CN103468733A - 抗猪圆环病毒2型的表达载体和转基因猪及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗猪圆环病毒2型的表达载体和转基因猪及其构建方法，属于基因工程领域。所述表达载体是通过分别将H1启动子和pPB-sh2序列连接到pUC57-H1质粒上，再将含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段连接到pPB-H1-sh2上构建得到的。将该载体导入猪的基因组，并采用体细胞核移植技术生产出转基因猪。本发明的表达载体具有piggyBac转座子，极大地提高了转基因效率，且将普通质粒串联重组的转基因整合模式变成了单位点单拷贝整合，更好的模拟生物基因的内环境。构建的转基因猪通过自身合成siRNA来降解PCV2mRNA，可从根本上抑制猪圆环病毒2型的感染。

Description

抗猪圆环病毒2型的表达载体和转基因猪及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种抗猪圆环病毒2型的表达载体及其构建方法，以及抗猪圆环病毒2型的转基因猪及其构建方法。 

背景技术

猪圆环病毒，属于圆环病毒科，为单股环状DNA病毒，分为1型和2型。其中猪圆环病毒1型（PCV1）不致病，猪圆环病毒2型（PCV2）具有致病性。PCV2基因组为共价闭合、单股环状的DNA分子，大小约为1767或1768个核苷酸。推测PCV2含有11个大小不一的开放性阅读框（Open reading frames,ORFs），其中ORF1、2、3、4、7和8具有一定的同源性，其余则无任何同源性。PCV2编码的ORF1、5、7和10位于基因组DNA链上，5→3顺时针方向相同；ORF2、3、4、6、8、9和11位于互补链上，5→3逆时针方向相同；这些基因组彼此重叠，最大限度利用病毒有限的遗传分子，完成病毒的复制和包装过程。11个ORFs中仅包含两个主要功能性ORFs，分别编码衣壳蛋白（Cap protein,Cap蛋白）和复制酶（Replicase,Rep）蛋白，在病毒的生命周期中起到两个最主要的基本功能，即病毒基因组的复制和连续性包装。Rep蛋白由PCV最大的开放阅读框ORF1编码，与该基因组的滚环复制有关，分子量分别为35.6kDa（PCV1）或35.8kDa（PCV2）。PCV1 和PCV2比较，Rep蛋白氨基酸序列同源性达86%，这也是2种血清型PCV产生抗原交叉性的主要原因。若PCV2中复制必需的rep和rep’基因发生突变，可降低病毒DNA的复制，同时使病毒蛋白的合成减少90%以上。ORF2基因编码的Cap蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白和最主要的免疫原性蛋白。研究表明，ORF2可以用来区分PCV1与PCV2，通过合成肽分析免疫相关区域，发现病毒ORF2的25～43aa和169～187aa是两型PCV之间的两个共同的抗原表位。PCV2与PCV1Cap蛋白之间虽然具有共同的抗原表位，但不存在交叉反应。经多肽扫描分析，Cap蛋白N-末端第65～87aa，113～139aa、157～183aa和193～207aa为PCV2特异性的抗原位点 

在养猪业疾病防控中，疫苗是人们用来对付疾病的最常用手段。而由于圆环病毒灭活疫苗与亚单位疫苗成本高、注射次数多和容易造成机体应激等缺点，以及免疫效力有待提高，并不能大规模的免疫接种。在我国销售进口PCV2疫苗单一头份价格最高达48元人民币，而国产灭活疫苗价格也在10元人民币左右。绝大多数养猪户是无法承受为单一疾病的预防而花费如此的价格购买疫苗的。另外，虽然疫苗的使用在控制由PCV2感染而引起PMWS中获得了一些成功，但是这种综合征的发病病源是多样的，而且在其它综合征上并没有突破，所以，从其他途径寻找解决这个问题的方法显得更有必要。 

RNAi（RNA interference,RNAi），又称反义RNA(anti-sense RNA)，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi技术可以防 止病毒入侵、抑制病毒复制、减少病毒RNA数量、阻断病毒蛋白的表达，在抗病毒感染领域具有较大的潜力。 

