CN102433337A - 七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子 - Google Patents
七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供的七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子，根据GeneBank中绵羊BMPR-1B基因(NM_001009431.1序列)；用shRNA设计软件设计干扰BMPR-1B基因转录的shRNA分子群,从设计的34条shRNA分子中，根据结构和位置筛选出8条针对不同位点的shRNA序列进行合成；将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒（pLL-BMPR-1B-shRNA），将干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，经荧光PCR及Westernblot检测表达，获得了7个显著抑制BMPR-1B基因的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率达90%以上，对BMPR-1B蛋白的抑制达80%以上。
Description
技术领域
本发明涉及能够对骨形成蛋白受体-1B(BMPR-1B)基因产生显著抑制作用的小干扰RNA分子的设计、合成和抑制作用在卵母细胞上的评价方法。
背景技术
BMPR-1B基因是一种增加排卵率的调控基因，属于TGF-ß超家族成员，又称为ALK6基因；ALK6
突变是在Booroola母羊(FecB)中发现的第一个点突变，发生在高度保守的胞内激酶区，核苷酸830处（A830G），引起精氨酸代替了谷氨酰胺(Q249R)；其显性表现型为卵泡发育提前以及产多胎。文献检索披露：(1)Biol.Reprod.64,1225-1235作者：Wilson,T.等发表《表现为多胎性状的Booroola羊，在卵母细胞和颗粒细胞表达的ALK6基因的一个突变》文章内容是携带FecB纯合子的母羊其排卵率升高，伴随着大量囊状卵泡比FecB+杂合子的母羊提前成熟并发生排卵；因此，携带FecB纯合子母羊其排卵前卵泡提前达到了最大直径并维持在一定水平，直到排卵，导致最终卵泡生长动力学发生了变化。(2)ReproductiveBiologyandEndocrinology2006,4:20doi:1184/1477-7827-4-20作者Stéphane Fabre等发表《在哺乳动物中调节排卵率：羊基因模型的作用》文章，内容是BMP15,GDF9,BMPR-1B这三个基因型来理解BMP系统的作用作为卵巢内滤泡生长和成熟的调节最后影响排卵率。(3)Reproduction (2011) 141 643-651作者Wei Wang等发表《RNA分子干扰猪的含有内源性SMAD4的颗粒细胞导致的FSH介导的颗粒细胞的增值和类固醇合成的减少》文章内容是在猪的颗粒细胞上用RNA干扰的方法敲低了SMAD4，结果显示了SMAD4-siRNA抑制了SMAD4的mRNA和蛋白的表达并抑制了FSH引起的猪颗粒细胞的分化和雌二醇的分泌和细胞周期蛋白的表达。
关于BMPR-1B基因shRNA分子的研究，ALK6 基因干扰的小鼠并没有像Booroola母羊一样表现出多胎性状，且卵泡发育和排卵率都表现正常，但其软骨形成受到影响，骨骼肌发育存在缺陷,说明ALK6 突变存在种属差异,针对其它家畜品种，如绵羊、山羊、猪等，均未见报道。
本发明构思根据绵羊BMPR-1B基因cDNA序列，自行设计合成的shRNA分子，通过功能验证，从设计的shRNA分子库中，筛选到7个对绵羊BMPR-1B基因均有显著抑制作用的shRNA分子，为绵羊生物学研究拓展了应用领域。
发明内容
本发明的目在于：通过对照组细胞BMPR-1B表达水平，从8种shRNA分子中筛选到7个具有显著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率可达90%以上，而对BMPR-1B蛋白的抑制可达80%以上。
本发明的目的是这样实现的：根据GeneBank 中绵羊BMPR-1B基因(NM_001009431.1序列)；从启始密码（ATG）至终止密码（TGA）共1515bp编码区序列，用shRNA设计软件设计干扰BMPR-1B基因转录的shRNA分子群,从设计的34条shRNA分子中，根据结构和位置筛选出8条针对不同位点的shRNA序列进行合成；将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒（pLL-BMPR-1B-shRNA），干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，携带BMPR-1B的病毒稳定感染Hek293细胞系，然后携带干扰RNA病毒感染携带BMPR-1B的Hek293细胞系，通过实时定量荧光PCR及Western blot从mRNA及蛋白水平分析了BMPR-1B的表达，以及shRNA对BMPR-1B的干扰抑制作用，通过分析和比较实验组与对照组细胞BMPR-1B表达水平，从8个shRNA分子中筛选到7个具有显著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率可达90%以上，而对BMPR-1B蛋白的抑制可达80%以上，最终确定的7个显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子；
