CN109706173A - 一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1 - Google Patents
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Abstract
一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW‑1,属于基因工程技术领域,其特征在于:首先复苏和培养A549/DDP细胞,接着设计最优靶向Egr1的干扰片段,其核苷酸序列如Seq ID No:1所示,构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体,命名为pZSW‑1,转染A549/DDP细胞后,通过qRT‑PCR、Western blot和流式细胞仪检测,结果显示,干扰Egr1后,MRP 1基因表达也随之降低,转染pZSW‑1实验组细胞内Rho‑123荧光强度高于对照组2.23倍,差异显著,MRP 1外排能力显著下降;说明沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1,属于基因工程技术领域。
背景技术
癌症严重威胁着人类健康,癌细胞的产生是由于人体内原癌基因和抑癌基因受多种因素刺激,导致表达失衡,引起正常细胞的癌变。2018年国家癌症中心数据显示,肺癌是发病率和死亡率较高的肿瘤疾病之一,每年新发病例约为50万例。药物化疗是治疗肿瘤疾病常用的手段之一,但长时间的化疗使肺癌细胞产生耐药性,导致其治疗效率降低(郑佳彬,2017)。多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗癌药物产生耐药性,同时对多种结构不同、作用机制不同的抗肿瘤药物产生的交叉耐药现象,其作用机制复杂。研究表明,多药耐药相关蛋白1(MRP 1)基因的过表达是肿瘤细胞产生耐药性的重要机制之一(Cole S P C,2014)。下调MRP 1蛋白表达,将有助提高肿瘤细胞对药物的敏感性,逆转肿瘤细胞的耐药现象。早期生长反应-1(early growth response,Egr 1)是一种重要的核转录因子(Karthikkeyan Gand Nagaraj N R,2018),在调控细胞的生长、分化、发育、增殖等方面发挥着重要的作用。Egr 1基因在绝大多数的肿瘤细胞中均有表达,参与了从肿瘤形成、增殖分化到凋亡的全过程(林芳,2010)。Egr1是DNA结构域含有3个Cyc2-His2锌指结构的转录因子(韩雷,2007),在锌离子存在的条件下,锌指结构与DNA序列中富含GC区结合,发挥转录调控作用。因此,Egr1可作为转录因子调控诸多靶基因的表达。大量研究证实,Egr 1与靶基因上特异地结合位点作用调节细胞发挥各种生物学功能。肿瘤细胞中某些基因的突变可能促使Egr1表达升高,对于这些肿瘤细胞来说,Egr1基因的高表达与肿瘤的发生、发展有关,并可能起到促肿瘤的作用。因此如何发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1成为急需解决的一大难题,所以通过首先复苏和培养A549/DDP细胞,接着根据NCBI中人Egr1基因(NM_001964.2)mRNA序列,按照RNAi设计原则,设计最优靶向Egr1的干扰片段;正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接,反向序列后连接终止序列TTTTTT;分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点,在5’端加上BamH I酶切位点,3’端加上HindⅢ酶切位点,经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性,送至上海生工合成,命名为shEgr1-3,以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组;shRNA的退火,使其形成双链片段,构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体,命名为pZSW-1。利用shRNA干扰表达载体转染A549/DDP细胞,通过qRT-PCR检测RNAi后的Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平,通过Western blot检测RNAi后的Egr 1和MRP1蛋白表达水平,用流式细胞仪检测Rho-123药物外排,发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1是必要的。
发明内容
