡15min，12000rpm离心15min，转移上清液到新的5mL离心管中
6)加入2.5倍体积的冰冻的无水乙醇，迅速的轻轻转动离心管使溶液充分混合，DNA立即形成沉淀，-20℃放置10min，用高压灭菌的牙签或枪头把沉淀挑出，或10000rpm离心10min，弃上清，注意沉淀不要丢失.
7)70％的乙醇洗涤DNA沉淀2次，8000rpm离心5min，倒掉乙醇后，用小枪头把管壁残留乙醇充分去除干净，室温晾干，加入TE(pHS.0)350μL，并加入RNAase使终浓度为50μg/mL，在37℃消化4h.
8)将DNA转到1.5mL的离心管中，加入TE(pH8.0)500μL，用等体积的酚抽提一次，再用等体积的酚∶氯仿(1∶1)，氯仿各抽提一次，后加入冰冻乙醇，转动离心管使溶液充分混合，沉淀DNA，沉淀用75％的乙醇洗涤DNA沉淀2次后干燥.
9)加入200μL的TE溶液溶解DNA，0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并用分光光度计和检测DNA浓度和纯度。
4.2 家蚕组织蛋白酶O基因各截断启动子
家蚕组织蛋白酶cathepsin O基因组序列分别设计该基因各截断启动子引物(图5)SEQ ID No：16～SEQ ID No：21。以家蚕基因组DNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，然后95℃变性40秒、55℃退火40秒、72℃延伸90秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收目的条带(图6)，然后与pMD19-T Simple载体连接，连接反应体系严格按照Solution I连接酶使用说明进行，连接条件是在16℃条件下连接过夜，将连接产物转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后测序验证(方法同3.4.3～3.4.7)，测序结果经分析为家蚕组织蛋白酶cathepsin O基因启动子，并在线使用TFSEARCH软件对启动子转录因子进行分析(图4)。
5、载体构建 
对商业化杆状病毒表达系统改造过程如下，以EGFP-F/R、dsRed-F/RSEQ ID No：10～SEQ ID No：13分别从质粒pEGFP-N 1和pdsred-N1质粒中扩增得到EGFP和dsred编码框片段，EGFP编码框片段用KpnI和XhoI双酶切后插入pFastBacTMDual载体Pp10启动子下游多克隆位点中，dsred编码 框片段用XbaI和HindIII双酶切后插入Past-EGFP-DUAL载体Pph启动子下游多克隆位点中。因Pph启动子下游多克隆位点存EcorI位点，应用点突变技术在Pph和PP10启动子之间突变成EcoRI的酶切位点，得到包含EGFP和dsred以及两个启动子之间存在ECORI酶切位点的重组转移载体，命名为PAST-pPH。应用EcoRI酶切可切除转移载体pFast上的Pph启动子，用CIAP酶去磷酸化后，载体进行T4连接后自连，获得缺失启动子Pph的转移载体PAST-ΔP。以家蚕基因组为模板应用PCR技术分别克隆不同长度的基因启动子片段，酶切以后插入到PAST-ΔP载体中dsred上游酶切位点，构建成以目的基因启动子驱动下游dsred表达的转移载体，命名为PAST-PHS，示意图见(图7)。：
6、DH1OBac感受态制备
1. 在含有50ug/ml Kan+和10ug/ml Tet+抗性的LB平板或无抗平板上，使用菌液DH1OBAC划线，37度培养箱过夜，培养12～20小时。
2. 从平板上挑取一个单菌落，接种到一个含有50ug/ml Kan+和10ug/ml Tet+抗性的100ml LB液体培养基中，于37℃，250rpm培养3～6小时，至OD600值为0.4左右。或者从平板上挑取一个单菌落，接种到一个含有50ug/ml Kan+和10ug/ml Tet+抗性的5ml LB液体培养基中，于37℃，250rpm培养12小时，然后再将菌液按照1∶100的比列接种于含有50ug/ml Kan+和10ug/ml Tet+抗性的100ml LB液体培养基中，于37℃，250rpm培养3小时，至OD600值为0.4左右。
