CN114438085A

CN114438085A - Mettl3的反义寡核苷酸及其在前列腺癌中的应用

Info

Publication number: CN114438085A
Application number: CN202210134832.7A
Authority: CN
Inventors: 尚芝群; 牛远杰; 李阳; 陈昱彤
Original assignee: TIANJIN INSTITUTE OF UROLOGY
Current assignee: TIANJIN INSTITUTE OF UROLOGY
Priority date: 2022-02-14
Filing date: 2022-02-14
Publication date: 2022-05-06

Abstract

本发明公开了METTL3的反义寡核苷酸及其在前列腺癌中的应用。本发明公开了抑制METTL3的表达水平可以降低去势抵抗前列腺癌细胞的增殖，恢复耐药前列腺癌细胞株的药物敏感性，为治疗去势抵抗前列腺癌以及耐药前列腺癌提供了新的手段。

Description

METTL3的反义寡核苷酸及其在前列腺癌中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及针对METTL3的反义寡核苷酸及其在前列腺癌中的应用。

背景技术

前列腺癌作为全球第二死亡率的恶性肿瘤，受到了国内外临床医生的重点关注(Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortalityworldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int JCancer,2015,136(5):E359-86.)。前列腺癌的发病率存在明显的地区差异，在西方的发病率约为亚洲的25倍，这可能与亚洲国家PSA的筛查率低等因素相关(Ha Chung B,Horie S,Chiong E.The incidence,mortality,and risk factors of prostate cancer in Asianmen[J].Prostate Int,2019,7(1):1-8.)。但由于人口老龄化等因素，我国男性前列腺癌的发病率有上升趋势。前列腺癌是雄激素依赖性的肿瘤，一些无法行根治性手术的患者通常会接受手术去势或药物去势联合抗雄激素治疗的治疗方案，在治疗初期患者多对这一治疗方案敏感，但最终会发展成为去势抵抗性前列腺癌(Castration-Resistant ProstateCancer,CRPC)(Carroll PH,Mohler JL.NCCN Guidelines Updates:Prostate Cancer andProstate Cancer Early Detection[J].J Natl Compr Canc Netw,2018,16(6):20-3.)。

6-甲基腺苷(m6A)作为真核生物的编码RNA与长链非编码RNA中最为常见的甲基化修饰，它可以在多种肿瘤的发病与进展中发挥促癌作用。甲基化转移酶样3(methyltransferase like 3,METTL3)作为RNA m6A甲基转移酶复合体中唯一的催化亚基，是调控RNA m6A甲基化这一动态过程中最为关键的蛋白分子。METTL3作为m6A相关酶家族中的“写入器”，已经在多个肿瘤的发病过程中被证实具有促癌作用，包括但不仅限于以下几种，如：在膀胱肿瘤中METTL3通过m6A依赖的途径介导miR-221/222的成熟，从而导致PTEN的减少，进而促进膀胱癌的增殖与进展。在消化系统癌症中，Mettl3通过调节E-cadherin蛋白信号通路，从而促进胃癌细胞的增殖、转移与侵袭。在肺癌中，METTL3与eIF3结合并调控翻译过程，从而发挥癌基因的作用。在肝脏肿瘤中，已证实METTL3分别以SOCS2与CTNNB1为靶基因，介导肝细胞癌与肝母细胞瘤的增殖与进展。在女性生殖系统中METTL3通过调节snail蛋白水平，上调肿瘤细胞的上皮间质转化进而促进宫颈癌的侵袭和转移。

尽管关于METTL3作为癌基因的机制研究已经较多，但是其在前列腺癌中介导细胞对恩扎鲁胺耐药的研究尚未被报道，关于靶向METTL3的寡核苷酸药物的研究也未见报道。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一是提供针对METTL3的反义寡核苷酸。

本发明的目的之二是提供一种治疗去势抵抗性前列腺癌的手段。

本发明的目的之三是提供一种治疗耐药前列腺癌的手段。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种经修饰的反义寡核苷酸，所述经修饰的反义寡核苷酸由15-30个核苷酸组成，所述反义寡核苷酸抑制METTL3的表达。

