CN103421781B - 猪肌肉组织特异性表达基因myf6启动子及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到猪的肌肉组织特异性表达基因myf6不同长度启动子区域的分离鉴定和功能验证。从猪的基因组中克隆了肌肉组织特异性表达基因myf6上游6个不同长度的启动子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：7所示；结果表明-88bp到-1510bp和-1070bp到-1382bp有独立的启动活性。本发明同时公开了6个不同缺失启动子片段、相应重组表达载体的制备方法及双荧光素酶活性检测系统对启动子活性分析的应用。

Description

猪肌肉组织特异性表达基因myf6启动子及应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到猪肌肉组织特异性表达基因myf6的不同长度启动子区域的分离鉴定及功能验证。

背景技术

高等生物基因的表达受到细胞内外环境的精细调控，因而具有严格的时间及空间有序性。基因的表达调控是一个复杂且有序的过程，由多阶段调控水平共同完成，这主要包括转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。其中转录水平的调控是最关键的环节。启动子是转录水平上一个重要的调控元件，是位于结构基因5′端上游区的DNA序列，可与众多的转录因子相互作用调控基因的表达(武力，1999)。因此深入研究启动子的结构、功能、作用模式等有利于我们更好的理解相应基因的功能及基因间的互作关系。

根据启动子作用方式及功能的不同可将启动子分为3类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子是指在该类启动子的调控下，基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织部位表达水平没有明显差异。诱导型启动子是指在某些特定物理或化学信号的刺激下，该种类型启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。组织特异性启动子是指在该类启动子的调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特征。

外源基因在机体中能否高效稳定地表达是基因工程研究的关键。在真核细胞中利用基因工程技术构建多种真核表达系统进行外源基因的表达已经是一项常用的技术，但是经常面临的问题是外源基因的表达量较低，且表达往往存在于机体的几乎所有组织中，如现阶段广泛利用的CMV及SV40启动子。两者均可以携带外源基因与几乎所有类型的细胞中高效地表达。这两种高效的启动子存在的问题是显而易见的：不具备调控基因靶向表达于某一特定组织的能力。能够解决此问题的关键乃是具备较高活性的组织特异性启动子的获得。组织特异性启动子通常以特定的组织细胞结构和化学、物理信号为基础，可对外源基因进行靶向定位，将基因固定于某一组织或细胞中表达，减少了机体能量和物质的损耗及对机体代谢活动的影响，同时又能够起到定向改善某一组织特性的效果，这在人类疾病的治疗方面的前景尤其可观。鉴于组织特异性启动具备这样的特质，在基因工程中越来越获得研究者的青睐。

利用肌肉组织特异性启动子，通过构建相应的表达载体，能够开启基因固定于肌肉中表达。通过外源基因的蛋白或RNAs在骨骼肌中的表达可很好的研究肌肉的分化或功能及改善肌肉的质量。例如可利用肌肉特异性的启动子携带目的MicroRNA特异性的静默其靶基因在肌肉中的表达而不影响其他组织此基因的正常表达，有效的获得目的基因对于肌肉组织的作用；同时可以利用肌肉组织特异性的启动子来研究那些通过QTL图谱定位及表达分析获得的可用于提高肌肉量的候选基因。但其肌肉的缺点是表达效率较低，个体间差异较大，所以，提高外源基因在肌肉组织中的表达具有重要的意义。