为了克服如何通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的难题,本发明提供了一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1,该一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1,首先复苏和培养A549/DDP细胞,接着根据NCBI中人Egr1基因(NM_001964.2)mRNA序列,按照RNAi设计原则,设计最优靶向Egr1的干扰片段;正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接,反向序列后连接终止序列TTTTTT;分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点,在5’端加上BamH I酶切位点,3’端加上HindⅢ酶切位点,经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性,送至上海生工合成,命名为shEgr1-3,以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组;shRNA的退火,使其形成双链片段,构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体,命名为pZSW-1。shRNA干扰表达载体转染A549/DDP细胞后,通过qRT-PCR检测Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平,通过Western blot检测Egr 1和MRP1蛋白表达水平,用流式细胞仪检测Rho-123药物外排,结果显示,干扰Egr1后,MRP 1基因表达降低,差异显著;细胞内Rho-123荧光强度高于对照组2.23倍,差异显著(P<0.01),MRP 1外排能力显著下降;说明分别沉默Egr1基因,细胞对Rho-123外排的能力降低,沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1,具体方案如下:
1.A549/DDP细胞复苏和培养
1.1细胞复苏:(1)液氮中取出冻存细胞,在37℃水浴锅内摇晃,至其全部融化;(2)缓慢滴入含5mL 1640培养基的离心管中,1000g离心5min,弃上清;(3)用5mL 1640完全培养基悬浮细胞沉淀,移至细胞瓶,37℃、5%CO2培养箱内培养细胞。
1.2细胞传代(待细胞汇合度至90%时进行传代培养):(1)弃原瓶内培养基,用5mLPBS轻轻洗涤细胞2遍;(2)加入1mL 0.25%胰酶消化细胞,镜下观察,待60%的贴壁细胞皱缩成亮点形态,加入完全培养基终止消化并反复吹打使其从壁上脱落;(3)向细胞悬液中加入10mL完全培养基吹匀后,分别取出5mL加入两个新瓶中,37℃、5%CO2培养箱内培养细胞。
1.3A549/DDP细胞复苏和培养结果:图2为普通光学显微镜下观察A549/DDP细胞状态图,由图可知,细胞为贴壁生长,A549/DDP呈多边形,细胞生长状态良好。
2.通过RNAi技术沉默Egr1对MDR的影响
2.1靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体的构建:(1)shEgr1片段的设计:根据NCBI中人Egr1基因(NM_001964.2)mRNA序列,按照RNAi设计原则,设计最优靶向Egr1的干扰片段。正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接,反向序列后连接终止序列TTTTTT。分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点,在5’端加上BamH I酶切位点,3’端加上HindⅢ酶切位点,经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性,送至上海生工合成,命名为shEgr1-3,shEgr1靶位点序列为GCGATGAACGCAAGAGGCATA,合成的oligo序列为:shEgr1-3-F:GATCCGCGATGAACGCAAGAGGCATACGAATATGC CTCTTGCGTTCATCGCTTTTTTGAATTCA;shEgr1-3-R:AGCTTGAATTCAAAAAAGCGAT GAACGCAAGAGGCATATTCGTATGCCTCTTGCGTTCATCGCG。以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组。(2)shRNA的退火:将合成的单链shEgr 1按照体系:F,2μL;R,2μL;10×PCRbuffer,5μL;dd H2O,41μL,进行退火,使其形成双链片段。各管混匀后94℃3min,37℃1h,使用时按照1:9的比例进行稀释。(3)shEgr1重组表达载体的构建:pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体经HindⅢ、Bam HⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测载体是否酶切完全,使用T4DNA连接酶,按照表4连接体系进行连接。双酶切回收后的线性与退火后的shEgr1片段的摩尔比为1:5,按照下列体系:pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP,1.0μL;T4DNA,1.0μL;10×buffer,1.0μL;退火后的shEgr1片段,5.0μL;ddH2O,2.0μL,连接酶进行连接,连接产物通过转化实验导入到大肠杆菌感受态细胞中,挑取单个菌落并进行富集培养,送至上海生工生物技术服务有限公司测序鉴定确认序列是否正确插入到pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体。
2.2PEI转染:(1)将汇合度达到90%的细胞接种到24孔板中,换为不含双抗的培养基继续培养;(2)待24孔板中细胞生长至60%左右时进行转染;将培养基换为无血清的1640培养基;(3)根据实验组数准备2倍的1.5mL EP管,每管加入25μLOpti-DMEM,向其中一半加入2μL PEI,另一半加入载体pZSW-1,室温孵育5min;(4)将含有PEI的Opti-DMEM孵育液与含有质粒的Opti-DMEM孵育液混合到一个1.5mL EP管内,室温孵育20min;(5)将混合液均匀滴加至每个细胞培养孔中,轻轻混匀,细胞培养箱中培养4h后,将培养基换为1640完全培养基,继续培养48h。
