发明内容
本发明的目在于:通过对照组细胞BMPR-1B表达水平,从8种shRNA分子中筛选到7个具有显著抑制效果的shRNA分子,在mRNA水平上抑制效率可达90%以上,而对BMPR-1B蛋白的抑制可达80%以上。
本发明的目的是这样实现的:根据GeneBank中绵羊BMPR-1B基因(NM_001009431.1序列);从启始密码(ATG)至终止密码(TGA)共1515bp编码区序列,用shRNA设计软件设计干扰BMPR-1B基因转录的shRNA分子群,从设计的34条shRNA分子中,根据结构和位置筛选出8条针对不同位点的shRNA序列进行合成;将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后,分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒(pLL-BMPR-1B-shRNA),干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒,携带BMPR-1B的病毒稳定感染Hek293细胞系,然后携带干扰RNA病毒感染携带BMPR-1B的Hek293细胞系,通过实时定量荧光PCR及Western blot从mRNA及蛋白水平分析了BMPR-1B的表达,以及shRNA对BMPR-1B的干扰抑制作用,通过分析和比较实验组与对照组细胞BMPR-1B表达水平,从8个shRNA分子中筛选到7个具有显著抑制效果的shRNA分子,在mRNA水平上抑制效率可达90%以上,而对BMPR-1B蛋白的抑制可达80%以上,最终确定的7个显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子;
其中使用的引物:
①LV-BMPR-1B-749
Sense:5’
TGGACAATAGCAAAGCAAATTTCAAGAGAATTTGCTTTGCTATTGTCCTTTTTTC-3’(55bp);
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGGACAATAGCAAAGCAAATTCTCTTGAAATTTGCTTTGCTATTGTCCA-3’(59bp);
②LV-BMPR-1B-803
Sense:5’
TGTAGATGTTTCAAGGTATATTCAAGAGATATACCTTGAAACATCTACTTTTTTC-3’(55bp);
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGTAGATGTTTCAAGGTATATCTCTTGAATATACCTTGAAACATCTACA-3’(59bp);
③LV-BMPR-1B-1306
Sense:5’
TGATGAGAGCTTGAACAGAATTCAAGAGATTCTGTTCAAGCTCTCATCTTTTTTC;-3’(55bp);
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGATGAGAGCTTGAACAGAATCTCTTGAATTCTGTTCAAGCTCTCATCA-3’(59bp);
④LV-BMPR-1B-1475
Sense:5’
TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC-3’(59bp);
Antisense:5’
TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3’(59bp);
⑤LV-BMPR-1B-1685
Sense:5’
TGGACAAAGCCAGTAGATATTTCAAGAGAATATCTACTGGCTTTGTCCTTTTTTC-3’(59bp);
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGGACAAAGCCAGTAGATATTCTCTTGAAATATCTACTGGCTTTGTCCA-3’(59bp);
⑥LV-BMPR-1B-2567
Sense:5’
TGTAAGAAGATGGTGTCAAATTCAAGAGATTTGACACCATCTTCTTACTTTTTTC-3’(59bp);
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGTAAGAAGATGGTGTCAAATCTCTTGAATTTGACACCATCTTCTTACA-3’(59bp);
⑦LV-BMPR-1B-2745
Sense:5’
TGAGGAAACGTATCAGGTTATTCAAGAGATAACCTGATACGTTTCCTCTTTTTTC-3’(59bp);
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGAGGAAACGTATCAGGTTATCTCTTGAATAACCTGATACGTTTCCTCA-3’(59bp);
其中shRNA分子的获取,包括shRNA慢病毒载体的构建:即plex-bmpr-1b、Lv-BMPR-1B-shRNA慢病毒的获取;重组Lentivirus感染Hek293细胞系的获取;shRNA病毒载体感染含BMPR-1B的Hek293细胞系的获取;siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价等步骤。通过定量分析得出,pSi749能够有效抑制68.3%的BMPR-1B的转录,pSi803能够有效抑制71.2%的BMPR-1B的转录,pSi1306能够有效抑制99.86%的BMPR-1B的转录,pSi1475能够有效抑制99.78%的BMPR-1B的转录,pSi1685能够有效抑制96.42%的BMPR-1B的转录,pSi2567能够有效抑制94.37%的BMPR-1Bp的转录,Si2745能够有效抑制80.5%的BMPR-1B的转录。
本发明的实践意义与技术效果:多胎性状是绵羊重要的经济性状之一;BMPR-IB基因是小尾寒羊,湖羊等多个绵羊品种的多胎主效基因;本研究应用分子克隆技术,细胞培养技术,Western blot技术,实时定量PCR技术,针对绵羊的BMPR-1B基因序列设计了8个shRNA干扰分子,并通过检测BMPR-1B基因的mRNA及蛋白水平分析干扰结果显示,8个shRNA分子中有7个shRNA分子具有显著抑制效果,在7个干扰分子中,能降低BMPR-IB基因表达水平的68.3-99.86%;本发明为阐明BMPR-1B基因的作用机制,培育多胎绵羊品种提供技术支持,彰显技术进步。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步说明。
依据GeneBank中绵羊BMPR-1B基因,即NM-001009431.1序列;设计34条shRNA分子,针对不同位点的shRNA序列进行合成,将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后,分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒,将pLL-BMPR-1B-shRNA干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒,经荧光PCR及Western blot的检测,确定7个显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子;所用引物(略);