生肌调节因子MRFs家族在哺乳动物胚胎发育整个过程中不仅决定肌肉发生和启动并且能够维持骨骼肌的分化以及生长的一个重要调控基因的家族。MRFs家族有四个成员即：MyoD（myf3）、生肌素（MyoG或myogenin）myf5和MRF4（myf6或herculin）(Braun T,et al.,1990)。这个家族中其他三个成员已经有很多的研究，对myf6的研究还是较少的。myf6是一个具有特殊的结构（bHLH）的骨骼肌调节因子之一，并且是在肌肉中特异性表达的基因(Wyszynska-koko J,Kuryl J,2005)。它可以通过与普遍表达的E2A基因产物E12、E47等相结合形成异二聚体，之后异二聚体和靶基因上游的一些启动子或增强子相结合，通过反式作用激活，促进肌肉特异基因的表达，进而促进生肌作用（Bober E,et al.,1991）。Miner等人利用人的myf6基因cDNA序列的基础上成功分离出小鼠myf6基因，之后Hinterberger克隆了大鼠的myf6基因。运用基因敲除的原理来做试验表明，在敲除MyoD的同时也敲除了myf5的小鼠中基本没有肌肉组织的出现，同时也检测不到肌肉相关的标志性基因，同时myogenin对基因的转录所起到的促进作用也没有发现(Hinterberger TJ,MaysJL,Konieczny SF,1992)。如果在没有敲除myf5基因而对MyoD基因进行敲除小鼠中，结果显示myf5基因与myogenin基因的RNA的表达量仅仅为原来表达量的一半。如果敲除myogenin基因，会发现成肌细胞的数目没有变化，它对成肌细胞的形成影响不是很大，但是它不能分化为正常的肌细胞。这些结果表明着myoD基因或myf5基因位于myogenin基因的上游，在肌细胞分化为肌小管的过程中起到独特的作用(Maak S,Neumann K,Swalve HH,2006)。myf6基因位于其它几种生肌因子的下游，不仅在肌纤维的形成上起重要作用，而且在肌肉表型的维持中也起作用。综上所述我们可以看出，myoD和myf5两个转录因子具有同源性，主要是在成肌过程中发挥重要作用；而myogenin和myf6二者也具同源性，主要在肌肉分化过程中发挥作用。myf6是唯一一个在成熟神经节中存在的生肌家族的成员（Buckingham M,et al.,1994）。肌肉分化过程中MyoG表达时，同时myf6也开始逐渐表达，我们不确定在肌肉分化中myf6的具体作用，但仍然认为在肌肉分化的过程中myf6参与肌肉分化。因为在myf6表达的同时也检测出了肌肉中特异性表达的蛋白肌球蛋白(Sumariwalla VM,Klein WH,2001)。myf5先表达，其次MyoG，再次myf6，最后MyoD为生肌家族的普遍的表达顺序；但也有些特殊情况也存在不同的差异，如有时myf6最先表达，或着myf6和myf5两者同时表达（Shibata M,et al.,2006）。

在近些年来，随着myf6基因的深入研究也取得了一些进展。如Wei等人以两种不同的老鼠为实验材料，一种是正常的成年老鼠，另一种是去除神经的成年老鼠，比较了两种不同的老鼠肌肉中myf6基因的mRNA的表达水平，研究结果表明myf6影响着已经发育成熟的肌收缩蛋白的编码同时对乙酞胆碱亚受体的编码也起作用，与此同时结果也显示myf6不仅在肌肉的重生中起重要作用而且对去神经以后的基因的活化过程起也起作用。Pavlath等人分别以野生型的老鼠和基因型的老鼠为研究对象，他们比较了野生型老鼠和转基因老鼠在局部性冻伤的咬肌以及前胫骨肌这两种肌肉中不同时间的myf6的mRNA的表达量，结果显示在肌肉的重生过程中由myf6增量调节和一些肌肉中存在的特异性的因子共同决定；Vykouk-alovaZ等人运用两点连锁分折方法和放射性杂交的技术将猪的myf6基因定位在第5号染色体上。

从目前在植物中及动物中获得的启动子分析发现，普遍存在以下几个方面的问题：特异性并不是很高；分离并且获得应用的特异性启动子并不是很多，限制了在基因工程中的应用；活性低。特别是在动物上的研究还比较欠缺。因此，获得特异性较强表达效率较高的启动子成为亟待解决的问题。

到目前为止，除申请人之外，仍没见到研究猪肌肉组织骨骼肌基因myf6的启动子功能的报道。所以申请人对这个基因进行了不同长度启动子功能的研究，以期能够更好地利用该启动子。

发明内容

本发明的目的在于分离克隆猪的肌肉特异性表达基因myf6启动子区域的不同片段，并对其进行功能验证,以期获得此基因的具备较高启动活性并保持肌肉组织特异性的调控区段。克服目前动物基因工程中可利用的组织特异性启动子数目的不足。

