CN102433337B - 一个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子 - Google Patents
一个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供的一个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子，根据GeneBank中绵羊BMPR-1B基因(NM_001009431.1序列)；用shRNA设计软件设计干扰BMPR-1B基因转录的shRNA分子群,从设计的34条shRNA分子中，根据结构和位置筛选出8条针对不同位点的shRNA序列进行合成；将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒（pLL-BMPR-1B-shRNA），将干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，经荧光PCR及Westernblot检测表达，获得了7个显著抑制BMPR-1B基因的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率达90%以上，对BMPR-1B蛋白的抑制达80%以上。
Description
技术领域
本发明涉及能够对骨形成蛋白受体-1B(BMPR-1B)基因产生显著抑制作用的小干扰RNA分子的设计、合成和抑制作用在卵母细胞上的评价方法。
背景技术
BMPR-1B基因是一种增加排卵率的调控基因，属于TGF-β超家族成员，又称为ALK6基因；ALK6突变是在Booroola母羊(FecB)中发现的第一个点突变，发生在高度保守的胞内激酶区，核苷酸830处（A830G），引起精氨酸代替了谷氨酰胺(Q249R)；其显性表现型为卵泡发育提前以及产多胎。文献检索披露：(1)Biol.Reprod.64,1225-1235作者：Wilson,T.等发表《表现为多胎性状的Booroola羊，在卵母细胞和颗粒细胞表达的ALK6基因的一个突变》文章内容是携带FecB纯合子的母羊其排卵率升高，伴随着大量囊状卵泡比FecB+杂合子的母羊提前成熟并发生排卵；因此，携带FecB纯合子母羊其排卵前卵泡提前达到了最大直径并维持在一定水平，直到排卵，导致最终卵泡生长动力学发生了变化。(2)ReproductiveBiologyandEndocrinology2006,4:20doi:1184/1477-7827-4-20作者Stéphane Fabre等发表《在哺乳动物中调节排卵率：羊基因模型的作用》文章，内容是BMP15,GDF9,BMPR-1B这三个基因型来理解BMP系统的作用作为卵巢内滤泡生长和成熟的调节最后影响排卵率。(3)Reproduction(2011)141643-651作者Wei Wang等发表《RNA分子干扰猪的含有内源性SMAD4的颗粒细胞导致的FSH介导的颗粒细胞的增值和类固醇合成的减少》文章内容是在猪的颗粒细胞上用RNA干扰的方法敲低了SMAD4，结果显示了SMAD4-siRNA抑制了SMAD4的mRNA和蛋白的表达并抑制了FSH引起的猪颗粒细胞的分化和雌二醇的分泌和细胞周期蛋白的表达。
关于BMPR-1B基因shRNA分子的研究，ALK6基因干扰的小鼠并没有像Booroola母羊一样表现出多胎性状，且卵泡发育和排卵率都表现正常，但其软骨形成受到影响，骨骼肌发育存在缺陷,说明ALK6突变存在种属差异,针对其它家畜品种，如绵羊、山羊、猪等，均未见报道。
本发明构思根据绵羊BMPR-1B基因cDNA序列，自行设计合成的shRNA分子，通过功能验证，从设计的shRNA分子库中，筛选到7个对绵羊BMPR-1B基因均有显著抑制作用的shRNA分子，为绵羊生物学研究拓展了应用领域。
发明内容
本发明的目在于：通过对照组细胞BMPR-1B表达水平，从8种shRNA分子中筛选到7个具有显著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率可达90%以上，而对BMPR-1B蛋白的抑制可达80%以上。
本发明的目的是这样实现的：根据GeneBank中绵羊BMPR-1B基因(NM_001009431.1序列)；从启始密码（ATG）至终止密码（TGA）共1515bp编码区序列，用shRNA设计软件设计干扰BMPR-1B基因转录的shRNA分子群,从设计的34条shRNA分子中，根据结构和位置筛选出8条针对不同位点的shRNA序列进行合成；将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒（pLL-BMPR-1B-shRNA），干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，携带BMPR-1B的病毒稳定感染Hek293细胞系，然后携带干扰RNA病毒感染携带BMPR-1B的Hek293细胞系，通过实时定量荧光PCR及Western blot从mRNA及蛋白水平分析了BMPR-1B的表达，以及shRNA对BMPR-1B的干扰抑制作用，通过分析和比较实验组与对照组细胞BMPR-1B表达水平，从8个shRNA分子中筛选到7个具有显著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率可达90%以上，而对BMPR-1B蛋白的抑制可达80%以上，最终确定的7个显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子；
其中使用的引物：
①LV-BMPR-1B-749
Sense:5’
TGGACAATAGCAAAGCAAATTTCAAGAGAATTTGCTTTGCTATTGTCCTTTTTTC-3’(55bp)；
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGGACAATAGCAAAGCAAATTCTCTTGAAATTTGCTTTGCTATTGTCCA-3’(59bp)；
②LV-BMPR-1B-803
Sense:5’
