CN109706173A - 一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1 - Google Patents
一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109706173A CN109706173A CN201910098244.0A CN201910098244A CN109706173A CN 109706173 A CN109706173 A CN 109706173A CN 201910098244 A CN201910098244 A CN 201910098244A CN 109706173 A CN109706173 A CN 109706173A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- egr1
- gene
- sequence
- pzsw
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101150114117 EGR1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims abstract description 17
- 101100444898 Mus musculus Egr1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 13
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 17
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 16
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 14
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 13
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 102100021339 Multidrug resistance-associated protein 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 7
- SPTYHKZRPFATHJ-HYZXJONISA-N dT6 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CO)[C@@H](O)C1 SPTYHKZRPFATHJ-HYZXJONISA-N 0.000 claims description 7
- 108010066052 multidrug resistance-associated protein 1 Proteins 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101150017517 MRP1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims description 3
- 239000000155 melt Substances 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 96
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 15
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- JKMPXGJJRMOELF-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazole-2,4,5-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC(C(O)=O)=C(C(O)=O)S1 JKMPXGJJRMOELF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW‑1，属于基因工程技术领域，其特征在于：首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着设计最优靶向Egr1的干扰片段，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体，命名为pZSW‑1，转染A549/DDP细胞后，通过qRT‑PCR、Western blot和流式细胞仪检测，结果显示，干扰Egr1后，MRP 1基因表达也随之降低，转染pZSW‑1实验组细胞内Rho‑123荧光强度高于对照组2.23倍，差异显著，MRP 1外排能力显著下降；说明沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1，属于基因工程技术领域。
背景技术
癌症严重威胁着人类健康，癌细胞的产生是由于人体内原癌基因和抑癌基因受多种因素刺激，导致表达失衡，引起正常细胞的癌变。2018年国家癌症中心数据显示，肺癌是发病率和死亡率较高的肿瘤疾病之一，每年新发病例约为50万例。药物化疗是治疗肿瘤疾病常用的手段之一，但长时间的化疗使肺癌细胞产生耐药性，导致其治疗效率降低(郑佳彬，2017)。多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗癌药物产生耐药性，同时对多种结构不同、作用机制不同的抗肿瘤药物产生的交叉耐药现象，其作用机制复杂。研究表明，多药耐药相关蛋白1(MRP 1)基因的过表达是肿瘤细胞产生耐药性的重要机制之一(Cole S P C，2014)。下调MRP 1蛋白表达，将有助提高肿瘤细胞对药物的敏感性，逆转肿瘤细胞的耐药现象。早期生长反应-1(early growth response,Egr 1)是一种重要的核转录因子(Karthikkeyan Gand Nagaraj N R，2018)，在调控细胞的生长、分化、发育、增殖等方面发挥着重要的作用。Egr 1基因在绝大多数的肿瘤细胞中均有表达，参与了从肿瘤形成、增殖分化到凋亡的全过程(林芳，2010)。