CN110272919A - 一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法 - Google Patents

一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110272919A
CN110272919A CN201910593462.1A CN201910593462A CN110272919A CN 110272919 A CN110272919 A CN 110272919A CN 201910593462 A CN201910593462 A CN 201910593462A CN 110272919 A CN110272919 A CN 110272919A
Authority
CN
China
Prior art keywords
target gene
catenin
wnt
carrier
wnt signal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910593462.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李碧春
张晨
左其生
王曼
金晶
李婷婷
张亚妮
孙红艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN201910593462.1A priority Critical patent/CN110272919A/zh
Publication of CN110272919A publication Critical patent/CN110272919A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法，涉及生物技术领域，本发明所述方法首先对Wnt信号通路的关键转录因子TCF7L2进行靶基因预测，对预测靶基因进行GO功能注释，筛选出其中共同参与生殖细胞发育及干细胞分化的保守性靶基因作为待选靶基因；通过体内外试验验证Wnt信号对待选靶基因转录水平的调控作用，检测待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时、Wnt信号对待选靶基因转录水平是否有调节作用，通过ChIP‑qPCR验证β‑Catenin/转录因子复合物与待选靶基因的结合作用，从而确定待选靶基因是否对Wnt信号具有靶向响应作用。本发明所述方法简单易行。

Description

一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通 路的靶基因的方法
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法。
背景技术
ESCs(胚胎干细胞)向PGCs(原始生殖细胞)特化是生殖细胞发生的第一个关键步骤，尽管不同物种间PGCs特化的机制有所不同，但均结合了体细胞发育程序的抑制、多能性细胞程序的启动以及全基因组表观遗传重编程三个方面复杂的动态变化。目前，对于前两者的研究较为透彻，且越来越多的证据表明体细胞的抑制和多能细胞的启动均经历一些相同基因表达的分子调控，包括细胞因子、RNA结合蛋白以及关键基因的调节，这些基因在PGCs发生的不同阶段发挥功能，广泛涉及PGCs的特化、迁移、增殖和存活，其特异性敲除个体将导致PGCs不同表态的丧失。Wnt信号作为明星信号通路之一，参与多种生物学过程，包括鸡PGCs的形成过程，但是其在PGCs形成过程中通过何种靶基因发挥作用还尚未明确。
目前，已有大量研究发现Wnt信号通路是生殖细胞形成的关键的信号。其作用机制主要通过β-Catenin/TCF核心效应因子以及表观遗传机制介导的靶基因的激活。然而到目前为止，除了广为人知的c-MYC、cyclin D1等Wnt靶基因外，还有一些关键性的Wnt信号通路的靶基因未找到，例如目前仍未找到参与家禽PGCs生成的关键靶基因。因此，急需一种有效筛选Wnt信号通路的靶基因的方法
发明内容
本发明为了克服目前缺少一种筛选Wnt信号通路的靶基因的缺陷，提供了一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法，本方法简单易行，操作可行性较高，为研究Wnt信号如何通过靶基因调控PGCs形成提供基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法，包括以下步骤：
(1)采用预测软件对Wnt信号通路的某一转录因子的结合靶基因预测，对预测的靶基因进行GO功能注释，根据注释选取生殖细胞发育和干细胞发育过程中共同的靶基因，得到待选靶基因；
(2)对待选靶基因进行体内和体外实验验证Wnt信号通路对待选靶基因转录水平是否有调节作用；
(3)检测待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时、Wnt信号对待选靶基因转录水平是否有调节作用；
(4)通过ChIP-qPCR验证β-Catenin/转录因子复合物与待选靶基因的结合作用；
(5)若待选靶基因经过步骤(2)～(4)的检测的结果为：Wnt信号通路对待选靶基因转录水平有调节作用、待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时的Wnt信号通路对待选靶基因转录水平无调节作用并且β-Catenin/转录因子复合物能够通过结合待选靶基因启动子区域调节其转录，则判断该待选靶基因为Wnt信号通路的直接靶基因；
所述步骤(2)～(4)之间无时间顺序上的限定。
优选的，所述步骤(1)利用在线软件对不同物种的Wnt信号通路的转录因子能够结合的靶基因进行预测。
优选的，步骤(2)所述体内实验包括以下步骤：
A1、分别制备Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体；
A2、分别将Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体转入孵化55～60h的鸡胚中，继续孵化4.5d后，以qRT-PCR检测生殖器官中的待选靶基因的表达情况。
优选的，步骤(2)所述体外试验包括以下步骤：
B1、分别制备Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体；
B2、分别向胚胎干细胞转染Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体，得到转染后的胚胎干细胞；
B3、对转染后的胚胎干细胞体外诱导，使其分化为原始生殖细胞，分别在诱导的第0d和第4d时检测待测靶基因的表达情况。
优选的，步骤(3)所述检测待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时、Wnt信号对待选靶基因转录水平是否有调节作用的方法包括以下步骤：
C1、以双荧光素酶报告基因检测系统筛选待选靶基因的启动子的核心区域；
C2、根据所述核心区域制备转录因子结合位点突变的待选靶基因启动子载体，所述转录因子结合位点突变的待选靶基因载体中含有双荧光素酶报告基因；
C3、以待选靶基因启动子核心区域的双荧光素酶表达载体作为阳性对照，以pGL3-basic为阴性对照，将阳性对照、阴性对照以及步骤C2制备的突变位点不同的各转录因子结合位点突变的待选靶基因载体分别转染DF1细胞，转染48h后，检测转染后细胞的启动活性。
优选的，步骤C1所述以双荧光素酶报告基因检测系统筛选待选靶基因的启动子的核心区域的方法，包括以下步骤：
S1、根据预测待选靶基因5’UTR区域前2000bp的片段进行引物设计，设计缺失不同启动子片段的上游引物，再设计一个下游引物，分别利用设计的各上游引物和下游引物对动物基因组进行PCR扩增，得到缺失不同片段的待选靶基因启动子序列，再连接到含有荧光素酶报告载体上，得到缺失不同片段的待选靶基因启动子载体；
