CN110438155A - 修饰cd163基因第561位氨基酸的组合物、应用、细胞及基因编辑猪的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物、应用、细胞及基因编辑猪的制备方法，涉及生物技术领域，本发明提供的用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物，包括重组质粒和单链donor序列。重组质粒包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA序列，单链donor序列为CD163基因第561位氨基酸被精确替换的单链DNA序列，在精确修饰CD163基因第561位氨基酸的同时，能够避免破坏或改变CD163基因的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗PRRSV感染的基础上，最大程度上保留CD163蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点。

Description

修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物、应用、细胞及基因编 辑猪的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物、应用、细胞及基因编辑猪的制备方法。
背景技术
猪生殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)具有高传染性和强致死性等特性，被认为是最亟需攻克的猪传染病之一。数据表明，PRRS每年在美国和欧洲造成的经济损失高达6.44亿美元和6亿欧元。
CD163蛋白被认为是PRRSV(porcine reproductive and respiratory syndromevirus)进入细胞的关键受体。自2014年至今，已有多个单位成功制备出了CD163基因敲除猪，且攻毒实验证实CD163基因敲除可完全抵抗PRRSV感染。但是，除了在介导PRRSV入侵方面发挥着重要作用外，CD163还作为血红蛋白清道夫受体介导了血红蛋白的吸收，因此直接对CD163进行敲除可能影响机体的其他生理功能。
因此，开发一种既能够抵抗PRRSV感染、又能保持CD163蛋白正常生理功能的基因编辑猪尤为重要，在猪抗病育种方面具有重要的科学和实际意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞的制备方法，该方法操作简单、成本低廉，且制备得到细胞中CD163基因第561位氨基酸被准确修饰。
本发明的第四个目的在于提供一种CD163基因第561位氨基酸修饰的基因编辑猪的制备方法，该方法操作方便，普适性强，且制备得到的基因编辑猪具有良好的猪生殖与呼吸综合征病毒抗性。
本发明提供了一种用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物，所述组合物包括重组质粒和单链donor序列；
所述重组质粒包括基因编辑载体骨架，以及连接于所述基因编辑载体骨架上的第561位氨基酸靶向片段；
所述单链donor序列用于替换CD163基因第561位氨基酸。
进一步地，所述第561位氨基酸靶向片段包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述单链donor序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
进一步地，所述基因编辑载体骨架包括CRISPR质粒、TALEN质粒或锌指质粒；
优选地，所述基因编辑载体骨架为CRISPR质粒；
优选地，所述CRISPR质粒包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2；
优选地，所述CRISPR质粒为CRISPR/Cas9；
优选地，所述CRISPR/Cas9质粒包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552；
优选地，所述CRISPR/Cas9质粒为pX330。
本发明还提供了上述的用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物在如下(a)-(c)中至少一种的应用：
(a)构建CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞系；
(b)制备预防猪生殖与呼吸综合征的产品；
(c)构建猪生殖与呼吸综合征抗性猪模型；
优选地，所述CD163基因第561位氨基酸修饰为R561替换为A561。
本发明还提供了一种CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞的制备方法，将上述的用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物转入细胞中，得到CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞；
优选地，所述细胞包括猪成纤维细胞，优选包括猪胎儿成纤维细胞；
优选地，通过电穿孔法转入或通过脂质体转染法转入。
进一步地，在组合物转入细胞后，通过筛选和鉴定得到CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞；
优选地，所述筛选包括通过有限稀释法筛选单克隆细胞；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定和酶切鉴定。
本发明还提供了通过上述的CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞的制备方法制备得到的CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞。
另外，本发明还提供了一种CD163基因第561位氨基酸修饰的基因编辑猪的制备方法，将上述的CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得CD163基因第561位氨基酸修饰的基因编辑猪。