Egr1是DNA结构域含有3个Cyc2-His2锌指结构的转录因子(韩雷，2007)，在锌离子存在的条件下，锌指结构与DNA序列中富含GC区结合，发挥转录调控作用。因此，Egr1可作为转录因子调控诸多靶基因的表达。大量研究证实，Egr 1与靶基因上特异地结合位点作用调节细胞发挥各种生物学功能。肿瘤细胞中某些基因的突变可能促使Egr1表达升高，对于这些肿瘤细胞来说，Egr1基因的高表达与肿瘤的发生、发展有关，并可能起到促肿瘤的作用。因此如何发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1成为急需解决的一大难题，所以通过首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人Egr1基因(NM_001964.2)mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向Egr1的干扰片段；正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接，反向序列后连接终止序列TTTTTT；分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为shEgr1-3，以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组；shRNA的退火，使其形成双链片段，构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体，命名为pZSW-1。利用shRNA干扰表达载体转染A549/DDP细胞，通过qRT-PCR检测RNAi后的Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测RNAi后的Egr 1和MRP1蛋白表达水平，用流式细胞仪检测Rho-123药物外排，发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1是必要的。
发明内容
为了克服如何通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的难题，本发明提供了一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1，该一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1，首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人Egr1基因(NM_001964.2)mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向Egr1的干扰片段；正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接，反向序列后连接终止序列TTTTTT；分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为shEgr1-3，以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组；shRNA的退火，使其形成双链片段，构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体，命名为pZSW-1。shRNA干扰表达载体转染A549/DDP细胞后，通过qRT-PCR检测Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测Egr 1和MRP1蛋白表达水平，用流式细胞仪检测Rho-123药物外排，结果显示，干扰Egr1后，MRP 1基因表达降低，差异显著；细胞内Rho-123荧光强度高于对照组2.23倍，差异显著(P＜0.01)，MRP 1外排能力显著下降；说明分别沉默Egr1基因，细胞对Rho-123外排的能力降低，沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1，具体方案如下：
1.A549/DDP细胞复苏和培养
1.1细胞复苏：(1)液氮中取出冻存细胞，在37℃水浴锅内摇晃，至其全部融化；(2)缓慢滴入含5mL 1640培养基的离心管中，1000g离心5min，弃上清；(3)用5mL 1640完全培养基悬浮细胞沉淀，移至细胞瓶，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞。
1.2细胞传代(待细胞汇合度至90％时进行传代培养)：(1)弃原瓶内培养基，用5mLPBS轻轻洗涤细胞2遍；(2)加入1mL 0.25％胰酶消化细胞，镜下观察，待60％的贴壁细胞皱缩成亮点形态，加入完全培养基终止消化并反复吹打使其从壁上脱落；(3)向细胞悬液中加入10mL完全培养基吹匀后，分别取出5mL加入两个新瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞。
1.3A549/DDP细胞复苏和培养结果：图2为普通光学显微镜下观察A549/DDP细胞状态图，由图可知，细胞为贴壁生长，A549/DDP呈多边形，细胞生长状态良好。
2.通过RNAi技术沉默Egr1对MDR的影响
2.1靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体的构建：(1)shEgr1片段的设计：根据NCBI中人Egr1基因(NM_001964.2)mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向Egr1的干扰片段。正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接，反向序列后连接终止序列TTTTTT。分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为shEgr1-3，shEgr1靶位点序列为GCGATGAACGCAAGAGGCATA，合成的oligo序列为：shEgr1-3-F：GATCCGCGATGAACGCAAGAGGCATACGAATATGC CTCTTGCGTTCATCGCTTTTTTGAATTCA；shEgr1-3-R：AGCTTGAATTCAAAAAAGCGAT GAACGCAAGAGGCATATTCGTATGCCTCTTGCGTTCATCGCG。