S2、将缺失不同片段的待选靶基因启动子载体与pRL-SV40共转染DF1细胞，转染48h后，检测荧光素酶相对活性，计算缺失不同片段的待选靶基因启动子的活性高低，确定待选靶基因的启动子TCF7L2结合位点的核心区域。
优选的，步骤(4)所述验证β-Catenin/转录因子复合物对待选靶基因的调节作用的方法，包括以下步骤：
D1、制备β-Catenin慢病毒干扰载体和β-Catenin过表达载体；
D2、分别将所述β-Catenin慢病毒干扰载体和β-Catenin过表达载体转染至原始生殖细胞中，并以β-Catenin特异性抗体进行染色质免疫共沉淀，检测Wnt信号的激活或抑制后、β-Catenin/转录因子复合物与靶基因启动区的结合能力影响。
优选的，所述β-Catenin慢病毒干扰载体的制备方法，包括以下步骤：
根据β-Catenin基因序列分别设计一条或多条干扰靶点序列、一条阴性对照序列，分别将各干扰靶点序列和/或阴性对照序列连接到慢病毒干扰载体中，得到β-Catenin慢病毒干扰载体。
优选的，所述Wnt慢病毒干扰载体的制备方法，包括以下步骤：
E1、根据Wnt5A基因序列分别设计一条或多条干扰靶点序列、一条阴性对照序列；
E2、分别以各干扰靶点序列或阴性对照序列合成shRNA Oligo片段，并在shRNAOligo片段两端加入不同的限制性内切酶酶切位点粘性末端，退火杂交后与慢病毒干扰载体连接，得到Wnt慢病毒干扰载体。
本发明还提供了上述技术方案所述的方法在研究禽类或哺乳动物的Wnt信号通路中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法，首先利用生物信息学方法对Wnt信号通路的关键转录因子TCF7L2进行靶基因预测，对预测靶基因进行GO功能注释，筛选出其中共同参与生殖细胞发育及干细胞分化的保守性靶基因作为待选靶基因；通过体内外试验验证Wnt信号对待选靶基因转录水平的调控作用，检测待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时、Wnt信号对待选靶基因转录水平是否有调节作用，通过ChIP-qPCR验证β-Catenin/转录因子复合物与待选靶基因的结合作用，从而确定待选靶基因是否对Wnt信号具有靶向响应作用。利用本发明提供的方法筛选得到了家禽PGCs生成过程中，Wnt信号通路的关键性靶基因Lin28A/B。
本发明所述方法简单易行、思路清晰、操作可行性高，在普通研究室就能完成。实验者利用本发明所述方法，三个月左右就能完成Wnt/β-catenin的靶基因研究工作。
本发明所述方法为研究Wnt信号如何通过靶基因调控动物PGCs的形成提供参考，可应用于禽类或哺乳动物的Wnt信号研究中，应用广泛。
附图说明
图1为韦恩分析参与生殖细胞发育和干细胞分化的Wnt信号靶基因；其中，1-1为不同物种TCF7L2靶基因的维恩分析；1-2为韦恩分析不同物种中参与生殖细胞发育和干细胞分化的靶基因；
图2为体内各组Lin28A/B mRNA表达的变化；其中，图A为干扰/过表达Wnt信号中的关键基因Wnt5A，Lin28A/B mRNA表达的变化，图B为干扰/过表达Wnt信号中的关键基因β-catenin，Lin28A/B mRNA表达的变化；
图3为体外各组Lin28A/B mRNA表达的变化；
图4为体外各组Lin28A/B mRNA表达的变化；
图5为Lin28A/B基因启动子各缺失片段克隆及重组载体双酶切；其中，A为Lin28A各缺失片段PCR扩增；M:DL5000 Marker；1-4分别为启动子2028bp、1600bp、1162bp、684bp；B为Lin28B各缺失片段PCR扩增；M:DL5000 Marker；1-4分别为启动子1962bp、1530bp、1133bp、591bp；C为Lin28A基因启动子各缺失克隆载体酶切验证；M:DL5000 Marker；1-4分别为pLin28A/2028、pLin28A/1600、pLin28A/1096、pLin28A/684；D为Lin28B基因启动子各缺失克隆载体酶切验证；M:DL5000 Marker；1-4分别为pLin28B/1962、pLin28B/1530、pLin28B/1133、pLin28B/591；
图6为pLin28A重组载体构建测序结果；
图7为pLin28B重组载体构建测序结果；
图8为Lin28A/B启动子各缺失片段启动子活性分析；其中，A为pLin28A各缺失片段质粒转染DFl细胞系24后检测双荧光素酶活性；B为pLin28B各缺失片段质粒转染DF1细胞系24后检测双荧光素酶活性；**代表差异极显著(P<0.01)，n＝3；
图9为转录因子TCF7L2结合位点缺失载体酶切验证；其中，A为pLin28A/684-mut载体酶切凝胶电泳图；M:DL5000 Maker；1：pGL3.0质粒；2：KpnI单酶切；3：KpnI、HindⅢ双酶切；B为pLin28B/1530-mut载体酶切凝胶电泳图；M:DL5000 Maker；1：pGL3.0质粒；2：KpnI单酶切；3：KpnI、HindⅢ双酶切；
图10为转录因子结合位点缺失载体测序图谱；其中，A为pLin28A/684-mut测序图谱；B为pLin28B/1530-mut测序图谱；
图11为Lin28A/B启动子转录因子结合位点突变分析；其中，A为Lin28A启动子核心区TCF7L2结合位点突变启动活性；B为Lin28B启动子核心区TCF7L2结合位点突变启动活性；
图12为Wnt信号对Lin28A/B启动活性的影响；其中，A为Wnt信号变化对Lin28A启动活性分析；B为Wnt信号变化对Lin28B启动活性分析。
具体实施方式
本发明提供了一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法，包括以下步骤：
(1)采用预测软件对Wnt信号通路的某一转录因子的结合靶基因预测，对预测的靶基因进行GO功能注释，根据注释选取生殖细胞发育和干细胞发育过程中共同的靶基因，得到待选靶基因；
(2)对待选靶基因进行体内和体外实验验证Wnt信号通路对待选靶基因转录水平是否有调节作用；
(3)检测待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时、Wnt信号对待选靶基因转录水平是否有调节作用；
(4)通过ChIP-qPCR验证β-Catenin/转录因子复合物与待选靶基因的结合作用；
(5)若待选靶基因经过步骤(2)～(4)的检测的结果为：Wnt信号通路对待选靶基因转录水平有调节作用、待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时的Wnt信号通路对待选靶基因转录水平无调节作用并且β-Catenin/转录因子复合物能够通过结合待选靶基因启动子区域调节其转录，则判断该待选靶基因为Wnt信号通路的直接靶基因；
所述步骤(2)～(4)之间无时间顺序上的限定。
本发明采用预测软件对Wnt信号通路的某一转录因子的结合靶基因预测，对预测的靶基因进行GO功能注释，根据注释选取生殖细胞发育和干细胞发育过程中共同的靶基因，得到待选靶基因。转录因子TCF7L2是T细胞因子/淋巴细胞增强子结合因子(TCF/LEF)之一，TCF/LEF和β连环蛋白(β-Catenin)形成的异二聚体是Wnt信号通路的主要组成部分。
如本发明的具体实施例所示，预测软件可以为在线预测软件(http://gtrd.biouml.org/bioumlweb/)。在本发明中，所述预测软件预测时的预测数据库包括人、大鼠和小鼠的Wnt信号通路的转录因子序列的数据库；如本发明的具体实施例所示，在缺乏家禽数据库的情况下，则可以利用人、大鼠和小鼠的Wnt信号转录因子TCF7L2结合的靶基因进行预测。在本发明中，选择多种动物的Wnt信号转录因子TCF7L2的序列作为数据库时，则选择多种动物中共同的靶基因作为预测的靶基因，以获得保守性高的靶基因。