随着转基因技术的发展，培育转基因品种已成为可能。目前，常规育种技术在实现猪杂种优势利用、性能测定、遗传评估及优良品种培育方面取得了显著成就，但其选择周期长、遗传进展慢等问题一直是培育突破性新品种的“技术瓶颈”。随着动物基因组学、蛋白组学、分子标记辅助选择和动物转基因等生物技术的迅猛发展，猪种质资源创新和新品种培育已进入了一个新的发展时期。在这一时期，研究和开发猪品种培育新技术，建立起优质、高效、环保型及无公害等重要功能基因高效克隆、基因转化、新品种快速扩繁等的技术体系，是猪新品种培育并建立现代健康养猪业的前提条件。通过转基因操作改良性状的生物技术育种方法，直接针对育种目标，目的性强、周期短，可以同时改良重要经济性状。因此，转基因育种是培育抗病型猪种的关键新技术，也切实可行。 

在针对PCV2的RNAi防治策略上，2011年，李曼等分别构建针对PCV2的rep和cap基因，设计并合成了10对编码PCV2特异的shRNA的DNA寡核苷酸和1对PCV2非特异（SCR）的shRNA的DNA寡核苷酸，转染PK15细胞后20h感染PCV2，结果表明，构建的PCV2特异的siRNA表达质粒均能不同程度地抑制PCV2DNA、mRNA及Rep与Cap蛋白在PK-15细胞内的合成。体内实验中，针对128只8周龄BALB/c，感染病毒后检测体重、血清中PCV2核酸阳性率以及组织中的PCV2载量，也表明质粒能够有效的抑制PCV2病毒的表达。 

2008年，Feng,Z等分别针对PCV2的ORF1和ORF2构建了2个慢病毒载体表达shRNA，发现可以shRNA有效的抑制PCV2病毒的复制。进而将shRNA注射小鼠体内，再感染PCV2，在感染后21-28天，脾脏可检测到PCV2病毒复制被有效抑制。 

同年，Wang,H等根据rep基因设计2个siRNAs，根据cap基因设计1个siRNA，插入含U6启动子的pSIREN-RetroQZsGreen载体，并进行细胞内和小鼠体内试验，结果表明感染PCV2前或后转染质粒能有效抑制PCV2在Dulac细胞上的复制，抑制率最高可达99％以上；动物试验中，肌肉注射10μg上述不同siRNA分子对小鼠体内PCV2的复制有一定的抑制作用，其抑制率在26%至99%之间。 

2007年，sun,M等针对PCV2的rep基因设计了3个siRNA表达载体(pS-RepA,pS-RepB和pS-RepC)，并在PK15细胞中进行相关实验，发现3个质粒均能显著降低PCV2病毒的复制，以pS-RepC的效果最为明显。 

2006年，Liu,J等设计shRNA表达载体在PK15细胞进行实验，发现转染质粒后病毒mRNA含量显著降低，接着用小鼠模型验证，通过淋巴结的病理变化及原位杂交均证明，shRNA表达载体可有效抑制PCV2的感染。 

上述实验均未能在猪上进行相关的检验。作为一种对养猪业造成严重损失的疾病，如果上述RNAi实验结果不能在猪上进行验证，是不具有说服力的。 

申请号为201210042295.X，发明名称为“一种抗猪圆环病毒2型 病转基因猪的构建方法”构建的转基因猪所使用的载体为pGK-zsGFP-shRNA，其调控shRNA表达的启动子为U6，其插入基因组的载体中含有氨苄抗性基因，因此，使得得到的转基因猪的不利于后续转基因生物安全性试验的展开，且该专利中，结果只检测到了目的基因整合进基因组，并未检测是否正确表达siRNA，而这是该转基因猪能否抗病的根本，因此，最终得到的转基因猪能否抗病也是个未知数。 

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种抗猪圆环病毒2型的表达载体和转基因猪及其构建方法。 

为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案： 

一种抗猪圆环病毒2型的表达载体的构建方法，包括以下步骤： 

(1)、用XhoI和EcoRI酶切SEQ ID NO:1的H1启动子和质粒pCyL50，纯化，连接，转化感受态细胞，培养后挑选单克隆菌落进行扩大培养，筛选阳性克隆，酶切鉴定，得到pPB-H1质粒； 