以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组。(2)shRNA的退火：将合成的单链shEgr 1按照体系：F，2μL；R，2μL；10×PCRbuffer，5μL；dd H2O，41μL，进行退火，使其形成双链片段。各管混匀后94℃3min，37℃1h，使用时按照1:9的比例进行稀释。(3)shEgr1重组表达载体的构建：pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体经HindⅢ、Bam HⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测载体是否酶切完全，使用T4DNA连接酶，按照表4连接体系进行连接。双酶切回收后的线性与退火后的shEgr1片段的摩尔比为1：5，按照下列体系：pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP，1.0μL；T4DNA，1.0μL；10×buffer，1.0μL；退火后的shEgr1片段，5.0μL；ddH2O，2.0μL，连接酶进行连接，连接产物通过转化实验导入到大肠杆菌感受态细胞中，挑取单个菌落并进行富集培养，送至上海生工生物技术服务有限公司测序鉴定确认序列是否正确插入到pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体。
2.2PEI转染：(1)将汇合度达到90％的细胞接种到24孔板中，换为不含双抗的培养基继续培养；(2)待24孔板中细胞生长至60％左右时进行转染；将培养基换为无血清的1640培养基；(3)根据实验组数准备2倍的1.5mL EP管，每管加入25μLOpti-DMEM，向其中一半加入2μL PEI，另一半加入载体pZSW-1，室温孵育5min；(4)将含有PEI的Opti-DMEM孵育液与含有质粒的Opti-DMEM孵育液混合到一个1.5mL EP管内，室温孵育20min；(5)将混合液均匀滴加至每个细胞培养孔中，轻轻混匀，细胞培养箱中培养4h后，将培养基换为1640完全培养基，继续培养48h。
2.3通过qRT-PCR检测Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平
2.3.1细胞总RNA提取：(1)收集各处理组细胞，加入1mL Trizol Reagent，混匀，室温静置30min；(2)加入0.2mL氯仿，剧烈震荡30s，室温放置3min，12000r/min，4℃离心10min；(3)吸去上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍体积无水乙醇，混匀；并将溶液转移至吸附柱中，室温静置2min，12000r/min，4℃离心3min，弃收集管中液体；(4)加入500μL RPE Solution，静止2min，10000r/min，4℃离心30s，倒掉收集管中液体，重复一次；(5)将吸附柱放回收集管中，10000r/min，4℃离心2min；(6)将吸附柱放入DEPC处理的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μL DEPC-treated ddH2O，室温静止5min，12000r/min，4℃离心2min；(7)采用Nano Drop 2000C spectrophotometer测定总RNA浓度。
2.3.2反转录cDNA：根据反转录试剂盒说明书，采用两步法将已获得的Total RNA反转录为cDNA。(1)按照反转录第一步体系：Total RNA or Poly(A)RNA，0.2—2μg；Oligo(dT)or Random primer(50μM)，1μL；dntp Mixture(10mM each)，1μL；Rnase Free H2O，Upto 14μL反转录；(2)在PCR仪上进行以下反应：65℃，5min，然后置于冰上急冷；(3)在上述PCR管中按反转录第二步体系：上述变性、退火后反应液，14μL；5*first-strand Buffer，4μL；M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μL)，1μL；RNase Inhibitor，1μL加入反转录反应液(20μL体系)；(4)在PCR仪上按以下条件进行反转录反应：45℃，60min；70℃，10min；-20℃保存。
2.3.3 qRT-PCR检测：(1)反应体系：cDNA，1μL；Sense primer，0.4μL；Anti-senseprimer，0.4μL；2×Mix，10μL；Rox，0.4μL；ddH2O，7.8μL，将所得cDNA用Power 2×SYBRReal-Time PCR Premixture试剂盒进行Real Time PCR，反应体系为20μL；(2)反应条件为：95℃2min，40×(95℃15s，60℃40s)，95℃15s，60℃1min；循环结束后进行溶解曲线检测。数据以2-ΔΔCt法进行计算。
2.4通过Western blot检测Egr 1和MRP1蛋白表达水平
2.4.1细胞全蛋白提取：(1)收集实验组细胞沉淀至1.5mL离心管，加300μL蛋白裂解液，置于4℃摇床上30min；(2)12000g离心20min，取上清至新的1.5mL离心管，-80℃保存。