进一步，所述反义寡核苷酸由18-22个核苷酸组成。

进一步，所述反义寡核苷酸由20个核苷酸组成。

进一步，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.1-11任一项所述的序列。

进一步，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述修饰包括至少一个核苷间键修饰。

进一步，所述核苷间键修饰是硫代磷酸酯修饰。

进一步，所述修饰包括全链的核苷间键修饰。

进一步，所述修饰包括至少一个糖修饰。

进一步，所述糖修饰为2′-O-甲氧乙基修饰。

进一步，所述修饰包括至少6个糖修饰。

进一步，所述修饰包括10个糖修饰。

进一步，所述糖修饰位于反义寡核苷酸序列两侧。

进一步，所述反义寡核苷酸包括至少一个的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰。

进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰。

进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少6个的糖修饰。

进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和10个糖修饰。

进一步，所述经修饰的反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.25所示。

本发明第二方面提供了一种组合物，所述组合物包括本发明第一方面所述的反义寡核苷酸或其盐。

进一步，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明第三方面提供了一种组合物，所述组合物包括METTL3的抑制剂和治疗前列腺癌的药物。

进一步，所述药物选自阿比特龙、多西他赛、恩杂鲁胺。

进一步，所述药物为恩杂鲁胺。

进一步，所述抑制剂降低METTL3 mRNA或蛋白的水平。

进一步，所述抑制剂选自核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。

进一步，所述核酸抑制物选自：shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义寡核苷酸，或能表达或形成所述shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义寡核苷酸的构建物。

进一步，所述核酸抑制物选自shRNA、反义寡核苷酸或其核酸构建物。

进一步，所述反义寡核苷酸如本发明第一方面所述。

进一步，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明第四方面提供了一种诊断耐药前列腺癌的产品，所述产品包括检测METTL3的试剂。

进一步，所述试剂包括特异性识别METTL3的探针；或

特异性扩增METTL3的引物；或

特异性结合METTL3的抗体或配体。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒。

本发明第五方面提供了一种筛选治疗耐药前列腺癌的候选药物的方法，用待筛选物质处理表达或含有METTL3基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中METTL3基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进METTL3基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗耐药前列腺癌的候选药物。

本发明第六方面提供了如下任一项所述的应用：

(1)本发明第一方面反义寡核苷酸、本发明第二方面或本发明第三方面所述的组合物在制备治疗去势抵抗前列腺癌的药物组合物中的应用；

(2)本发明第一方面反义寡核苷酸、本发明第二方面或本发明第三方面所述的组合物在制备治疗耐药前列腺癌的药物组合物中的应用；

(3)检测METTL3的试剂在制备诊断耐药前列腺癌的产品中的应用；

(4)METTL3在筛选治疗耐药前列腺癌的候选药物中的应用。

进一步，所述耐药前列腺癌选自耐阿比特龙、多西他赛、恩杂鲁胺的前列腺癌。

进一步，所述耐药前列腺癌为耐恩杂鲁胺的前列腺癌。

进一步，所述产品包括通过RT-PCR法、RT-qPCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测METTL3基因或蛋白表达水平的试剂。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了敲除MEETL3与治疗前列腺癌的药物联合具有协同抗去势抵抗前列腺癌的作用，为去势抵抗前列腺癌的治疗提供了一种新的治疗手段。

本发明首次发现了使用MEETL3抑制剂与治疗前列腺癌的药物联合，能够恢复耐药肿瘤对药物的敏感性，从而为耐药癌症的治疗提供了一种新的手段。

本发明提供了设计反义寡核苷酸以及进行反义寡核苷酸修饰的方法，使用该方法设计的反义寡核苷酸具有较高的敲除效率。

附图说明

图1是METTL3对去势抵抗性前列腺癌细胞系的影响图，其中，1A是MTT检测METTL3对LNCap-AI增殖的影响图；1B是平板克隆检测METTL3对LNCap-AI生长的影响图；图1C是MTT检测METTL3对C4-2增殖的影响图；1D是平板克隆检测METTL3对C4-2生长的影响图；