本发明从大白猪的基因组中分离并鉴定出myf6基因具有肌肉组织特异性的启动子。以大白猪的血液基因组DNA为模板扩增获得了1810bp、1422bp、1053bp、763bp、441bp、312bp共6个不同长度的缺失启动子片段（见序列表SEQ ID NO:2-7所示），将这些片段融合报告基因萤火虫荧光素酶基因（简称LUC基因）构建pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-C2 6个真核表达载体，将这些载体分别转染C2C12、PK及3T3-L1细胞，通过双荧光素酶报告系统分析报告基因萤火虫荧光素酶的相对活性，从而获得保持肌肉组织特异性的核心启动子区。

本发明通过以下技术实现：

本发明的技术路线见图1所示。

利用BLASTn数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）搜索获得猪肌肉组织特异性基因myf6的上游调控序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用TESS、TFSEARCH及MethPrimer生物信息学软件预测分析核心启动子区域、顺反式作用元件及CpG岛分布情况。根据预测结果设计5对缺失引物（其核苷酸序列见表1），利用PCR法从大白猪的基因组中分离获得肌肉组织特异性启动子。构建报告基因LUC融合载体，申请人将其分别命名为pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5其片段长度分别为1810bp、1422bp、1053bp、763bp、441bp，其核苷酸序列分别如下SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示。瞬时转染C2C12、PK及3T3-L1细胞，双荧光素酶报告系统检测发现pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5仅在C2C12细胞中表达，在其余两种细胞中的表达量同阴性对照pGL3-basic无显著性差异。pGL3-basic-Q2的活性在C2C12中有了极大的提高，同上述前5种载体的活性相比而言有极显著的差异，在PK细胞中并无明显变化。结果显示1422bp pGL3-basic-Q2的片段中间序列具备独立的启动报告基因表达的功能并同时保持着肌肉组织的表达特异性。但是pGL3-basic-Q2片段有1422bp作为核心启动子区域有点长，根据这段序列存在的相关转录因子又对这一段进行了缺失，选择312bp为核心的启动子区域用pGL3-basic-C2表示，序列SEQ ID NO：7。瞬时转染C2C12、PK及3T3-L1细胞，双荧光素酶报告系统检测发现，在C2C12细胞中高量表达，比pGL3-basic-Q2表达量高，所以确定pGL3-basic-C2为核心启动区域。

本发明的具体步骤如下：

在前人研究的基础上选择具备肌肉组织特异性的表达基因myf6，在美国国立生物研究所网站NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTn数据库，搜索获得该基因的上游调控序列，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。利用TESS、TFSEARCH及MethPrimer等生物信息学软件对序列SEQ ID NO：1预测其核心启动子区域、顺反式作用元件及CpG岛分布情况。根据网络预测的结果设计缺失引物，以大白猪基因组DNA为模板，PCR扩增获得6个不同长度的启动子区域，序列分别如序列表SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：7所示。将这些启动子候选片段装载到pGL3-basic报告基因LUC上游多克隆位点（载体图及多克隆位点等信息见图2）处，装配成融合表达载体(图3)。通过脂质体介导的转染法将融合表达载体瞬时转入C2C12、PK及3T3-L1细胞，同时转入海肾荧光素酶报告基因pRL-TK为内参质粒。本发明设置阴性对照pGL3-basic（图2），阳性对照pGL3-control。转染48h后通过双荧光素酶报告系统对报告基因LUC进行定量分析，进而考察验证该启动子的不同缺失片段在不同来源细胞中的启动功能。检测结果表明pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-C2仅在C2C12细胞中表达，在其余两种细胞中的表达量同阴性对照pGL3-basic无显著性差异。pGL3-basic-C2的活性在C2C12中有了极大的提高，同上述前六种载体的活性相比而言有极显著的差异，在PK细胞中并无明显变化。结果显示312bp。pGL3-basic-C2的片段中间序列具备独立的启动报告基因表达的功能并同时保持着肌肉组织的表达特异性。

本发明的优点在于：

（1）本发明详尽的验证了myf6启动子的各个区段在不同来源细胞中启动基因表达的能力，为myf6基因的表达调控带来了更深层次的认知。

（2）本发明鉴定了肌肉组织特异表达的启动子myf6的核心区段，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》的内容。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1，是本发明克隆的猪肌肉特异表达基因myf6的上游调控核苷酸序列，长度为2000bp。

序列表SEQ ID NO：2是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q1的核苷酸序列，长度为1810bp。

序列表SEQ ID NO：3是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q2的核苷酸序列，长度为1422bp。

