CN107988257A - 基于供体细胞dna甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞和方法。本发明提供的载体包括阻遏蛋白TetR表达载体和含有操纵基因TetO的双向表达载体，在融合前将两者共转染到供体细胞中。筛选阳性转染的细胞，药物诱导表达山羊TET3，将TET3诱导表达的阳性细胞作为最终供体细胞，再将其注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，挑选成功融合的山羊体细胞克隆胚培养。本发明可以有效的降低供体细胞的甲基化水平，纠正克隆胚胎中的异常高甲基化现象，从而显著提高后期山羊体细胞克隆胚胎的发育率和质量，可以高效地体外生产山羊体细胞克隆胚胎，胚胎移植后的克隆山羊的出生率也显著提高。

Description

基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载 体、细胞及方法

技术领域

本发明属于动物体细胞克隆技术领域，涉及一种基于供体细胞甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法。

背景技术

体细胞克隆是一种具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆、疾病模型、人器官移植、动物转基因研究，频临灭绝动物品种保护及优良家畜品种扩增等方面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。

目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体体细胞核没有被受体卵胞质完全的重编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列的变化，主要是表观遗传修饰的变化。表观遗传修饰主要包括组蛋白乙酰化和DNA甲基化两方面。

TET3是一种DNA去甲基化酶，可以降低DNA甲基化的水平，但其酶活性在不同物种中发挥作用的时机并不相同，例如，研究表明，小鼠中敲除TET3基因，导致原核期胚胎中去甲基化作用部分丧失。

研究发现，山羊体细胞核移植胚胎甲基化水平异常偏高，降低供体细胞甲基化水平，是提高克隆胚胎发育质量及克隆效率的一种方法，但目前尚未发现一种有效降低体细胞甲基化水平的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，包括用于共转染山羊供体细胞的阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体；所述目的基因诱导表达载体包括目的基因以及通过与阻遏蛋白结合或分离调控目的基因表达的阻遏操纵基因，所述目的基因包括山羊TET3基因。

优选的，所述目的基因还包括与山羊TET3基因共表达的EGFP基因。

优选的，所述阻遏蛋白表达载体表达四环素阻遏蛋白TetR；所述目的基因诱导表达载体选自含有四环素操纵基因TetO的双向表达载体，且四环素操纵基因TetO对沿两个表达方向排列的目的基因同时进行调控，所述目的基因的序列包括位于其中一个表达方向上的EGFP基因读码框和位于另一个表达方向上的山羊TET3基因读码框。

优选的，所述双向表达载体还包括与EGFP基因及山羊TET3基因分别融合表达的Kozak序列。

优选的，所述双向表达载体还包括与山羊TET3基因以及对应Kozak序列融合表达的3×FLAG标签序列。

优选的，所述阻遏蛋白表达载体选自载体pEF1a-Tet3G；所述目的基因诱导表达载体选自重组载体pTRE3G-GTet3-EGFP-BI，该重组载体包括骨架载体pTRE3G-BI，并且在该载体的双向启动子两侧的多克隆位点分别插入有EGFP基因和山羊TET3基因，EGFP基因和山羊TET3基因的上游均设置有位于对应多克隆位点内的Kozak序列，山羊TET3基因与其对应的Kozak序列之间设置有3×FLAG标签序列。

优选的，所述重组载体pTRE3G-GTet3-EGFP-BI与载体pEF1a-Tet3G以2～4:1的质量比共转染山羊供体细胞。

优选的，所述山羊TET3基因(CDS)的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的细胞，该细胞为过表达山羊TET3基因的山羊核移植供体细胞；所述山羊核移植供体细胞，是以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，利用诱导表达药物对转染于该宿主细胞内的诱导表达系统所携带的目的基因进行诱导表达，并通过筛选得到的目的基因阳性表达细胞；诱导表达系统由上述阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体构成。

优选的，所述诱导表达药物为Dox，诱导表达中Dox的处理浓度为100～200ng/mL，处理时间为48～72h；所述阳性表达细胞激发后发出绿色荧光。

一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的融合方法，该融合方法包括以下步骤：

1)以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将上述阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体共转染至宿主细胞；利用与阻遏蛋白相对应的诱导表达药物对转染成功的宿主细胞进行诱导表达处理，然后将筛选得到的目的基因诱导表达载体的阳性表达细胞作为核移植供体细胞；

2)将核移植供体细胞注入到去核后的卵母细胞中后进行电融合，挑选融合细胞进行激活处理，得到克隆胚胎；

3)在进行激活处理后于培养液中进行克隆胚培养。

优选的，所述共转染具体包括以下步骤：将上述重组载体pTRE3G-GTet3-EGFP-BI和载体pEF1a-Tet3G通过电击转染按2～4:1的质量比共转入山羊原代胎儿成纤维细胞；然后使用400～800μg/mL G418对转染后的细胞进行筛选，得到具有G418抗性的细胞克隆，即转染成功的宿主细胞；