2.4.2 Western blot检测：(1)将提取的蛋白样品与上样缓冲液按照4：1的比例混合，沸水中煮5～10min，待其将至室温，分装-20℃保存或继续实验。(2)安装胶板，并按照分离胶配方：水，8.2mL；30％丙烯酰胺，6.6mL；10％SDS，0.2mL；Tris-Cl(PH8.8)，5mL；10％APS，200μl；TEMED，20μl配制分离胶；(3)将分离胶注入两层玻璃板中，加入适当位置后，滑动枪头加入异丙醇，至液面溢出；(4)待胶凝后，倒出异丙醇，并用滤纸吸净残余异丙醇；(5)按浓缩胶配方：水，5.7mL；30％丙烯酰胺，1.7mL；10％SDS，0.1mL；Tris-Cl(PH6.8)，2.5mL；10％APS，200μl；TEMED，20μL配制浓缩胶，将浓缩胶注入两层玻璃板中，至液面溢出，插入梳子；(6)待胶凝后，拔出梳子，与电泳槽组装，加入电泳液；(7)点样：实验组蛋白样品为30μL蛋白样品，Marker上样量为10μL；设置电源电压为100V，待溴酚蓝到达底端时停止电泳；(8)取出胶板，按照Marker指示留目的条带附近的胶；(9)将留下的胶浸泡在转移液中，并准备稍大于胶的滤纸(四层)和PVDF膜(甲醇浸泡30sec)；(10)按下列顺序摆放：海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵(放置时避免产生气泡)；(11)将组装好的夹板置于转印槽中，倒入转移液，接通电源，电流设置为300mA，时间为90min；(12)待转印结束，取出PVDF膜，放置于丽春红染色液中，摇床上染色5min；(13)冲洗PVDF膜，根据Marker指示和目的条带的蛋白大小，剪膜，置于5％脱脂奶粉配制的封闭液中，室温孵育1h；(14)倒掉封闭液，一抗孵育(1：300)，置于4℃摇床摇孵育过夜；(15)回收一抗，PBST洗膜10min，三次；(16)弃去PBST，二抗孵育(1：10000)，置于4℃摇床孵育1h；(17)回收二抗，PBST洗膜10min，三次；(18)Odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化。
2.5 Rho-123药物外排检测：(1)收集各实验组细胞至1.5mL EP管中，1500r/min离心10min。(2)用预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次，2000r/min离心10min。(3)将1μL Rho-123加入到稀释好的500μL1×Incubation Buffer中，配制成Rho-123工作液。(4)向每个实验组的EP管中加入500μL的Rho-123工作液，重悬细胞，37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育30min。(5)2000r/min离心5min收集细胞，使用500μL PBS重悬清洗细胞两次后，再用500μL PBS重悬细胞。(6)400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。
2.6通过RNAi技术沉默Egr1对MDR的影响结果：图1为pZSW-1重组质粒图；图3、4和5为被RNAi技术干扰Egr1后Egr1和MRP 1基因表达的变化，分别通过qRT-PCR和Western blot法检测Egr1和MRP 1基因mRNA和蛋白的表达水平。qRT-PCR结果显示，干扰Egr1后，MRP 1基因表达也随之降低，且差异显著。Western blot结果与qRT-PCR结果趋势一致，结果表明，Egr 1基因可正向调控MRP 1基因的表达；图6为流式细胞术检测转染RNAi表达载体A549/DDP细胞内Rho-123的荧光强度，从而反映MRP 1蛋白外排能力变化。结果显示，转染pZSW-1实验组细胞内Rho-123荧光强度高于对照组2.23倍，差异显著(P＜0.01)，MRP1外排能力显著下降。说明沉默Egr1基因，细胞对Rho-123外排的能力降低，沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
本发明的有益效果为，一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1，首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人Egr1基因(NM_001964.2)mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向Egr1的干扰片段；正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接，反向序列后连接终止序列TTTTTT；分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为shEgr1-3，以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组；shRNA的退火，使其形成双链片段，构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体，命名为pZSW-1。shRNA干扰表达载体转染A549/DDP细胞后，通过qRT-PCR检测RNAi后的Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测RNAi后的Egr 1和MRP1蛋白表达水平，用流式细胞仪检测Rho-123药物外排，结果显示，干扰Egr1后，MRP 1基因表达也随之降低，且差异显著；转染pZSW-1实验组细胞内Rho-123荧光强度高于对照组2.23倍，差异显著(P＜0.01)，MRP 1外排能力显著下降；说明沉默Egr1基因，细胞对Rho-123外排的能力降低，沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的shRNA表达载体质粒pZSW-1图。
图2为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的普通光学显微镜下观察A549/DDP细胞(10×10)细胞状态图。
图3为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的Egr1和MRP 1基因mRNA表达变化图。
图4为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的Western blot检测结果。
图5为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的Egr1和MRP 1基因蛋白表达变化图。
图6为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的A549/DDP细胞中Rho-123荧光强度变化。
具体实施方式
实施例一：如图所示，本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1实验方法及结果如下：
1.A549/DDP细胞复苏和培养
1.1细胞复苏
液氮中取出冻存细胞，在37℃水浴锅内摇晃，至其全部融化；