其中使用的引物：
①LV-BMPR-1B-749
Sense : 5’TGGACAATAGCAAAGCAAATTTCAAGAGAATTTGCTTTGCTATTGTCCTTTTTTC-3’(55bp)；Antisense: 5’
TCGAGAAAAAAGGACAATAGCAAAGCAAATTCTCTTGAAATTTGCTTTGCTATTGTCCA-3’ (59bp )；
②LV-BMPR-1B-803
Sense : 5’
TGTAGATGTTTCAAGGTATATTCAAGAGATATACCTTGAAACATCTACTTTTTTC
-3’
(55bp)；
Antisense:
5’
TCGAGAAAAAAGTAGATGTTTCAAGGTATATCTCTTGAATATACCTTGAAACATCTACA-3’ (59bp)；
③LV-BMPR-1B-1306
Sense : 5’ TGATGAGAGCTTGAACAGAATTCAAGAGATTCTGTTCAAGCTCTCATCTTTTTTC；-3’(55bp)；Antisense:
5’ TCGAGAAAAAAGATGAGAGCTTGAACAGAATCTCTTGAATTCTGTTCAAGCTCTCATCA-3’ (59bp)；
④LV-BMPR-1B-1475
Sense : 5’
TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC
-3’ (59bp)；
Antisense: 5’ TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3’ (59bp)；
⑤LV-BMPR-1B-1685
Sense : 5’
TGGACAAAGCCAGTAGATATTTCAAGAGAATATCTACTGGCTTTGTCCTTTTTTC
-3’(59bp)；
Antisense: 5’
TCGAGAAAAAAGGACAAAGCCAGTAGATATTCTCTTGAAATATCTACTGGCTTTGTCCA-3’(59bp)；
⑥LV-BMPR-1B-2567
Sense : 5’
TGTAAGAAGATGGTGTCAAATTCAAGAGATTTGACACCATCTTCTTACTTTTTTC -3’(59bp)；Antisense:
5’
TCGAGAAAAAAGTAAGAAGATGGTGTCAAATCTCTTGAATTTGACACCATCTTCTTACA-3’(59bp)；
⑦LV-BMPR-1B-2745
Sense : 5’
TGAGGAAACGTATCAGGTTATTCAAGAGATAACCTGATACGTTTCCTCTTTTTTC-3’(59bp)； Antisense: 5’
TCGAGAAAAAAGAGGAAACGTATCAGGTTATCTCTTGAATAACCTGATACGTTTCCTCA -3’(59bp)；
其中shRNA分子的获取，包括shRNA慢病毒载体的构建：即plex-bmpr-1b 、Lv-BMPR-1B-shRNA慢病毒的获取；重组Lentivirus感染Hek293细胞系的获取； shRNA病毒载体感染含BMPR-1B的Hek293细胞系的获取； siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价等步骤。通过定量分析得出，pSi749能够有效抑制68.3%的BMPR-1B的转录，pSi803能够有效抑制71.2%的BMPR-1B的转录，pSi1306能够有效抑制99.86%的BMPR-1B的转录，pSi1475能够有效抑制99.78%的BMPR-1B的转录，pSi1685能够有效抑制96.42%的BMPR-1B的转录，pSi2567能够有效抑制94.37%的BMPR-1Bp的转录，Si2745能够有效抑制80.5%的BMPR-1B的转录。
本发明的实践意义与技术效果：多胎性状是绵羊重要的经济性状之一；BMPR-IB基因是小尾寒羊，湖羊等多个绵羊品种的多胎主效基因；本研究应用分子克隆技术，细胞培养技术，Western blot技术，实时定量PCR技术，针对绵羊的BMPR-1B基因序列设计了8个shRNA干扰分子，并通过检测BMPR-1B基因的mRNA及蛋白水平分析干扰结果显示，8个shRNA分子中有7个shRNA分子具有显著抑制效果，在7个干扰分子中，能降低BMPR-IB基因表达水平的68.3-99.86% ；本发明为阐明BMPR-1B基因的作用机制，培育多胎绵羊品种提供技术支持，彰显技术进步。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步说明。
依据GeneBank 中绵羊BMPR-1B基因，即NM-001009431.1序列；设计34条shRNA分子，针对不同位点的shRNA序列进行合成，将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒，将pLL-BMPR-1B-shRNA干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，经荧光PCR及Western blot的检测，确定7个显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子；所用引物（略） ；