2.3通过qRT-PCR检测Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平
2.3.1细胞总RNA提取:(1)收集各处理组细胞,加入1mL Trizol Reagent,混匀,室温静置30min;(2)加入0.2mL氯仿,剧烈震荡30s,室温放置3min,12000r/min,4℃离心10min;(3)吸去上层水相转移至干净的离心管中,加入1/2倍体积无水乙醇,混匀;并将溶液转移至吸附柱中,室温静置2min,12000r/min,4℃离心3min,弃收集管中液体;(4)加入500μL RPE Solution,静止2min,10000r/min,4℃离心30s,倒掉收集管中液体,重复一次;(5)将吸附柱放回收集管中,10000r/min,4℃离心2min;(6)将吸附柱放入DEPC处理的1.5mL离心管中,在吸附膜中央加入30μL DEPC-treated ddH2O,室温静止5min,12000r/min,4℃离心2min;(7)采用Nano Drop 2000C spectrophotometer测定总RNA浓度。
2.3.2反转录cDNA:根据反转录试剂盒说明书,采用两步法将已获得的Total RNA反转录为cDNA。(1)按照反转录第一步体系:Total RNA or Poly(A)RNA,0.2—2μg;Oligo(dT)or Random primer(50μM),1μL;dntp Mixture(10mM each),1μL;Rnase Free H2O,Upto 14μL反转录;(2)在PCR仪上进行以下反应:65℃,5min,然后置于冰上急冷;(3)在上述PCR管中按反转录第二步体系:上述变性、退火后反应液,14μL;5*first-strand Buffer,4μL;M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μL),1μL;RNase Inhibitor,1μL加入反转录反应液(20μL体系);(4)在PCR仪上按以下条件进行反转录反应:45℃,60min;70℃,10min;-20℃保存。
2.3.3 qRT-PCR检测:(1)反应体系:cDNA,1μL;Sense primer,0.4μL;Anti-senseprimer,0.4μL;2×Mix,10μL;Rox,0.4μL;ddH2O,7.8μL,将所得cDNA用Power 2×SYBRReal-Time PCR Premixture试剂盒进行Real Time PCR,反应体系为20μL;(2)反应条件为:95℃2min,40×(95℃15s,60℃40s),95℃15s,60℃1min;循环结束后进行溶解曲线检测。数据以2-ΔΔCt法进行计算。
2.4通过Western blot检测Egr 1和MRP1蛋白表达水平
2.4.1细胞全蛋白提取:(1)收集实验组细胞沉淀至1.5mL离心管,加300μL蛋白裂解液,置于4℃摇床上30min;(2)12000g离心20min,取上清至新的1.5mL离心管,-80℃保存。
2.4.2 Western blot检测:(1)将提取的蛋白样品与上样缓冲液按照4:1的比例混合,沸水中煮5~10min,待其将至室温,分装-20℃保存或继续实验。(2)安装胶板,并按照分离胶配方:水,8.2mL;30%丙烯酰胺,6.6mL;10%SDS,0.2mL;Tris-Cl(PH8.8),5mL;10%APS,200μl;TEMED,20μl配制分离胶;(3)将分离胶注入两层玻璃板中,加入适当位置后,滑动枪头加入异丙醇,至液面溢出;(4)待胶凝后,倒出异丙醇,并用滤纸吸净残余异丙醇;(5)按浓缩胶配方:水,5.7mL;30%丙烯酰胺,1.7mL;10%SDS,0.1mL;Tris-Cl(PH6.8),2.5mL;10%APS,200μl;TEMED,20μL配制浓缩胶,将浓缩胶注入两层玻璃板中,至液面溢出,插入梳子;(6)待胶凝后,拔出梳子,与电泳槽组装,加入电泳液;(7)点样:实验组蛋白样品为30μL蛋白样品,Marker上样量为10μL;设置电源电压为100V,待溴酚蓝到达底端时停止电泳;(8)取出胶板,按照Marker指示留目的条带附近的胶;(9)将留下的胶浸泡在转移液中,并准备稍大于胶的滤纸(四层)和PVDF膜(甲醇浸泡30sec);(10)按下列顺序摆放:海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵(放置时避免产生气泡);(11)将组装好的夹板置于转印槽中,倒入转移液,接通电源,电流设置为300mA,时间为90min;(12)待转印结束,取出PVDF膜,放置于丽春红染色液中,摇床上染色5min;(13)冲洗PVDF膜,根据Marker指示和目的条带的蛋白大小,剪膜,置于5%脱脂奶粉配制的封闭液中,室温孵育1h;(14)倒掉封闭液,一抗孵育(1:300),置于4℃摇床摇孵育过夜;(15)回收一抗,PBST洗膜10min,三次;(16)弃去PBST,二抗孵育(1:10000),置于4℃摇床孵育1h;(17)回收二抗,PBST洗膜10min,三次;(18)Odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化。