进一步地，基因编辑猪出生后还包括鉴定的步骤；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定。
本发明提供的用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物，包括重组质粒和单链donor序列。本发明提供的重组质粒中，包括基因编辑载体骨架，以及连接于所述基因编辑载体骨架上的第561位氨基酸靶向片段，该基因编辑载体骨架表达的酶切蛋白能够在多种细胞中对靶位点进行有效地酶切，并且通过用于替换CD163基因第561位氨基酸的单链donor序列引导序列重组。第561位氨基酸靶向片段为能够表达特异性的识别CD163基因第561位氨基酸位点附近序列的gRNA。在基因编辑载体骨架上连接第561位氨基酸靶向片段，能够使得本发明提供的重组质粒靶向性更强；单链donor序列为修饰目的靶序列的替换模板，在特异性的识别CD163基因第561位氨基酸位点附近序列的gRNA的引导下，酶切蛋白对靶标片段进行酶切并引导单链donor序列替换细胞中原有的同源片段，从而达到CD163基因第561位氨基酸精确修饰的目的。本发明提供的用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物，在精确修饰CD163基因第561位氨基酸的同时，能够避免破坏或改变CD163基因的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗PRRSV感染的基础上，最大程度上保留CD163蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点。
本发明提供的CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞的制备方法，将本发明提供的组合物转入细胞中即可，该方法操作简单、成本低廉，且制备得到细胞中CD163基因第561位氨基酸被准确修饰。
本发明提供的CD163基因第561位氨基酸修饰的基因编辑猪的制备方法，将本发明提供的细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠即可得到基因编辑猪，该方法操作方便，普适性强，且制备得到的基因编辑猪具有良好的PRRSV抗性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的猪CD163基因R561单氨基酸精确突变模式图；
图2A为本发明实施例2提供的CD163基因第561位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞的酶切结果图；
图2B为本发明实施例2提供的CD163基因第561位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞的测序结果图；
图3为本发明实施例3提供的CD163基因第561位氨基酸精确修饰的基因编辑猪PCR测序结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
CD163蛋白是PRRSV进入细胞的关键受体，但除了在介导PRRSV入侵方面发挥着重要作用外，CD163还作为血红蛋白清道夫受体介导了血红蛋白的吸收，因此直接对CD163进行敲除可能影响机体的其他生理功能。氨基酸点突变研究结果显示CD163肽链中位于SRCR5区域内的第561位的精氨酸(Arginine，R)是影响其作为PRRSV受体活性最重要的一个氨基酸位点。
基于此，本发明提供了一种用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物，以在不改变CD163其他氨基酸的情况下对R561进行精确替换，将R561替换为A561。本发明提供的组合物包括重组质粒和单链donor序列；其中，重组质粒包括基因编辑载体骨架，以及连接于所述基因编辑载体骨架上的第561位氨基酸靶向片段，单链donor序列用于替换CD163基因第561位氨基酸。
其中，基因编辑载体骨架能够在多种细胞中进行有效地酶切，并且引导酶切后的序列重组，具有适用范围广、酶切效率高等优点。对基因编辑载体骨架的种类不做限定，只要能够实现基因组编辑功能的载体均可作为本发明中的基因编辑载体骨架。
第561位氨基酸靶向片段为能够特异性的识别CD163基因第561位氨基酸位点附近序列的gRNA，在基因编辑载体骨架上连接第561位氨基酸靶向片段，能够使得本发明提供的重组质粒靶向性更强。对第561位氨基酸靶向片段的核苷酸序列不做限定，只要能够特异性的识别CD163基因第561位氨基酸位点附近序列的核苷酸序列，均可作为本发明中的第561位氨基酸靶向片段。
单链donor序列为修饰目的靶序列，即通过基因编辑将靶标片段替换为donor序列，从而达到基因修饰的目的。对单链donor序列的核苷酸序列不做限定，只要含有将靶标片段中包含待修饰核苷酸的DNA片段进行核苷酸修饰后得到的DNA片段序列，均可作为本发明中的单链donor序列。
本发明提供的用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物，通过第561位氨基酸靶向片段引导基因编辑载体骨架表达的酶切蛋白对靶标片段进行酶切，并引导donor替换细胞中原有的同源片段，从而达到CD163基因第561位氨基酸精确修饰的目的。本发明提供的组合物，在精确修饰CD163基因第561位氨基酸的同时，能够避免破坏或改变CD163基因的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗PRRSV感染的基础上，最大程度上保留CD163蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点，能够为制备、培育CD163单氨基酸精确突变的抗PRRSV猪新品种提供有力支撑。
在一些优选的实施方式中，所述第561位氨基酸靶向片段包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。当选择SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列作为重组质粒中的第561位氨基酸靶向片段时，该重组质粒的靶向性更强，修饰更精确。