在本发明中，所述GO功能注释(基因本体，Gene ontology)优选的采用在线数据库DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)和KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php)。根据GO功能注释的结果，从预测的靶基因中选取生殖细胞发育(germ celldevelopment)和干细胞发育(stem cell differentiatian)过程中共同的靶基因，作为待选靶基因。
得到待选靶基因后，本发明对待选靶基因进行体内和体外实验验证Wnt信号通路对待选靶基因转录水平是否有调节作用。本发明所述体内实验和体外实验通过抑制或激活Wnt信号通路，研究Wnt信号对待选靶基因的表达变化，进而确定待选靶基因是否受到Wnt信号通路的调控。
在本发明中，所述体内实验优选的包括以下步骤：
A1、分别制备Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体；
A2、分别将Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体转入孵化55～60h的鸡胚中，继续孵化4.5d后，以qRT-PCR检测生殖器官中的待选靶基因的表达情况。
在本发明中，所述Wnt过表达载体的制备方法优选的包括以下步骤：根据Wnt5A的基因序列进行引物设计，以待测动物的生殖器官cDNA为模板进行PCR扩增，得到Wnt片段。将扩增得到的Wnt片段连接到质粒载体上，得到Wnt过表达载体。在本发明中，所述PCR扩增的条件优选的包括：98℃3min；98℃25s、64℃30s、72℃1min，35个循环；72℃7min。在本发明中，所述PCR扩增的体系优选的包括：模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，水7μL，扩增酶10μL。
在本发明中，所述β-Catenin过表达载体的制备方法优选的包括以下步骤：根据β-Catenin的基因序列进行引物设计，以待测动物的生殖器官cDNA为模板进行PCR扩增，得到β-Catenin片段。将扩增得到的β-Catenin片段连接到质粒载体上，得到β-Catenin过表达载体。在本发明中，所述PCR扩增的条件优选的包括：98℃3min；98℃25s、64℃30s、72℃1min，35个循环；72℃7min。
在本发明中，所述Wnt慢病毒干扰载体的制备方法，优选的包括以下步骤：
E1、根据Wnt5A基因序列分别设计一条或多条干扰靶点序列、一条阴性对照序列；
E2、分别在各干扰靶点序列或阴性对照序列合成shRNA Oligo片段，并在shRNAOligo片段两端加入不同的限制性内切酶酶切位点粘性末端，退火杂交后与慢病毒干扰载体连接，得到Wnt慢病毒干扰载体。
在本发明中，所述干扰靶点序列的设计可委托设计公司完成，本发明的具体实施例中委托上海吉满公司设计所述干扰靶点序列。在本发明中，所述干扰靶点序列优选的设计2～4条。在本发明中，所述阴性对照序列为目的基因中不存在的序列，以便排除载体的干扰，本发明的具体实施例中由上海吉满公司设计所述阴性对照序列。
在本发明中，所述合成的shRNA Oligo片段中，正反序列通过loop环连接，所述loop环的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ttcaagaga。本发明将干扰靶点序列或阴性对照序列合成shRNA Oligo片段具体的包括：长的双链RNA与Dicer一起形成复合物，双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。随后这些siRNA片段与RISC结合，RISC由Argonaute-2(Ago-2)、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白(TRBP)组成。然后RNA的两条链分开，其中一条链从复合物上分离。5'端双链稳定性最低的那条链被选择出来，稳定的并入沉默复合物中，进一步识别mRNA占有互补序列，导致其降解。本发明中使用的干扰方式除Wnt5A干扰载体外为shRNA外，其余为siRNA。由于原始生殖细胞获得时间短，在体外诱导过程中能短时间诱导获得，因此利用siRNA进行干扰。ShRNA和siRNA的区别在于shRNA需要构建在载体上，能在较长时间内进行干扰，而siRNA的干扰是瞬时的。
在本发明中，所述慢病毒干扰载体优选为pGMLV-SC5载体。在本发明中，所述两端加入的限制性内切酶优选为BamhHⅠ和EcoRⅠ。
在本发明中，所述β-Catenin慢病毒干扰载体的制备方法，优选的包括以下步骤：
根据β-Catenin基因序列分别设计一条或多条干扰靶点序列、一条阴性对照序列，分别将各干扰靶点序列和/或阴性对照序列连接到慢病毒干扰载体中，得到β-Catenin慢病毒干扰载体。在本发明中，所述干扰靶基因序列的设计可委托设计公司完成，本发明的具体实施例中委托上海吉满公司设计所述干扰靶点序列。在本发明中，所述阴性对照序列为目的基因中不存在的序列，以便排除载体的干扰，本发明的具体实施例中由上海吉满公司设计所述阴性对照序列。在本发明中，所述慢病毒干扰载体优选为pGMLV-SC5载体。
构建得到Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体，本发明将Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体转入孵化55～60h的鸡胚中，继续孵化4.5d后，以qRT-PCR检测生殖器官中的待选靶基因的表达情况。本发明选择孵化55～60h的鸡胚是为了进行血管注射，此时能够清楚看清血管及血液流向。
在本发明中，所述体外试验优选的包括以下步骤：
B1、分别制备Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体；
B2、分别向胚胎干细胞转染Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体，得到转染后的胚胎干细胞；
B3、对转染后的胚胎干细胞体外诱导，使其分化为原始生殖细胞，分别在诱导的第0d和第4d时检测待测靶基因的表达情况。
在本发明中，步骤B1所述Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体的构建方式如体内实验部分的记载所述，在此不再赘述。
体外实验中，本发明在诱导ESCs向PGCs分化的基础上通过过表达/干扰Wnt5A或β-Catenin对Wnt信号进行激活/抑制，并在第0d和4d收集细胞以qRT-PCR检测Lin28A/B的表达。
得到待选靶基因后，本发明检测待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时、Wnt信号对待选靶基因转录水平是否有调节作用，所述检测的方法具体包括以下步骤：
C1、以双荧光素酶报告基因检测系统筛选待选靶基因的启动子中转录因子结合位点的核心区域；
C2、根据所述核心区域制备不同突变位点的转录因子结合位点突变的待选靶基因启动子载体，所述转录因子结合位点突变的待选靶基因载体中含有双荧光素酶报告基因；
C3以待选靶基因启动子核心区域的双荧光素酶表达载体作为阳性对照以pGL3-basic为阴性对照，将阳性对照、阴性对照以及步骤C1制备的突变位点不同的各转录因子结合位点突变的待选靶基因载体分别转染DF1细胞，转染48h后，检测转染后细胞的启动活性。
在本发明中，所述以双荧光素酶报告基因检测系统筛选待选靶基因的启动子的核心区域的方法，包括以下步骤：
S1、根据预测待选靶基因5’UTR区域前2000bp的片段进行引物设计，设计缺失不同启动子片段的上游引物，再设计一个下游引物，分别利用设计的各上游引物和下游引物对动物基因组进行PCR扩增，得到缺失不同片段的待选靶基因启动子序列，再连接到含有荧光素酶报告载体上，得到缺失不同片段的待选靶基因启动子载体；
S2、将缺失不同片段的待选靶基因启动子载体与pRL-SV40共转染DF1细胞，转染48h后，检测荧光素酶相对活性，计算缺失不同片段的待选靶基因启动子的活性高低，确定待选靶基因的启动子转录因子结合位点的核心区域。