图2是细胞的形态图，其中，2A是C4-2的细胞形态图；2B是耐药细胞株C4-2^EnzR的细胞形态图；

图3是恩杂鲁胺剂量依赖曲线图；

图4是METTL3表达情况图；

图5是RT-QPCR检测ASO的敲除效果图；其中，5A是浓度为200nM的ASO48h后的敲除效果图；5B是浓度为100nM的ASO 24h后的敲除效果图；

图6是RT-qQPCR检测不同修饰的ASO敲除效果图；其中，6A是不同修饰方式的ASO敲除效果图；6B是不同修饰位点数的ASO敲除效果图；

图7是METTL3对前列腺癌耐药细胞株的影响图；其中，7A是METTL3的表达情况图；7B是RNA m6A的水平图；7C是METTL3抑制剂联合恩杂鲁胺对耐药细胞株的增殖的影响图。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，首次证实了METTL3在去势抵抗前列腺癌中起着重要的作用。并进一步通过设计具有较高敲除效率的反义寡核苷酸，证实了METTL3的敲低可增加耐药细胞株对药物的敏感性。

术语“寡核苷酸”通常包含两个或以上共价联接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常先经固相化学合成后再加以纯化和分离。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2'糖修饰的核苷。

术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。

核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸诸如DNA和RNA核苷酸包括核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(它们在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。

如本文所用，术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在优选的实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语经修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”互换地使用。

术语经修饰的寡核苷酸描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。

根据本发明，靶核酸是编码哺乳动物METTL3的核酸，并且可以例如是基因、RNA、mRNA和前体mRNA、成熟的mRNA或cDNA序列。该靶标因此可以称为METTL3靶核酸。合适地，靶核酸编码METTL3蛋白，特别是哺乳动物METTL3，例如人METTL3(gene ID：56339)。

对于体内或体外应用，本发明的寡核苷酸通常能够抑制表达METTL3靶核酸的细胞中METTL3靶核酸的表达。本发明的寡核苷酸的核碱基的连续序列通常与METTL3靶核酸互补，如在整个寡核苷酸的长度上测量的，任选地，除了一个或两个错配以外，并且任选地排除可以将寡核苷酸与任选的官能团连接的基于核苷酸的接头，诸如缀合物或其他非互补性末端核苷酸。在一些实施例中，所述靶核酸可为RNA或DNA，诸如信使RNA，例如成熟mRNA或前体mRNA。

糖修饰

与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时本发明的寡聚物可包含一种或多种具有修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。

已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。

这样的修饰包括其中核糖环结构被修饰的那些修饰，例如，通过用己糖环(HNA)或双环替换核糖环结构来实现，其通常在核糖环(LNA)的C2和C4碳原子之间具有双基桥，或通常在C2和C3之间缺乏键的未连接核糖环(例如UNA)。

糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2′-OH基团所做出的修饰。例如，可以在2′、3′、4′或5′位置引入取代基。

2′糖修饰的核苷

2′糖修饰的核苷是一种核苷，其在2′位置具有除H或-OH以外的取代基(2′取代的核苷)或包含能够在2′碳与核糖环中的第二个碳原子之间形成桥的2′连接双基，诸如LNA(2′-4′双基桥连)核苷。

2′取代的修饰的核苷的实例是2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。

本文所用的术语“治疗”是指既存疾病(例如本文所指的疾病或病症)的治疗或疾病的阻止即预防。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。

反义寡核苷酸

本发明提供了一种经修饰的反义寡核苷酸，所述经修饰的反义寡核苷酸由15-30个核苷酸组成，所述反义寡核苷酸抑制METTL3的表达。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸由18-22个核苷酸组成。

在本发明的具体实施方案中，所述反义寡核苷酸由20个核苷酸组成。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.1-11任一项所述的序列。