序列表SEQ ID NO：4是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q3的核苷酸序列，长度为1053bp。

序列表SEQ ID NO：5是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q4的核苷酸序列，长度为763bp。

序列表SEQ IDNO：6是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q5的核苷酸序列，长度为441bp。

序列表SEQ ID NO：7是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-C2的核苷酸序列，长度为312bp

图1：本发明的技术路线图。

图2：表示载体pGL3-basic结构示意图，在多克隆位点的下方包含报告基因luc+。

图3：构建好的以pGL3-basic为骨架的融合载体简图。肌肉特异表达基因myf6的启动子系列缺失片段来驱动LUC基因表达，由图中的deleted promoter来表示。Amp为氨苄抗性筛选基因；luc+为报告基因萤火虫荧光素酶；MCS表示多克隆位点；箭头方向表示基因或启动子表达的方向。

图4：融合载体pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-C2的KpnⅠ和NheⅠ双酶切鉴定图。M表示DL marker 2000,1-6分别表示融合载体pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-C2的双酶切结果，上面较大的条带为载体条带，下端为缺失启动子条带，条带长度分别为1810bp、1422bp、1053bp、763bp、441bp、312bp。

图5：猪肌肉特异表达基因myf6的系列缺失启动子驱动LUC基因在不同来源的细胞中的表达情况。其中图5A是pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5双酶切图；图5B是pGL3-basic-C2双酶切图。

具体实施方式

实施例1：大白猪基因组DNA的提取及猪的肌肉组织特异性表达基因myf6的启动子候选片段及相应缺失片段的获得

1、大白猪基因组DNA的提取：

将现场所采大白猪（来自华中农业大学精品猪场，为常规报道的品种，下同）新鲜血液加入0.5M乙二胺四乙酸（即EDTA，购自武汉市江润精细化工有限责任公司）作为抗凝剂（按血液量体积比的1/10），并摇匀，防止凝血。

白细胞分离：

（1）4℃，6000rpm，离心10min，去血清。

（2）加入2倍体积双蒸水，轻轻摇匀沉淀10min，破碎红细胞。

（3）4℃，6000rpm，离心10min，去上层红细胞浆。

（4）利用0.9%NaCl洗涤沉淀，轻轻摇匀10min。

（5）4℃，6000rpm，离心10min，弃上清，得到白细胞沉淀。

总DNA提取：

（1）在白细胞沉淀或肌肉组织磨碎浆液中，加入等体积1×SET（1ml），蛋白酶K（10mg/mL）至终浓度100μg/mL，10％十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度0.5%，摇匀，55℃水浴摇床中温育过夜消化。

（2）在消化液中加入等体积的Tris饱和酚，轻轻摇匀15min，于4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，注意标上相应的记号。

（3）加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（体积比25：24：1），缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。

（4）加入等体积的氯仿/异戊醇（体积比24：1），缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。

（5）将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，小心混匀后可见白色絮状DNA沉淀。

（6）用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水溶解DNA。

（7）在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测DNA提取质量。

2、猪的骨骼肌特异性表达基因myf6的启动子候选片段及相应缺失片段的获得

利用报道的猪的myf6基因的DNA序列(GenBank登录号：397005)为探针序列，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）选择第一外显子ATG上游的2000bp序列作为启动子候选片段。利用TESS、TFSEARCH及MethPrimer等生物信息学软件预测此段候选序列的核心启动子区域、顺反式作用元件及CpG岛分布情况。根据网络预测的结果设计缺失引物（相应的引物序列如表1对应的编号所示；PCR反应参数设置如表2所示）。其中P1F/R、P2F/R、P3F/R、P4FR、P5F/R、P6F/R依次代表构建的6个5，端缺失载体的前向引物（正向引物）和后向引物（反向引物），前向引物添加酶切位点NheⅠ（GCTAGC,以下划线表示），同时携带保护性碱基CTA（阴影表示）；后向引物添加的酶切位点为KpnⅠ（GGTACC，以下划线表示），同时携带保护性碱基CGG（以阴影区表示）；将载体分别命名为TA-Q1、TA-Q2、TA-Q3、TA-Q4、TA-Q5、TA-Q6。