在本发明中，所述含有荧光素酶报告载体优选为pGL3-basic。在本发明中，所述步骤S2中共转染时，缺失片段的待选靶基因启动子载体与pRL-SV40的质量比优选为30:1。
在本发明中，所述步骤S2中，启动子的活性值为荧光素酶相对活性值，即双荧光素酶报告基因检测系统中的萤火虫荧光素酶活性值与海肾荧光素酶活性值之比。
利用生物信息学方法预测待选靶基因的启动子中转录因子结合位点，对预测的转录因子结合位点进行点突变，
制备不同突变位点的转录因子结合位点突变的待选靶基因启动子载体，具体的，本发明所述不同突变位点的转录因子结合位点突变的待选靶基因启动子载体的制备方法，优选的包括以下步骤：
利用生物信息学方法预测待选靶基因的启动子中转录因子结合位点，对预测的转录因子结合位点进行点突变，制备多个不同点突变的待选靶基因启动子，得到不同点突变位点的转录因子结合位点突变的待选靶基因启动子，连接到载体上即得。
得到待选靶基因后，本发明通过ChIP-qPCR验证β-Catenin/转录因子复合物与待选靶基因的结合作用。具体的，所述验证方法优选的包括以下步骤：
D1、制备β-Catenin慢病毒干扰载体和β-Catenin过表达载体；
D2、分别将所述β-Catenin慢病毒干扰载体和β-Catenin过表达载体转染至原始生殖细胞中，并以β-Catenin特异性抗体进行染色质免疫共沉淀，检测Wnt信号的激活或抑制后、β-Catenin/转录因子复合物对靶基因启动区的结合能力影响。
在本发明中，所述β-Catenin慢病毒干扰载体和β-Catenin过表达载体的方法如体内实验部分所述，在此不再赘述。
在本发明中，所述转录因子优选为TCF7L2。
本发明所述寻找靶基因的方法可用于寻找参与家禽PGCs生成的Wnt信号通路相关的关键靶基因，如本发明的具体实施例所示，利用本发明所述方法确定了在鸡ESCs向PGCs分化过程中，Wnt信号通路Lin28A/B具有靶向作用。
本发明所述寻找靶基因的方法还可以为哺乳动物上Wnt靶基因的研究提供方法，本发明所述方法应用广泛，简单易行。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号靶基因预测
由于缺乏家禽数据库，利用在线预测软件:http://gtrd.biouml.org/bioumlweb/对不同物种(人Human、大鼠Rat、小鼠Mouse)的Wnt信号转录因子TCF7L2结合的靶基因进行预测。结果如图1所示，Mouse共富集15374个靶基因，Human中共富集15727个靶基因，Rat共富集15652个靶基因，其中Mouse_vs_Human存在9218个共同靶基因，Mouse_vs_Rat8存在8714个共同靶基因，Human_vs_Rat存在10016个共同靶基因，三个物种共有的靶基因有7473个。为了筛选保守性高的靶基因，本研究选择三个物种共有的7473个靶基因进行下一步分析。利用在线数据库DAVID:https://david.ncifcrf.gov/和KOBAS:http://kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php对预测的靶基因进行GO(基因本体，Geneontology)功能注释，筛选出三个物种中生殖细胞发育(germ cell development)和干细胞发育(stem cell differentiation)过程靶基因，进行GO分析，选取三个物种中germ celldevelopment和stem cell differentiation过程共同的靶基因。确定Lin28A和Lin28B为待选靶基因。
2.载体构建
a)Wnt5A/β-Catenin干扰载体构建
根据NCBI中鸡β-Catenin基因序列分别设计4条β-Catenin干扰靶点，同时设计一条阴性对照序列，将各靶点克隆连接到piLenti-siRNA-GFP慢病毒干扰载体中。干扰载体构建服务由镇江爱必梦生物科技有限公司完成。
表1β-Catenin-siRNA干扰载体的引物序列
同时根据NCBI中鸡Wnt5A基因序列分别设计3条Wnt5A干扰靶点，同时设计一条阴性对照序列(引物设计和引物序列参考文献：He N,Wang Y,Zhang C,et al.Wnt SignalingPathway RegμLates Differentiation of Chicken Embryonic Stem Cells intoSpermatogonial Stem cells via Wnt5a[J].Journal of CellμLar Biochemistry,2017,119(2))，在4条DNA链的两端分别加入BamHI和EcoRI酶切位点粘性末端，中间加入Loop环(TTCAAGAGA)，将这些单链DNA送至上海生工生物工程股份有限公司，合成纯化的shRNAOligo片段，经退火杂交后与pGMLV-SC5载体连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，转化菌液涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃倒置培养过夜。次日挑取阳性菌落培养，收集菌液，以PCR方法筛选阳性克隆，以双酶切和测序进行验证。
将构建成功的干扰载体分别转染DF1细胞，具体步骤如下：提前一天以每孔2×105的DF1细胞接种24孔板，当DF1细胞覆盖率达到50％～60％时，将干扰载体以质粒(质量m)：FuGENE HD(体积v)为1:3的比例转染(一孔为例)：Opti-MEM稀释1μg质粒至50μL作为A液；Opti-MEM稀释3μL FuGENE HD至50μL作为B液。将A、B液混合，轻轻吹打，37℃孵育10～15min。将混合液100μL缓缓加入含有400μL完全培养基的孔内混匀，于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，48h后进行嘌呤霉素筛选，24h后观察拍照，收集细胞，通过Trizol裂解法抽提总RNA，并反转录合成cDNA，以β-actin为内参检测β-Catenin的表达变化。PCR反应体系为：cDNA 2μL，TB Green Premix Ex TaqII 10μL，上下游引物(10uM)各0.8μL，ddH2O 6.4μL，总体积20μL。PCR反应程序参照Takara公司TB GreenTMPremix Ex TaqTMII说明书。
b)Wnt5A/β-Catenin过表达载体构建
根据GenBank鸡Wnt5A/β-Catenin基因序列，应用Primer Premier 5.0设计引物。提取4.5d生殖嵴总RNA，反转录为cDNA。以此为模板进行PCR扩增，获得目的基因克隆片段。PCR扩增条件：98℃3min；98℃25s、64℃30s、72℃1min，35个循环；72℃7min。将经各自双酶切的线性质粒pcDNA3.1和扩增的目的基因片段，以T4连接酶进行连接反应，16℃孵育16h。将连接产物转化DH5α感受态细胞，转化菌液涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃倒置培养过夜。次日挑取阳性菌落培养，收集菌液，以PCR方法筛选阳性克隆，以双酶切和测序进行验证。
c)靶基因真核表达载体的构建
以鸡胚基因组DNA为模板，利用引物克隆Lin28A和Lin28B启动子区，反应体系：Prime STAR Max DNA Polymerase 10μL，上下游引物各lμL，DNA模板1μL，ddH20补足至20μL。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃25s，62℃30s，72℃90s，共35个循环；72℃最后延伸7min。扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