在优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少一个核苷间键修饰。

作为一种优选的实施方案，反义寡核苷酸的修饰包括全链核苷间键修饰。

在一些实施方案中，核苷间键修饰是硫代磷酸酯修饰。

在具体实施方案中，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.12-22任一项所述的序列。

在优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸为SEQ ID NO.13所述的序列。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少一个糖修饰。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少6个糖修饰。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少10个糖修饰。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸的糖修饰位于反义寡核苷酸序列两侧。

作为优选的实施方案，所述糖修饰为2′-O-甲氧乙基修饰。

在优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸包括至少一个的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰。优选的，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰。更为优选的，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少6个的糖修饰。更为优选的，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和10个糖修饰。

在具体实施方案中，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.24-27任一项所述的序列。在优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.25所述的序列。

组合物

在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括METTL3的抑制剂。

METTL3的抑制剂是指任何可降低METTL3蛋白的活性、降低METTL3基因或蛋白的稳定性、下调METTL3蛋白的表达、减少METTL3蛋白有效作用时间、或抑制METTL3基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调METTL3有用的物质，从而可用于预防或治疗前列腺癌。例如所述的抑制剂包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。其中，核酸抑制物包括但不限于shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义寡核苷酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义寡核苷酸的构建物。蛋白结合分子选自：与METTL3蛋白特异性结合的物质，如能够抑制METTL3蛋白活性的抗体或配体。

作为本发明的一种选择方式，所述的METTL3的抑制剂是一种特异性与METTL3结合的抗体。所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体；本发明不仅包括完整的抗体分子，也包括抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与METTL3蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体

作为本发明的一种优选方式，所述METTL3的抑制剂是一种METTL3特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

作为本发明的一种可选方式，所述的METTL3的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。

“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。

作为本发明的一种优选的实施方式，所述METTL3的抑制剂是一种反义寡核苷酸。在本发明中，所述反义寡核苷酸如前面所述。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包括治疗前列腺癌的药物。所述药物包括但不限于阿比特龙、多西他赛、恩杂鲁胺。

在本发明中，药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体等。

在实施方案中，发明实践包括以适当的核酸递送系统施用至少一种上述反义寡核苷酸或组合物。在一个实施方案中，该系统包括可操作地连接于多核苷酸的非病毒载体。这种非病毒载体的实例包括单独寡核苷酸或寡核苷酸与适当的蛋白、多糖或脂质制剂的组合。

另外适当的核酸递送系统包括病毒载体，通常序列来自以下的至少一种：腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、辅助病毒依赖型腺病毒、逆转录病毒或日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合体。优选地，病毒载体包括可操作地连接于多核苷酸的强的真核启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子。

另外优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼氏鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一种优选的基于HIV的病毒载体包括至少两种载体，其中gag和pol基因来自HIV基因组且env基因来自另一病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘病毒载体例如正痘病毒或禽痘病毒载体、疱疹病毒载体例如I型单纯疱疹病毒(HSV)载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。

本发明的组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或这种酯的盐、或当施用于动物(包括人)时能够提供(直接或间接)生物活性代谢物的任何其它化合物或其残留物。

应用

本发明提供了前述的针对METTL3的反义寡核苷酸以及组合物在治疗去势抵抗前列腺癌中的应用和治疗耐药前列腺癌中应用。

在一些实施方案中，使用METTL3的抑制剂治疗去势抵抗前列腺癌。当使用METTL3的抑制剂时，去势抵抗前列腺癌的细胞增殖活性降低；

在一优选的实施方案中，使用METTL3的抑制剂联合治疗前列腺癌的药物治疗去势抵抗前列腺癌。METTL3的抑制剂与治疗前列腺癌的药物在用于治疗去势抵抗前列腺癌时产生协同的治疗效果。

在一些实施方案中，通常使用MEETL3抑制剂联合治疗前列腺癌的药物组成的组合物治疗耐药前列腺癌。所述药物包括但不限于阿比特龙、多西他赛、恩杂鲁胺，取决于前列腺癌的耐药种类。MEETL3抑制剂可恢复耐药癌症对药物的敏感性。