表1：本发明的启动子缺失载体引物的设计

表2PCR扩增参数

实施例2：猪的肌肉特异性表达基因myf6的启动子候选片段及相应缺失片段的转染载体构建。

将实施例1获得的猪肌肉特异性表达基因myf6缺失片段与载体pGL3-basic连接，酶切载体（载体pGL3-basic，购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司）及缺失片段的TA克隆质粒TA-Q1、TA-Q2、TA-Q3、TA-Q4、TA-Q5、TA-Q6。用KpnⅠ、NheⅠ双酶切pGL3-basic及TA-Q1、TA-Q2、TA-Q3、TA-Q4、TA-Q5、TA-Q6（载体pGL3-basic的多克隆位点等信息见图2）。酶切体系如表3所示：

表3酶切体系

37°C酶切2h后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切的完整性并回收目的片段：pGL3-basic回收较大的片段，TA-Q1、TA-Q2、TA-Q3、TA-Q4、TA-Q5、TA-Q6回收相应大小的缺失片段。用上海莱枫生物基因技术有限责任公司生产的胶回收试剂盒回收（按该试剂盒的说明书操作），置于-20℃冰箱保存。

（2）将酶切回收的缺失片段连接到pGL3-basic载体上（见图3）

连接体系如表4所示：

表4连接体系

16°C水浴连接12h后，将其转入大肠杆菌DH5α中,在含氨苄青霉素（Amp）的LB平板上筛选阳性单克隆,对重组子进行PCR及酶切鉴定,将阳性重组子挑出送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。对于测序正确的阳性克隆按原菌液：培养基体积比=1:100的比例进行扩大培养，37°C摇床摇16h后用OMEGA公司生产的可用于细胞转染的质粒小量抽提试剂盒（D6950-01）抽提质粒，分别命名为pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-C2。用KpnⅠ、NheⅠ双酶切鉴定抽提的质粒，酶切体系如上所述，此时质粒只需加1μL酶切结果见图4。用640核酸-蛋白质浓度测定仪（美国Beckman公司产品）测定质粒的浓度，置于-20℃冰箱备用。

实施例3：脂质体介导的细胞转染

本发明用24孔细胞培养皿做转染用。为了消除实验的误差，每个重组载体均进行三轮独立的试验，每次试验做三个复孔。根据Lipofectamine^TM2000（invitrogen公司）说明书操作，每孔按载体的质量：脂质体的体积=1μg：3μL的比例转染。转染的受体为不同来源的细胞，主要包括小鼠肌源细胞系C2C12、猪肾细胞PK及小鼠前脂肪细胞系3T3-L1细胞（简称3T3-L1，购自湖北省疾病预防控制中心）。重组载体转染入细胞48h后收集细胞裂解液后利用双荧光素酶检测系统对缺失启动子的活性进行分析。本发明的细胞培养、诱导分化、转染的主要步骤及各种溶液的配制如下所述：

（1）主要溶液的配制

1）细胞生长液（10%浓度的胎牛血清培养基FBS）：将胎牛血清（购自GIBCO BRL公司）放置于4℃冰箱融化，待其完全融化后，用50mL的注射器吸取100mL的已过滤的胎牛血清，加入100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素，DMEM/F12培养基（购自invitrogen公司），定容至1L，分装置于4℃冰箱备用。

2）细胞消化液：胰酶2.5g、Na₂HPO₄ 1.15g、KCl 0.2g、NaCl 8.0g、KH₂PO₄ 0.2g，溶于900mL双蒸水中，待完全溶解后，定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃冰箱中备用。

3）平衡盐溶液PBS：2.89g的Na₂HPO₄、0.2g的KCl、0.2g的K₂HPO₄、8g NaCl加入800mL双蒸水，充分溶解后定容至1L，高压灭菌后室温放置待用。

4）细胞冻存液：分别吸取1.50mL的二甲基亚砜（DMSO）、6.00mL的胎牛血清培养基（FBS）和7.50mL的DMEM（购自invitrogen公司），充分混匀后，以每管1.50mL的量分装置于-20℃冰箱中备用。