利用限制性内切酶对真核表达载体pEGFP-Nl进行双酶切消化。酶切体系：pEGFP-Nl载体1ug，限制性内切酶各1μL，10×Buffer 2μL，ddH20补足至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，将线性载体条带切下，同时将大量扩增的两个基因的启动子片段，分别用DNA纯化回收试剂盒回收线性载体和目的片段。
目的基因与线性载体进行连接：连接体系：2×SoSoo Mix 5μL，线性载体100ng；目的片段100ng，ddH2O补足至10μL。50℃连接15min。将10μL的连接产物加入到50μL感受态DH5α中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热击90s，迅速放入冰中3min，加入1ml不含抗生素的LB液体培养基，置于摇床中37℃，180r/min复苏1h；取100μL涂布于添加卡那抗生素的固体LB培养基平板中，于37℃倒置培养12-14h。LB培养基：Trypton 1.0g；Yeast Extract 0.5g；NaCl1.0g；Agar 1.5g(固体培养基添加)；去离子水溶解，调节pH＝7.2，定容至1L，高压灭菌后备用。
待LB固体平板培养基中长出菌落后，无菌枪头挑取单个菌落置于1ml LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃恒温摇床，180rpm，摇菌14-16h。根据质粒小提试剂盒说明书提取质粒，并进行双酶切鉴定。酶切体系见步骤二，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。酶切鉴定正确的载体质粒送南京擎科生物有限公司进行测序。
将测序正确的载体菌液，以1:1000的比例添加的10ml的LB液体培养基中，37℃恒温摇床，180rpm摇菌14-16h，收集菌液。根据天根去内毒中量小提试剂盒说明书提取载体质粒，测定浓度后置于-20℃备用。
d)TCF7L2结合位点缺失的启动子报告基因载体的构建
根据生物信息学预测目的基因的启动子核心区TCF7L2的结合位点并进行点突变。点突变载体构建服务由武汉金开瑞生物科技有限公司完成，构建的载体经酶切和测序鉴定成功。
根据生物信息学预测结果，对Lin28A/B的启动子核心区TCF7L2的结合位点进行点突变。具体的：Lin28A的“ggagcctttgaaaaaac(SEQ ID NO.7)”序列突变“ggagcctgtgaaaaaac(SEQ ID NO.8)”；Lin28B的“ggaccatttgatgggct(SEQ ID NO.9)”序列突变为“ggaccatgtgatgggct(SEQ ID NO.10)”点突变载体构建服务由武汉金开瑞生物科技有限公司完成，构建的载体经酶切和测序鉴定成功后分别命名为：pLin28A/684-mut，pLin28B/1530-mut。
e)预测靶基因启动子区不同缺失片段双荧光素酶报告载体构建
根据NCBI上调取的预测靶基因5’UTR区域前2000bp的片段进行引物设计，同时固定下游引物，不断改变上游引物，设计4对不同大小缺失片段引物。利用鸡基因组为模板进行扩增，与pGL3-basic载体进行连接，后续步骤参照上述方法。
表2 Lin28A/B启动子区不同长度片段PCR扩增引物
注：下划线部分为限制性酶切位点，小写字母为载体同源臂。
3.体内外检测Wnt5A/β-Catenin信号正向调控靶基因表达
Wnt5A过表达载体(oeWnt5A)和慢病毒干扰载体(shWnt5A)，以及β-Catenin过表达载体(oeβ-Catenin)和β-Catenin慢病毒干扰载体(siβ-Catenin)，作为介导Wnt信号激活或抑制的实验工具，通过对正常孵化55h-60h左右的鸡胚进行血管注射，并在孵化4.5d收集生殖嵴进行qRT-PCR检测预测Wnt信号靶基因的表达变化。
体外我们在诱导ESCs向PGCs分化的基础上通过过表达/干扰Wnt5A或β-Catenin对Wnt信号进行激活/抑制，并在第0d和4d收集细胞以qRT-PCR检测预测Wnt信号靶基因的表达。
利用Wnt5A干扰载体(oeWnt5A)和慢病毒干扰载体(shWnt5A)，以及β-Catenin过表达载体(oeβ-Catenin)和β-Catenin慢病毒干扰载体(siβ-Catenin)，作为介导Wnt信号激活或抑制的实验工具，通过对正常孵化55h-60h左右的鸡胚进行血管注射，并在孵化4.5d收集生殖嵴进行qRT-PCR检测Lin28A/B的表达变化。结果发现：与对照组(1±0)相比，过表达Wnt5A显著提高Lin28A/B(1.25±0.095和1.57±0.090)的表达，而干扰Wnt5A后，Lin28A/B表达水平(0.82±0.047和0.68±0.057)极显著下降(P<0.01)；同样，过表达β-Catenin显著提高Lin28A/B(1.69±0.107和1.82±0.097)的表达，而干扰β-Catenin后，Lin28A/B表达水平(0.73±0.084和0.68±0.065)极显著下调；即Wnt5A/β-Catenin信号能正向调控Lin28A/B的表达。
表3不同分组中相关基因表达qRT-PCR检测结果
不同分组中相关基因表达qRT-PCR检测结果
体外我们在诱导ESCs向PGCs分化的基础上通过过表达/干扰Wnt5A或β-Catenin对Wnt信号进行激活/抑制，并在第0d和4d收集细胞以qRT-PCR检测Lin28A/B的表达。结果发现：与对照组相比，过表达Wnt5A显著提高Lin28A/B的表达水平；而干扰Wnt5A则显著降低Lin28A/B的表达水平；同样，过表达β-Catenin显著提高Lin28A/B的表达，而干扰β-Catenin后，Lin28A/B表达水平显著下调。以上结果说明Wnt5A/β-Catenin信号的确可以调控Lin28A/B的表达。接下来，我们将重点研究Wnt5A/β-Catenin信号对Lin28A/B的靶向作用是否是直接作用。
表4不同分组中相关基因表达qRT-PCR检测结果
表5不同分组中相关基因表达qRT-PCR检测结果
4.TCF7L2结合位点突变对靶基因的启动活性的影响
(1)靶基因启动子核心区域的筛选
以双荧光素酶报告基因检测系统检测目的基因启动子的启动活性，具体步骤如下：将包含不同启动子片段的重组质粒和pRL-SV40以质量比为30:1的比例共转染DF1细胞，同时设置阴性对照(pGL3-basic质粒与pRL-SV40质粒以质量比为30:1的比例共转染DF1细胞)。每次转染3个孔，重复3次。转染48h后收集细胞，每管加70μL细胞裂解液，轻轻混匀，每孔细胞中加入等体积即70μL荧光液，轻轻混匀，放入酶标仪中读取萤火虫荧光值，然后加入70μL STOP终止液，轻轻吹打混匀，再放入酶标仪中读取海肾荧光值。
启动子活性值为荧光素酶相对活性值(Relative Luciferase activity)即萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。相对荧光活性的数值为3次重复试验结果的“平均值±标准差。具体操作参照Promega公司双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书。通过双荧光素报告酶检测各缺失片段启动子活性高低以筛选核心启动子区域。
具体实施如下：
以鸡胚基因组DNA为模板，PCR分别扩增Lin28A和Lin28B启动子不同长度的缺失片段2028bp、1600bp、1162bp、684bp和1962bp、1530bp、1133bp、591bp。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，所获得的PCR产物片段大小与预期设计的结果一致，说明Lin28A和Lin28B启动子的不同长度缺失片段克隆成功。根据同源重组法将不同缺失片段连接至线性化PGL3-basic载体上，经转化、筛选、挑选阳性克隆后进行摇菌提质粒，对构建好的不同长度的PGL3.0重组载体进行双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示Lin28A/B启动子不同长度片段和载体片段两条清晰条带(图5的C、D)，测序结果正确，说明载体构建成功可以用于启动子核心区域筛选实验。