在一些实施方案中，当耐药前列腺癌为耐恩杂鲁胺的前列腺癌时，使用MEETL3抑制剂联合恩杂鲁胺治疗前列腺癌。

在一些实施方案中，当耐药前列腺癌为耐阿比特龙的前列腺癌时，使用MEETL3抑制剂联合阿比特龙治疗前列腺癌。

在一些实施方案中，当耐药前列腺癌为耐多西他赛的前列腺癌时，使用MEETL3抑制剂联合多西他赛治疗前列腺癌。

本发明基于METTL3在耐药前列腺癌中表达上调，进一步提供了METTL3在诊断耐药前列腺癌中的应用。通过检测METTL3的表达水平来判断受试者是否耐药。

本发明的METTL3使用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。因此，本发明的宽度和范围不应限于任何上述的实施方案。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1METTL3对去势抵抗性前列腺癌细胞系C4-2与LNCap-AI对恩杂鲁胺耐药的影响

使用慢病毒转染携带sh-METTL3序列与嘌呤霉素抗性基因的载体，基于LNCAP-AI与C4-2细胞系，转染病毒后，培养细胞一周后，使用嘌呤霉素筛选，从而获得METTL3敲低的稳定细胞系。

将对照细胞与敲低细胞分别铺板与在96孔板(n＝5)与6孔板中，每孔2000细胞，并且分别给予恩杂鲁胺与DMSO。

对于96孔板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔24小时取出一块96孔板。使用PBS溶液或是生理盐水做溶剂，配置四甲基偶氮唑(MTT)溶液，终浓度5mg/ml。于每一孔中加入10μl MTT溶液，再次放于37℃、5％CO₂培养箱中孵育2小时。两小时后取出96孔板，轻轻倒扣在滤纸上，每孔中加入150μl DMSO溶液，避光于摇床上低速摇晃30分钟使甲臢结晶充分溶解。使用酶标仪在OD值490nm检测各孔吸光度，记录数值，之后每24小时取出一个96孔板进行上述操作，统一计算。

对于6孔板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，铺板6天后使用甲醇对细胞集落进行固定(15min)，然后使用结晶紫染色(30min)后轻柔冲洗干净，最后观察克隆形成的数量/大小。

实验结果显示，敲除METTL3，细胞的增殖能力和细胞活力都显著下降，sh-METTL3与恩杂鲁胺联合产生协同增效的效果。

实施例2METTL3在耐药去势抵抗性前列腺癌细胞系中的表达情况

1、构建恩杂鲁胺耐药的去势抵抗性前列腺癌细胞系

将前列腺癌细胞系C4-2培养于10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养基中渐次加入不同浓度的恩杂鲁胺(5μM，10μM，20μM，40μM)。细胞于细胞培养箱中进行培养，培养条件为37℃，5％CO₂。培养过程中根据细胞实际生长情况决定是否进行细胞换液及细胞传代，培养细胞至其处于40μM恩杂鲁胺时，生长与增殖速率与原代C4-2置于10％胎牛血清的RPMI-1640培养基大体一致。

使用显微镜观察耐药细胞与原细胞可见具有显著的形态差异(图2)。

2、MTT检测不同细胞株对恩杂鲁胺的反应情况

对两种细胞给予不同浓度恩杂鲁胺后，进行MTT实验(详细步骤同实施例1)。

计算恩杂鲁胺对不同细胞系对的IC₅₀，结果显示IC₅₀原来的17.1μM上升为62.8μM(图3)，说明恩杂鲁胺耐药细胞株构建成功，此阶段细胞系即成为C4-2^EnzR。

3、检测METTL3在耐药细胞株中的表达水平

使用免疫印迹法(Western Blotting)检测METTL3蛋白在耐药细胞中的表达量，结果显示，相比细胞系C4-2，C4-2^EnzR中的METTL3蛋白显著增加(图4)。