3. 将DH1OBac细菌培养烧瓶在冰上孵育10min，使培养物冷却至0℃，转入无菌的预先用冰预冷的50ml离心管中，然后于4℃下5000rpm离心8分钟收集细胞。
4. 倒出培养液，尽量使上清弃尽。每50ml初始培养物加入30ml预先用冰预冷的0.1M CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟。
5. 于4℃，5000rpm离心8分钟收集细胞，弃尽上清。加入4ml预先用冰遇冷的0.1M CaCl2。轻轻吹打悬浮细胞，加入1ml灭菌的预先用冰遇冷的80％甘油，吹打混匀。
6. 将DH1OBac感受态细胞按照每管100ul分装。可以直接使用新鲜制备的DH1OBac感受态细胞进行质粒转化，也可以放在-80℃冰箱保存备用。
6、重组Bacmid的获得及鉴定 
将获得的重组转移载体转化大肠杆菌DH1OBac感受态细胞，37℃振荡培养3h后，LB培养平板(包含50ug/ml Kan+，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG)用来进行DH1OBac转化株的筛选培养48h后挑选白色单菌落再次划线，从划线的平板挑选白色单菌落扩大培养后提取重组Bacmid，并用使用M13F/M13R引物采用PCR方法鉴定重组Bacmid的纯度和是否有片段插入(图8)。
7、昆虫细胞BmE-swu3的培养以及转染
BmE-swu3细胞系有家蚕基因组生物学国家重点实验室保存。27℃恒温培养箱中，用含有10％FBS的Grac’s培养基培养。
(1)将BME-SWU3细胞铺板于24孔板内培养，当细胞生长状态良好，达到80％汇合率时将，方可进行转染。
(2)在1.5ml离心管，加入100uL无抗无血清的Grace’s培养基，随后加入10u重组Bacmid，并轻轻混合均匀，然后轻轻加入1.5uL的脂质体，共同孵30min～45min。
(3)当Bacmid和脂质体共同孵育的同时，用无抗无血清的培养基润洗24孔板中细胞2次后，加入400uL的培养基。再加入孵育好的Bacmid-脂质体复合物，
6h后更换为有抗生素有血清的培养基。
(4)转染72h后，用4％多聚甲醛固定15min，并用DAPI染细胞核10min，在倒置显微镜下观察看到病毒感染的现象。
8、病毒的扩增与浓缩
1、转染细胞后，观察到被病毒细胞所带EGFP的信号，就可以从每个孔中收集含有病毒的细胞，并转入灭过菌的1.5ml离心管。500Xg离心5分钟除去细胞和大的碎片，保留上清。2、将上清转到新的1.5ml离心管。这就是P1病毒株。4度避光储存。
3、将收集的P1代病毒上清，加入到生长状况良好的BMe-swu3细胞24孔板中，48小时后在荧光显微镜下可以观察到感染病毒细胞所带EGFP的信号增多增强，1.5ml离心管收集细胞以及培养基上清，离心力500g离心5分钟，取上清得到P2代病毒株。
4、多次培养可以得到滴度较高的病毒株。
9、病毒侵染家蚕
选取大小体重一致5龄一天家蚕幼虫，用毛细管在幼虫腹部气孔将重组(107PFU/ml，10ul/头)注射幼虫腹部。注射病毒后的家蚕在室温下用桑叶饲养，在120小时后分别提取丝腺、脂肪体和血细胞爬片在荧光显微镜下观察EGFP和dsred的表达情况(图10、图11、图12)。
实验步骤如下 
9.1 血细胞爬片 
1. 将圆形玻片洗净后自然晾干，再泡入75％的乙醇过夜。然后用镊子夹出玻片自然晾干，放入干净的24孔板中。
2. 准备一干净的1.5mL离心管至于冰上，加入3μL巯基乙醇和300μL 1×PBS。取侵染病毒120小时的家蚕，用注射器针头刺破其腹足，将血滴入离心管，至1mL处，充分混匀。
3. 吸取100μL上述离心管中的混合液至24孔板的圆形玻片中，静置贴片30min。
4. 用1×PBS摇床清洗3次，每次5min。
5. 在孔中加入500μL 4％多聚甲醛，固定15min。