2.5 Rho-123药物外排检测:(1)收集各实验组细胞至1.5mL EP管中,1500r/min离心10min。(2)用预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次,2000r/min离心10min。(3)将1μL Rho-123加入到稀释好的500μL1×Incubation Buffer中,配制成Rho-123工作液。(4)向每个实验组的EP管中加入500μL的Rho-123工作液,重悬细胞,37℃,5%CO2细胞培养箱中孵育30min。(5)2000r/min离心5min收集细胞,使用500μL PBS重悬清洗细胞两次后,再用500μL PBS重悬细胞。(6)400目筛网过滤,流式细胞仪上机检测。
2.6通过RNAi技术沉默Egr1对MDR的影响结果:图1为pZSW-1重组质粒图;图3、4和5为被RNAi技术干扰Egr1后Egr1和MRP 1基因表达的变化,分别通过qRT-PCR和Western blot法检测Egr1和MRP 1基因mRNA和蛋白的表达水平。qRT-PCR结果显示,干扰Egr1后,MRP 1基因表达也随之降低,且差异显著。Western blot结果与qRT-PCR结果趋势一致,结果表明,Egr 1基因可正向调控MRP 1基因的表达;图6为流式细胞术检测转染RNAi表达载体A549/DDP细胞内Rho-123的荧光强度,从而反映MRP 1蛋白外排能力变化。结果显示,转染pZSW-1实验组细胞内Rho-123荧光强度高于对照组2.23倍,差异显著(P<0.01),MRP1外排能力显著下降。说明沉默Egr1基因,细胞对Rho-123外排的能力降低,沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
本发明的有益效果为,一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1,首先复苏和培养A549/DDP细胞,接着根据NCBI中人Egr1基因(NM_001964.2)mRNA序列,按照RNAi设计原则,设计最优靶向Egr1的干扰片段;正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接,反向序列后连接终止序列TTTTTT;分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点,在5’端加上BamH I酶切位点,3’端加上HindⅢ酶切位点,经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性,送至上海生工合成,命名为shEgr1-3,以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组;shRNA的退火,使其形成双链片段,构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体,命名为pZSW-1。shRNA干扰表达载体转染A549/DDP细胞后,通过qRT-PCR检测RNAi后的Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平,通过Western blot检测RNAi后的Egr 1和MRP1蛋白表达水平,用流式细胞仪检测Rho-123药物外排,结果显示,干扰Egr1后,MRP 1基因表达也随之降低,且差异显著;转染pZSW-1实验组细胞内Rho-123荧光强度高于对照组2.23倍,差异显著(P<0.01),MRP 1外排能力显著下降;说明沉默Egr1基因,细胞对Rho-123外排的能力降低,沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的shRNA表达载体质粒pZSW-1图。
图2为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的普通光学显微镜下观察A549/DDP细胞(10×10)细胞状态图。
图3为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的Egr1和MRP 1基因mRNA表达变化图。
图4为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的Western blot检测结果。
图5为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的Egr1和MRP 1基因蛋白表达变化图。
图6为本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1的A549/DDP细胞中Rho-123荧光强度变化。
具体实施方式
实施例一:如图所示,本发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1实验方法及结果如下:
1.A549/DDP细胞复苏和培养
1.1细胞复苏
液氮中取出冻存细胞,在37℃水浴锅内摇晃,至其全部融化;
缓慢滴入含5mL 1640培养基的离心管中,1000 g离心5min,弃上清;
(3)用5mL 1640完全培养基悬浮细胞沉淀,移至细胞瓶,37℃、5%CO2培养箱内培养细胞。
1.2细胞传代(待细胞汇合度至90%时进行传代培养)
(1)弃原瓶内培养基,用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍;
(2)加入1mL 0.25%胰酶消化细胞,镜下观察,待60%的贴壁细胞皱缩成亮点形态,加入完全培养基终止消化并反复吹打使其从壁上脱落;