缓慢滴入含5mL 1640培养基的离心管中，1000 g离心5min，弃上清；
(3)用5mL 1640完全培养基悬浮细胞沉淀，移至细胞瓶，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞。
1.2细胞传代(待细胞汇合度至90％时进行传代培养)
(1)弃原瓶内培养基，用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍；
(2)加入1mL 0.25％胰酶消化细胞，镜下观察，待60％的贴壁细胞皱缩成亮点形态，加入完全培养基终止消化并反复吹打使其从壁上脱落；
(3)向细胞悬液中加入10mL完全培养基吹匀后，分别取出5mL加入两个新瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞。
1.3 A549/DDP细胞复苏和培养结果
图2为普通光学显微镜下观察A549/DDP细胞状态图，由图可知，细胞为贴壁生长，A549/DDP呈多边形，细胞生长状态良好。
2.通过RNAi技术沉默Egr1对MDR的影响
2.1靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体的构建
2.1.1 shEgr1片段的设计
根据NCBI中人Egr1基因(NM-001964.2)mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向Egr1的干扰片段。正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接，反向序列后连接终止序列TTTTTT。分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为shEgr1-3，shEgr1靶位点见表1，合成的oligo序列见表2。以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组。
表1 shEgr 1靶点
表2 shEgr1 oligo序列
2.1.2 shRNA的退火：将合成的单链shEgr 1按照表3体系进行退火，使其形成双链片段。
表3退火体系
各管混匀后94℃3min，37℃1h，使用时按照1:9的比例进行稀释。
2.1.3shEgr1重组表达载体的构建
pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体经HindⅢ、Bam HⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测载体是否酶切完全，使用T4DNA连接酶，按照表4连接体系进行连接。双酶切回收后的线性与退火后的shEgr1片段的摩尔比为1：5，按照下列体系进行连接：
表4连接体系
连接产物通过转化实验导入到大肠杆菌感受态细胞中，挑取单个菌落并进行富集培养，送至上海生工生物技术服务有限公司测序鉴定确认序列是否正确插入到pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体，测序成功的载体命名为载体pZSW-1。
2.2 PEI转染
(1)将汇合度达到90％的细胞接种到24孔板中，换为不含双抗的培养基继续培养；
(2)待24孔板中细胞生长至60％左右时进行转染；将培养基换为无血清的1640培养基；
(3)根据实验组数准备2倍的1.5mL EP管，每管加入25μLOpti-DMEM，向其中一半加入2μL PEI，另一半加入载体pZSW-1载体，室温孵育5min。
(4)将含有PEI的Opti-DMEM孵育液与含有质粒的Opti-DMEM孵育液混合到一个1.5mL EP管内，室温孵育20min。
(5)将混合液均匀滴加至每个细胞培养孔中，轻轻混匀，细胞培养箱中培养4h后，将培养基换为1640完全培养基，继续培养48h。
2.3通过qRT-PCR检测Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平
2.3.1细胞总RNA提取
(1)收集实验组细胞，加入1mL Trizol Reagent，混匀，室温静置30min，
(2)加入0.2mL氯仿，剧烈震荡30s，室温放置3min，12000r/min，4℃离心10min；
(3)吸去上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍体积无水乙醇，混匀；并将溶液转移至吸附柱中，室温静置2min，12000r/min，4℃离心3min，弃收集管中液体；
(4)加入500μL RPE Solution，静止2min，10000r/min，4℃离心30s，倒掉收集管中液体，重复一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，10000r/min，4℃离心2min；
(6)将吸附柱放入DEPC处理的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μL DEPC-treated ddH2O，室温静止5min，12000r/min，4℃离心2min；
(7)采用Nano Drop 2000C spectrophotometer测定总RNA浓度。
2.3.2反转录cDNA
根据反转录试剂盒说明书，采用两步法将已获得的Total RNA反转录为cDNA。
(1)按照表5体系反转录
表5反转录体系
(2)在PCR仪上进行以下反应：65℃，5min，然后置于冰上急冷
(3)在上述PCR管中按表6加入反转录反应液(20μL体系)
表6反转录第二步
(5)在PCR仪上按以下条件进行反转录反应：45℃，60min；70℃，10min；-20℃保存。
2.3.3 qRT-PCR检测
(1)表7反应体系将所得cDNA用Power 2×SYBR Real-Time PCR Premixture试剂盒进行Real Time PCR，反应体系为20μL。
表7 qRT-PCR反应体系
(2)反应条件为：95℃2min，40×(95℃15s，60℃40s)，95℃15s，60℃1min；循环结束后进行溶解曲线检测。数据以2-ΔΔCt法进行计算。
2.4通过Western blot检测Egr 1和MRP1蛋白表达水平
2.4.1细胞全蛋白提取
(1)收集实验组细胞沉淀至1.5mL，加300μL蛋白裂解液，置于4℃摇床上30min；