优选的，所述诱导表达处理具体包括以下步骤：将具有G418抗性的细胞克隆于含有100～200ng/mL Dox的培养液中培养，直至得到在荧光显微镜下呈现绿色的细胞克隆，将该细胞克隆扩大培养至细胞密度达到70～80％后消化并悬浮细胞，然后转接在含有100～200ng/mL Dox的培养液中，继续培养48～72h；

所述筛选的标准为：保持G418抗性且激发下发出(更强)绿光。

所述克隆胚培养具体包括以下步骤：将激活处理后得到的克隆胚胎首先于G1.5培养液中培养72h，然后转移至G2.5培养液中培养至激活处理后第8天。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明基于DNA甲基化水平的修饰来进行表观遗传修饰，利用山羊TET3蛋白的靶向特异性的DNA去甲基化活性，将山羊TET3基因构建于含有阻遏操纵基因(例如TetO)的表达载体中，并将其与对应阻遏蛋白(例如TetR)表达载体共转入核移植供体细胞，这样就可以在核移植前通过药物诱导去阻遏，从而达到供体细胞内DNA去甲基化的表观遗传修饰。通过在核移植前诱导供体细胞表达山羊TET3蛋白，有效降低供体细胞的甲基化水平，并且在核移植后能纠正早期克隆胚胎异常高甲基化状态，从而促进体细胞克隆胚正常发育。且本发明显著提高山羊克隆胚的发育率和质量，可高效地体外生产山羊体细胞克隆胚胎；胚胎移植后的克隆山羊的出生率也显著提高。因此，本发明能显著提高山羊克隆效率。

进一步的，本发明利用Dox对山羊胎儿成纤维细胞进行处理，诱导成纤维细胞表达山羊TET3蛋白，可有效降低成纤维细胞的甲基化水平，并且在核移植后能纠正早期克隆胚异常高甲基化状态。与未诱导表达的对照组相比，利用Dox诱导处理之后进行核移植，可显著提高胚胎发育率。Dox诱导处理山羊供体细胞表达TET3蛋白，可有效降低供体细胞DNA的5mC表观遗传修饰水平，核移植后可以显著提高囊胚发育率、囊胚孵化率和囊胚的细胞总数，并且提高山羊的克隆效率。山羊体细胞克隆胚在2细胞期、4细胞期和囊胚期的5mC表观遗传修饰水平显著低于对照组(p<0.05)；山羊体细胞克隆囊胚发育率显著高于对照组(p<0.05)；囊胚的孵化率显著高于对照组(p<0.05)；囊胚的细胞总数显著高于对照组(p<0.05)；山羊的克隆效率得到显著提高(p<0.05)。

附图说明

图1A为Tet-on 3G Inducible Expression System真核细胞诱导表达系统pEF1a-Tet3G载体图谱；TetR阻遏蛋白基因属于图中Tet-on 3G的一部分。

图1B为Tet-on 3G Inducible Expression System真核细胞诱导表达系统pTRE3G-BI载体图谱；其中的pTRE3G-BI元件是双向启动子，TetO属于它的一部分。

图1C为山羊TET3基因真核诱导表达载体(pTRE3G-GTet3-EGFP-BI)图谱。

图2为山羊TET3基因的CDS区域、EGFP序列、Kozak序列和3×FLAG标签序列表达元件在pTRE3G-BI的多克隆位点的排列示意图；其中数字449和2829对应图1B中骨架载体上的位置。

图3是山羊TET3基因诱导表达细胞克隆效果图。

图4为TET3诱导表达细胞克隆的qPCR和Western Blot鉴定效果，Western Blot结果为3×FLAG标签杂交结果，GAPDH为qPCR内参。

图5为TET3诱导表达后基因组DNA 5mC和5HmC染色图。

图6为利用本发明制备的山羊体细胞克隆胚胎图。

图7为山羊克隆胚胎发育率(A)和孵化率(B)的统计图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明提供一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法。本发明是基于DNA甲基化水平的修饰来进行表观遗传修饰。对山羊供体细胞进行处理，诱导山羊TET3蛋白的过表达，并将处理后的山羊供体细胞注入去核的卵母细胞后进行电融合，对融合后的山羊克隆胚进行激活处理和体外培养处理，从而提高山羊体细胞克隆囊胚质量和发育率，胚胎移植后的克隆山羊的出生率也显著提高。

本发明选择山羊TET3基因作为去甲基化基因，而为了便于在特定的阶段进行去甲基化的修饰，将TET3基因和EGFP插入含有阻遏操纵基因TetO的双向表达载体的启动子两侧，和阻遏蛋白TetR表达载体共转入细胞，这样既能够进行阳性细胞的筛选，又方便进行诱导表达，同时EGFP标签又不会妨碍TET3蛋白的功能。