构建的8个载体和PGL3-Basic分别与PRL-SV40按1:30比例共转染DF1细胞，48h后收集细胞，采用双荧光素酶报告基因检测系统测定Lin28A/B启动子各缺失片段的启动活性。结果发现：pLin28A/684(-584～+100bp)活性最高，pLin28A/1162(-162～-584bp)活性最低，说明pLin28A/684和pLin28A/1162(-1062～-584bp)区域存在负向调控元件，在-584～+100bp区域启动活性最强，存在重要的正向调控元件，为Lin28A的核心片段。对于Lin28B，pLin28B/1530(-1431～+99bp)活性最高，其他活性均低，说明pLin28B/1962和pLin28B/1530(-1862～-1431bp)区域存在负向调控元件，在pLin28B/1530和pLin28B/1133(-1431bp～-1034bp)区域存在正向调控元件，为Lin28B启动子的核心片段。
表6启动子各缺失克隆片段相对荧光表达值
(2)双荧光素报告基因检测预测靶基因Tcf7l2转录因子结合位点缺失的启动活性
以上述方法检测到的预测靶基因核心启动区域载体为阳性对照，pGL3-basic为阴性对照，将构建好的Tcf7l2结合位点缺失的载体转染DF1细胞，转染和检测步骤如下
利用The JASPAR database(http://jaspardev.genereg.net/)在线数据库对Lin28A/B启动子区转录因子TCF7L2结合位点进行预测，发现Lin28A核心启动子区(-584～+100bp)和Lin28B核心启动子区(-1431bp～-1034bp)均存在TCF7L2结合位点，针对该区域分别对Lin28A和Lin28B核心启动子区进行TCF7L2结合位点点突变，并构建至pGL3.0-Basic载体上，经双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示发现在500bp左右出现特异性条带，测序结果显示Lin28A/B核心启动子区转录因子结合位点确实被突变，原保守性“T”碱基被突变为“G”碱基，载体构建成功，我们将构建成功的载体分别命名为pLin28A/684-mut和pLin28B/1530-mut。
为了验证TCF7L2结合位点突变对Lin28A/B的启动活性的影响，将构建的pLin28A/684-mut和pLin28B/1530-mut分别与PRL-SV40按1:30比例共转染DF1细胞，并且分别以pLin28A/684和pLin28B/1530为阳性对照，PGL3-Basic为阴性对照，转染48h后收集细胞，采用双荧光素酶报告基因检测系统测定Lin28A/B启动子各缺失片段的启动活性。结果显示：与pLin28A/684组相比，突变Lin28A核心启动子区TCF7L2结合位点后，其启动活性极显著下调；与pLin28B/1530组相比，突变Lin28B核心启动子区TCF7L2结合位点后，其启动活性同样极显著下调。以上结果说明转录因子TCF7L2对Lin28A/B的启动至关重要，这是调控Lin28A/B表达的重要因素。
表7转录因子结合位点突变载体启动活性分析
5.预测靶基因是Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号链直接靶基因
(1)双荧光素报告基因检测靶基因对Wnt信号的响应
将β-Catenin和TCF7L2真核表达载体、靶基因启动子区缺失载体及其相应的TCF7L2结合位点突变载体以不同的组合形式共转染DF1细胞，转染48h后收集细胞，采用双荧光素酶报告基因检测系统测定预测靶基因启动子各缺失片段的启动活性。
为了进一步确认Lin28A/B是否是Wnt信号通路的靶基因，将β-Catenin和TCF7L2真核表达载体、Lin28A/B启动子区缺失载体及其相应的TCF7L2结合位点突变载体以不同的组合形式共转染DF1细胞，转染48h后收集细胞，采用双荧光素酶报告基因检测系统测定Lin28A/B启动子各缺失片段的启动活性。结果显示：与对照组Lin28A/684相比，激活Wnt信号(+β-Catenin或+TCF7L2)能极显著提高Lin28A核心启动子区的活性，且+TCF7L2组的活性显著高于+β-Catenin组，而突变TCF7L2结合位点后，即使激活Wnt信号也不能挽救Lin28A的启动活性。对于Lin28B，与对照组Lin28B/1530组相比，激活Wnt信号(+β-Catenin或+TCF7L2)能极显著提高Lin28B核心启动子区的活性，且+β-Catenin组的活性显著高于+TCF7L2组，而突变TCF7L2结合位点后，即使激活Wnt信号也不能挽救Lin28B的启动活性。以上结果说明Lin28A/B是Wnt信号的靶基因，且Wnt信号能通过转录因子TCF7L2结合Lin28A/B启动子区调控其转录活性。
表8 Wnt信号变化对Lin28A/B启动活性分析
(2)Chip-qPCR验证β-Catenin富集于靶基因启动子区
在鸡PGCs细胞中分别转染β-Catenin干扰载体和过表达载体，并利用β-Catenin特异性抗体进行染色质免疫共沉淀，检测Wnt信号的激活/抑制后，β-Catenin/TCF7L2复合物对靶基因启动子区的结合能力的影响。
本次试验通过生物信息学分析PGCs形成过程中，对受H3K4me2调控的Wnt信号关键转录因子TCF7L2，进行靶基因预测，并根据GO功能注释筛选其中参与生殖细胞发育及干细胞分化的保守性靶基因Lin28A/B，并通过体内外实验验证Wnt信号以及组蛋白H3K4me2对Lin28A/B转录水平的调控作用，通过双荧光素报告基因检测试验系统研究Wnt信号对Lin28A/B的启动活性影响，通过ChIP-qPCR(结合位点分析法)验证了β-Catenin/TCF7L2复合物对Lin28A/B的差异性调节作用，从而确定了Wnt信号对Lin28A/B的靶向作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcaagaga 9
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcaagttgc tgatattgat ggccaatat 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaggtctcc tcaaatggta tctgcaatt 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggattctg tgttgttcta tgccattac 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agagagtagc tgcgggtgta ctttgtgaa 29
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggtgaactc acgtcagaac 20
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggagcctttg aaaaaac 17
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggagcctgtg aaaaaac 17
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggaccatttg atgggct 17
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaccatgtg atgggct 17
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgccatgcat tagttattaa ctacacatcc ctatccgaat tactcctcaa a 51