1）shRNA慢病毒载体的构建
各取10UL 10uM 的两条siRNA寡核苷酸(正链和互补链)，加入8μL 10×annealing
buffer和12μL 灭菌超纯水，煮沸10min后自然冷却至室温,同时pLL3.7质粒载体经XhoI和HpaI双酶切后回收线性化质粒，与退火产物4℃过夜连接,连接产物转化DH5a感受态细胞，LB平板氨苄青霉素（100ug/uL）筛选;用载体检测引物及shRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆并送上海生工测序鉴定序列正确后，提取纯化重组质粒用于转染。
2）plex-bmpr-1b 、Lv-BMPR-1B-shRNA慢病毒的制备
第一日: 铺板（上午10-11时）
每10cm 面积中铺3×106个293T细胞，保证第二天细胞子完全培养液中汇合度达到80%-90%；
第二日:
Lipectamine2000脂质体转染（下午2-3时）
首先在聚丙烯管内准备脂质体和DNA复合物；
加入1.5ml预热的OPTI-MEM®Ｉ培养基后，按比例加入目的载体及病毒包装载体，轻轻混匀，室温放置；其中加入的比例：转染载体 lv- bmpr-1b -shRNA 12ug、包装质粒 REV 6ug、pMDL 6ug、包膜质粒VSVG 6ug、转染载体plex-bmpr-1b 12 ug、包装质粒 Pspax2 9 ug、包膜质粒PMD2.G 3.5 ug；
在使用Lipictamine2000之前先轻轻混匀脂质体,而后在另一个聚丙烯管中加入1.5mL预热的OPTI-MEM®Ｉ培养基，再加入50uLLipictamine2000,轻轻混匀后室温放置;
在室温放置5分钟后，将上述稀释好的DNA与脂质体混合,混合物质于室温孵育20min,在此期间可以用OPTI-MEM®Ｉ培养基洗待转染的细胞一次;
注：由于293T细胞易脱壁，故整个过程中操作须轻缓，可以先将细胞培养板倾斜，将液体沿板壁慢慢加入，在慢慢放正细胞板。
然后将脂质和DNA复合物加入细胞,上下倾斜细胞板使液体均匀覆盖在细胞表面,而后，将细胞放回37℃培养箱，培养4h后，换10mL新鲜的DMEM完全培养基，继续培养48h后收集病毒,此时的病毒能直接用来转染，或置于-70℃备用。
3）重组Lentivirus感染Hek293细胞系的步骤
转染前一天按每孔4×105个/mL的密度将Hek293细胞系接种于六孔板,保证转染时汇合度达到60-70%;将滤过的重组0.5 mL Lentivirus和0.5 mL培养液（体积比，1：1）混合，同时加入1μL聚凝胺（polybrene）(终浓度为10μg/mL),将病毒加入细胞,然后，把细胞置于32℃培养箱14-16h后移回37℃培养箱孵育，4-6h后更换新鲜培养液，37℃培养箱继续培养。感染48h后，将6孔培养皿中的细胞转入100mm培养皿中，1h后加入Puromycin（终浓度为600ng/ mL）选择性培养液；为了获得稳定整合外院基因的细胞，每隔2-3d更换含Puromycin选择性培养液,通常14-21d，即获得稳定转染的细胞。
4）shRNA病毒载体感染含BMPR-1B的Hek293细胞系
感染前一天按每孔4×105个/mL的密度将表达BMPR-1B的Hek293细胞接种于六孔板,用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞,24h后细胞达到70-80%汇合度时;将500μL 的shRNA干扰病毒与500μL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞（体积比1：1）混合，同时加入1μL 10μg/mL 的Polybrene
, 24h后，更换为含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液，再培养24h后收获细胞,用Trizol法提取总RNA及细胞蛋白裂解液提取蛋白。
5）siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价
上述感染细胞的总RNA经反转录成cDNA后，通过实时定量PCR对BMPR-1B基因表达进行相对定量分析，评价对BMPR-1B基因表达的抑制效果；定量分析方法如下：Real time PCR荧光染料SYBR Green I购自TAKARA公司试剂进行Real Time PCR 反应体系为：2хmaster mix 10μL,上下游（10pm）个0.8μL；cDNA 2μL。PCR反应条件为：95℃ 10s,58℃ 20s,72℃ 20s,55个循环后进入溶解曲线分析程序：40℃-99℃（0.1℃/s）。通过相对定量分析得出：pSi749能够有效抑制68.3%的BMPR-1B的转录，pSi803能够有效抑制71.2%的BMPR-1B的转录，pSi1306能够有效抑制99.86%的BMPR-1B的转录，pSi1475能够有效抑制99.78%的BMPR-1B的转录，pSi1685能够有效抑制96.42%的BMPR-1B的转录，pSi2567能够有效抑制94.37%的BMPR-1Bp的转录，Si2745能够有效抑制80.5%的BMPR-1B的转录。