(2)12000g离心20min，取上清至新的1.5mL离心管，-80℃保存。
2.4.2 Western blot检测
(1)将提取的蛋白样品与上样缓冲液按照4：1的比例混合，沸水中煮5～10min，待其将至室温，分装-20℃保存或继续实验。
(2)安装胶板，并按照表8配制分离胶：
表8分离胶
(3)将分离胶注入两层玻璃板中，加入适当位置后，滑动枪头加入异丙醇，至液面溢出；
(4)待胶凝后，倒出异丙醇，并用滤纸吸净残余异丙醇；
(5)按表9配制浓缩胶：
表9浓缩胶
将浓缩胶注入两层玻璃板中，至液面溢出，插入梳子；
(6)待胶凝后，拔出梳子，与电泳槽组装，加入电泳液；
(7)点样：实验组蛋白样品为30μL蛋白样品，Marker上样量为10μL；设置电源电压为100V，待溴酚蓝到达底端时停止电泳。
(8)取出胶板，按照Marker指示留目的条带附近的胶；
(9)将留下的胶浸泡在转移液中，并准备稍大于胶的滤纸(四层)和PVDF膜(甲醇浸泡30sec)；
(10)按下列顺序摆放：海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵(放置时避免产生气泡)；
(11)将组装好的夹板置于转印槽中，倒入转移液，接通电源，电流设置为300mA，时间为90min；
(12)待转印结束，取出PVDF膜，放置于丽春红染色液中，摇床上染色5min；
(13)冲洗PVDF膜，根据Maker指示和目的条带的蛋白大小，剪膜，置于5％脱脂奶粉配制的封闭液中，室温孵育1h；
(14)倒掉封闭液，Anti-Egr 1和Anti-GAPDH一抗孵育(1：300)，置于4℃摇床摇孵育过夜；
(15)回收一抗，PBST洗膜10min，三次；
(16)弃去PBST，二抗孵育(1：10000)，置于4℃摇床孵育1h；
(17)回收二抗，PBST洗膜10min，三次；
(18)Odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化
2.5 Rho-123药物外排检测
(1)收集各实验组细胞至1.5mL EP管中，1500r/min离心10min。
(2)用预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次，2000r/min离心10min。
(3)将1μL Rho-123加入到稀释好的500μL1×Incubation Buffer中，配制成Rho-123工作液。
(4)向每个实验组的EP管中加入500μL的Rho-123工作液，重悬细胞，37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育30min。
(5)2000r/min离心5min收集细胞，使用500μL PBS重悬清洗细胞两次后，再用500μL PBS重悬细胞。
(6)400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。
2.6通过RNAi技术沉默Egr1对MDR的影响结果
图1为pZSW-1重组质粒图
图3、4和5为被RNAi技术干扰Egr1后Egr1和MRP 1基因表达的变化，分别通过qRT-PCR和Western blot法检测Egr1和MRP 1基因mRNA和蛋白的表达水平。qRT-PCR结果显示，干扰Egr1后，MRP 1基因表达也随之降低，且差异显著。Western blot结果与qRT-PCR结果趋势一致，结果表明，Egr 1基因可正向调控MRP 1基因的表达。
图6为流式细胞术检测转染RNAi表达载体A549/DDP细胞内Rho-123的荧光强度，从而反映MRP 1蛋白外排能力变化。结果显示，转染pZSW-1实验组细胞内Rho-123荧光强度高于对照组2.23倍，差异显著(P＜0.01)，MRP 1外排能力显著下降。说明沉默Egr1基因，细胞对Rho-123外排的能力降低，沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。
核苷酸和/或氨基酸序列表
核苷酸和/或氨基酸序列表
<110>齐齐哈尔大学
<120>一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1
<160>3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
GCGATGAACG CAAGAGGCAT A 21
<210>2
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
GATCCGCGAT GAACGCAAGA GGCATACGAA TATGCCTCTT GCGTTCATCG CTTTTTTGAA
TTCA 64
<210>3
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
AGCTTGAATT CAAAAAAGCG ATGAACGCAA GAGGCATATT CGTATGCCTC TTGCGTTCAT
CGCG 64
Claims (3)
1.一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1，其特征在于：一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1，首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人NM号为001964.2的Egr1基因的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向Egr1的干扰片段；正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接，反向序列后连接终止序列TTTTTT；分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为shEgr1-3，以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组；shRNA的退火，使其形成双链片段，构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体，命名为pZSW-1；转染A549/DDP细胞后，通过qRT-PCR检测Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测Egr 1和MRP1蛋白表达水平，用流式细胞仪检测Rho-123药物外排，结果显示，干扰Egr1后，MRP 1基因表达降低，细胞内Rho-123荧光强度高于对照组2.23倍，MRP 1外排能力显著下降；说明沉默Egr1基因，细胞对Rho-123外排的能力降低，沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