（2）细胞培养

1）根据细胞的生长状况及时更换培养液：当细胞培养液变黄时应更换培养液，吸出旧的培养液，加入新鲜的培养液，一般是24h更换一次。

2）细胞生长至80%的汇合度后进行传代，吸管吸出旧的培养基，用1×磷酸缓冲液（PBS）（购自invitrogen公司）冲洗两次。

3）预先将0.25%胰蛋白酶置于37℃培养箱温浴几分钟以减少对细胞的伤害。50cm²细胞培养瓶加入1mL消化液（购于invitrogen公司）即可，快速的前后旋转细胞瓶以便胰蛋白酶可以覆盖所有细胞，然后置于培养箱中约1min，加速胰蛋白酶的消化。

4）待细胞附着松动，快速的向培养瓶中加入新鲜的10%浓度的FBS细胞生长液（购自杭州四季青生物有限公司）终止胰蛋白酶的作用。

5）用吸管反复吹打瓶壁细胞，使之瓶完全从壁上脱离形成细胞悬液。

6）各吸出1/3的细胞悬液移入新的细胞瓶中，补充新的细胞生长液，使每瓶终体积达到4mL。

（3）脂质体介导的细胞转染步骤

1）转染前一天，取一瓶生长状况良好的细胞用胰蛋白酶消化后，加入2mL新鲜的不含任何抗生素的10%的FBS细胞生长培养液，用吸管将细胞完全吹散形成均匀的细胞悬液后，用细胞计数板对细胞进行计数。计算出24孔细胞培养板共需细胞量（每孔细胞数目约为0.5-2×10⁵），然后吸出共需的悬液，向其内加入额外的新鲜的不含任何抗生素的10%的FBS细胞生长培养液（总体积12mL），吹打均匀后，每孔分装500μL细胞悬液，轻轻晃动培养板摇匀细胞后置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养24h。

2）对于每孔待转染的细胞：根据待转染质粒的浓度及每孔待转染质粒的量1μg取适量的质粒加入到50μLOPTI-MEM培养液（购自invitrogen公司，按该试剂的说明书操作）中，轻轻吹打混合均匀后室温静置5min；以质粒量：Lipofectamine^TM2000的体积量为1：2.5的情况下，取2.5μL的Lipofectamine ^TM2000加入到50μLOPTI-MEM培养液中，混合均匀后室温静置5min。

3）将步骤2）中的两份混合液在30min内混合均匀，室温静置20min。

4）弃原培养液，用1×PBS或OPTI-MEM培养液清洗细胞两次，并将清洗液吸净。

5）每孔细胞加入3）中混合液100μL后补足OPTI-MEM培养液至总体积为500μL，以前后左右十字交叉的姿势晃动培养板以混合均匀。

6）37℃，5%CO₂细胞培养箱培养6h后更换成不含任何抗生素的10%的FBS细胞生长培养液

实施例4：肌肉特异性表达基因myf6的启动子候选片段及相应缺失片段的双荧光酶活性的检测

本实施例设置阴性对照质粒pGL3-basic，阳性对照质粒pGL3-control，以海肾荧光素酶报告基因PRL-TK（载体购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，即美国Promega公司）做内参质粒（用以校正转染效率），以Lipofectamine^TM2000做转染试剂，在24孔的细胞培养皿中按每孔载体的质量：脂质体的体积=1μg：3μL的比例将构建的缺失载体分别瞬时转染小鼠肌源细胞系C2C12、猪肾细胞PK、小鼠前脂肪细胞系3T3-L1诱导分化的肌管，以空转染做对照，转染细胞48h后收集细胞裂解液，利用双荧光素酶报告基因检测试系统对猪骨骼肌特异性表达基因myf6的启动子不同缺失片段的活性及组织特异性进行分析，确定高活性并具备肌肉组织表达特异性的区段。结果表明（见图5所示）：在三种不同的细胞中，构建的6缺失载体pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-C2在PK细胞和3T3-L1中的活性很低同阴性对照pGL3-basic相比并无明显的差异，在C2C12细胞中pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-C2活性很高，其中pGL3-basic-C2的活性最高。本发明的结果最终获得312bp的启动子片段（即构建的重组表达载体pGL3-basic-C2，序列信息见SEQ ID NO：7，具备独立的启动功能兼具肌肉组织特异性。

参考文献

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Claims (4)

1.一个调控猪肌肉组织特异基因myf6的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

2.一个调控猪肌肉组织特异基因myf6的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7所示。

3.权利要求1或2所述的启动子在猪遗传改良中的应用。

4.权利要求3的应用，其中包括调控猪肌肉组织特异性表达中的应用。