(2)、以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3作为模板及引物进行重叠PCR扩增得到序列号为SEQ ID NO:4的pPB-sh2序列，按步骤(1)相同的方法将pPB-sh2序列连接到pPB-H1质粒上，得到序列号为SEQ ID NO:11的shRNA分子pPB-H1-sh2； 

(3)、分别以质粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175-CAGGS-EGFP为模板，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 为引物进行第一次PCR扩增，纯化得到neo基因和EGFP；各取10ng-200ng混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo-EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pcDNA3.1(+)和neo-EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA3.1-Neo-T2A-EGFP载体； 

(4)、以SEQ ID NO:13的质粒为模板，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为引物，PCR扩增出含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段；按步骤(1)相同的方法将含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段连接到pPB-H1-sh2上，得到抗猪圆环病毒2型的表达载体：pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP，序列号为SEQ ID NO:12。 

在其中一个实施例中，步骤(2)中重叠PCR扩增的反应程序为：98℃3min；98℃10s，50℃10s，72℃10s；30个循环；72℃10min。 

在其中一个实施例中，步骤(3)中所述第一次PCR的反应程序为：98℃2min；98℃10s，68℃50s；35个循环；72℃10min；所述第二次PCR的反应程序为：98℃2min；98℃10s；68℃1min40s；35个循环；72℃10min。 

在其中一个实施例中，步骤(4)中所述PCR扩增的反应程序为：98℃3min；98℃30s，65℃30s，72℃3min；35个循环；72℃10min 

本发明还提供了上述构建方法构建得到的抗猪圆环病毒2型的表达载体。 

本发明还提供了一种抗猪圆环病毒2型的转基因猪的构建方法，包括以下步骤： 

(1)、将表达载体pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB混合共转染猪胎儿成纤维细胞系，筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系； 

(2)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，采用常规育种技术进行培育，即可得到抗猪圆环病毒2型的转基因猪。 

在其中一个实施例中，所述转染的步骤为： 

（1）、把表达载体pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB混合加入到1000μL

中，混匀； 

（2）、加入7μL用前混匀的PLUS^TMReagents，混匀后静置5min； 

（3）、加入21μL用前混匀的Lipofectamine^TMLTX，混匀后静置30min； 

（4）、用DMEM洗单层细胞1-2次，加入1000μL DMEM，再把上述（3）的混合液左右轻晃混匀，4-6h后换上含有10%胎牛血清的细胞生长培养基，转染48小时。 

在其中一个实施例中，所述表达载体pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB的摩尔数比为3:1。 

在其中一个实施例中，所述可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系的筛选步骤为： 

转染48小时后，弃培养基，用PBS洗1-2遍单层细胞，加500μg/mLG418筛选浓度培养基4mL，隔天换液，置于39℃，5%CO₂，饱和湿度继续培养至有单个的细胞克隆出现时，分离出单个的细胞克隆，并做 扩大培养，即得单克隆转基因细胞系。 

本发明还提供了上述构建方法构建得到的抗猪圆环病毒2型的转基因猪。 

本发明针对PCV2rep基因，筛选出可以有效抑制PCV2的siRNA（small interference RNA）序列，构建由H1启动子调控的shRNA（short hairpin RNA）piggyBac转座子表达载体pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP，再将该载体利用细胞工程技术导入猪的基因组，并采用体细胞核移植技术生产出转基因猪。检测结果表明：抗猪圆环病毒2型转基因猪基因组中插入了目的基因，并且成功检测到siRNA的表达。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 

1、本发明的表达载体具有可视化筛选neo-EGFP融合双标记、piggyBac高效转座系统和Lox-Cre酶系统，piggyBac转座子极大地提高了转基因效率，且将普通质粒串联重组的转基因整合模式变成了单位点单拷贝整合，更好的模拟生物基因的内环境。EGFP绿色荧光标记，便于检测，其loxp重组位点，也可以方便后期删除。 