本发明具体利用Dox诱导山羊胎儿成纤维细胞过表达山羊TET3蛋白，可有效降低成纤维细胞DNA甲基化水平，并且在核移植后能纠正早期克隆胚异常高甲基化状态，显著提高山羊克隆胚的发育率和质量，可高效地体外生产山羊体细胞克隆胚胎；胚胎移植后的克隆山羊的出生率也显著提高，显著提高山羊克隆效率。

(一)试剂和培养液/处理液的来源和制备

Dox(强力霉素)、G418、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、青霉素、链霉素、无机盐、石蜡油、17β-E₂、ITS、BSA、BME、细胞松弛素B、Hoechst 33342、离子霉素、6-DMAP为Sigma公司产品，DMEM和Opti-MEM液体培养基、PBS、细胞消化液和特级胎牛血清(FBS)、TCM199液、DMEM/12液体培养基为Gibco产品，胚胎培养液G1.5、G2.5均购买于vitrolife公司，H3K9me3的抗体购自Abcam公司，货号ab8898。HMG为Prospec公司产品，SOF培养液为Caisson公司产品。

其他未标明的产品均为Sigma公司产品。

a、卵母细胞体外成熟培养液

成熟培养液为TCM199液中添加2.2mg/mL NaHCO₃、0.075IU/mL HMG、1μg/mL17β-E₂、0.33mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、体积分数1％的ITS、体积分数10％的FBS以及100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素。

b、mSOF溶液

mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养液，并包含有体积分数为1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、体积分数2％的BME、体积分数为1％的MEM、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素。

c、电融合液

电融合液的组成为：0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸及0.1％BSA。

d、Dox储存液的配制

浓度1mg/mL Dox储存液：称取10mg Dox于灭菌的15mL离心管中，加入10mLddH₂O混匀，过滤除菌并分装，避光储存于-20℃冰箱待用，一年内有效。

e、G418储存液的配制

浓度100mg/mL G418储存液：称取1g G418于灭菌的15mL离心管中，加入10mLddH₂O混匀，过滤除菌并分装，避光储存于-20℃冰箱待用，一年内有效。

f、DMEM/F12细胞筛选培养液的配制

成品DMEM/12液体培养基中加入体积分数10％FBS、10ng/mL bFGF，以此为基础培养液，细胞筛选培养液的G418初始浓度为800μg/mL，复筛浓度为400μg/mL。

g、BTX细胞电击转染缓冲液及工作液的配制

BTX细胞电击转染缓冲液配方：KCL 120mM、CaCl₂·2H₂O 0.15mM、K₂HPO₄ 10mM及MgCl₂·6H₂O 5mM；

工作液为BTX细胞电击转染缓冲液与Opti-MEM按体积比3:1预混。

(二)真核细胞诱导系统载体的构建及阳性细胞克隆筛选方法

2.1、真核细胞诱导系统载体的构建

Tet-On 3G Inducible Expression System是真核诱导表达系统，由pEF1a-Tet3G和pTRE3G-BI(Clontech)载体所组成。其中pEF1a-Tet3G(图1A)载体表达四环素阻遏蛋白(TetR)，pTRE3G-BI含有四环素操纵基因(TetO)，当有Dox存在时，四环素类似药物(指Dox，Dox使用时，用量小，尽量减少对细胞的副作用)使TetR的构象发生改变，导致TetR与TetO分离，从而引起目的基因的抑制解除，使目的蛋白得以表达。pTRE3G-BI(图1B)载体中有两个多克隆位点(MCS)，MCS-1区插入含有Kozak序列的绿色荧光蛋白(EGFP)读码框，在MCS-2区插入含Kozak序列和3×FLAG标签的山羊TET3基因的读码框，所构建载体命名为pTRE3G-GTet3-EGFP-BI(图1C)。

2.1.1、扩增包含TET3CDS区的目的片段(记为片段A)

山羊TET3基因位于11号染色体上，编码序列长4974bp，编码氨基酸1658个。Trizol法提取山羊卵母细胞(2016年10月采自陕西省宝鸡市定点屠宰场)RNA，通过反转录PCR获得相应cDNA，以此为模板使用PCR酶Takara PrimerStar获得TET3的CDS区域全长(TET3CDS区核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示)。引物设计完成时间2015年10月：

TET3上游引物F1：5’-CGGGGTACCCCGGCCACC ATGGACTCAGGGCCAGTGTACCATG-3’(斜体部分是KpnI的酶切位点和保护碱基，带下划线的是Kozak序列，加方框的部分是3×FLAG标签序列)

TET3下游引物R1：5’-TGCTCTAGAGCACTACTAGATCCAGCGGCTGTAGGGGCCGGTG-3’(斜体部分是XbaI的酶切位点和保护碱基)

表1.TET3CDS的PCR扩增体系

PCR反应程序为：98℃预变性2min；35个循环：98℃变性12s，68℃退火6min；68℃延伸10min，16℃保存10min。

2.1.2、扩增包含EGFP基因的目的片段(记为片段B)