2.根据权利要求1所述的一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1，其特征在于：所述的复苏和培养A549/DDP细胞的步骤为：细胞复苏：液氮中取出冻存细胞，在37℃水浴锅内摇晃，至其全部融化；缓慢滴入含5mL 1640培养基的离心管中，1000g离心5min，弃上清；用5mL 1640完全培养基悬浮细胞沉淀，移至细胞瓶，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞；细胞传代：弃原瓶内培养基，用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍；加入1mL0.25％胰酶消化细胞，镜下观察，待60％的贴壁细胞皱缩成亮点形态，加入完全培养基终止消化并反复吹打使其从壁上脱落；向细胞悬液中加入10mL完全培养基吹匀后，分别取出5mL加入两个新瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞；A549/DDP细胞复苏和培养结果：细胞为贴壁生长，A549/DDP呈多边形，细胞生长状态良好。
3.根据权利要求1所述的一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1，其特征在于：所述的构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体的步骤为：shEgr1片段的设计：根据NCBI中人Egr1基因mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向Egr1的干扰片段；正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接，反向序列后连接终止序列TTTTTT；分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为shEgr1-3，shEgr1靶位点序列为GCGATGAACGCAAGAGGCATA，合成的oligo序列为：shEgr1-3-F：GATCCGCGATGAACGCAAGAGGCATACGAATATGCCTCTTGCGTTCATCGCTTTTTTGAATTCA；shEgr1-3-R：AGCTTGAATTCAAAAAAGCGATGAACGCAAGAGGCATATTCGTATGCCTCTTGCGTTCATCGCG；以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组；shRNA的退火：将合成的单链shEgr 1按照体系：F，2μL；R，2μL；10×PCRbuffer，5μL；dd H2O，41μL，进行退火，使其形成双链片段；各管混匀后94℃3min，37℃1h，使用时按照1:9的比例进行稀释；shEgr1重组表达载体的构建：pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体经Bam H I、HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测载体是否酶切完全，使用T4DNA连接酶，按照表4连接体系进行连接；双酶切回收后的线性与退火后的shEgr1片段的摩尔比为1：5，按照下列体系：pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP，1.0μL；T4DNA，1.0μL；10×buffer，1.0μL；退火后的shEgr1片段，5.0μL；ddH2O，2.0μL，连接酶进行连接，连接产物通过转化实验导入到大肠杆菌感受态细胞中，挑取单个菌落并进行富集培养，送至上海生工生物技术服务有限公司测序鉴定确认序列是否正确插入到pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910098244.0A CN109706173A (zh) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | 一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910098244.0A CN109706173A (zh) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | 一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109706173A true CN109706173A (zh) | 2019-05-03 |
Family
ID=66263467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910098244.0A Pending CN109706173A (zh) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | 一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109706173A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109777803A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-05-21 | 齐齐哈尔大学 | 一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的基因ZSWa |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1414865A (zh) * | 1999-10-26 | 2003-04-30 | 尤尼瑟驰有限公司 | 癌症的治疗 |