2、本发明构建的转基因猪通过自身合成siRNA来降解PCV2mRNA，可从根本上抑制猪圆环病毒2型的感染，显著降低生产成本，提高养猪业的利润，减少PCV2对人和环境的危害，而且获得了抗猪圆环病毒2型的一种转基因猪生物模型，有利于促进养猪业疾病防控的进一步研究。 

3、采用本发明构建的表达载体构建的转基因猪，表达载体上的 氨苄基因在整合进猪基因组时会被转座酶切除，且检测到siRNA在转基因猪中特异性的表达，使得本发明的转基因猪更具有实用性和实践性。 

附图说明

图1为实施例1中H1启动子的PCR扩增结果电泳鉴定图谱，其中M为marker，1为H1启动子的PCR扩增产物； 

图2为实施例1中pPB-H1-sh2质粒的PCR扩增结果及酶切电泳鉴定图谱，其中M为marker，1为pPB-H1-sh2质粒，2为XhoI单酶切鉴定结果，3为XhoI和AscI双酶切鉴定结果； 

图3为实施例1中loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段的PCR扩增结果电泳鉴定图谱，其中M为marker，1为EGFP-Neo融合双标记片段的PCR产物； 

图4为实施例1中抗猪圆环病毒2型的表达载体：pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP的PCR扩增结果电泳鉴定图谱电泳，其中M为marker，1为质粒pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP，2为XhoI单酶切鉴定结果，3为SalI和AscI双酶切鉴定结果； 

图5为实施例1中抗猪圆环病毒2型的表达载体：pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP图谱； 

图6为实施例2筛选的抗PCV2转基因细胞（200x），其中左为绿色荧光视野，右为白光视野； 

图7为实施例3的转基因猪绿色荧光检测结果，其中A部分为活体 照片，B部分为解剖照片，蓝光为荧光灯蓝光激发条件下所拍照片，自然光为自然条件下所拍照片；转基因代表获得的转基因猪，野生型为同期出生的同品种杜洛克非转基因猪。 

图8为实施例3的转基因猪PCR、southern blot结果，其中A部分，M为DNA Marker，1至8为8只不同转基因猪DNA样品的pPB-sh2目的基因片段PCR扩增产物；9,10为非转基因猪DNA对照；最后一条泳道是质粒对照；A部分第一张图代表目的基因片PCR扩增电泳结果，第二张图代表转座酶质粒PCR扩增电泳结果，β-actin为内参基因对照；B部分，M为DIG标记的Marker，1C是将带有pPB-sh2基因的转基因质粒用于Southern杂交的1个拷贝的阳性对照，3C是将带有pPB-sh2基因的转基因质粒用于Southern杂交的5个拷贝的阳性对照，5C是将带有pPB-sh2基因的转基因质粒用于Southern杂交的10个拷贝的阳性对照；1至8为8只不同转基因猪DNA的pPB-sh2基因片段southern blot杂交结果，9,10为非转基因猪DNA对照。 

图9为实施例3的IPCR实验结果，其中A、B分别代表目的基因在4号染色体和2号染色体2个不同的整合位点示意图； 

图10为实施例3的siRNA相对定量实验结果，其中603201,603205,603305为非转基因猪；920603,31502,931503,931504,931506,931600,931601,931602,931603为转基因猪。 

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。 

如无特殊说明，以下实施例中所使用的试剂均来源于市售，操作方法均为现有常规操作方法。 

实施例1抗猪圆环病毒2型的piggyBac转座子表达载体：pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP的构建 

包括以下步骤： 

(1)、合成H1启动子序列

H1启动子的序列来自于商业性载体pSilencer3.1-H1-neo质粒（Ambion公司），其长度为99bp。在该H1启动子序列的5′端加上酶切位点XhoI，3′端加上酶切位点EcoRI，委托公司合成其序列，合成得到H1的序列为SEQ ID NO:1。将H1启动子序列插入到质粒pUC57（金斯瑞生物科技有限公司）中，命名为pUC57-H1；设计引物(H1-F：GAACCCACTGCTTACTGGCTTATCG；H1-R：GGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC)扩增质粒pUC57-H1中H1启动子序列，然后回收PCR产物；由图1可知，质粒pUC57-H1中H1启动子扩增序列大小与预期相符（约110bp）。回收H1启动子。 