在一些优选的实施方式中，所述单链donor序列具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。当选择SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列作为重组质粒中的单链donor序列时，该单链donor序列替换掉CD163基因中的野生型序列后，R561能够被准确替换为A561，并且，在保证其他氨基酸不变的情况下，还能够引入一个酶切位点NaeⅠ，以便于在需要时进行阳性细胞的克隆鉴定。
在一些优选的实施方式中，所述基因编辑载体骨架包括CRISPR质粒、TALEN质粒或锌指质粒；
优选地，所述基因编辑载体骨架为CRISPR质粒；
优选地，所述CRISPR质粒包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2；
优选地，所述CRISPR质粒为CRISPR/Cas9；优选地，所述CRISPR/Cas9质粒包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552；
优选地，所述CRISPR/Cas9质粒为pX330。
CRISPR/Cas9和pX330普适性广，通用性较强，且产品成熟度较高，使用其作为基因编辑载体骨架，能够达到更高的酶切效率。
本发明还提供了上述的用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物在如下(a)-(c)中至少一种的应用：
(a)构建CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞系；
(b)制备预防猪生殖与呼吸综合征的产品；
(c)构建猪生殖与呼吸综合征抗性猪模型；
优选地，所述CD163基因第561位氨基酸修饰为R561替换为A561。
本发明提供的用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物够将CD163基因中第561位氨基酸由R561准确替换为A561。因此，将本发明提供的组合物转染入细胞后，能够构建CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞系。并且，由于R561是影响PRRSV受体活性最重要的一个氨基酸位点，将其替换后能够阻断CD163与PRRSV的结合，从而制备预防猪生殖与呼吸综合征的产品，该产品例如可以为，但不限于试剂、试剂盒或疫苗等。同样地，将R561准确替换为A561后，能够抵抗PRRSV的感染，从而极大地增强机体对PRRSV的抗性，达到构建猪生殖与呼吸综合征抗性猪模型的目的。
本发明还提供了一种CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞的制备方法，将上述的用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物转入细胞中，得到CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞。
该方法操作简单、成本低廉，且制备得到细胞中CD163基因第561位氨基酸被准确修饰。
优选地，所述细胞为猪成纤维细胞，优选为猪胎儿成纤维细胞。
猪胎儿成纤维细胞相较于其他细胞，克隆效率更高。
优选地，通过电穿孔法转入或通过脂质体转染法转入，优选通过电穿孔法转入。
使用电穿孔法进行转染，能够具有更高的转染效率。
在一些具体的实施方式中，将序列如SEQ ID NO：3-4所示的寡核苷酸单链退火形成双链，与经过酶切的载体骨架连接，筛选获得阳性克隆即得基因编辑载体骨架。
在一些优选的实施方式中，在组合物转入细胞后，通过筛选和鉴定得到CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞。
优选地，所述筛选包括通过有限稀释法筛选单克隆细胞，鉴定所述单克隆细胞是否为CD163基因第561位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞。
优选地，所述鉴定包括测序鉴定和酶切鉴定。
在一些具体的实施方式中，提取单克隆细胞的基因组DNA，分别使用如SEQ ID NO：5-6所示引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序和酶切，根据测序和酶切结果判定所述单克隆细胞是否为CD163基因第561位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞。
本发明还提供了通过上述的CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞的制备方法制备得到的CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞。
另外，本发明还提供了一种CD163基因第561位氨基酸修饰的基因编辑猪的制备方法，将上述的CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得CD163基因第561位氨基酸修饰的基因编辑猪。
该方法操作方便，普适性强，且制备得到的基因编辑猪具有良好的猪生殖与呼吸综合征病毒抗性。
在一些优选的实施方式中，基因编辑猪出生后还包括鉴定的步骤；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定。
在一些具体的实施方式中，所述鉴定的步骤包括：提取猪的基因组DNA，使用核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示的上下游引物对提取的DNA基因组进行扩增，对扩增产物进行测序，测序结果确定所述猪是否为CD163基因第561位氨基酸精确修饰的基因编辑猪。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂及仪器信息如下：
主要试剂：分离猪胎儿成纤维细胞用的胶原酶type IV购自sigma；细胞培养用的DMEM、FBS、PS、NEAA、Glutamine、Trypsase均购自Gibco；提取细胞和耳组织DNA试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成；用于PCR的Expremix PCR酶购自TaKaRa。