以pEGFP-N1质粒(Clontech公司)为模板扩增EGFP基因并在末端添加Kozak序列和酶切位点。引物设计完成时间2015年10月：

EGFP上游引物F1：5’-CGCGGATCCGCGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(斜体部分是BamHI的酶切位点和保护碱基，带下划线的是Kozak序列)

EGFP下游引物R1：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’(斜体部分是NotI的酶切位点和保护碱基)

表2.EGFP的PCR扩增体系

PCR反应程序为：95℃预变性5min；35个循环：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸5min，16℃保存10min。

2.1.3、制备pTRE3G-GTet3-EGFP-BI

两个扩增目的片段随后通过双酶切，拼接入pTRE3G-BI载体的对应MSC区(元件连接顺序如图2所示，两个多克隆位点中分别插入对应片段。具体如下：

首先，将获得的含有EGFP读码框的片段(片段B)和pTRE3G-BI载体分别用BamHI(NEB公司)和NotI(NEB公司)酶切，然后通过连接反应，将片段B插入到pTRE3G-BI载体的MCS-1上，得到含有EGFP的pTRE3G-BI重组载体pTRE3G-EGFP-BI(3606bp)；随后将得到的重组载体和含有TET3CDS区的片段(片段A)分别用KpnI(NEB公司)和XbaI(NEB公司)酶切，然后通过连接反应，将片段A插入到pTRE3G-EGFP-BI中对应于pTRE3G-BI载体的MCS-2的多克隆位点上，得到含有山羊TET3和EGFP的pTRE3G-BI重组载体pTRE3G-GTet3-EGFP-BI(8646bp)。

第一部分：pTRE3G-EGFP-BI的构建

酶切体系：

表3.BamHI和NotI双酶切体系

连接体系：

表4.片段B连接体系

第二部分：pTRE3G-GTet3-EGFP-BI的构建

酶切体系：

表5.KpnI和XbaI双酶切体系

连接体系：

表6.片段A连接体系

扩增TET3的CDS区是为了获得正确表达TET3蛋白的核酸序列，将其插入真核诱导表达载体，即可在诱导后准确依照CDS区域的核酸序列转录出相应的mRNA，随后翻译出正确的肽链，并组装成有活性的TET3蛋白。

Kozak序列均为GCCACC，加在CDS区序列ATG前端，主要目的是促进依照CDS区转录出的mRNA有效地与核糖体结合，保证翻译的正常进行。

pTRE3G-GTet3-EGFP-BI的元件排列如图2所示，pTRE3G-BI共有MCS-1和MCS-2两个多克隆位点，在MCS-1中，插入依次排列的Kozak序列及EGFP编码框的序列，在MCS-2中，插入依次排列的Kozak序列、3×FLAG标签序列及山羊TET3CDS。图2框内酶切位点为连入目的片段所选择的位点。

2.2、阳性细胞克隆筛选

在BTX细胞电击转染工作液下，将pTRE3G-GTet3-EGFP-BI和pEF1a-Tet3G使用电击转染按2:1的质量比共转入山羊原代胎儿成纤维细胞(2014年8月采自陕西省杨凌中国克隆羊基地)中(两次电击，参数为510V，1ms)，电转质粒用量：60皿细胞对应大约2x10⁶个细胞量，对应pEF1a-Tet3G用量为10μg，则2:1的用量就是20μg:10μg。使用含800μg/mL G418的DMEM/F12细胞筛选培养液对转染后的细胞进行筛选(38.5℃,5％CO₂,饱和湿度)。约2周后得到具有G418抗性的细胞克隆，抗性细胞克隆继续于400μg/mL G418条件下培养，并加入100ng/mL Dox诱导后(24h后)，在荧光显微镜下标记出EGFP表达的细胞克隆，并将满足以上两项条件的阳性细胞克隆(指添加Dox后有荧光产生的细胞单克隆)进行扩大培养(DMEM/F12，38.5℃,5％CO₂,饱和湿度)。对于扩大培养得到克隆一部分再次加入100ng/mL Dox诱导72h后，通过qPCR或者WesternBlot确定TET3的表达，另一部分冻存入液氮中以备后用。

结果显示，上述100ng/mL Dox处理72h，阳性细胞表达更多的绿色荧光蛋白(图3)，诱导表达效果正常。对照组为未经过任何Dox处理的G418抗性的细胞克隆。

参见图4，与对照组相比较，显示100ng/mL Dox处理72h后，阳性细胞克隆能高效表达TET3的mRNA及蛋白，显然在加入Dox诱导后TET3和EGFP得到显著表达。

qPCR的定量引物如下(引物设计完成时间2015年5月)：

TET3上游引物F2：5’-GCGATTGATTGCCGTCTGG-3’

TET3下游引物R2：5’-TTGGCGTTCTGGTTCTCCTC-3’

GAPDH上游引物F1：5’-CCACGCCATCACTGCCACCC-3’