(2)、将H1启动子序列连接到pCyL50载体(Sanger Institute赠送)上； 

将回收的H1启动子片段与质粒pCyL50分别用XhoI和EcoRI酶进行酶切。酶切后纯化，再利用TaKaRa连接试剂盒进行连接。把连接产物转化感受态细胞DH5α，培养后挑选单克隆菌落进行扩大培养，通过菌液PCR初步验证是否获得阳性克隆。再提取阳性克隆的质粒，利用XhoI和EcoRI进行酶切鉴定，并电泳检测酶切结果。选择酶切结果 与预期相符的2-3个克隆送往上海英骏生物技术服务有限公司进行正反两个方向测序，测序结果与目的序列一致，说明成功将H1启动子连接到pCyL50载体上，即pPB-H1质粒构建成功。 

(3)、扩增目的基因pPB-sh2序列并连接到pPB-H1质粒上； 

设计重叠延伸引物，并分别在两端加入酶切位点EcoRI和AscI。 

引物分别如下： 

sh2-F：5’-ggaattcaccacatactggaaaccacttcaagagagtggtttccagtatgtggtttt-3’(SEQ ID NO:2) 

sh2-R：5’-aggcgcgccttccaaaaaaaccacatactggaaaccactc-3’(SEQ ID NO:3) 

上游DNA片段sh2-R(SEQ ID NO:3)和下游DNA片段sh2-F(SEQ ID NO:2)同时作为重叠延伸PCR的反应模板。 

重叠延伸PCR的反应体系如下： 

重叠PCR扩增的反应程序为：98℃3min；98℃10s，50℃10s， 72℃10s；30个循环；72℃10min。 

PCR扩增得到pPB-sh2序列，为SEQ ID NO:4。按照(2)所述同样的方法将pPB-sh2序列连接到pPB-H1质粒上，构建出由H1启动子调控的产生发夹结构的shRNA分子pPB-H1-sh2，序列为SEQ ID NO:11。由图2可知，pPB-H1-sh2质粒大小符合要求，酶切结果与预期相符（约4039bp）。 

(4)、将含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段连接到(3)的pPB-H1-sh2质粒上 

以质粒pPSP-PB-neoEGFP-XynB-manA(SEQ ID NO:13，这个质粒是经过申请人采用改造常规手段，PCR、酶切以及连接的方法改造而成的)为模板，设计引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，5′加酶切位点SalI扩增出含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段； 

引物序列分别如下： 

Neo/EGFP-F:5’-GTCGACCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGC-3’(SEQ ID NO:9); 

Neo/EGFP-R:5’-GTCGACGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQ ID NO:10) 

PCR的反应体系为 

PCR反应程序：98℃3min；98℃30s，65℃30s，72℃3min；35个循环；72℃10min。 

PCR结束后，对PCR的结果进行鉴定，由图3可知，loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段大小与预期相符（约3052bp）。 

按照(2)所述同样的方法将其连接到(3)所述的载体上，完成抗猪圆环病毒2型的表达载体：pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP的构建，结果如图4所示，从图4可知，获得的表达载体与预期相符（约6944bp）。再经测序确定，质粒序列与所设计序列完全相符，序列为SEQ ID NO:12。至此即已完成抗猪圆环病毒2型的piggyBac转座子表达载体：pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP的构建。载体图谱如图5所示。 