本实验自制的细胞蛋白裂解液，由50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl,1% N P-40,0.1% SDS配制，置于容器中，混合均匀使用。
本实验选用的Opti-MEM培养液和DMEM培养液，购自美国Gibco公司； XhoI和HpaI双酶切，购自美国TAKARA公司；染载体pLL3.7由周文来，即美国加州大学圣地亚哥分校医学部, 霍华德休斯医学研究所提供；Pspax2；VSVG由李文蓉，即美国克罗拉大学提供； plex 购自美国Openbiosystem公司；包装质粒pMDL，REV，PMD2.G购自美国biosystem公司。
Organization
Applicant
----------------------
Street : 克拉玛依东街151号
City : 乌鲁木齐市
State : 新疆维吾尔自治区
Country : 中国
PostalCode : 830000
PhoneNumber : 0991-4846163
FaxNumber : 0991-4841417
EmailAddress :
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OrganizationName : 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心
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Title : 七个抑BMPR-1B基表达合成的shRNA分子
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Claims (2)
1.七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子，其特征在于：依据GeneBank 中绵羊BMPR-1B基因，即NM-001009431.1序列；设计34条shRNA分子，针对不同位点的shRNA序列进行合成，将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒，将pLL-BMPR-1B-shRNA干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，经荧光PCR及Western
blot的检测，确定7个显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子；
其中使用的引物：
①LV-BMPR-1B-749
Sense : 5’
TGGACAATAGCAAAGCAAATTTCAAGAGAATTTGCTTTGCTATTGTCCTTTTTTC-3’(55bp)；Antisense:
5’
TCGAGAAAAAAGGACAATAGCAAAGCAAATTCTCTTGAAATTTGCTTTGCTATTGTCCA-3’ (59bp )；
②LV-BMPR-1B-
803
Sense : 5’
TGTAGATGTTTCAAGGTATATTCAAGAGATATACCTTGAAACATCTACTTTTTTC
-3’ (55bp)；
Antisense:
5’
TCGAGAAAAAAGTAGATGTTTCAAGGTATATCTCTTGAATATACCTTGAAACATCTACA-3’ (59bp)；
③LV-BMPR-1B-1306
Sense : 5’
TGATGAGAGCTTGAACAGAATTCAAGAGATTCTGTTCAAGCTCTCATCTTTTTTC
；-3’(55bp)；Antisense:
5’ TCGAG
AAAAAAGATGAGAGCTTGAACAGAATCTCTTGAATTCTGTTCAAGCTCTCATCA-3’ (59bp)；
④LV-BMPR-1B-1475
Sense : 5
’
TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC
-3
’ (59bp)；
Antisense: 5
’ TCGAG
AAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA
-3
’ (59bp)；
⑤LV-BMPR-1B-
1685
Sense : 5
’
TGGACAAAGCCAGTAGATATTTCAAGAGAATATCTACTGGCTTTGTCCTTTTTTC
-3
’(59bp)；
Antisense: 5
’
TCGAGAAAAAAGGACAAAGCCAGTAGATATTCTCTTGAAATATCTACTGGCTTTGTCCA
-3
’(59bp)；
⑥LV-BMPR-1B-
2567
Sense : 5
’
TGTAAGAAGATGGTGTCAAATTCAAGAGATTTGACACCATCTTCTTACTTTTTTC
-3
’(59bp)；Antisense: 5’
TCGAGAAAAAAGTAAGAAGATGGTGTCAAATCTCTTGAATTTGACACCATCTTCTTACA
-3
’(59bp)；
⑦