GAPDH下游引物R1：5’-CAGCCTTGGCAGCGCCAGTA-3’

参见图5，与对照相比，利用Dox诱导山羊体细胞表达TET3蛋白，可以显著降低体细胞DNA的5mC的修饰水平。具体表现为：TET3诱导表达组5mC水平显著下降(7.6±1.1％vs21.1±1.4％)，而5HmC水平显著提高。

结果表明Dox可高效地诱导所构建的载体中的TET3的mRNA转录和蛋白翻译。

(三)体细胞核移植技术生产山羊克隆胚胎

a.山羊胎儿成纤维细胞阳性克隆的培养和处理

从液氮中取一管山羊胎儿成纤维细胞阳性克隆于38℃解冻，加0.8mL的DMEM/F12液体培养基离心，弃上清，加DMEM/F12重悬，取2mL细胞重悬液接种于直径60mm的培养皿中，置于CO₂培养箱中38.5℃条件下培养。

待细胞密度达到80％左右，去掉培养液，用PBS冲洗细胞，加入细胞消化液消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％FBS的DMEM/F12液体培养基终止消化，用移液器吹打后，离心收集并悬浮，按1:3体积比例传代接种于24孔板中，在对应孔内DMEM/F12液体培养基中加入终浓度100ng/mL的Dox，置于CO₂培养箱中38.5℃条件下培养72h。

b.卵母细胞的成熟培养

山羊卵巢于2016年10月采自陕西省宝鸡市定点屠宰场，将卵巢置于保温瓶中含青、链霉素的20～25℃的生理盐水中，5h以内运回实验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在无菌生理盐水中清洗三次，用灭菌刀片刺卵巢表面的卵泡，挑选卵质好的卵母细胞培养。

将培养的卵母细胞在卵母细胞体外成熟培养液中冲洗两遍，然后移入装有3mL卵母细胞体外成熟培养液的3cm平皿中，置于CO₂培养箱中38.5℃条件下培养24～26h，待成熟后，用1000mL移液枪反复吹打除去卵丘细胞，挑选带有极体的卵母细胞备用。

c.山羊体细胞克隆胚的构建

去核：

在去核前，卵母细胞先在含有7.5μg/mL细胞松弛素B、10μg/mL Hoechst 33342和体积分数10％FBS的PBS中孵育10～20min；然后在显微操仪下，用内径为20μm的去核针吸取第一极体及其周围的卵胞质，去除第一极体及染色体的卵母细胞应用于核移植。

注核和电融合：

注核时挑选直径为15～20μm的步骤a所得细胞注入去核的卵母细胞透明带下。注核后的重组体采用微电极的方法进行融合。融合前，重构体在电融合液中预平衡3～5min，电融合在150倍的显微操作仪下进行。用于融合操作的两根“Z”字形微电极顶端直径为15μm，后端连于显微操作仪上，使重组体的供体、受体细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时长20μs、2次脉冲间隔10ms。融合后1.5h在显微镜下观察融合情况。

挑选融合细胞进行以下激活处理：含5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育5min，转移到含2mol/L 6-DMAP的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养5h；

将激活后的克隆胚胎转移到G1.5培养液中，38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养24h后，一部分用于胚胎移植，另一部分继续培养。在72h转移到G2.5中继续培养至第8d。记录胚胎发育情况并收集胚胎用于后续实验。

与对照组相比，利用Dox诱导所形成的体细胞克隆胚可以显著提高山羊体细胞克隆胚胎的发育率、囊胚孵化率和质量，胚胎移植后可以显著提高山羊的克隆效率，具体表现为：

1)山羊体细胞克隆胚的发育

Dox诱导表达TET3对山羊体细胞克隆胚胎的发育的影响如图6所示，当供体细胞诱导表达TET3时，可显著提高胚胎发育率，激活后第2天有更多的融合细胞卵裂，第8天囊胚和孵化囊胚的比例也显著增加。

2)山羊体细胞克隆胚胎的发育率和囊胚的孵化率

由图7可以看出，经过Dox诱导TET3表达的供体细胞，所形成克隆胚胎的发育率显著高于对照组(2-4细胞：73.1±4.6％vs 63.1±1.8％；8-16细胞：58.6±2.7％vs 50.1±2.0％；桑椹胚：41.8±1.5％vs 32.9±2.8％；囊胚：32.7±2.1％vs 21.4±2.0％)，并且囊胚孵化率也得到显著提高(56.8±1.4％vs 22.2±1.9％)