其中该步骤中，质粒pcDNA3.1-NEO-2A-EGFP的构建步骤为： 

a、扩增neo 

以质粒pcDNA3.1（+）（life technology）为模板，设计引物EcoRI-neo-1(SEQ ID NO:5)，neo-T2A-2(SEQ ID NO:6)扩增neo基因。PCR反应程序：98℃2min；98℃10s，68℃50s；35个循环；72℃10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。接着用EasyPure PCR Purification Kit（北京全式金生物技术有限公司）对PCR产物纯化（简称―过柱纯化），去除引物和其他杂质； 

b、扩增EGFP 

以质粒pT2AL200R175-CAGGS-EGFP（life technology）模板，设计引物T2A-EGFP-3(SEQ ID NO:7)，EGFP-4(SEQ ID NO:8)扩增EGFP。其中，上游引物T2A-EGFP-3(SEQ ID NO:7)中有15pb左右与neo-T2A-2(SEQ ID NO:6)重叠序列，去掉neo的终止密码子加入GCC三个碱基，下游引物有限制性内切酶XbaⅠ酶切位点和保护碱基。PCR反应程序和产物纯化条件与步骤a相同。 

c、neo-EGFP融合基因 

经纯化回收neo和EGFP的PCR产物进行浓度测定，调整浓度后，各取1μL混合后作为模板进行PCR扩增。PCR反应程序：98℃，2min；98℃，10s；68℃，1min40s；35个循环；72℃，10min。得到neo-EGFP融合基因。酶切鉴定，鉴定结果与预期相符。 

d、pcDNA3.1-Neo-T2A-EGFP载体构建 

把上述通过重叠PCR得到的neo-EGFP融合基因过纯化柱，去除引物和PCR反应废液。用

（Thermo scientific）和

（Thermo scientific）双酶切pcDNA3.1（+）质粒和PCR产物neo-EGFP融合基因。酶切产物过柱纯化回收。用Ligation Kit Ver.2.0连接试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）于16℃连接仪中恒温过夜连接。最后构建成pcDNA3.1-Neo-T2A-EGFP 载体，并进行酶切鉴定，鉴定结果与预期相符。 

在pcDNA3.1-Neo-T2A-EGFP载体的构建过程中，合成的引物序列如表1。 

表1构建pcDNA3.1-Neo-T2A-EGFP载体所采用的引物 

实施例2利用实施例1构建得到的表达载体构建抗猪圆环病毒2型的转基因猪 

包括以下步骤： 

1、筛选可稳定表达的单克隆抗体

将转座子质粒pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP(即实施例1构建得到的表达载体)与转座酶质粒mPB（Sanger Institute赠送）混合共转染猪胎儿成纤维细胞系；用无抗生素的含有10%胎牛血清的细胞生长培养基复苏猪胎儿成纤维细胞至直径为60mm细胞培养皿中，当细胞达到 50%-80%汇合度时即用于转染。转染步骤如下： 

（1）把转座子质粒pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB按摩尔数比3:1混合加入到1000μL

I（life technology）的离心管中，混匀； 

（2）PLUS^TMReagents（life technology）用前混匀，取7μL加入离心管中，混匀后静置5min； 

（3）Lipofectamine^TMLTX（life technology）用前混匀，取21μL加到混合液中，混匀后静置30min； 

（4）用DMEM洗单层细胞1-2次，加入1000μL DMEM，再把上述（3）的混合液加入细胞培养皿中，左右轻晃混匀，4-6h后换上含有10%胎牛血清的细胞生长培养基。 

转染48小时后，吸弃培养基，用PBS洗1-2遍单层细胞，加500μg/mL G418筛选浓度培养基4mL，隔天换液。同时将未转染的猪胚胎成纤维细胞用作抗生素筛选的对照细胞。将所有的细胞培养板置于39℃，5%CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中继续培养。当有单个的细胞克隆出现时，用克隆环分离出单个的细胞克隆，并做扩大培养，即得可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系。获得结果如图6所示。 

2、体细胞核移植

(1)猪卵母细胞－颗粒细胞复合体（COCs）的采集及体外成熟培养从猪屠宰场（广东省天河肉联厂）收集猪卵巢，放入含有1%双抗（双抗为life technology的产品：Penicillin-Streptomycin-Glutamine）的28～37℃生理盐水中并于4h内送回实验室。用37℃的生理盐水清洗 后拿带有18号针头的10mL注射器抽取直径为2～6mm卵泡中的卵母细胞。在显微镜下挑选出细胞质均匀、卵丘致密且包裹3层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体（Cumulus oocyte complexes，COCs），用M199成熟培养液洗涤后，转入提前置于CO₂培养箱中孵育4h以上的加有500μLM199培养液的四孔板内，在39℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养42～44h。 