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgactgcaga attcgaagct tactcgcttg caaattccg 39
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acttggcagt acatctacgt agaatgggtt ctgtgagggc atc 43
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcgactgcag aattcgaagc ttgtgctctt ctgctttaac ccaacatc 48
<210> 15
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atttctctat cgataggtac cctacacatc cctatccgaa ttactcctca aa 52
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atttctctat cgataggtac catccccgtt gtcattggtg taaagat 47
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atttctctat cgataggtac cacagtgcgc acttcagcac cac 43
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atttctctat cgataggtac cagctgggac aaagtcgggg tc 42
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agtaccggaa tgccaagctt actcgcttgc aaattccg 38
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atttctctat cgataggtac cgaatgggtt ctgtgagggc atc 43
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atttctctat cgataggtac caaggttggg accatttgat ggg 43
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atttctctat cgataggtac caagccgctc gccgaagtaa 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atttctctat cgataggtac caagccgctc gccgaagtaa 40
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atttctctat cgataggtac caacaatcgc cgccgcc 37
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtaccggaat gccaagcttg tgctcttctg ctttaaccc 39

Claims (10)

1.一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法，包括以下步骤：
(1)采用预测软件对Wnt信号通路的某一转录因子的结合靶基因预测，对预测的靶基因进行GO功能注释，根据注释选取生殖细胞发育和干细胞发育过程中共同的靶基因，得到待选靶基因；
(2)对待选靶基因进行体内和体外实验验证Wnt信号通路对待选靶基因转录水平是否有调节作用；
(3)检测待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时、Wnt信号对待选靶基因转录水平是否有调节作用；
(4)通过ChIP-qPCR验证β-Catenin/转录因子复合物与待选靶基因的结合作用；
(5)若待选靶基因经过步骤(2)～(4)的检测的结果为：Wnt信号通路对待选靶基因转录水平有调节作用、待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时的Wnt信号通路对待选靶基因转录水平无调节作用并且β-Catenin/转录因子复合物能够通过结合待选靶基因启动子区域调节其转录，则判断该待选靶基因为Wnt信号通路的直接靶基因；
所述步骤(2)～(4)之间无时间顺序上的限定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)利用在线软件对不同物种的Wnt信号通路的转录因子能够结合的靶基因进行预测。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述体内实验包括以下步骤：
A1、分别制备Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体；
A2、分别将Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体转入孵化55～60h的鸡胚中，继续孵化4.5d后，以qRT-PCR检测生殖器官中的待选靶基因的表达情况。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述体外试验包括以下步骤：
B1、分别制备Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体；
B2、分别向胚胎干细胞转染Wnt过表达载体、Wnt慢病毒干扰载体、β-Catenin过表达载体和β-Catenin慢病毒干扰载体，得到转染后的胚胎干细胞；
B3、对转染后的胚胎干细胞体外诱导，使其分化为原始生殖细胞，分别在诱导的第0d和第4d时检测待测靶基因的表达情况。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述检测待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时、Wnt信号对待选靶基因转录水平是否有调节作用的方法包括以下步骤：
C1、以双荧光素酶报告基因检测系统筛选待选靶基因的启动子的核心区域；
C2、根据所述核心区域制备转录因子结合位点突变的待选靶基因启动子载体，所述转录因子结合位点突变的待选靶基因载体中含有双荧光素酶报告基因；
C3、以待选靶基因启动子核心区域的双荧光素酶表达载体作为阳性对照，以pGL3-basic为阴性对照，将阳性对照、阴性对照以及步骤C2制备的突变位点不同的各转录因子结合位点突变的待选靶基因载体分别转染DF1细胞，转染48h后，检测转染后细胞的启动活性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤C1所述以双荧光素酶报告基因检测系统筛选待选靶基因的启动子的核心区域的方法，包括以下步骤：
S1、根据预测待选靶基因5’UTR区域前2000bp的片段进行引物设计，设计缺失不同启动子片段的上游引物，再设计一个下游引物，分别利用设计的各上游引物和下游引物对动物基因组进行PCR扩增，得到缺失不同片段的待选靶基因启动子序列，再连接到含有荧光素酶报告载体上，得到缺失不同片段的待选靶基因启动子载体；
S2、将缺失不同片段的待选靶基因启动子载体与pRL-SV40共转染DF1细胞，转染48h后，检测荧光素酶相对活性，计算缺失不同片段的待选靶基因启动子的活性高低，确定待选靶基因的启动子转录因子结合位点的核心区域。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述验证β-Catenin/转录因子复合物对待选靶基因的调节作用的方法，包括以下步骤：
D1、制备β-Catenin慢病毒干扰载体和β-Catenin过表达载体；