主要仪器：CO2培养箱(Thermo Scientific,3131/3111)；荧光倒置显微镜(LEICA,DMI66B)；PCR仪(BIO-RID,C1000Touch)；凝胶成像系统(BIO-RID,Universal HoodⅡ)；显微操作系统(Eppendorf，Celltram vario)。
实施例1重组质粒pX330-CD163-gRNA载体的构建和单链donor序列设计
1.首先锁定编码猪CD163基因的第561位氨基酸附近序列，利用麻省理工学院张峰实验室开发的网站(http://crispr.mit.edu)对gRNA进行评分，从候选的gRNA中选择一个靠近R561位点同时分值又较高的gRNA，其序列如SEQ ID NO：1(CD163-gRNA序列：GCTACATGTCCCGTCAGGGC)所示。根据gRNA序列合成如SEQ ID NO：3(CD163-gRNA-F序列：caccGCTACATGTCCCGTCAGGGC)和SEQ ID NO：4(CD163-gRNA-R序列：aaacGCCCTGACGGGACATGTAGC)所示的互补配对的寡聚核苷酸序列。同时，根据gRNA序列本实施例还设计了一条如SEQ ID NO：2(CD163-ssODN序列：GACAGATCTGGGCTGAAGAATTCCAGTGTGAGGGGCACGAGTCCCACCTTTCACTCTGCCCAGTAGCGCCGGCCCCTGACGGGACATGTAGCCACAGCAGGGACGTCGGCGTAGTCTGCTCAAGTGAGACCCAGGGAATGTGTTCACTTT)所示的ssODN序列作为单链donor序列，当单链donor序列替换掉野生型序列后，R561被成功替换为A561，同时在保证其他氨基酸不变的情况下还引入了一个酶切位点NaeⅠ以便于阳性细胞克隆鉴定。猪CD163基因R561单氨基酸精确突变模式图如图1所示。
2.构建的靶向CD163基因的第561位氨基酸附近序列的CRISPR/Cas9重组质粒，命名为pX330-CD163-gRNA。将合成的寡聚核苷酸在98℃条件下处理10min，然后自然冷却至室温的条件下对其进行退火；用限制性内切酶Bbs I对含有Cas9序列的PX330骨架载体在37℃条件下酶切2h，切胶回收线性化片段后，与退火的寡聚核苷酸16℃连接1h，随后转化Top10或DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄的LB平板生长，挑取单菌落扩大培养并测序，测序引物为SEQ ID NO：7所示的U6-FWD(U6-FWD:GAGGGCCTATTTCCCATGATT)。序列正确，进行扩大培养后，用质粒去内毒素大提试剂盒(Endo-Free Plasmid Maxi Kit)上提供的方法，提取pX330-CD163-gRNA质粒，所提的质粒用于细胞的转染。
实施例2 CD163基因第561位氨基酸精确修饰猪成纤维细胞单克隆的建立
1.猪胎儿成纤维细胞的制备
将猪35日龄胚胎去除头、尾、四肢、内脏和骨头，并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL完全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴胎牛血清，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL全培养液，于6-8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75培养瓶后冻存备用。其中，猪为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基地猪场饲养的猪。
2.细胞转染
转染前一天将原代猪胎儿成纤维细胞复苏至6cm平皿中，当细胞达到70-80％汇合度时即可进行细胞转染。将5μg pX330-CD163-gRNA质粒和2μg CD163-ssODN共转染入猪胎儿成纤维细胞中，转染步骤严格按照Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行操作。
3.阳性单克隆细胞的筛选
电转48h后细胞汇合度大约为90％左右时，将细胞以适宜的密度铺板，每3天更换一次培养液。铺板后的细胞大约培养10天左右，可以观察到合适大小的克隆点形成。将单克隆细胞进行扩大培养，同时取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。
4.阳性单克隆细胞的鉴定
对所挑取的细胞单克隆进行鉴定：以提取的细胞基因组为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO：5(CD163-406-F2序列：TCCCTCACCGAAATGCTAT)和SEQ ID NO：6(CD163-406-R2序列：TGACTACCTAACCCTACCCTCT)所示的上下游引物对提取的DNA基因组进行扩增，扩增出406bp片段。扩增条件为95℃5min；95℃30s，62℃30s，72℃30s，34个循环；72℃，5min。2％琼脂糖凝胶电泳观察条带，PCR产物送北京天一辉远公司测序，同时也利用限制性内切酶NaeⅠ对PCR产物进行酶切。根据测序和酶切结果，筛选CD163基因第561位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞用作核移植时的供体细胞。
5.实验结果
测序结果显示，本实施例成功的获得了多株CD163基因第561位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞效率为2％。阳性细胞的酶切和测序结果如图2A和图2B所示。
实施例3体细胞核移植技术制备CD163基因第561位氨基酸精确修饰的基因编辑猪
以实施例2获得的纯合敲除的阳性细胞作为核移植供体细胞，以体外成熟40h的青年猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞，经电融合与激活，构建成重组克隆胚胎，挑选发育状态良好的克隆重组胚胎用手术法移入自然发情的经产大白母猪子宫内进行妊娠，其中手术法胚胎移植步骤为呼吸机麻醉，并伴有2％的水合氯醛维持麻醉，在手术架上仰卧保定，腹中线做一个长约10cm的手术切口，曝露卵巢、输卵管及子宫，用胚胎移植玻璃管沿输卵管伞部进入约5cm，将发育状态良好克隆重组胚胎移植到输卵管壶腹部-峡部结合处。胚胎移植后，技术人员定期观察，并用B型超声波检查受体母猪妊娠情况。