(3)向细胞悬液中加入10mL完全培养基吹匀后,分别取出5mL加入两个新瓶中,37℃、5%CO2培养箱内培养细胞。
1.3 A549/DDP细胞复苏和培养结果
图2为普通光学显微镜下观察A549/DDP细胞状态图,由图可知,细胞为贴壁生长,A549/DDP呈多边形,细胞生长状态良好。
2.通过RNAi技术沉默Egr1对MDR的影响
2.1靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体的构建
2.1.1 shEgr1片段的设计
根据NCBI中人Egr1基因(NM-001964.2)mRNA序列,按照RNAi设计原则,设计最优靶向Egr1的干扰片段。正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接,反向序列后连接终止序列TTTTTT。分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点,在5’端加上BamH I酶切位点,3’端加上HindⅢ酶切位点,经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性,送至上海生工合成,命名为shEgr1-3,shEgr1靶位点见表1,合成的oligo序列见表2。以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组。
表1 shEgr 1靶点
表2 shEgr1 oligo序列
2.1.2 shRNA的退火:将合成的单链shEgr 1按照表3体系进行退火,使其形成双链片段。
表3退火体系
各管混匀后94℃3min,37℃1h,使用时按照1:9的比例进行稀释。
2.1.3shEgr1重组表达载体的构建
pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体经HindⅢ、Bam HⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测载体是否酶切完全,使用T4DNA连接酶,按照表4连接体系进行连接。双酶切回收后的线性与退火后的shEgr1片段的摩尔比为1:5,按照下列体系进行连接:
表4连接体系
连接产物通过转化实验导入到大肠杆菌感受态细胞中,挑取单个菌落并进行富集培养,送至上海生工生物技术服务有限公司测序鉴定确认序列是否正确插入到pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体,测序成功的载体命名为载体pZSW-1。
2.2 PEI转染
(1)将汇合度达到90%的细胞接种到24孔板中,换为不含双抗的培养基继续培养;
(2)待24孔板中细胞生长至60%左右时进行转染;将培养基换为无血清的1640培养基;
(3)根据实验组数准备2倍的1.5mL EP管,每管加入25μLOpti-DMEM,向其中一半加入2μL PEI,另一半加入载体pZSW-1载体,室温孵育5min。
(4)将含有PEI的Opti-DMEM孵育液与含有质粒的Opti-DMEM孵育液混合到一个1.5mL EP管内,室温孵育20min。
(5)将混合液均匀滴加至每个细胞培养孔中,轻轻混匀,细胞培养箱中培养4h后,将培养基换为1640完全培养基,继续培养48h。
2.3通过qRT-PCR检测Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平
2.3.1细胞总RNA提取
(1)收集实验组细胞,加入1mL Trizol Reagent,混匀,室温静置30min,
(2)加入0.2mL氯仿,剧烈震荡30s,室温放置3min,12000r/min,4℃离心10min;
(3)吸去上层水相转移至干净的离心管中,加入1/2倍体积无水乙醇,混匀;并将溶液转移至吸附柱中,室温静置2min,12000r/min,4℃离心3min,弃收集管中液体;
(4)加入500μL RPE Solution,静止2min,10000r/min,4℃离心30s,倒掉收集管中液体,重复一次;
(5)将吸附柱放回收集管中,10000r/min,4℃离心2min;
(6)将吸附柱放入DEPC处理的1.5mL离心管中,在吸附膜中央加入30μL DEPC-treated ddH2O,室温静止5min,12000r/min,4℃离心2min;
(7)采用Nano Drop 2000C spectrophotometer测定总RNA浓度。
2.3.2反转录cDNA
根据反转录试剂盒说明书,采用两步法将已获得的Total RNA反转录为cDNA。
(1)按照表5体系反转录
表5反转录体系
(2)在PCR仪上进行以下反应:65℃,5min,然后置于冰上急冷
(3)在上述PCR管中按表6加入反转录反应液(20μL体系)
表6反转录第二步
(5)在PCR仪上按以下条件进行反转录反应:45℃,60min;70℃,10min;-20℃保存。
2.3.3 qRT-PCR检测
(1)表7反应体系将所得cDNA用Power 2×SYBR Real-Time PCR Premixture试剂盒进行Real Time PCR,反应体系为20μL。
表7 qRT-PCR反应体系
(2)反应条件为:95℃2min,40×(95℃15s,60℃40s),95℃15s,60℃1min;循环结束后进行溶解曲线检测。数据以2-ΔΔCt法进行计算。
2.4通过Western blot检测Egr 1和MRP1蛋白表达水平
2.4.1细胞全蛋白提取