LV-BMPR-1B-
2745
Sense : 5
’
TGAGGAAACGTATCAGGTTATTCAAGAGATAACCTGATACGTTTCCTCTTTTTTC
-3
’(59bp)
；
Antisense: 5
’
TCGAGAAAAAAGAGGAAACGTATCAGGTTATCTCTTGAATAACCTGATACGTTTCCTCA
-3
’(59bp)；
其中shRNA分子的获取
1） shRNA慢病毒载体的构建
各取10UL 10uM 的两条siRNA寡核苷酸，即为正链和互补链；加入8μL 10×annealing buffer和12μL 灭菌超纯水，煮沸10分钟后冷却至室温；同时用pLL3.7质粒载体经XhoI和HpaI双酶切后回收质粒，与退火产物4℃过夜连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，即用LB平板氨苄青霉素100ug/uL；用载体检测引物及shRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆，并送上海生工所测序鉴定，提取纯化重组质粒用于转染；
2 ） plex-bmpr-1b 、Lv-BMPR-1B-shRNA慢病毒的制备
铺板，每10cm 面积中铺5×106个293T细胞；Lipectamine2000脂质体转染，在含有脂质体和DNA复合物的试管中加入1.5ml预热的OPTI-MEM®Ｉ培养基，加入目的载体及病毒包装载体，其载体的加量分别为：转染载体
lv- bmpr-1b
-shRNA 12ug、REV 6ug、pMDL 6ug、VSVG 6ug； plex-bmpr-1b12 ug、Pspax2 9ug、PMD2.G3.5 ug，轻轻混匀，室温放置5分钟，之后将上述稀释好的DNA与脂质体混合，置于室温孵育20分钟，此时用OPTI-MEM®Ｉ培养基清洗液转染细胞一次；将脂质和DNA复合物加入细胞，置于37℃培养箱，培养4-6小时，换10mL新鲜的DMEM完全培养基，继续培养48-50小时，收集病毒,此时的病毒直接用于转染或置于-70℃备用；
3） 重组Lentivirus感染的Hek293细胞系
将滤过的重组0.5 mL Lentivirus和0.5 mL培养液，以体积比1：1混合，加入浓度为10μg/mL的聚凝胺1μL,将病毒加入细胞，置于32℃培养箱14-16h，移回37℃培养箱孵育4-6h，更换新鲜培养液，在37℃培养箱继续培养，感染48-52h，将6孔培养皿中的细胞转入100mm培养皿中，1-1.5h加入含有浓度为600ng/ mL的Puromycin的选择性培养液；每隔2-3天更换选择性培养液， 2-3周获得稳定转染的细胞；
4） shRNA病毒载体感染含BMPR-1B的Hek293细胞系
感染前按每孔4×105个/mL的密度将表达BMPR-1B的Hek293细胞接种于六孔板,用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，24-26h备用；将500μL 的shRNA干扰病毒与500μL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，以体积比1：1混合，同时加入1μL 10μg/mL 的Polybrene , 24-30h，更换含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液，再培养24-28h收获细胞；用Trizol法提取总RNA及细胞蛋白裂解液提取蛋白；
5） siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价
PCR 反应体系：2хmaster mix
10μL,上下游（10pm）个0.8μL；cDNA 2μL；PCR反应条件：95℃ 10s,58℃
20s,72℃ 20s,55个循环后进入溶解曲线分析程序：40℃-99℃，即为0.1℃/s；通过定量分析得出：pSi749能够有效抑制68.3%的BMPR-1B的转录，pSi803能够有效抑制71.2%的BMPR-1B的转录，pSi1306能够有效抑制99.86%的BMPR-1B的转录，pSi1475能够有效抑制99.78%的BMPR-1B的转录，pSi1685能够有效抑制96.42%的BMPR-1B的转录，pSi2567能够有效抑制94.37%的BMPR-1Bp的转录，Si2745能够有效抑制80.5%的BMPR-1B的转录；
其中细胞蛋白裂解液：由50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl,1% N P-40,0.1% SDS配制，混合均匀后使用。
2.根据权利要求1所述合成的shRNA分子，其特征在于：Opti-MEM培养液和DMEM培养液，购自美国Gibco公司； XhoI和HpaI双酶切，购自美国TAKARA公司；染载体pLL3.7由周文来，即美国加州大学圣地亚哥分校医学部, 霍华德休斯医学研究所提供； plex
购自美国Openbiosystem公司；包装质粒pMDL，REV，PMD2.G购自美国biosystem公司； Pspax2；VSVG由李文蓉，即美国克罗拉大学提供。
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