(2)COCs上颗粒细胞的去除和成熟卵的挑选 

卵母细胞成熟后，将COCs转移到含透明质酸酶的离心管中，用移液器吹打后将液体转移到30mm培养皿中，用吸管将脱去卵丘的卵母细胞拣出。洗涤后于实体显微镜下挑选排出第一极体的卵母细胞。 

(3)供核细胞的准备 

用胰酶消化后离心洗涤，用HN操作液(无钙H-NCSU-23显微操作液)将卵母细胞沉淀重悬并吹打均匀后用作核供体。 

HN操作液的配方如下(所有试剂均为分析纯级别，购自广州康龙生物科技有限公司)： 

(4)卵母细胞的去核与注核 

挑选已排出第一极体且形态良好的卵母细胞，用外径为100～120μm的固定针，内径为15～20μm的去核针采用盲吸法去核：在65mm无菌培养盘中加入约50μL的操作液滴，并用石蜡油覆盖，然后将30个左右的卵母细胞和适量的体细胞移入其中。用固定针固定住卵母细胞，用去核针拨动卵母细胞使极体在大约5点钟的位置。用去核针沿3点钟位置刺进去，去除极体及附近的胞质，之后把针撤出并将极体和胞质吐出，挑选一个体细胞注入卵周隙中即完成胚胎重构过程。重构胚胎放入胚胎培养液中恢复培养1h。 

(5)卵母细胞和体细胞的融合及激活 

将重构卵分批转移到融合液中平衡2min后用融合/激活液洗涤3遍，按每批5～8个放入已铺满融合液的融合槽内，用实心玻璃针拨动重构卵使供核细胞-受体卵的细胞膜接触面与电极平行，施加120v/mm,100μs,2DC的直流电脉冲诱导融合同时激活重构胚，接着用胚胎培养液洗涤3遍后立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，置于39℃，5%CO₂饱和湿度的培养箱中，4h后在体视显微镜下判定融合情 况。将已融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后，转入预平衡好的胚胎培养液，置于39℃，饱和湿度，低氧（5%O₂+5%CO₂+90%N₂）的条件下培养。 

(6)通过手术移植克隆胚生产转基因猪 

受体母猪为广东省华农温氏畜牧股份有限公司的优质母猪。本发明采用输卵管移植法，胚胎发育处于为2细胞或4细胞期时进行移植。手术当天对母猪禁食，手术前绑定母猪并对它进行全身静脉麻醉。手术部位选择在倒数第二对乳头中间部位，先用清水清洗手术部位及四周，擦干后先用碘酒大范围消毒，再用75%酒精脱碘。盖上手术布同时暴露手术部位，沿腹中线切开皮肤和皮下肌肉，然后分离皮下脂肪和腹膜，手探入腹腔，慢慢牵引出子宫和输卵管，检查排卵情况。将装有胚胎的吸胚管从输卵管伞口插入，小心将胚胎吹入。然后恢复子宫和输卵管到腹腔内。常规手术缝合，术后连续4天注射抗生素消炎。即得到能抗猪圆环病毒2型的转基因猪。 

实施例3实施例2构建得到的抗猪圆环病毒2型的转基因猪的检测 

通过以下方法进行检测 

1、绿色荧光检测 

用蓝色光灯直接照射检测，转基因阳性猪可发绿色荧光，如图7所示，转基因猪的各解剖器官均发绿色荧光，初步证明抗猪圆环病毒2型的转基因质粒已整合且能在转基因猪上表达。 

2、DNA水平的检测 

通过PCR、southern blot、IPCR等方法进行DNA水平的检测，图8为转基因猪PCR、southern blot结果，从图8可知，转基因猪和质粒(整合进入转基因猪中的质粒即为实施例1构建得到的载体，但不含Amp部分）的DNA的PCR扩增产物具有pPB-sh2基因片段(650bp)，而非转基因猪DNA的PCR扩增产物不具有pPB-sh2基因片段；转座酶质粒没有整合进转基因猪的基因组中。 