3)山羊体细胞克隆囊胚的细胞数

由表7可以看出，经Dox诱导TET3表达的供体细胞核移植得到的囊胚的细胞总数显著高于对照组(102.0±6.4vs 88.4±7.1)。

表7.山羊体细胞克隆囊胚的细胞数分析

每个处理组与对照组的样品均为重复三次的实验结果汇总(Mean±SD)，在同一列内数据上标不同字母表示差异显著(p<0.05)。

4)山羊体细胞克隆胚移植后的克隆效率

如表8所示，基于Dox诱导供体细胞表达TET3蛋白能显著提高克隆效率(出生率：71.8±8.1％vs 29.2±7.2％；克隆效率：3.6％vs 1.5％)。

表8.各组山羊克隆胚胎的克隆效率

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4974

<212> DNA

<213> 山羊TET3基因 CDS区()

<400> 1

atggactcag ggccagtgta ccatggggac tcacggcagc taagcgcctc aggggcgcca 60

gtcaatggtg ctagagaacc tgctggaccc agtctgctgg gcgccgggag tccttggcaa 120

gcagaccaga agcccgactg ggacacggcc ccaggaccag ctcacaccgc tcgcctggaa 180

gatgcccacg atctggtggc cttttcggct gtggccgaag ctgtgtcctc ttatggagcc 240

cttagcaccc ggctctatga aaccttcaac cgtgagatga gtcgtgaggc tgggaacaac 300

agcaggggac ccaggtcagg gcccgagagc tgctctgcca gcagtgaaga ccttgacacg 360

ctgcagacgg ccctggccct cgctcggcat ggcatgaaac cgcccaactg caactgcgat 420

ggcccagagt gccccgacta cctcgagtgg ctggagggga agatcaagtc tgtggtcgtg 480

gagggagggg aggagcggcc tagactccca gggactctgc cttctggtga cgcaggcctc 540

ccggcgccag tcaccgggcc actcctcaac tccgaggtcc cccagatgcc gcctctggag 600

ggcctaccct tgtcccagag cgccctgagc atcgccaagg agaagaacat cagcctgcag 660

actgccattg ccattgaggc cctcacacag ctctcctctg cgctccccca accttctcac 720

gccacctccc aggctccttg cccccttccc gaggccttgt cccctcctgc ccctttcaga 780

tctccccagt cctacctccg ggctccctca tggcctgtgg tccctcctga agagcaccca 840

tcctttgctc ctgacggccc tgccttccct gcagcaactc cgagaacaga gtttcctgaa 900

gcctggggca ccgacacgcc accggcaacc ccccagagct cgtggcccat gcctcgccca 960

agccctgacc ccatggctga actggagcag ttgttgggca gtgccagcga ttacatccag 1020

tcagtattca agcggcccga ggccctgccc accaagccca aggtcaaggt cgaggtgccc 1080

tcgtcctccc cgtcccccgt tctccagagg gaggcgccca caccgtcctc ggagcccgac 1140

acccaccaga aggcccagac ggccctgcag cagcacctcc accataagcg cagtctcttc 1200

ctggaacagg cccacgacgc ctcccgcccg ccgcccccgg agcttcctgc tcctggctgg 1260

tgggcgccac ccagctcacc tgcccctcgg ccttccgaca gaccacccaa ggagaagaag 1320

aagaagcccc tggcactagc tggaggtcct gtgggagctg acagaggtgg ccctgggatc 1380

aagcccggtg tccggaagcc cgttcacatc aagaagtcca ggccacgaga agcgcagccc 1440

ctcttcccgc ctctgcggca gatcgtcctg gaagggctga ggcccccagc ctctgaggac 1500

gtgcaggctc acccacctgc ccccgtcccc acctcacagg gctctgtcgt ccccctgccc 1560

ccagaacctt ctcttgcgct atttgcacct agtccctccg gggacagcct gctggcccct 1620

actcaggaaa tgaggtctcc cagccccgtg gcagccctgc agccaggctc cactggccct 1680

cttccccctg ctgatgacaa gctggaagag ctcatccggc agtttgaggc tgaatttggg 1740

gatagctttg ggcttcctgg ccccccgtct gtgcccattc aggaccctga gaaccagcca 1800

acttgtctcc cagcccccga gagccctttt gctacccgct ctcccaagca aatcaagatc 1860

gaatcttcag gggctgtgac tgtgctctca accacctgct tccattcaga ggagggaggc 1920

caggaggcca cacccaccaa ggccgagaac ccactcacac ccaccctcag tggcttcctg 1980

gagtcgcctc ttaagtacct ggacacaccc accaagagtc tgctggacac acccgccaag 2040

agagcccagg ccgagttccc cacctgtgat tgtgtggaac aaatagtgga gaaagatgaa 2100

ggtccatatt atactcatct gggatctggc cccacagtag cctccatccg ggagctcatg 2160

gaggagcggt acggagagaa ggggaaagcc atccggatcg agaaggtcat ctacacgggg 2220

aaggaaggga agagctcacg tggctgcccc atcgcaaagt gggtgatccg caggcacacg 2280

ctagaagaga agctgctctg cctggtgcgg caccgggcgg gccaccactg ccagaatgcc 2340