TGTAGATGTTTCAAGGTATATTCAAGAGATATACCTTGAAACATCTACTTTTTTC-3’(55bp)；
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGTAGATGTTTCAAGGTATATCTCTTGAATATACCTTGAAACATCTACA-3’(59bp)；
③LV-BMPR-1B-1306
Sense:5’
TGATGAGAGCTTGAACAGAATTCAAGAGATTCTGTTCAAGCTCTCATCTTTTTTC；-3’(55bp)；
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGATGAGAGCTTGAACAGAATCTCTTGAATTCTGTTCAAGCTCTCATCA-3’(59bp)；
④LV-BMPR-1B-1475
Sense:5’
TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC-3’(59bp)；
Antisense:5’
TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3’(59bp)；
⑤LV-BMPR-1B-1685
Sense:5’
TGGACAAAGCCAGTAGATATTTCAAGAGAATATCTACTGGCTTTGTCCTTTTTTC-3’(59bp)；
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGGACAAAGCCAGTAGATATTCTCTTGAAATATCTACTGGCTTTGTCCA-3’(59bp)；
⑥LV-BMPR-1B-2567
Sense:5’
TGTAAGAAGATGGTGTCAAATTCAAGAGATTTGACACCATCTTCTTACTTTTTTC-3’(59bp)；
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGTAAGAAGATGGTGTCAAATCTCTTGAATTTGACACCATCTTCTTACA-3’(59bp)；
⑦LV-BMPR-1B-2745
Sense:5’
TGAGGAAACGTATCAGGTTATTCAAGAGATAACCTGATACGTTTCCTCTTTTTTC-3’(59bp)；
Antisense:5’
TCGAGAAAAAAGAGGAAACGTATCAGGTTATCTCTTGAATAACCTGATACGTTTCCTCA-3’(59bp)；
其中shRNA分子的获取，包括shRNA慢病毒载体的构建：即plex-bmpr-1b、Lv-BMPR-1B-shRNA慢病毒的获取；重组Lentivirus感染Hek293细胞系的获取；shRNA病毒载体感染含BMPR-1B的Hek293细胞系的获取；siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价等步骤。通过定量分析得出，pSi749能够有效抑制68.3%的BMPR-1B的转录，pSi803能够有效抑制71.2%的BMPR-1B的转录，pSi1306能够有效抑制99.86%的BMPR-1B的转录，pSi1475能够有效抑制99.78%的BMPR-1B的转录，pSi1685能够有效抑制96.42%的BMPR-1B的转录，pSi2567能够有效抑制94.37%的BMPR-1Bp的转录，Si2745能够有效抑制80.5%的BMPR-1B的转录。
本发明的实践意义与技术效果：多胎性状是绵羊重要的经济性状之一；BMPR-IB基因是小尾寒羊，湖羊等多个绵羊品种的多胎主效基因；本研究应用分子克隆技术，细胞培养技术，Western blot技术，实时定量PCR技术，针对绵羊的BMPR-1B基因序列设计了8个shRNA干扰分子，并通过检测BMPR-1B基因的mRNA及蛋白水平分析干扰结果显示，8个shRNA分子中有7个shRNA分子具有显著抑制效果，在7个干扰分子中，能降低BMPR-IB基因表达水平的68.3-99.86%；本发明为阐明BMPR-1B基因的作用机制，培育多胎绵羊品种提供技术支持，彰显技术进步。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步说明。
依据GeneBank中绵羊BMPR-1B基因，即NM-001009431.1序列；设计34条shRNA分子，针对不同位点的shRNA序列进行合成，将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒，将pLL-BMPR-1B-shRNA干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，经荧光PCR及Western blot的检测，确定7个显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子；所用引物（略）；
1）shRNA慢病毒载体的构建
各取10UL 10uM的两条siRNA寡核苷酸(正链和互补链)，加入8μL 10×annealing buffer和12μL灭菌超纯水，煮沸10min后自然冷却至室温,同时pLL3.7质粒载体经XhoI和HpaI双酶切后回收线性化质粒，与退火产物4℃过夜连接,连接产物转化DH5a感受态细胞，LB平板氨苄青霉素（100ug/uL）筛选;用载体检测引物及shRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆并送上海生工测序鉴定序列正确后，提取纯化重组质粒用于转染。
2）plex-bmpr-1b、Lv-BMPR-1B-shRNA慢病毒的制备
第一日:铺板（上午10-11时）
每10cm面积中铺3×106个293T细胞，保证第二天细胞子完全培养液中汇合度达到80%-90%；
第二日:Lipectamine2000脂质体转染（下午2-3时）
首先在聚丙烯管内准备脂质体和DNA复合物；
加入1.5ml预热的