1)shRNA慢病毒载体的构建
各取10UL 10uM的两条siRNA寡核苷酸(正链和互补链),加入8μL 10×annealing buffer和12μL灭菌超纯水,煮沸10min后自然冷却至室温,同时pLL3.7质粒载体经XhoI和HpaI双酶切后回收线性化质粒,与退火产物4℃过夜连接,连接产物转化DH5a感受态细胞,LB平板氨苄青霉素(100ug/uL)筛选;用载体检测引物及shRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆并送上海生工测序鉴定序列正确后,提取纯化重组质粒用于转染。
2)plex-bmpr-1b、Lv-BMPR-1B-shRNA慢病毒的制备
第一日:铺板(上午10-11时)
每10cm面积中铺3×106个293T细胞,保证第二天细胞子完全培养液中汇合度达到80%-90%;
第二日:Lipectamine2000脂质体转染(下午2-3时)
首先在聚丙烯管内准备脂质体和DNA复合物;
加入1.5ml预热的
I培养基后,按比例加入目的载体及病毒包装载体,轻轻混匀,室温放置;其中加入的比例:转染载体lv-bmpr-1b-shRNA12ug、包装质粒REV 6ug、pMDL 6ug、包膜质粒VSVG 6ug、转染载体plex-bmpr-1b12ug、包装质粒Pspax2 9ug、包膜质粒PMD2.G 3.5ug;
在使用Lipictamine2000之前先轻轻混匀脂质体,而后在另一个聚丙烯管中加入1.5mL预热的
I培养基,再加入50uLLipictamine2000,轻轻混匀后室温放置;
在室温放置5分钟后,将上述稀释好的DNA与脂质体混合,混合物质于室温孵育20min,在此期间可以用
I培养基洗待转染的细胞一次;
注:由于293T细胞易脱壁,故整个过程中操作须轻缓,可以先将细胞培养板倾斜,将液体沿板壁慢慢加入,在慢慢放正细胞板。
然后将脂质和DNA复合物加入细胞,上下倾斜细胞板使液体均匀覆盖在细胞表面,而后,将细胞放回37℃培养箱,培养4h后,换10mL新鲜的DMEM完全培养基,继续培养48h后收集病毒,此时的病毒能直接用来转染,或置于-70℃备用。
3)重组Lentivirus感染Hek293细胞系的步骤
转染前一天按每孔4×105个/mL的密度将Hek293细胞系接种于六孔板,保证转染时汇合度达到60-70%;将滤过的重组0.5mL Lentivirs和0.5mL培养液(体积比,1:1)混合,同时加入1μL聚凝胺(polybrene)(终浓度为10μg/mL),将病毒加入细胞,然后,把细胞置于32℃培养箱14-16h后移回37℃培养箱孵育,4-6h后更换新鲜培养液,37℃培养箱继续培养。感染48h后,将6孔培养皿中的细胞转入100mm培养皿中,1h后加入Puromycin(终浓度为600ng/mL)选择性培养液;为了获得稳定整合外院基因的细胞,每隔2-3d更换含Puromycin选择性培养液,通常14-21d,即获得稳定转染的细胞。
4)shRNA病毒载体感染含BMPR-1B的Hek293细胞系
感染前一天按每孔4×105个/mL的密度将表达BMPR-1B的Hek293细胞接种于六孔板,用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞,24h后细胞达到70-80%汇合度时;将500μL的shRNA干扰病毒与500μL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞(体积比1:1)混合,同时加入1μL 10μg/mL的Polybrene,24h后,更换为含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液,再培养24h后收获细胞,用Trizol法提取总RNA及细胞蛋白裂解液提取蛋白。
5)siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价
上述感染细胞的总RNA经反转录成cDNA后,通过实时定量PCR对BMPR-1B基因表达进行相对定量分析,评价对BMPR-1B基因表达的抑制效果;定量分析方法如下:Real time PCR荧光染料SYBR Green I购自TAKARA公司试剂进行Real Time PCR反应体系为:2xmaster mix 10μL,上下游(10pm)个0.8μL;cDNA 2μL。PCR反应条件为:95℃10s,58℃20s,72℃20s,55个循环后进入溶解曲线分析程序:40℃-99℃(0.1℃/s)。通过相对定量分析得出:pSi749能够有效抑制68.3%的BMPR-1B的转录,pSi803能够有效抑制71.2%的BMPR-1B的转录,pSi1306能够有效抑制99.86%的BMPR-1B的转录,pSi1475能够有效抑制99.78%的BMPR-1B的转录,pSi1685能够有效抑制96.42%的BMPR-1B的转录,pSi2567能够有效抑制94.37%的BMPR-1Bp的转录,Si2745能够有效抑制80.5%的BMPR-1B的转录。
本实验自制的细胞蛋白裂解液,由50mM Tris,pH7.4,150mM NaCl,1%NP-40,0.1%SDS配制,置于容器中,混合均匀使用。
本实验选用的Opti-MEM培养液和DMEM培养液,购自美国Gibco公司;XhoI和HpaI双酶切,购自美国TAKARA公司;染载体pLL3.7由周文来,即美国加州大学圣地亚哥分校医学部,霍华德休斯医学研究所提供;Pspax2;VSVG由李文蓉,即美国克罗拉大学提供;plex购自美国Openbiosystem公司;包装质粒pMDL,REV,PMD2.G购自美国biosystem公司。
Organization Applicant
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Street : 克拉玛依东街151号
City : 乌鲁木齐市
State : 新疆维吾尔自治区
Country : 中国
PostalCode : 830000
PhoneNumber : 0991-4846163
FaxNumber : 0991-4841417
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<110> OrganizationName : 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心
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<120> Title : 七个抑BMPR-1B基表达合成的shRNA分子
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