小猪出生后，剪取耳组织并提取基因组DNA，使用上述SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的核苷酸序列进行PCR扩增，PCR扩增产物测序以检测基因型。测序结果显示，本实施例成功的获得了多头CD163基因第561位氨基酸精确修饰的基因编辑猪，部分基因编辑猪PCR测序结果如图3所示。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物、应用、细胞及基因编辑猪的制备方
法
<130> 2019
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctacatgtc ccgtcagggc 20
<210> 2
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacagatctg ggctgaagaa ttccagtgtg aggggcacga gtcccacctt tcactctgcc 60
cagtagcgcc ggcccctgac gggacatgta gccacagcag ggacgtcggc gtagtctgct 120
caagtgagac ccagggaatg tgttcacttt 150
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccgctaca tgtcccgtca gggc 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaacgccctg acgggacatg tagc 24
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tccctcaccg aaatgctat 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgactaccta accctaccct ct 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagggcctat ttcccatgat t 21

Claims (10)

1.一种用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物，其特征在于，所述组合物包括重组质粒和单链donor序列；
所述重组质粒包括基因编辑载体骨架，以及连接于所述基因编辑载体骨架上的第561位氨基酸靶向片段；
所述单链donor序列用于替换CD163基因第561位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第561位氨基酸靶向片段包括如SEQID NO：1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述单链donor序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其特征在于，所述基因编辑载体骨架包括CRISPR质粒、TALEN质粒或锌指质粒；
优选地，所述基因编辑载体骨架为CRISPR质粒；
优选地，所述CRISPR质粒包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2；
优选地，所述CRISPR质粒为CRISPR/Cas9；
优选地，所述CRISPR/Cas9质粒包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552；
优选地，所述CRISPR/Cas9质粒为pX330。
5.如权利要求1-4任一项所述的用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物在如下(a)-(c)中至少一种的应用：
(a)构建CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞系；
(b)制备预防猪生殖与呼吸综合征的产品；
(c)构建猪生殖与呼吸综合征抗性猪模型；
优选地，所述CD163基因第561位氨基酸修饰为R561替换为A561。
6.一种CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞的制备方法，其特征在于，将权利要求1-4任一项所述的用于修饰CD163基因第561位氨基酸的组合物转入细胞中，得到CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞；
优选地，所述细胞包括猪成纤维细胞，优选包括猪胎儿成纤维细胞；
优选地，通过电穿孔法转入或通过脂质体转染法转入。
7.根据权利要求6所述的细胞的制备方法，其特征在于，在组合物转入细胞后，通过筛选和鉴定得到CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞；
优选地，所述筛选包括通过有限稀释法筛选单克隆细胞；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定和酶切鉴定。
8.通过权利要求6或7所述的CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞的制备方法制备得到的CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞。
9.一种CD163基因第561位氨基酸修饰的基因编辑猪的制备方法，其特征在于，将权利要求8所述的CD163基因第561位氨基酸修饰的细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得CD163基因第561位氨基酸修饰的基因编辑猪。
10.根据权利要求9所述的基因编辑猪的制备方法，其特征在于，基因编辑猪出生后还包括鉴定的步骤；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定。
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