实施例3METTL3的反义寡核苷酸的设计及检测

1、ASO序列的生物学鉴定以及修饰方案和位点的效果对比

使用NCBI中的BLAST生物串行信息一级结构在线比对工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对比分析Mettl3 mRNA各个转录本的mRNA结构信息，并记录其共有序列。使用sfold RNA二级结构在线预测工具中的“soligo”页面(http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl)，输入Mettl3各个转录本的共有序列，oligo长度选择为20nt，提交并记录筛选结果。

从公司(生工Sagon)购得所有ASO序列(表1)并仅使用基础修饰(表2)。

表1 ASO序列

ASO序列	序列编号
		GGTGTAGCAACTTCTTCTCT	SEQ ID NO.1
TCTTTTCTGCCACAGCACCC	SEQ ID NO.2
		GTTGGTTCAGAAGGCTCTCT	SEQ ID NO.3
CGTGTGGTCTTTGCTGCCAG	SEQ ID NO.4
		AGGGTGGGTCAGCCATCACA	SEQ ID NO.5
CCAAGCAGTGTTCCTTCCCA	SEQ ID NO.6
		GAGTGCCAGGAGATAGTCTT	SEQ ID NO.7
GGTGGATCCCATCCAGTTGG	SEQ ID NO.8
		GTAGGTGGATCCCATCCAGT	SEQ ID NO.9
GGCTATGGATTCTTAGCTCT	SEQ ID NO.10
		GAGCCATGGCTATGGATTCT	SEQ ID NO.11

表2修饰的ASO序列

编号	ASO序列	序列编号
			ASO-1	GGTGTAGCAACTTCTTCTC*T	SEQ ID NO.12
ASO-2	TCTTTTCTGCCACAGCACC*C	SEQ ID NO.13
			ASO-3	GTTGGTTCAGAAGGCTCTC*T	SEQ ID NO.14
ASO-4	CGTGTGGTCTTTGCTGCCA*G	SEQ ID NO.15
			ASO-5	AGGGTGGGTCAGCCATCAC*A	SEQ ID NO.16
ASO-6	CCAAGCAGTGTTCCTTCCC*A	SEQ ID NO.17
			ASO-7	GAGTGCCAGGAGATAGTCT*T	SEQ ID NO.18
ASO-8	GGTGGATCCCATCCAGTTG*G	SEQ ID NO.19
			ASO-9	GTAGGTGGATCCCATCCAG*T	SEQ ID NO.20
ASO-10	GGCTATGGATTCTTAGCTC*T	SEQ ID NO.21
			ASO-11	GAGCCATGGCTATGGATTC*T	SEQ ID NO.22

注：*代表硫代磷酸酯修饰。

2、RT-qPCR检测ASO^Mettl3的敲除效果

体外六孔板培养C4-2细胞，细胞铺板24小时后转染细胞。首先将反义寡核苷酸ASO^Mettl3与脂质体转染试剂混合均匀室温孵育20分钟，将混合物均匀加入培养基中。使得ASO^Mettl3在培养基中的终浓度分别为0nM,100nM,200nM。分别于24小时和48小时后，去除细胞培养基，加入Trizol试剂，提取细胞总RNA。采用Thermo RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit将总RNA反转录为cDNA，采用CWBIO 2×Taq MasterMix、Mettl3引物和Sangon Biotech GAPDH内参引物进行RT-qPCR反应，并计算其Ct值换算，得到mRNA的相对水平数值。

结果显示，ASO(ASO-2)具有较强的敲除能力(图5)，后续修饰与修饰位点的实验将使用该序列进行。

3、不同修饰方法的敲除效果检测

从公司(生工Sagon)合成以ASO-2序列为基础，不同修饰方法的序列，包括全链RNA，全链DNA，全链2-MOE以及GAPMER-2-MOE的不同修饰策略，如表3所示。经过转染-RNA抽提-RT-qPCR实验，计算其Ct值换算，得到mRNA的相对水平数值，具体操作步骤同上。