(1)收集实验组细胞沉淀至1.5mL,加300μL蛋白裂解液,置于4℃摇床上30min;
(2)12000g离心20min,取上清至新的1.5mL离心管,-80℃保存。
2.4.2 Western blot检测
(1)将提取的蛋白样品与上样缓冲液按照4:1的比例混合,沸水中煮5~10min,待其将至室温,分装-20℃保存或继续实验。
(2)安装胶板,并按照表8配制分离胶:
表8分离胶
(3)将分离胶注入两层玻璃板中,加入适当位置后,滑动枪头加入异丙醇,至液面溢出;
(4)待胶凝后,倒出异丙醇,并用滤纸吸净残余异丙醇;
(5)按表9配制浓缩胶:
表9浓缩胶
将浓缩胶注入两层玻璃板中,至液面溢出,插入梳子;
(6)待胶凝后,拔出梳子,与电泳槽组装,加入电泳液;
(7)点样:实验组蛋白样品为30μL蛋白样品,Marker上样量为10μL;设置电源电压为100V,待溴酚蓝到达底端时停止电泳。
(8)取出胶板,按照Marker指示留目的条带附近的胶;
(9)将留下的胶浸泡在转移液中,并准备稍大于胶的滤纸(四层)和PVDF膜(甲醇浸泡30sec);
(10)按下列顺序摆放:海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵(放置时避免产生气泡);
(11)将组装好的夹板置于转印槽中,倒入转移液,接通电源,电流设置为300mA,时间为90min;
(12)待转印结束,取出PVDF膜,放置于丽春红染色液中,摇床上染色5min;
(13)冲洗PVDF膜,根据Maker指示和目的条带的蛋白大小,剪膜,置于5%脱脂奶粉配制的封闭液中,室温孵育1h;
(14)倒掉封闭液,Anti-Egr 1和Anti-GAPDH一抗孵育(1:300),置于4℃摇床摇孵育过夜;
(15)回收一抗,PBST洗膜10min,三次;
(16)弃去PBST,二抗孵育(1:10000),置于4℃摇床孵育1h;
(17)回收二抗,PBST洗膜10min,三次;
(18)Odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化
2.5 Rho-123药物外排检测
(1)收集各实验组细胞至1.5mL EP管中,1500r/min离心10min。
(2)用预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次,2000r/min离心10min。
(3)将1μL Rho-123加入到稀释好的500μL1×Incubation Buffer中,配制成Rho-123工作液。
(4)向每个实验组的EP管中加入500μL的Rho-123工作液,重悬细胞,37℃,5%CO2细胞培养箱中孵育30min。
(5)2000r/min离心5min收集细胞,使用500μL PBS重悬清洗细胞两次后,再用500μL PBS重悬细胞。
(6)400目筛网过滤,流式细胞仪上机检测。
2.6通过RNAi技术沉默Egr1对MDR的影响结果
图1为pZSW-1重组质粒图
图3、4和5为被RNAi技术干扰Egr1后Egr1和MRP 1基因表达的变化,分别通过qRT-PCR和Western blot法检测Egr1和MRP 1基因mRNA和蛋白的表达水平。qRT-PCR结果显示,干扰Egr1后,MRP 1基因表达也随之降低,且差异显著。Western blot结果与qRT-PCR结果趋势一致,结果表明,Egr 1基因可正向调控MRP 1基因的表达。
图6为流式细胞术检测转染RNAi表达载体A549/DDP细胞内Rho-123的荧光强度,从而反映MRP 1蛋白外排能力变化。结果显示,转染pZSW-1实验组细胞内Rho-123荧光强度高于对照组2.23倍,差异显著(P<0.01),MRP 1外排能力显著下降。说明沉默Egr1基因,细胞对Rho-123外排的能力降低,沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内,本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。
核苷酸和/或氨基酸序列表
核苷酸和/或氨基酸序列表
<110>齐齐哈尔大学
<120>一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1
<160>3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
GCGATGAACG CAAGAGGCAT A 21
<210>2
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
GATCCGCGAT GAACGCAAGA GGCATACGAA TATGCCTCTT GCGTTCATCG CTTTTTTGAA
TTCA 64
<210>3
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
AGCTTGAATT CAAAAAAGCG ATGAACGCAA GAGGCATATT CGTATGCCTC TTGCGTTCAT
CGCG 64
Claims (3)