| CN107893078A (zh) * | 2017-11-28 | 2018-04-10 | 西安交通大学 | 靶向突触结合蛋白‑11的siRNA、表达载体和病毒颗粒及其制药应用 |
-
2019
- 2019-01-31 CN CN201910098244.0A patent/CN109706173A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1414865A (zh) * | 1999-10-26 | 2003-04-30 | 尤尼瑟驰有限公司 | 癌症的治疗 |
| CN107893078A (zh) * | 2017-11-28 | 2018-04-10 | 西安交通大学 | 靶向突触结合蛋白‑11的siRNA、表达载体和病毒颗粒及其制药应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| JUNXIA WEI, ET AL.: "Early growth response gene 1, a TRBP binding protein, is involved in miRNA activity of miR-125a-3p in human cells", 《CELLULAR SIGNALLING》 * |
| 刘炘等: "大鼠野生型Egr-1基因及Egr-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定", 《南京医科大学学报（自然科学版）》 * |
| 刘锐锐等: "Egr-1基因反义干扰表达载体的构建与鉴定", 《杭州师范大学学报（自然科学版）》 * |
| 张晓明等: "长链非编码RNA AK005183干扰载体构建及慢病毒包装", 《家畜生态学报》 * |
| 张欣等: "靶向survivin基因高效RNA干扰序列的筛选", 《诊断病理学杂志》 * |
| 邵淑丽等: "靶向MRP1基因的shRNA 定逆转肺癌的多药耐药性", 《中国病理生理杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109777803A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-05-21 | 齐齐哈尔大学 | 一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的基因ZSWa |
| CN109777803B (zh) * | 2019-01-31 | 2022-09-02 | 齐齐哈尔大学 | ZSWa基因在显著增强A549/DDP细胞ABCC1基因表达中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114432452B (zh) | 一种抗食管鳞状细胞癌的药物 | |
| CN104388428B (zh) | 一种干扰hnRNPA2/B1基因表达的双链siRNA及其应用 | |
| CN111850123A (zh) | 一种用于检测细胞血管生成信号通路基因表达的pcr试剂及其应用 | |
| CN103773802B (zh) | Hip-55蛋白在开发抑制肿瘤药物中的应用 | |
| CN109706173A (zh) | 一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1 | |
| CN109777831A (zh) | 一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1 | |
| CN108531544A (zh) | 一种miR-181b靶基因筛选的方法 | |
| CN103421781B (zh) | 猪肌肉组织特异性表达基因myf6启动子及应用 | |
| CN104531760B (zh) | Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒及其应用方法 | |
| CN101705227B (zh) | 抑制人AP-2alpha基因表达的siRNA在抗宫颈癌药物制备中的应用 | |
| CN114457158B (zh) | Hsa_circ_0006867作为食管癌分子靶标在制备药物和试剂盒中的应用 | |
| CN110272919A (zh) | 一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法 | |
| CN114032236B (zh) | 一种TMEM2的shRNA及其应用 | |
| CN107287200A (zh) | 特异性抑制Eya2基因表达的siRNA及其重组载体和应用 | |
| CN113862359A (zh) | Fam13a基因转录本在评估胶质母细胞瘤患者临床预后中的应用 | |
| CN105624159A (zh) | 一种针对人EDIL3基因的siRNA及其应用 | |
| CN111996251A (zh) | 一种恶性胶质瘤生物标志物的应用 | |
| CN102174521A (zh) | 人核糖体蛋白分子hRrp15p及其制备方法与应用 | |
| CN107119072A (zh) | 一种过表达zeb2基因质粒及其构建方法和应用 | |
| CN104388541B (zh) | miR‑1914*和miR‑1915的用途 | |
| CN115998846B (zh) | Smim26蛋白以及slc25a11蛋白在肾癌中的应用 | |
| CN114292844B (zh) | 干扰U2AF2基因的shRNA及其在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用 | |
| CN108300763A (zh) | 一种筛选miR-101-3P靶基因的方法 | |
| CN112301030B (zh) | 一种抑制Hippo信号通路和胃癌的基因抑制剂 | |
| CN107753956A (zh) | 一种rax2基因的靶向抑制剂及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190503 |