gtgatcgtca tcctcatcct ggcctgggag ggcatccccc gcagcctcgg agacaccctc 2400

taccaggagc tcaccgacac cctccggaag tacgggaacc ccaccagccg gagatgcggc 2460

ctcaacgatg accggacctg cgcttgccaa ggcaaagacc caaacacctg tggtgcctcc 2520

ttctccttcg gttgttcctg gagcatgtac ttcaatggct gcaaatatgc tcggagcaag 2580

actcctcgca agttccgcct cgcaggggac aaccccaaag aggaagaagt gctccggaag 2640

agtttccagg acctggccac cgaagttgct cccctgtata agcggctggc gccccaggcc 2700

tatcagaacc aggtgaccaa tgaggaaata gcgattgatt gccgtctggg gctgaaggaa 2760

gggcggccct tctcaggggt cacagcctgc atggacttct gtgcccacgc ccacaaggac 2820

cagcataacc tctacaacgg gtgcacagtg gtctgcactc tgaccaagga agacaatcgc 2880

tgcgtgggca agatccccga ggacgagcag ctgcacgtgc tccccctgta caagatggcc 2940

agcacagacg agttcggcag tgaggagaac cagaacgcca aggtgggcag tggggccatc 3000

caggtgctca ccgccttccc ccgcgaggtc cggcgcctgc ccgagcctgc caagtcctgc 3060

cgccagcggc agcttgaagc caggaaggcg gcagccgaga agaagaaggt tcagaaggag 3120

aagctgagca cgcctgagaa gatcaagcag gaggccctgg agctggctgg catcaccact 3180

gacccaggcc tttctctgaa gggtggattg tcccagcaaa gcctgaaacc ctccctcaag 3240

gtggagccgc agagcccctt cagctccttc aagtacagcg gcaacacggt ggtggagagc 3300

tactcggtgc tgggcagttg ccggccctcc gacccataca gcgtgaacag cgtgtactcc 3360

tgccactccc actatgcaca gcctggcctg gctgccgtca acggcttcca ctccaagtac 3420

gcgcttccgg cgttcagcta ctacggcttc ccatccagta acccggtctt cccctctcag 3480

ttcctgggtg ctggtgcctg ggggcacagt ggcggcagca gcagttttga gaagaagcca 3540

gacctccacg ctctgcacaa cagcctgagc ccggcctacg gtggtgctga gtttgccgag 3600

ctgcccggtc aggctgttcc cacagacacc caccaccctg cttctcacca ccagcagcct 3660

gcttatccag gccctaagga gtatctgctt ccgaaggccc ctcagatcca cccagtgtcc 3720

agggacccgt ctccctttgc acagagctcc aattgctaca acagatccat caagcaagag 3780

ccagtagacc ctctgctcca cactgaatct gtatccagag agcctggcaa gatgggcaaa 3840

acacctttgc ctgaggcatc tcagaacggg ggtcccagtc atctatgggg acagtactca 3900

ggaggcccaa gcatgtcccc caagaggact aacggcgtgg gtggcagctg gggcgtgttc 3960

cctcctgtgg agagctctgc tgttatccct gataagctcg gttcttttgg aggtgcctgc 4020

ctgacccctt cccacttccc tgatggccag catcagtggg ggttgtttcc tggcgaggga 4080

cagcagccag ccccccagcc tggaggacgg ctgcgaggca agccgtggag cccctgcaag 4140

tttggaagca acgcctcggc cttggctggg cccggcctga ctgagaagcc gtggggggta 4200

ggggcagggg atttcagctc cgccctgaaa ggtggtcctg gattccaaga caagctgtgg 4260

agccccttga aaggggagga ggggcggatt ccaaccccgg gggcgagcca gctggacaaa 4320

gcctggcagt ccttcggcat gcccctgggc cccagtgaga agctgtttgg ggccctgaag 4380

tccgaggaga agctgtggga tcccttcagc ctggaggagg ggacggcaga ggggtccccg 4440

aacaagggga tggtgaagga ggagaagggc gccggtgggg cggaggagga ggaggagctg 4500

tggtcggaca gcgagcacaa cttcctggac gagaacattg gcggcgtggc cgtggccccc 4560

gcccatggct ccatcctcat cgagtgtgcc cggcgggagc tgcacgccac cacacccctc 4620

aagaagccca accgctgcca ccccacccgc atctcgctgg tcttctacca gcacaagaac 4680

ctcaaccagc ccaaccatgg gctggcgctc tgggaggcca agatgaagca gctggcggag 4740

agggcacggg cacgacagga ggaggccgcc cggctgggcc tgggccatca ggaggccaag 4800

ctctacggga agaagcgcaa gtgggggggc gccgtggtcc ctgagtccca gcataaggag 4860

aagaagggga tggtccctac ccggcaggcg ctggccgtgc ccacggactc agcagtcacc 4920

gtgtcctcct acgcctacac gaaggtcacc ggcccctaca gccgctggat ctag 4974

<210> 2

<211> 112

<212> DNA

<213> TET3上游引物F1()