表3不同修饰的ASO

注：*代表硫代磷酸酯修饰；i2OMe代表代表2′-O-甲氧乙基修饰

结果显示，GAPMER-2-MOE修饰的ASO在序列相同的条件下具有较强的敲除能力(图6A)。

由于GAPMER修饰策略两侧的2-MOE修饰数量并不固定。为了进一步优化敲低效率，对ASO两侧的修饰数量进行了进一步的对比(如表4所示)并从公司(生工Sagon)合成，其中ASO-2-flank5和GAPMER-2MOE相同，并同样进行了ASO转染-RNA抽提-RT-qPCR实验的流程，具体操作步骤同上。

表4不同数量修饰的ASO

注：*代表硫代磷酸酯修饰；i2OMe代表2′-O-甲氧乙基修饰结果显示，采用ASO-2-flank5修饰时，两侧的2-MOE修饰数量为5时能够获得最强的敲除效果(图6B)。

实施例4反义寡核苷酸ASO^Mettl3对C4-2^EnzR的影响

1、RT-qPCR检测

将进行ASO-2-flank5转到C4-2^EnzR细胞中，RT-qPCR检测METTL3的相对的表达水平，方法同实施例3。

结果如图7A所示，转染后48小时，在C4-2^EnzR细胞中METTL3表达水平显著降低。

2、Dot-blot法检测细胞m6A水平

将抽提完的样本RNA稀释至100ng/μl并放入95℃恒温金属浴中加入5分钟，随后立即放置在冰上。将RNA滴NC膜上，并且做上标记以示正反。放进紫外交联仪中使用254nm交联5分钟。用PBST缓冲液溶解，配置成5％脱脂奶粉封闭液。将经过紫外交联的NC膜放入盛有PBST溶液的干净托盘中洗涤。在室温下，使用摇床轻轻摇晃洗涤三次，每次5分钟。将未结合的RNA洗掉。随后丢弃洗涤PBST缓冲液，加入使用PBST为溶液的5％脱脂奶封闭液，在室温中孵育，封闭一小时。封闭完成后，再次使用PBST缓冲液洗涤NC膜三次，每次5分钟。将抗m6A抗体按照说明使用PBST缓冲液按照1:500稀释，配置成终浓度为2μg/ml的工作液。将洗涤过的NC膜浸一抗工作液中，在4℃冰箱中摇床上摇晃孵育过夜。次日，回收一抗工作液，并将NC膜浸入PBST缓冲液洗涤，每一次5分钟洗涤三次，除去未结合的一抗。随后使用二抗孵育，在室温中，摇床轻轻摇晃1小时。随后回收二抗，PBST缓冲液洗膜三次，每一次10分钟。打开曝光机，预冷至-40℃。新配置化学发光显影液(ECL)，A液B液按照1:1避光混合，滴在膜上，放入曝光机中显影曝光。

结果显示，相比ASO-con组，ASO-2-flank5组m6A的水平显著降低(图7B)。

3、MTT检测细胞的增殖能力

给予ASO-con和ASO-2-flank5组细胞恩杂鲁胺(20nM)，进行MTT实验，详细步骤同实施例1。

结果显示，相比对照组，转入ASO-2-flank5的恩杂鲁胺耐药细胞系在恩杂鲁胺存在下，细胞活力显著降低(图7C)。说明敲低Mettl3可逆转药物对恩杂鲁胺的敏感性。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 天津市泌尿外科研究所

<120> METTL3的反义寡核苷酸及其在前列腺癌中的应用

<141> 2022-02-14

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtgtagcaa cttcttctct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcttttctgc cacagcaccc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttggttcag aaggctctct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtgtggtct ttgctgccag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agggtgggtc agccatcaca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaagcagtg ttccttccca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagtgccagg agatagtctt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtggatccc atccagttgg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtaggtggat cccatccagt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggctatggat tcttagctct 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagccatggc tatggattct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 12

ggtgtagcaa cttcttctct 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 13

tcttttctgc cacagcaccc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 14

gttggttcag aaggctctct 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 15

cgtgtggtct ttgctgccag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 16

agggtgggtc agccatcaca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 17

ccaagcagtg ttccttccca 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 18

gagtgccagg agatagtctt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 19

ggtggatccc atccagttgg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 20

gtaggtggat cccatccagt 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 21

ggctatggat tcttagctct 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 22

gagccatggc tatggattct 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 23

ucuuuucugc cacagcaccc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 甲氧乙基修饰