D2、分别将所述β-Catenin慢病毒干扰载体和β-Catenin过表达载体转染至原始生殖细胞中，并以β-Catenin特异性抗体进行染色质免疫共沉淀，检测Wnt信号的激活或抑制后、β-Catenin/转录因子复合物与靶基因启动区的结合能力影响。
8.根据权利要求3、4或7所述的方法，其特征在于，所述β-Catenin慢病毒干扰载体的制备方法，包括以下步骤：
根据β-Catenin基因序列分别设计一条或多条干扰靶点序列、一条阴性对照序列，分别将各干扰靶点序列和/或阴性对照序列连接到慢病毒干扰载体中，得到β-Catenin慢病毒干扰载体。
9.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述Wnt慢病毒干扰载体的制备方法，包括以下步骤：
E1、根据Wnt5A基因序列分别设计一条或多条干扰靶点序列、一条阴性对照序列；
E2、分别以各干扰靶点序列或阴性对照序列合成shRNA Oligo片段，并在shRNA Oligo片段两端加入不同的限制性内切酶酶切位点粘性末端，退火杂交后与慢病毒干扰载体连接，得到Wnt慢病毒干扰载体。
10.权利要求1～9任意一项所述的方法在研究禽类或哺乳动物的Wnt信号通路中的应用。
CN201910593462.1A 2019-07-03 2019-07-03 一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法 Pending CN110272919A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910593462.1A CN110272919A (zh) 2019-07-03 2019-07-03 一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910593462.1A CN110272919A (zh) 2019-07-03 2019-07-03 一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110272919A true CN110272919A (zh) 2019-09-24

Family

ID=67962830

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910593462.1A Pending CN110272919A (zh) 2019-07-03 2019-07-03 一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110272919A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111944887A (zh) * 2020-08-26 2020-11-17 扬州大学 一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法
CN114427116A (zh) * 2021-12-29 2022-05-03 北京林业大学 一种在全基因组水平上预测植物生长发育转录因子调控的下游靶基因的方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111944887A (zh) * 2020-08-26 2020-11-17 扬州大学 一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法
CN114427116A (zh) * 2021-12-29 2022-05-03 北京林业大学 一种在全基因组水平上预测植物生长发育转录因子调控的下游靶基因的方法
CN114427116B (zh) * 2021-12-29 2023-08-15 北京林业大学 一种在全基因组水平上预测植物生长发育转录因子调控的下游靶基因的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107828738A (zh) 一种dna甲基转移酶缺陷型cho细胞系及其制备方法及应用
CN107513531A (zh) 用于内源性过表达lncRNA‑XIST的gRNA靶点序列及其应用
CN106591306A (zh) 靶向干扰肿瘤ptn‑ptprz1通路的小干扰rna在肿瘤免疫治疗中的应用
CN109182562B (zh) 与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA apla-mir-25-42及其检测引物、抑制物和应用
CN110272919A (zh) 一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法
CN101705227B (zh) 抑制人AP-2alpha基因表达的siRNA在抗宫颈癌药物制备中的应用
CN115976021A (zh) lncRNA MSTRG.5970.28及其应用、调控卵巢发育的产品和方法
Katsuoka et al. One enhancer mediates mafK transcriptional activation in both hematopoietic and cardiac muscle cells
CN115948578A (zh) 与黑山羊繁殖相关的差异基因及检测方法和应用
CN104357444A (zh) 一种使牛trim5α基因沉默的siRNA及其应用
CN109536495A (zh) 抑制RTL1基因表达的siRNA及其应用
CN107988257A (zh) 基于供体细胞dna甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法
CN103505745A (zh) 小分子rna作为免疫抑制剂的应用
CN103952406B (zh) 抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表达载体和应用
CN102433337B (zh) 一个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子
CN109504679A (zh) 用于基因在禽类骨骼肌中特异性表达的启动子以及应用
CN110343752A (zh) 一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法
Li et al. Galectin-1 promotes angiogenesis and chondrogenesis during antler regeneration
CN109055429A (zh) 一种靶向RunX2基因的小鼠成骨样细胞慢病毒载体及其构建方法
CN109706173A (zh) 一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1
CN111228292B (zh) 人tpt1/tctp基因在制备抗肿瘤药物中的应用
CN110317809B (zh) 一种调控蛋鸭卵泡发育的长链RNA Lnc-30215及其应用
CN117187249B (zh) 一种牦牛Lnc-MEG8基因及其应用
CN105861502A (zh) 干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA及其表达质粒和应用
Li et al. Plant-specific histone deacetylases are essential for early as well as late stages of Medicago nodule development

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190924

RJ01 Rejection of invention patent application after publication