6. 用1×PBS摇床清洗3次，每次5min。
7. 吸去PBS，DAPI室温染色15min，同样用PBS清洗。
8. 小心将圆形玻片取出，滴加抗荧光淬灭剂后，反扣于干净载玻片上封片。
9. 镜检并记录。 
9.2 丝腺、脂肪体的处理
1、解剖侵染120小时的家蚕，取出丝腺或脂肪体于2mL离心管中。 
2、用1×PBS摇床清洗3次，每次5min。
3、在离心管中加入1mL4％多聚甲醛，固定30min。
4、用1×PBS摇床清洗3次，每次5min。
5、吸去PBS，DAPI室温染色15min，同样用PBS清洗
6、镜检并记录 
如(图10-图12)所示，说明这组织蛋白酶O四个启动子pBmCat0(1912bp，-1836/+76，)pBmCatO1(1530bp，-1454/+76)pBmCatO2(938bp，-862/+76)pBmCatO3(409bp，-3333/+76)在血细胞特异性，而在其他组织无启动子活性。而pBmCatO4(156bp，-80/+76)启动子在血细胞，丝腺以及脂肪体都能驱动红色荧光蛋白的表达，这就说明pBmCatO4(156bp，-80/+76)启动子具有启动子活性，但没有组织特异性，在启动子序列(-333/-80)这间存一个重要的血细胞特异表达元件，抑制了启动子在其他组织的驱动。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (4)

1.家蚕血细胞特异性表达基因的筛选方法及由蛋白酶O基因启动子的克隆，分析发现家蚕血细胞特异调控元件的方法。其特征在于，所述方法包含对Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行了改装，蛋白酶O基因启动子其启动子在转录起始位点上游-333到-80之间片段具有组织特异性调控元件。
2.根据权利要求1所述的发明方法，其特征在于，所述家蚕血细胞特异表达调控原件的发现有下面步骤得到：
(1)血细胞特异表达候选基因组织蛋白酶O基因的筛选与组织特异性的验证。
(2)组织蛋白酶O基因启动子进行克隆，并进行功能分析。
(3)Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行了改装
(4)家蚕细胞和个体水平对候选基因启动子活性进行检测。
(5)通过本研究得到家蚕血细胞特异性基因蛋白酶O基因启动子，分析发现其启动子在转录起始位点上游-333到-80之间片段具有组织特异性调控元件，控制该基因在血细胞的特异表达。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，Bac-to-Bac杆状病毒表达pFastBacTMDual载体系统进行了改装，以EGFP-F/R、dsRed-F/R引物分别从质粒pEGFP-N1和pdsredN1质粒中扩增得到EGFP和dsred编码框片段EGFP编码框片段用KpnI和XhoI双酶切后插入pFastBacTMDual载体Pp10启动子下游多克隆位点中，dsred编码框片段用XbaI和HindIII双酶切后插入Past-EGFP-DUAL载体Pph启动子下游多克隆位点中。因Pph启动子下游多克隆位点存EcorI位点，应用点突变技术在Pph和PP10启动子之间突变成EcoRI的酶切位点，得到包含EGFP和dsred以及两个启动子之间存在ECORI酶切位点的重组转移载体，命名为PAST-pPH。应用EcoRI酶切可切除转移载体pFast上的Pph启动子，用CIAP酶去磷酸化后，载体进行T4连接后自连，获得缺失启动子Pph的转移载体PAST-ΔP。以家蚕基因组为模板应用PCR技术分别克隆不同长度的基因启动子片段，酶切以后插入到PAST-ΔP载体中dsred上游酶切位点，构建成以目的基因启动子驱动下游dsred表达的转移载体，命名为PAST-PHS。
4.权利要求1-3中任一项的研究的家蚕组织蛋白酶O其启动子在转录起始位点上游-333到-80之间片段血细胞特异调控元件碱基序列。
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