1.一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1,其特征在于:一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1,首先复苏和培养A549/DDP细胞,接着根据NCBI中人NM号为001964.2的Egr1基因的mRNA序列,按照RNAi设计原则,设计最优靶向Egr1的干扰片段;正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接,反向序列后连接终止序列TTTTTT;分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点,在5’端加上BamH I酶切位点,3’端加上HindⅢ酶切位点,经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性,送至上海生工合成,命名为shEgr1-3,以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组;shRNA的退火,使其形成双链片段,构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体,命名为pZSW-1;转染A549/DDP细胞后,通过qRT-PCR检测Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平,通过Western blot检测Egr 1和MRP1蛋白表达水平,用流式细胞仪检测Rho-123药物外排,结果显示,干扰Egr1后,MRP 1基因表达降低,细胞内Rho-123荧光强度高于对照组2.23倍,MRP 1外排能力显著下降;说明沉默Egr1基因,细胞对Rho-123外排的能力降低,沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。
2.根据权利要求1所述的一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1,其特征在于:所述的复苏和培养A549/DDP细胞的步骤为:细胞复苏:液氮中取出冻存细胞,在37℃水浴锅内摇晃,至其全部融化;缓慢滴入含5mL 1640培养基的离心管中,1000g离心5min,弃上清;用5mL 1640完全培养基悬浮细胞沉淀,移至细胞瓶,37℃、5%CO2培养箱内培养细胞;细胞传代:弃原瓶内培养基,用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍;加入1mL0.25%胰酶消化细胞,镜下观察,待60%的贴壁细胞皱缩成亮点形态,加入完全培养基终止消化并反复吹打使其从壁上脱落;向细胞悬液中加入10mL完全培养基吹匀后,分别取出5mL加入两个新瓶中,37℃、5%CO2培养箱内培养细胞;A549/DDP细胞复苏和培养结果:细胞为贴壁生长,A549/DDP呈多边形,细胞生长状态良好。
3.根据权利要求1所述的一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1,其特征在于:所述的构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体的步骤为:shEgr1片段的设计:根据NCBI中人Egr1基因mRNA序列,按照RNAi设计原则,设计最优靶向Egr1的干扰片段;正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接,反向序列后连接终止序列TTTTTT;分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点,在5’端加上BamH I酶切位点,3’端加上HindⅢ酶切位点,经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性,送至上海生工合成,命名为shEgr1-3,shEgr1靶位点序列为GCGATGAACGCAAGAGGCATA,合成的oligo序列为:shEgr1-3-F:GATCCGCGATGAACGCAAGAGGCATACGAATATGCCTCTTGCGTTCATCGCTTTTTTGAATTCA;shEgr1-3-R:AGCTTGAATTCAAAAAAGCGATGAACGCAAGAGGCATATTCGTATGCCTCTTGCGTTCATCGCG;以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组;shRNA的退火:将合成的单链shEgr 1按照体系:F,2μL;R,2μL;10×PCRbuffer,5μL;dd H2O,41μL,进行退火,使其形成双链片段;各管混匀后94℃3min,37℃1h,使用时按照1:9的比例进行稀释;shEgr1重组表达载体的构建:pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体经Bam H I、HindⅢ双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测载体是否酶切完全,使用T4DNA连接酶,按照表4连接体系进行连接;双酶切回收后的线性与退火后的shEgr1片段的摩尔比为1:5,按照下列体系:pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP,1.0μL;T4DNA,1.0μL;10×buffer,1.0μL;退火后的shEgr1片段,5.0μL;ddH2O,2.0μL,连接酶进行连接,连接产物通过转化实验导入到大肠杆菌感受态细胞中,挑取单个菌落并进行富集培养,送至上海生工生物技术服务有限公司测序鉴定确认序列是否正确插入到pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体。
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