图9为IPCR实验结果，从图9可知，目的基因在4号染色体和2号染色体具有2个不同的整合位点。 

从图8和9可知，实施例1构建得到的载体pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP已经整合进入转基因猪基因组，且为单拷贝多位点整合；mPB质粒未整合进基因组，保证了转座子表达载体pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP整合的稳定性。 

3、RNA水平检测 

siRNA相对定量检测结果如图10所示，由图10可知，非转基因猪中不表达本发明特异性设计的siRNA，而转基因猪中则特异性的表达可降解PCV2mRNA的siRNA，因此实施例2构建得到的转基因猪具备抗PCV2的基础。 

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。 因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 

Claims (10)

1.一种抗猪圆环病毒2型的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、用XhoI和EcoRI酶切SEQ ID NO:1的H1启动子和质粒pCyL50，纯化，连接，转化感受态细胞，培养后挑选单克隆菌落进行扩大培养，筛选阳性克隆，酶切鉴定，得到pPB-H1质粒；

(2)、以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3作为模板及引物进行重叠PCR扩增得到序列号为SEQ ID NO:4的pPB-sh2序列，按步骤(1)相同的方法将pPB-sh2序列连接到pPB-H1质粒上，得到序列号为SEQ IDNO:11的shRNA分子pPB-H1-sh2；

(3)、分别以质粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175-CAGGS-EGFP为模板，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行第一次PCR扩增，纯化得到neo基因和EGFP；各取10ng-200ng混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo-EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pcDNA3.1(+)和neo-EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA3.1-Neo-T2A-EGFP载体；

(4)、以SEQ ID NO:13的质粒为模板，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为引物，PCR扩增出含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段；按步骤(1)相同的方法将含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段连接到pPB-H1-sh2上，得到抗猪圆环病毒2型的表达载体：pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP，序列号为SEQ ID NO:12。

2.根据权利要求1所述的抗猪圆环病毒2型的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中重叠PCR扩增的程序为：98℃3min；98℃10s，50℃10s，72℃10s；30个循环；72℃10min。

3.根据权利要求1所述的抗猪圆环病毒2型的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述第一次PCR的反应程序为：98℃2min；98℃10s，68℃50s；35个循环；72℃10min；所述第二次PCR的反应程序为：98℃2min；98℃10s；68℃1min40s；35个循环；72℃10min。

4.根据权利要求1所述的抗猪圆环病毒2型的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述PCR扩增的反应程序为：98℃3min；98℃30s，65℃30s，72℃3min；35个循环；72℃10min。

5.权利要求1-4任一项所述的构建方法构建得到的抗猪圆环病毒2型的表达载体。

6.一种抗猪圆环病毒2型的转基因猪的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、将权利要求5所述的表达载体与转座酶质粒mPB混合共转染猪胎儿成纤维细胞系，筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；

(2)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，采用常规育种技术进行培育，即可得到抗猪圆环病毒2型的转基因猪。

7.根据权利要求6所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述共转染的步骤为：

（1）、把表达载体pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB混合加入到1000μL中，混匀；

（2）、加入7μL用前混匀的PLUS^TMReagents，混匀后静置5min；

（3）、加入21μL用前混匀的Lipofectamine^TMLTX，混匀后静置30min；

（4）、用DMEM洗单层细胞1-2次，加入1000μL DMEM，再把上述（3）的混合液左右轻晃混匀，4-6h后换上含有10%胎牛血清的细胞生长培养基，转染48小时。

8.根据权利要求6或7所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述表达载体pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB的摩尔数比为3:1。

9.根据权利要求6或7所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系的筛选步骤为：

转染48小时后，弃培养基，用PBS洗1-2遍单层细胞，加500μg/mLG418筛选浓度培养基4mL，隔天换液，置于39℃，5%CO₂，饱和湿度继续培养至有单个的细胞克隆出现时，分离出单个的细胞克隆，并做扩大培养，即得单克隆转基因细胞系。

10.权利要求6-9任一项所述的构建方法构建得到的抗猪圆环病毒2型的转基因猪。

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