<400> 24

ucuuuucugc cacagcaccc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(5)

<223> 甲氧乙基修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (16)..(20)

<223> 甲氧乙基修饰

<400> 25

ucuuutctgc cacagcaccc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(1)

<223> 甲氧乙基修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (20)..(20)

<223> 甲氧乙基修饰

<400> 26

ucttttctgc cacagcaccc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(3)

<223> 甲氧乙基修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (18)..(20)

<223> 甲氧乙基修饰

<400> 27

ucutttctgc cacagcaccc 20

Claims

1.经修饰的反义寡核苷酸，其特征在于，所述经修饰的反义寡核苷酸由15-30个核苷酸组成，所述反义寡核苷酸抑制METTL3的表达；

优选的，所述反义寡核苷酸由18-22个核苷酸组成；

优选的，所述反义寡核苷酸由20个核苷酸组成；

优选的，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.1-11任一项所述的序列；

优选的，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示；

优选的，所述修饰包括至少一个核苷间键修饰；

优选的，所述核苷间键修饰是硫代磷酸酯修饰；

优选的，所述修饰包括全链的核苷间键修饰；

优选的，所述修饰包括至少一个糖修饰；

优选的，所述糖修饰为2′-O-甲氧乙基修饰；

优选的，所述修饰包括至少6个糖修饰；

优选的，所述修饰包括10个糖修饰；

优选的，所述糖修饰位于反义寡核苷酸序列两侧。

2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸包括至少一个的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰；

优选的，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰；

优选的，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少6个的糖修饰；

优选的，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和10个糖修饰；

优选的，所述经修饰的反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.25所示。

3.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1或2所述的反义寡核苷酸或其盐；

优选的，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括METTL3的抑制剂和治疗前列腺癌的药物；

优选的，所述药物选自阿比特龙、多西他赛、恩杂鲁胺；

优选的，所述药物为恩杂鲁胺；

优选的，所述抑制剂降低METTL3 mRNA或蛋白的水平；

优选的，所述抑制剂选自核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子；

优选的，所述核酸抑制物选自：shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义寡核苷酸，或能表达或形成所述shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义寡核苷酸的构建物；

优选的，所述核酸抑制物选自shRNA、反义寡核苷酸或其核酸构建物；

优选的，所述反义寡核苷酸如权利要求1或2所述；

优选的，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

5.一种诊断耐药前列腺癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测METTL3的试剂；

优选的，所述试剂包括特异性识别METTL3的探针；或

特异性扩增METTL3的引物；或

特异性结合METTL3的抗体或配体；

优选的，所述产品包括芯片、试剂盒。

6.一种筛选治疗耐药前列腺癌的候选药物的方法，其特征在于，用待筛选物质处理表达或含有METTL3基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中METTL3基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进METTL3基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗耐药前列腺癌的候选药物。

7.如下任一项所述的应用：

(1)权利要求1或2所述的反义寡核苷酸、权利要求3或4所述的组合物在制备治疗去势抵抗前列腺癌的药物组合物中的应用；

(2)权利要求1或2所述的反义寡核苷酸、权利要求3或4所述的组合物在制备治疗耐药前列腺癌的药物组合物中的应用；

(4)METTL3在筛选治疗耐药前列腺癌的候选药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述耐药前列腺癌选自耐阿比特龙、多西他赛、恩杂鲁胺的前列腺癌；

优选的，所述耐药前列腺癌为耐恩杂鲁胺的前列腺癌。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过RT-PCR法、RT-qPCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测METTL3基因或蛋白表达水平的试剂。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，筛选治疗耐药前列腺癌的候选药物的步骤如下：

用待筛选物质处理表达或含有METTL3基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中METTL3基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进METTL3基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗耐药前列腺癌的候选药物。