<400> 2

cggggtaccc cggccaccat ggactacaaa gaccatgacg gtgattataa agatcatgac 60

atcgattaca aggatgacga tgacaagatg gactcagggc cagtgtacca tg 112

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> TET3下游引物R1()

<400> 3

tgctctagag cactactaga tccagcggct gtaggggccg gtg 43

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> EGFP上游引物F1()

<400> 4

cgcggatccg cggccaccat ggtgagcaag ggcgaggag 39

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> EGFP下游引物R1()

<400> 5

ataagaatgc ggccgctaaa ctatttactt gtacagctcg tccatgccg 49

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> TET3上游引物F2()

<400> 6

gcgattgatt gccgtctgg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> TET3下游引物R2()

<400> 7

ttggcgttct ggttctcctc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH上游引物F1()

<400> 8

ccacgccatc actgccaccc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH下游引物R1()

<400> 9

cagccttggc agcgccagta 20

Claims (10)

1.一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：包括用于共转染山羊供体细胞的阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体；所述目的基因诱导表达载体包括目的基因以及通过与阻遏蛋白结合调控目的基因表达的阻遏操纵基因，所述目的基因包括山羊TET3基因。

2.根据权利要求1所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：所述目的基因还包括与山羊TET3基因共表达的EGFP基因。

3.根据权利要求1或2所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：所述阻遏蛋白表达载体表达四环素阻遏蛋白TetR；所述目的基因诱导表达载体选自含有四环素操纵基因TetO的双向表达载体，且四环素操纵基因TetO对沿两个表达方向排列的目的基因同时进行表达调控，所述目的基因的序列包括位于其中一个表达方向上的EGFP基因读码框和位于另一个表达方向上的山羊TET3基因读码框。

4.根据权利要求3所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：所述双向表达载体还包括与EGFP基因及山羊TET3基因分别融合表达的Kozak序列。

5.根据权利要求4所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：所述双向表达载体还包括与山羊TET3基因以及对应Kozak序列融合表达的3×FLAG标签序列。

6.根据权利要求1所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：所述山羊TET3基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

7.一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的细胞，其特征在于：该细胞为过表达山羊TET3基因的山羊核移植供体细胞；所述山羊核移植供体细胞，是以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，利用诱导表达药物对转染于该宿主细胞内的诱导表达系统所携带的目的基因进行诱导表达，并通过筛选得到的目的基因阳性表达细胞；诱导表达系统由阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体构成，目的基因诱导表达载体包括目的基因以及通过与阻遏蛋白结合调控目的基因表达的阻遏操纵基因，所携带的目的基因包括山羊TET3基因。

8.根据权利要求7所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的细胞，其特征在于：所述诱导表达药物为Dox，诱导表达中Dox的处理浓度为100～200ng/mL，处理时间为48～72h；所述目的基因还包括与山羊TET3基因共表达的EGFP基因，所述阳性表达细胞激发后发出绿色荧光。

9.一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的融合方法，其特征在于：该融合方法包括以下步骤：

1)以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体共转染至宿主细胞，所述目的基因诱导表达载体包括目的基因以及通过与阻遏蛋白结合调控目的基因表达的阻遏操纵基因，所述目的基因包括山羊TET3基因；利用与阻遏蛋白相对应的诱导表达药物对转染成功的宿主细胞进行诱导表达处理，然后将筛选得到的目的基因诱导表达载体的阳性表达细胞作为核移植供体细胞；

2)将核移植供体细胞注入到去核后的卵母细胞中后进行电融合，挑选融合细胞进行激活处理，得到克隆胚胎；

3)在进行激活处理后于培养液中进行克隆胚培养。

10.根据权利要求9所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的融合方法，其特征在于：所述共转染具体包括以下步骤：将重组载体pTRE3G-GTet3-EGFP-BI和载体pEF1a-Tet3G通过电击转染按2～4:1的质量比共转入山羊原代胎儿成纤维细胞；然后使用400～800μg/mL G418对转染后的细胞进行筛选，得到具有G418抗性的细胞克隆；

所述重组载体pTRE3G-GTet3-EGFP-BI包括骨架载体pTRE3G-BI，并且在该载体的双向启动子两侧的多克隆位点分别插入有EGFP基因和山羊TET3基因；

所述诱导表达处理具体包括以下步骤：将具有G418抗性的细胞克隆于含有100～200ng/mL Dox的培养液中培养，直至得到在荧光显微镜下呈现绿色的细胞克隆，将该细胞克隆扩大培养至细胞密度达到70～80％后消化并悬浮细胞，然后转接在含有100～200ng/mL Dox的培养液中，培养48～72h；

所述克隆胚培养具体包括以下步骤：将激活处理后得到的克隆胚胎首先于G1.5培养液中培养72h，然后转移至G2.5培养液中培养至激活处理后第8天。