Ｉ培养基后，按比例加入目的载体及病毒包装载体，轻轻混匀，室温放置；其中加入的比例：转染载体lv-bmpr-1b-shRNA12ug、包装质粒REV 6ug、pMDL 6ug、包膜质粒VSVG 6ug、转染载体plex-bmpr-1b12ug、包装质粒Pspax2 9ug、包膜质粒PMD2.G 3.5ug；
在使用Lipictamine2000之前先轻轻混匀脂质体,而后在另一个聚丙烯管中加入1.5mL预热的
Ｉ培养基，再加入50uLLipictamine2000,轻轻混匀后室温放置;
在室温放置5分钟后，将上述稀释好的DNA与脂质体混合,混合物质于室温孵育20min,在此期间可以用
Ｉ培养基洗待转染的细胞一次;
注：由于293T细胞易脱壁，故整个过程中操作须轻缓，可以先将细胞培养板倾斜，将液体沿板壁慢慢加入，在慢慢放正细胞板。
然后将脂质和DNA复合物加入细胞,上下倾斜细胞板使液体均匀覆盖在细胞表面,而后，将细胞放回37℃培养箱，培养4h后，换10mL新鲜的DMEM完全培养基，继续培养48h后收集病毒,此时的病毒能直接用来转染，或置于-70℃备用。
3）重组Lentivirus感染Hek293细胞系的步骤
转染前一天按每孔4×105个/mL的密度将Hek293细胞系接种于六孔板,保证转染时汇合度达到60-70%;将滤过的重组0.5mL Lentivirs和0.5mL培养液（体积比，1：1）混合，同时加入1μL聚凝胺（polybrene）(终浓度为10μg/mL),将病毒加入细胞,然后，把细胞置于32℃培养箱14-16h后移回37℃培养箱孵育，4-6h后更换新鲜培养液，37℃培养箱继续培养。感染48h后，将6孔培养皿中的细胞转入100mm培养皿中，1h后加入Puromycin（终浓度为600ng/mL）选择性培养液；为了获得稳定整合外院基因的细胞，每隔2-3d更换含Puromycin选择性培养液,通常14-21d，即获得稳定转染的细胞。
4）shRNA病毒载体感染含BMPR-1B的Hek293细胞系
感染前一天按每孔4×105个/mL的密度将表达BMPR-1B的Hek293细胞接种于六孔板,用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞,24h后细胞达到70-80%汇合度时;将500μL的shRNA干扰病毒与500μL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞（体积比1：1）混合，同时加入1μL 10μg/mL的Polybrene,24h后，更换为含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液，再培养24h后收获细胞,用Trizol法提取总RNA及细胞蛋白裂解液提取蛋白。
5）siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价
上述感染细胞的总RNA经反转录成cDNA后，通过实时定量PCR对BMPR-1B基因表达进行相对定量分析，评价对BMPR-1B基因表达的抑制效果；定量分析方法如下：Real time PCR荧光染料SYBR Green I购自TAKARA公司试剂进行Real Time PCR反应体系为：2xmaster mix 10μL,上下游（10pm）个0.8μL；cDNA 2μL。PCR反应条件为：95℃10s,58℃20s,72℃20s,55个循环后进入溶解曲线分析程序：40℃-99℃（0.1℃/s）。通过相对定量分析得出：pSi749能够有效抑制68.3%的BMPR-1B的转录，pSi803能够有效抑制71.2%的BMPR-1B的转录，pSi1306能够有效抑制99.86%的BMPR-1B的转录，pSi1475能够有效抑制99.78%的BMPR-1B的转录，pSi1685能够有效抑制96.42%的BMPR-1B的转录，pSi2567能够有效抑制94.37%的BMPR-1Bp的转录，Si2745能够有效抑制80.5%的BMPR-1B的转录。
本实验自制的细胞蛋白裂解液，由50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl,1%NP-40,0.1%SDS配制，置于容器中，混合均匀使用。
本实验选用的Opti-MEM培养液和DMEM培养液，购自美国Gibco公司；XhoI和HpaI双酶切，购自美国TAKARA公司；染载体pLL3.7由周文来，即美国加州大学圣地亚哥分校医学部,霍华德休斯医学研究所提供；Pspax2；VSVG由李文蓉，即美国克罗拉大学提供；plex购自美国Openbiosystem公司；包装质粒pMDL，REV，PMD2.G购自美国biosystem公司。
Organization Applicant
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Street : 克拉玛依东街151号
City : 乌鲁木齐市
State : 新疆维吾尔自治区
Country : 中国
PostalCode : 830000
PhoneNumber : 0991-4846163
FaxNumber : 0991-4841417
EmailAddress :
<110> OrganizationName : 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心
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<120> Title : 七个抑BMPR-1B基表达合成的shRNA分子
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Claims (1)
1.一个抑制BMPR-IB基因表达合成的shRNA分子，其特征在于：所述shRNA分子的正义链模板序列为5’- TGATGAGAGCTTGAACAGAATTCAAGAGATTCTGTTCAAGCTCTCATCTTTTTTC-3’，
反义链模板序列为5’- TCGAGAAAAAAGATGAGAGCTTGAACAGAATCTCTTGAATTCTGTTCAAGCTCTCATCA-3’ 。
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